1.

PARTEA TEORETICA

1.1. Introducere Problematica remedierii solurilor contaminate cu substante toxice utilizand resurse naturale reprezinta o preocupare deosebita la nivel mondial. Eforturile cercetarilor s-au indreptat spre gasirea unor metode eficiente si ieftine dar cu impact cat mai redus asupra mediului. Poluarea solurilor si apelor reziduale cu compusi chimici, incluzand metale grele, reprezinta la ora actuala, una din problemele majore cu consecinte grave asupra biosferei. Metalele grele provenite din activitatile umane, cum ar fi mineritul sau din apele industriale sau acumulat de-a lungul anilor in mediu si uneori chiar in lantul alimentar determinand probleme grave ecologice si de sanatate. Expansiunea rapida si continua crestere a industriilor in ultimul secol a condus la cresterea nivelurilor de efluenti toxici eliberati in mediu. Multe incidente majore s-au produs in trecut, ceea ce arata necesitatea de a prevenii scaparea efluentilor in mediu, sau eliberarea de materiale radioactive cum a fost accidentul de la Cernobal .(Lloyd , 2002) In ultimul timp s-au facut eforturi substantiale pentru a solutiona aceasta problema. Astfel, una din preocuparile actuale ale omenirii o reprezinta remedierea solurilor contaminate cu metale grele. Obiectivul principal al lucrarii il constituie identificarea si caracterizarea de microorganisme rezistente la poluanti din categoria metalelor grele (Escherichia coli, Pseudomonas putida, Agrobacterium tumefaciens) in scopul remedierii solurilor contaminate. Obiectivele specifice au constat in: 1. Testarea rezistentei la diferite concentratii de poluanti in vitro 2.Selectarea si caracterizarea microorganismelor 3. Obtinerea de biomasa microbiana la nivel de laborator . 4. Conservarea microorganismelor in vederea testarii lor pe soluri contaminate.

1.2. Bioremedierea Specia umana functioneaza la vrful piramidei trofice n calitate de consumator omnivor, fara a avea ea nsasi un consumator specific superior, ceea ce duce la o nmultire necontrolata a populatiei umane. Prin constiinta de sine si inteligenta, omul a reusit sa devina din biosistem agresat de mediul natural, factor de exploatare a acestui mediu, conform programului pentru sine de autoconservare la nivel de individ si specie. nmultirea necontrolata implica o competitie acerba pentru resurse, ceea ce se extinde procesul de antropizare spre cele mai inaccesibile zone ale planetei, iar intensitatea acestui proces, desfasurat intempestiv n ultimele secole, depaseste capacitatea de redresare prin autoreglare a ecosistemelor, invadate prin: - urbanizare - industrializare -agrosistematizare Degradarea ecosistemelor pna la perturbarea echilibrului dinamic, a structurii si functiilor acestora, restrngerea biodiversitatii, ameninta nsasi specia umana, prin decuplarea sa energetica si materiala, deci, prin alterarea conditiilor sale de existenta. Cercetarile n domeniul biologiei solului, n vederea ntelegerii proceselor biologice fundamentale care se petrec n sol, au cunoscut n secolul XX o adevarata explozie. La nceputul secolului trecut, cercetarile erau orientate spre mbunatatirea fertilitatii solului si cresterii productiei agricole Pna n anii 50, s-au studiat diferite tipuri de microorganisme (fixatoare de azot, nitrificatori, sulfo-oxidatoare etc) si relatiile dintre acestea si nutritia plantelor. In anii 60, cercetarile s-au axat pe corelatiile dintre transformarile solului, populatiile microbiene si activitatile enzimatice pentru sporirea fertilitatii solului.

n anii 70, rezolvarea problemelor cu privire la asigurarea hranei (inocularea solului cu bacterii fixatoare de azot din genul Azospirillum fiind primul pas important n acest sens). Dupa anii 70, a avut loc n microbiologia solului un salt de la aplicarea acestei stiinte n agricultura, la folosirea microorganismelor n decontaminarea mediului poluat. ncepnd cu anii 80, s-au realizat primele experimente de laborator n care s-a folosit inocularea cu tulpini de microorganisme cu abilitati degradative ale compusilor organici. Pornind de la activitatile degradative ale microorganismelor au fost elaborate numeroase tehnologii de depoluare, care sunt cuprinse generic n termenul de bioremediere. (Alexander, 1994). Bioremediarea mediului reprezinta un nou domeniu in cadrul biotehnologiilor. Bioremedierea reprezinta metoda de eliminare cu ajutorul microorganismelor a poluantilor din mediu, prin transformarea lor din compusi toxici in compusi netoxici, fara afectarea mediului inconjurator. Cu alte cuvinte, bioremediarea este o tehnologie prin care se urmareste indepartarea poluantilor din mediu refacand mediul natural original si prevenind viitoarele contaminari. Aceste microorganisme pot fi izolate din zonele contaminate sau pot fi izolate din alte surse si transferate in regiunile poluate. Compusii contaminati sunt trasformati de organismele vii prin reactii care au loc ca etape in procesele de metabolism. Biodegradarea este adesea rezultatul activitatii metabolice a mai multor microorganisme. Pentru ca bioremedierea sa aiba efectele scontate, microorganismele trebuie sa atace pe cale enzimatica poluantii din siturile contaminate si sa ii transforme in compusi mai putin toxici. Acest lucru se poate realiza in zonele unde conditiile de mediu permit dezvoltarea microorganismelor iar acestea pot sa se dezvolte normal si sa aiba capacitatea de a degrada compusii poluanti cu o rata destul de ridicata. Controlul si optimizarea proceselor de bioremediere reprezinta un sistem complex ce implica mai multi factori ce includ: existenta unei populatii microbiene cu capacitate ridicata de a degrada compusii poluanti; disponibilitatea unor contaminanti la populatiile de

microorganisme; factorii de mediu (tip de sol, temperatura, pH, prezenta oxigenului si a altor acceptori, nutrienti). Microorganismele pot fi izolate din aproape toate conditiile de mediu cum ar fi din regiuni cu temperatura scazuta sub zero grade, din regiuni cu temperaturi foarte ridicate, conditii de desert, din ape etc. Cel mai important factor pentru ca aceste microorganisme sa supravietuiasca o reprezinta sursa de carbon si sursa de energie.(Sasikumar C. Sheela and Taniya Papinazath, 2003)

2. Studii privind relatia microorganism-metale

2.1. Studiul documentar privind relatia dintre microorganismele sensibile la metale grele si radioactive, cele cu capacitate inalta de retentie a acestora si microorganismele potential decontaminante. Cei mai abundenti poluanti in apele reziduale sunt metalele grele. Activitatile umane, cum ar fi mineritul si devarsarile apelor industriale, au drept rezultat acumularea metalelor in mediu si eventual acumularea direct in lanturile de hrana conducand la serioase probleme ecologice si de sanantate. Prezenta metalelor si radionuclizilor organici in sol si ape reziduale in zonele contaminate prezinta schimbari specifice ale mediului iar optiunile pentru remediere sunt foarte limitate. Acesti contaminanti sunt ne-degradabili, iar alternativele de remediere se limiteaza la escavarea solului contaminat. O alternativa la aceste metode conventionale de

remediere o reprezinta utilizarea microorganismelor (bacterii, fungi, drojdii) dar si a plantelor si algelor in detoxifierea mediilor contaminate. Contaminarea apelor din rezervoarele minerale dar si a apei de baut cu metale grele poate determina alterarea comunitatilor micro si macrobiologice (Shakoori, 2002). S-a raportat ca microorganismele au capacitatea de a se adapta la aceste noi conditii prin intermediul sistemelor de rezistenta, si de accea, studiul interactiei intre metale grele si microorganisme a crescut foarte mult. Cele mai numeroase studii privind interactia metal-microorganism s-au concentrat pe izolarea si caracterizarea microorganismelor rezistente la un anumit tip de metal din mediile contaminate si prin posibilitatea utilizarii acestor microorganisme in procesele de detoxifiere a mediilor poluate (Drochioiu G., 2006). Metalele grele joaca un rol important in cresterea celulara si in functiile metabolice. Astfel, cand un metal cu functie biologica necunoscuta inlocuieste sau este in competitie cu alt metal cu functie cunoscuta, rezulta fenomenul de toxicitate. Analize recente au aratat ca toxicitatea totala anuala a metaleleor mobilizate prin activitatile umane este mult mai mare decat suma intre totalul de toxicitate al substanteleor radioactive si organice generate in fiecare an.

2.1.1. Relatia microorganism-metale grele Investigarea interactiei intre metal si microorganism ne va ajuta sa intelegem mecanismele prin care microorganismele au capacitatea de a altera toxicitatea radionuclizilor si a metalelor grele dar si capacitatea lor de a se adapta la acele conditii de mediu. Intelegerea unor astfel de mecanisme ne va ajuta in viitor la dezvoltarea unor strategii de bioremediere a solurilor contaminate pe de o parte, dar si de utilizare a microorganismelor si a componentelor acestora ca matrita pentru obtinerea de nanoparticule metalice cu aplicatii in industrie. Chiar daca unele metale grele sunt elemente esentiale, majoritatea pot fi, la concentratii mari, toxice pentru toate tipurile de viata, inclusiv microorganisme, formand compusi complexi in celula. Deoarece metalele grele se gasesc din ce in ce mai mult in habitatul microorganismelor, ele

si-au dezvoltat cateva mecanisme pentru a tolera prezenta metalelor grele. Unele metale grele sunt necesare pentru functiile enzimatice si crestere, ele sunt cofactori a unor largi metaloproteine care catalizeaza reactiile redox. Reactiile celulare ale metalelor grele esentiale sunt implicate intr-o mare masura in metabolismul celular. O deficienta in aceste metale poate avea consecinte severe la nivelul celulei si organismului.(H. Seidel, 2004) Metalele joaca un rol esential pentru unele microorganisme. Spre exemplu, unele metale, cum ar fi calciul, cobaltul, cromul, cuprul, fierul, potasiul, magneziul, manganul, nichelul si zincul, servesc ca micronutrienti si sunt folositi in procesele redox, pentru a stabiliza moleculele in intereactiile electrostatice; sunt componente ale unor enzyme,sunt utilizate pentru reglarea presiunii osmotice. Multe alte metale nu au nici un rol biologic (ex: argint, aluminiu, cadmiu, aur, mercur) si sunt neesentiale. La concentratii mari, si metalele esentiale si cele neesentiale pot provoca rupturi la nivelul membranelor celulare; pot altera specificitatea enzimelor, pot distruge functiile celulare, si pot provoca modificari la nivelul structurii moleculelor de ADN.( Anne Spain, 2003) Poluarea apelor cu metale grele ramane una din serioasele probleme de mediu si de aceea se impune necesitatea dezvoltarii de sisteme avantajoase de indepartare a acestora. Principalele tehnici utilizate pentru indepartarea metalelor grele s-au rezumat la schimbul de ioni, precipitarea chimica, metode electrolitice, dar aceste metode sunt destul de limitate deoarece implica costuri de operare foarte ridicate. Astfel, majoritatea cercetarilor s-au concentrat in identificarea unor metode avantajoase de indepartarea a poluantilor prin utilizarea unor sorbenti cum ar fi celulele de microorganisme. Astfel, biomasa microbiana in forma sa nativa nu este avantajos de utilizat in procesele pe scara larga de indepartare a poluantilor. O solutie in acest caz o reprezinta imobilizarea acestor microorganisme prin conversia biomasei intr-o forma a particulelor care poate fi utilizata ca absorbent conventional cu marime dorita, porozitate ridicata si o mai mare performanta fizica si chimica. Dintre cei

mai utilizati agenti pentru imobilizare cei mai utilizati sunt alginatul, silicele si poliacrilamida. Un exemplu in acest sens, il reprezinta utilizarea bacteriei Bacillus sphaericus tulpina JGA12, tulpina izolata din minele de uranium care dupa incapsularea in silicagel isi mentine inca proprietatea de retentie a metalelor grele. (Selenska-Pobell, 2001)

2.2. Micoorganisme utilizate in procesele de detoxifiere Microorganismele sunt considerate reciclatori naturali datorita capacitatii lor de a transforma substantele chimice sintetice si naturale in surse de energie si materiale organice; pentru cresterea lor se sugereaza faptul ca substantele chimice scumpe si remedierea fizica pot fi inlocuite cu procese biologice care sunt mai ieftine si mai inofensive pentru mediul inconjurator. Prin urmare, microorganismele reprezinta o resursa promitatoare, in mare masura neexploatata inca pentru noile biotehnologii. Cele mai utilizate microorganisme in detoxifierea metalelor grele sunt bacteriile si fungi. De exemplu, la unele tipuri de Pseudomonas s-a demonstrat ca au capacitatea de a rezista si acumula diferite metale precum:crom, cupru, cadmiu si nichel. De asemenea, numeroase bacterii din familia Enterobacteria au capacitatea de a reduce enzymatic cromul. dezvoltat mecanisme de rezistenta la cupru, zinc si arsen este E.coli. Cercetari privind identificarea si caracterizarea bacteriilor si fungilor ce prolifereaza n solurile poluate cu petrol si apa sarata au fost efectuate de Toti si colab. (2003) S-au identificat principalele bacterii ce contribuie la degradarea petrolului (Pseudomonas, Flavobacterium, Corynebacterium etc), bacterii care se ntlnesc si n zacamintele de titei. Pentru a optimiza metodele de bioremedierea solului contaminat cu metale grele, au fost folosite diferite variante experimentale in cateva proiecte de cercetare. Soluri cu diferite grade de contaminare au fost amestecate cu sau fara fungi si cultivate cu specii de plante pentru a diminua concentratia de metale grele transferate in plante. Intr-o alta varianta experimentala, plante care au fost crescute in aceleasi soluri mixte au fost date cu 2 aminoetanol pentru a micsora stresul oxidativ si pentru a creste productia de biomasa. O alta bacterie care si-a

Alternativ, 2 specii diferite de Streptomyces au fost inoculate in sol pentru a verifica daca transferul de metale grele scade comparativ cu variantele care nu au fost inoculate. Utilizarea fungilor a fost benefica pentru plante in aproape toate conditiile testate, pentru producerea de biomasa si scaderea stresului oxidativ.( Neagoe A., 2004)

Tabel.1.Grupuri functionale de legare a metalelor la suprafata membranelor bacteriene Grupari functionale Carboxil Localizare lipopolizaharide peptidoglican peptidoglican Amine/imidazole polipeptide Organisme Pseudomonas aeruginosa E. coli Bacillus subtilis B. subtilis Klebsiela pneumoniae E. coli, OMG Ralstonia eutropha,OMG E. coli B. subtilis

Tiol

fitochelatine metaltionine

Fosforil

lipopolizaharide acid teicoic

Microorganismele si-au dezvoltat cateva mecanisme pentru a tolera prezenta metalelor grele (fie prin efluxare, complexare sau reducere a metalelor la o stare mai putin toxica). Majoritatea mecanismelor studiate implica efluxarea ionilor metalici in afara celulei. Deoarece efluxarea ionilor metalelor grele de obicei include o reactie redox, bacteriile care sunt rezistente si cresc pe metale de asemenea joaca un rol important in ciclul biogeochimic.

Este o implicare importanta in toleranta la metalele grele deoarece starea de oxidare a metalelor grele se refera la solubilitatea si toxicitatea metalelor grele in sine. De asemenea, deoarece starea de oxidare a ionilor metalici poate determina solubilitatea lor, multi cercetatori au incercat sa foloseasca microorganismele care sunt capabile sa oxideze sau sa reduca metalele grele. ( G. Haferburg, 2007) Cuprul este folosit de celule in cantitati mici in enzimele celulare. Cuprul este cu precadere utilizat in unele activitati industriale si agricultura si se gasete in anumite soluri, iar bacteriile si-au dezvoltat unele mecanisme de rezistenta la cupru. De exemplu, bacteria Pseudomonas syringae, rezista la cupru prin acumularea si compartimentarea in periplasma celulara si in exteriorul membranei, effect datorat a 4 proteine codificate de operonul cop de la nivelul plasmidei. Proteinele se gasesc in periplasma (Cop A si Cop C), exteriorul membranei (CopB), si in interiorul membranei (CopD) si lucreaza impreuna pentru a compartimenta cuprul departe de functiile celulare sensibile. La E.coli , rezistenta la cupru se bazeaza pe un mecanism de efluxare prin care cuprul este indepartat din celula. Gupta si col, 1995 au identificat doua gene, cutC si cutF ce codifica pentru o proteina de legare la cupru si o lipoproteina din membrana exterioara. Zincul, reprezinta alt element essential care nu este utilizat in respiratie dar care este important in formarea unor complexe la nivel celular cum ar fi compleze de tip zinc-finger cu moleculele de ADN. Celulele bacteriene au capacitatea de a acumula zinc foarte rapid prin mecanisme de absorbtie a acestuia in concentratii destul de ridicate dar este mai putin toxic comparativ cu alte metale grele (Nies 1999). Absorbtia ionilor de zinc se realizeaza prin acelasi mecanism de absorbtie al magneziului. De exemplu, la E.coli tulpina K-12 a fost identificata o gena cromozomala zntA care s-a dovedit a fi responsabila de transportul zincului si a altor cationi de-a lungul membranei celulare (Beard si al., 1997) Un studiu interesant s-a realizat in cazul bacteriei Geobacter metallireducens care are o capacitate ridicata de reducere a metalelor, elimina uraniul din apele de drenaj in operatiile miniere si din apele subterane contaminate. Chiar si celulele microbiene moarte pot fi utile in

tehnologia bioremedierii. Aceste descoperiri sugereaza ca viitoare explorari ale diversitatii microbiene este posibil sa ne conduca la descoperirea de mult mai multe microorganisme cu proprietati unice utile in procesele de bioremediere. Microorganismele s-au adaptat pentru a tolera prezenta metalelor sau chiar le pot ajuta sa creasca. Astfel, interactiile dintre microorganisme si metale au implicatii importante aupra mediului si sanatatii.Unele implicatii sunt benefice ca de exemplu utilizarea bacteriilor in decontaminarea metalelor. Alte implicatii nu sunt atat de benefice, deoarce prezenta mecanismului de toleranta la metale poate contribui la cresterea rezistentei la antibiotice. Numeroase studii au demonstrat ca toleranta la antibiotice si metale grele a bacteriileor este oarecum inrudita deoarece genele de rezistenta in ambele cazuri sunt situate una langa cealalta in aceeasi plasmida in bacterii si cel mai probabil sunt transferate impreuna in mediu. Datorita raspandirii bacteriilor rezistente la antibiotice, bolile infectioase au devenit din ce in ce mai dificil de tratat si cu costuri destul de ridicate. De aceea, societatea trebuie sa devina mult mai precauta in utilizarea antibioticelor astfel incat san nu se foloseasca doze foarte mari de antibiotice si sa se evite pe cat posibil tranferul de substante antimicrobiene, cum ar fi metalele grele, in mediul inconjurator. Cresterea utilizarii antibiotice in sanatatea umana ca si in economia agricola si zootehnica, a condus la cresterea rezistentei la antibiotice a bacteriilor. Produsele din categoria dezinfectantilor si metalele grele utilizate in industrie dar si alte produse de uz casnic, au creat alaturi de antibiotice, o presiune selectiva in mediu ce a condus la mutatii ale microorganismelor care le permite sa supravietuiasca mult mai mult in astfel de medii selective. In conformitate cu Jefferey Lawrence (2000) gruparea genelor in clusteri pe o plasmida, este in beneficiul acelui organism pentru a supravietui deoarece aceste gene au o probabilitate mai mare de a fi tranferate impreuna de la un organim la altul in timpul procesului de conjugare. Deci, intr-un mediu cu mai multe categorii de stress, de exemplu antibiotice si metale grele, acele bacterii cu genele de rezistenta grupate in clusteri au o

10

probabilitate mai ridicata de a transfera gene de la o bacteria la alta simultan si aceste bacterii vor avea o sansa mult mai mare de supravietuire. In afara microorganismelor, si plantele pot fi utilizate in procesele de remedierea solurilor contaminate cu metale. Astfel, un rol important o are actualmente studiul fitoremedierii solurilor contaminate cu substante toxice.O buna cunoastere a implicatiilor acestor tehnici de imbunatatire a fitoremedierii ne va ajuta sa minimizam efectele de risc si alte efecte asociate. Astfel, strategiile biologice actuale sunt desemnate pentru a imbunatati procesele de fitoremediere in vederea reducerii concentratiei metalelor grele din solurile contaminate prin fitoextractia sau fitodegradarea acestora de catre plantele tolerante la toxice. Remedierea mediului utilizand plantele prezinta avantaje in ce priveste costurile care sunt relativ mici, dar si capacitatea ridicata a plantelor de a metaboliza la nivelul tesuturilor compusi organici din clase diferite.

2.2.1. Rezistenta la metale grele

Metalele grele din categoria Cd2+, Cr6+, Cu2+ si Pb2+ sunt deosebit de toxice si numeroase microorganisme au evoluat de-a lungul anilor si si-au dezvoltat un sistem de detoxifiere a acestora. La eucariote, calea de detoxifiere implica sinteza unor molecule de chelatare care se leaga la ionii de metal si mediaza transportul lor in afara celulei sau ii poate sechestra la nivelul compartimentelor subcelulare. Majoritatea celulelor rezolva aceasta problema prin doua tipuri de sisteme de uptake, absorbtie a ionilor de metale grele: una este foarte rapida, nespecifica si deoarece utilizeaza numeroase substraturi se exprima constitutiv. Acest sistem destul de rapid este in mod usual condus numai de gradienti chemiosmotici de-a lungul membranei citoplasmatice a bacteriiilor. Cel de-al doilea sistem are o specificitate ridicata de substrat, este destul de incet si adesea utilizeaza ca sursa de energie sistemul de hidroliza ATP in combinatie cu gradientul chemiosmotic. Acest sistem este produs numai cand celula are nevoie si este un sistem

11

inductibil (Nies si Silver, 1995). De exemplu cromul se acumuleaza foarte rapid printr-un sistem de tipul sulfate-uptake. Un exemplu de sistem de tipul uptake absorbtie, este sistemul de tipul P dependent de ATP-aza. In general este utilizat in cazul Cd, Cu si Pb. Cand suprafata celulara intra in contact cu o concentratie foarte mare de metale grele ce se acumuleaza prin sistemele mentionate mai sus, ionii acestor metale sunt transportati in citoplasma deaoarece acesti trasportori cum ar fi de tipul P se exprima constitutiv. De aceea, acest transport nu poate fi oprit, iar metalele devin astfel toxice. In cazul cuprului de exemplu, plasmidele rezistente la cupru din interiorul bacteriei E.coli interactioneaza puternic cu functiile codificate de cromozom si mecanismul actual depinde de faza de crestere celulara. De altfel, mecanismul de rezistenta la Cu al E.coli si Pseudomonas este relativ la fel, dar fenotipul este diferit. Celulele de E.coli raman mai putin colorate in timp ce coloniile de Pseudomonas se shimba in albastru deoarece Cu se acumuleaza la nivelul periplasmei si in afara membranei. Cadmiul este un element care se gaseste in sol dar la concentratii destul de scazute. Cadmuiul nu se gasete liber in sol ci in combinatie cu alte elemente cum ar fi oxigelul sau sulful. Nivelul de cadmiu creste datorita activitatilor umane cum ar fi din industrie, agricultura dar si alte activitati urbane. Una din problemele legate de cadmiu este ca acesta nu se poate mobiliza rapid si persista in sol un timp foarte indelungat.. Efectele asupra sanatatii umane se bazeaza pe natura si cresterea expunerii persoanelor la soluri contaminate, ape sau aer. O expunere la 1-5mg/m3 la cadmiu timp de 8 ore poate fi fatala. Acumularea de cadmiu in organismul uman in concentratii mici dar timp indelungat poate sa aiba efecte dramatice asupra rinichilor dar mai ales a oaselor care devin foarte fragile. Ca urmare, cadmiul este considerat unul din cele mai toxice metale grele si nici pana la ora actuala metodele de degradare utilizand microorganismele nu au fost elucidate inca. Un efort deosebit a fost adus in acest sens, si anume degradarea cadmiului prin mecanisme de tipul legare la tiol sau degradare proteinca, interactia cu metabolismul calciului si degradarea membranei

12

celulare, si intercatii cu metabolismul zincului sau pierderea functiei de protectie. (K. Vig si colab., 2003) In cele mai multe cazuri metalele grele trebuie sa intre in celule pentru a fi toxice. De exmplu, la E.coli cadmiul este acumulat in celule prin intermediul sistemului de transport al zincului (Nies, 1995). La alte bacterii gram pozitive cum ar fi Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus sau Lactobacillus plantarum, cadmiul este in competitie cu transportorii de Mn. Unele din aceste bacterii au mai mare afinitate pentru cadmiu decat mangan. In concluzie, la toate nivelele moleculare mecanismul de acumulare si degradare al cadmiului nu se cunoaste cu exactitate. Numeroase studii au demonstrat ca rezistenta la cadmiu a bacteriilor se bazeaza pe efluxul de cadmiu (K. Vig, 2003). Rezistenta bacteriilor la metale grele se bazeaza pe implicarea proteinelor care sunt responsabile de facilitarea difuziei cationilor (cation difusion facilitator=CDF) si a proteinelor de rezistenta la diviziunea celulara nodulare sau RND. In categoria RND include un grup de sapte proteine intalnite la toate organismele. De exemplu, Cyanobacteriile contin melatonina. Amplificarea locusului smt creste rezistenta la cadmiu a acestor bacterii. Gena melatoninei, smtA este controlata de represorul SmtB care la randul sau e reglat de transportorii de zinc de tip A (Silver S., 1996). 2.3. Efectele toxicitatii cu metale grele Metalele grele si radioactive sunt periculoase pentru viata si sanatatea oamenilor si a mediului. Relatia acestor poluanti persistenti cu procesele fiziologice este putin inteleasa la nivel molecular, iar masurile de decontaminare, insuficiente. Cercetari recente arata relatia acestora cu procesele maligne, bolile pulmonare, alte afectiuni degenerative. Astfel cele mai intalnite boli asociate cu toxicitatea la metale grele sunt: sindromul Alzheimer, Parkinson, autismul si deficiente ale sistemul neuronal auto-imun cum ar fi ALS (scleroza laterala amitrofica), MS (scleroza multipla). Toxicitatea cu metale grele condce de asemenea la boli grave cronice . In programele de detoxificare umana cel mai ades este utilizata vitamina B12 (metilcobalmina).( Popa si colab., 2006)

13

Mercurul: Compusii metilmercurici provoaca anomalii cromozomiale, trec prin placenta din corpul mamei in cel al fatului, afecteaza celulele nervoase ale creierului, provocand grave afectiuni cum ar fii : orbire, deteriorarea coordonarii nervoase, anomalii psihice, moarte. Mecanismul chimic al acestor procese pare a consta in afinitatea mare a mercurului fata de sulful din moleculele proteice, ceea ce afecteaza tranzitul de ioni prin membrane, activitatea enzimatica, activitatea mitocondriilor, etc. Mercurul este singrul metal care se gasete in toate cel trei medii majore - apa, sol, atmosfera. Sursele de mercur sunt naturale si din activitatea umana. Mercurul este folsit mai ales in industria chimica la fabricarea vopselelor, a hirtiei, a unor pesticide si fugnicide, a produselor farmaceutice, a dezinfectantilor. O alta sursa de poluare cu mercur o constitue arderea combustibililor fosili. Anual in urma acestui proces in atmosfera nimeresc circa 5000 tone de mercur. Contaminarea cu mercur are un caracter global si afecteaza atat mediul terestru, cat si cel acvatic. Mediul natural contine o anumita cantitate de mercur la care vietuitoarele s-au adaptat in decursul evolutiei. Dar datorita activitatii umane nivelul global al contaminarii cu mercur este in crestere. Cea mai mare parte a Hg provenit din activitatea umana se degaja in atmosfera, prin migrare si transformare el ajunge in mediul acvatic, unde se acumuleaza mai ales in organisme sub forma unor produsi foarte toxici. Intoxicatiile cu mercur se produc frecvent in urma utilizarii fungicidelor organomercurice. Unii compusi ai mercurului precum sublimatul corziv (HgCl2) este cunoscut de mult timp ca fiind toxic. O toxicitate mare o au compusii organomercurici, ca metilmercurul si dimetilmercurul (CH 3Hg si (CH 3)2Hg.( Cecal A. si colab., 2003) Zincul si Cuprul: Aceste doua metale sunt de importanta vitala pentru cresterea si dezvoltarea normala a omului, animalelor si plantelor. In acelasi timp in legatura cu intensificarea poluarii mediului ambiant continutul acestor metale este limitat in produsele alimentare si apa. Cantitatea de zinc variaza de la 5,0 mg/kg pentru produsele lactate si 40,0

14

mg/kg pentru peste si carne,iar pentru cupru oscileaza de la 0,5 mg/kg pentru produsele lactate si 10,0 mg/kg in peste si legume. Exista ipoteza ca intoxicarea cronica cu zinc si cupru poate provoca dezvoltarea hipertoniei, aterosclerozei si bolilor de inima. Sunt date, care confirma ca afectarea organica a ficatului cu incalcarea structurii morfologice a organului (ciroza ficatului, cancerul primar al ficatului) duce la schimbari mult mai pronuntate ale spectrului microelementelor sangelui si in special a cuprului, zincului, plumbului. Cunoaterea efectelor, adesea toxice, ale metalelor grele prezente la nivel de urme n alimente, apa potabila, probe de mediu, aer, apa, sol, a dus la instituirea unei legislatii specifice si la crearea de programe pentru urmarirea si asigurarea calitatii. ( Popa K., 2007) 2.4. Metode de bioremediere In literatura de specialitate se cunosc mai multe tipuri de bioremediere: 1. Bioremedierea in situ, aplicata cel mai adesea pentru degradarea contaminantilor

din solurile saturate sau din apele freatice. Este o metoda superioara pentru curatarea mediul contaminat deoarece este mai ieftina si folosteste organisme microbiene inofensive cu capacitatea de a degrada substantele chimice. Chemotaxia este importanta pentru studierea bioremedierii in-situ deoarece organismele microbiene cu capacitati chemotactice se pot misca intr-o zona care contine contaminanti. De aceea, prin sporirea capacitatii chemotactice ale celulei, bioremedierea in-situ va deveni o metoda avantajoasa si sigura in degradarea componentilor daunatori . Metodele bioremedierii in-situ (figura 1) prezinta numeroase avantaje cum ar fi: nu necesita escavatii ale solului contaminat fiind astfel mai ieftin de realizat, excavarea solului este minima, deci cantitatea de praf creat este mai mica, si sunt posibile tratamente simultan ale solului si ale apei freatice. Bioremedierea in-situ prezinta si unele dezavantaje metoda este indelungata comparativ cu alte metode de remediere, variatiile sezoniere ale activitatii microbiene conduc

15

la expunerea directa la schimbarile factorilor de mediu care nu pot fi controlati. Microorganismele prezinta un comportament normal numai cand materialul prezent le da voie sa produca nutrientii si energia necesara pentru dezvoltarea mai multor celule. Cand aceste conditii nu sunt favorabile atunci si capacitatea lor de a degrada este redusa.

Fig.1 Reprezentarea schematica a procesului de bioremediere in situ (Brar Sk., 2006)

2. Bioremediere ex situ, necesita escavarea solului contaminat sau pomparea apelor subterane pentru a facilita degradarea microbiana .Aceasta tehnica cuprinde o faza solida si una lichida (figura 2). Faza lichida: Acest tratament implica combinarea apei cu solul contaminat, si apoi degradarea in bioreactor.

16

Faza solida: In aceasta faza solul contaminat este alimentat cu nutrienti,umiditate si oxigen pentru a fi descompus.

Fig.2 Reprezentarea schematica a procesului de bioremediere ex situ (Brar SK., 2006)

2.5. Aplicatii practice ale metodelor de bioremediere cu microorganisme:

Metodele de bioremediere cu microorganisme conduc la beneficii si efecte economice, prin elaborarea de tehnologii aplicabile de mediu (depoluarea, reconversia metalelor grele si radioactive, elaborarea de biotehnologii si materiale biologice si sintetice ce pot fi valorificate comercial ), privind sanatatea publica (eliminarea toxicilor din mediu, indepartarea lor din lanturile trofice ), privind depoluarea mediului. Solutiile microbiologice sunt relativ ieftine si nepoluante. Impactul asupra mediului: indepartarea poluantilor din sol, ape, aer si realizarea unei decontaminari microbiologice nepoluante. Prin indepartarea toxicilor din mediu, are de castigat starea de sanatatea a oamenilor, deoarece lanturile trofice ar fi adus toxicii pana la nivelu acestora. Solutiile propuse in vederea decontaminarii vor aduce beneficii economice, prin aceea ca unii compusi extrem de toxici vor fi recuperati si reutilizati.

17

Impactul social: se va imbunatatii starea de sanatate a populatiei si se reduce riscul de imbolnavire, in special de maladii degenerative ( datorita mercurului, plumbului, metalelor radioactive etc. ). ( Saleem, 2007)

3. PARTEA EXPERIMENTALA

Obiectivul principal al prezentei teze de licenta l-a reprezentat selectarea, caracterizarea si testarea rezistentei la diferite substante poluante (metale grele) a unor bacterii din genurile Pseudomonas sp, Escherichia coli si Agrobacterium tumefaciens. in vederea dezvoltarii de noi metode si tehnologii de remediere, decontaminare, recuperare si are un grad de noutate avansat prin aceea ca prevede decontaminarea pe scara extinsa a unor poluanti majori de tipul metalelor grele si radioactive cu mijloace microbiologice moderne si cu biopolimeri sintetici. Pana in prezent a fost studiata doar implicarea unor bacterii in bioremedierea apelor contaminate si a solurilor, fara a fi indicate masurile concrete de bioacumulare si reutilizare.Datele experimentale prezentate fac parte dintru-un studiu amplu ce implica participarea mai multor echipe de cercetare in scopul dezvoltarii de noi metodologii si tehnologii de decontaminare a solurilor contaminate cu diferite tipuri de poluanti. Obiectivele specifice ale prezentei teze au fost: 1. Cracterizarea microorganismelor selectionate si testarea rezistentei la diferite

18

concentratii de substante poluante (ex:metale grele). 2. Stabilirea conditiilor optime de cultivare si intretinere a microorganismelor selectionate. 3. Stabilirea parametrilor optimi de cultivare a microorganismelor la nivel de laborator 4. Elaborarea modelului experimental de obtinere de biomasa microbiana la nivel de laborator . Astfel, intelegerea comunitatii microbiologice si raspunsul acestora la mediul inconjurator si al poluantilor ne va ajuta la cresterea cunostiintelor privind genetica microorganismelor si capacitatii acetora de a degrada poluantii, conducand astfel la dezvoltarea de noi tehnici de biodegradare pe baza de microorganismne cu costuri foarte reduse ce ofera astfel avantaje semnificative Experimentele s-au realizat in cadrul Centrului de Biotehnologii Microbiene iar tema face parte dintr-un proiect de cercetare exploratorie din domeniile prioritare cu titlul: Membrane microbiologice si polimeri sintetici biocompatibili cu potentiale aplicatii la indepartarea metalelor grele radioactive din mediu (Contract 32-173/01.10.2008) la care centrul este partener.. De asemenea, mentionam ca actualmente se are in vedere izolarea de microorganisme din siturile contaminate,caracterizarea genetica a acestora, dar si testarea capacitatii lor de a rezista pe soluri contaminate.

3.1. MATERIALE SI METODE 3.1.1 Microorganisme testate

Microorganismele testate in cadrul aceste lucrari au fost selectate pe baza datelor din literatura de specialitate cu privire la categoriile de microorganisme utilizate in rpocesele de remediere. Astfel, am uitilizat in testele de laborator bacterii din genul: Pseudomonas putida, tulpinile P5 si P15, si E. coli, tulpini apartinand colectiei de microorganisme a USAMV. De asemenea, am testat o tulpina de Agrobacterium tumefaciens, At10, din colectia laboratorului

19

de biotehnologii microbiene. Caracteristici generale ale microorganismelor luate in studiu: E. coli face parte din familia Enterobacteriaceae, celule in forma de tija care sunt adesea motile prin flagel, Gram negative, dispuse izolat, in perechi sau in gramezi (figura 3), este de obicei vazuta ca unicelulara, de aproximativ 1 m in latime si 2-4 m in lungime. (Radmila Kucerova, 2006)

Fig.3. Celule de E. coli(vizualizare la microscop) marire de 1000X Pseudomonas putida face parte din genul Pseudomonas, familia Pseudomonadaceae, are o forma baciliforma cu unu sau mai multi flageli, Gram negative, avand dimensiunea intre 0.5 - 10 m x 1.5 - 4.0 m, in general sunt dispuse izolat, in gramezi sau sub forma de lanturi. Limitele temperaturii de crestere sunt intre 0 42 0 C, temperatura optima este de 25 35 0 C.( Radmila Kucerova, 2006)

20

Fig. 4. Vizualizare microscopica Pseudomonas sp.

Agrobacterium tumefaciens (fig. 5), este o bacterie de sol apartinand familiei

Rhizobiaceae si este utilizata cu precadere in experimentele de transformare genetica datorita capacitatii sale de a transfera gene la plante. Agrobacterium este mentionata in litaratura ca fiind o bacterie cu rezistenta la diferite categorii de metale grele cum ar fi fierul sau cuprul.

21

Fig.5. Vizualizarea microscopica a bacteriei Agrobacteriumm tumefaciens ( dupa, International Society for Microbial Ecology)

3.1.2. Medii de cultivare si intretinere

Toate tulpinile testate au fost cultivate pe mediul LB in care s-a adaugat concentratii diferite de metal. Martorul a fost reprezentat de microorganism cultivat pe mediu fara metal. Compozitia mediului de intretinere LB a fost urmatoarea: 10 g/l bactotriptona 5 g/l extract de drojdie 10 g/l clorura de sodiu 15 g/l agar pH 7.5

Mod de preparare: toate componentele au fost cantarite cu ajutorul balantei analitice intr-un pahar Erlenmeyer s-au dizolvat pe rand bactotriptona, extractul de drojdie si

22

clorura de sodiu amestecul s-a adus pana la volumul de1000 ml cu apa distilata se aduce solutia la un pH de 7.5 cu o solutie de NAOH 10% ulterior s-a adaugat restul de apa si agarul mediul astfel preparat s-a sterilizat la 110 grade Celsius, timp de 20 minute dupa sterilizarea mediului, acesta s-a repartizat steril in cutii Petri mediul repartizat s-a insamantat steril cu cultura bacteriana

Tabel.2. Concentratia metalelor la care au fost testate bacteriile Concentratii 1 2.5 5 CuSO4 CuSO4 CuSO4 FeSO4 FeSO4 FeSO4 Metale ZnSO4 ZnSO4 ZnSO4 CdCl2 CdCl2 CdCl2 HgCl2 HgCl2 HgCl2

Metalele au fost adaugate in mediu sub forma de saruri ( cupru, fier si zinc) si de cloruri ( cadmiu si mercur), substante cumparate de la Sigma si Roth. Solutiile stoc au fost sterilizate prin filtrare si adaugate steril in mediul de cultura. Dezvoltarea bacteriilor s-a realizat la 32 0C pentru Pseudomonas, 37 0 C pentru E.coli si 28 0 C pentru Agrobacterium timp de 48 ore. Placile au fost apoi analizate prin cuantificarea numarului de bacterii crescute pe medii in functie de tipul de metal adaugat si de concentratie. Astfel, placile in care bacteria s-a dezvoltata la fel ca martorul, prin martor intelegand mediul LB fara adaus de metal, a fost considerat ca fiind dezvoltarea de 100% a bacteriei. Acelasi mediu dar sub forma lichida a fost utilizat pentru obtinerea de biomasa microbiana in vederea testarii acestora pe soluri contaminate cu metale grele. De asemenea, coloniile rezistente au fost selectate si crioconservate la -80 grade.

23

Pentru crioconservarea bacteriilor s-a folosit urmatoarea metoda: Cultura peste noapte a bacteriilor Apoi in tuburile de crioconservare s-a adaugat 1ml Glicerol 100%, steril Peste Glicerol s-a adaugat 1ml cultura bacteriana si s-a omogenizat prin vortexare cateva secunde Dupa ce a avut loc omogenizarea, tuburile de crioconservare au fost tinute in azot lichid timp de 30 50 secunde Stocare la 80 0 C

4. REZULTATE SI DISCUTII

In vederea selectarii si caracterizarii mciroorganismelor rezistente la diferite metale grele am ales ca model experimental testarea a trei microorganisme din genurile Pseudomonas, Escherichia coli, si Agrobacterium. Astfel, microorganismele au fost cultivate pe
medii continand metale grele in vederea selectarii tulpinilor resistente si testarii capacitati de retentie a metalelor luate in studiu.

Pe plan mondial se cauta metode cat mai eficiente care utilizeaza materiale ieftine, cu capacitate de adsorbtie ridicata. Au fost studiate diferite tipuri de sorbenti plecand de la oxizi simpli, amestecuri de oxizi, hidroxizi, oxi-hidroxizi, polimeri sintetici, membrane celulare, alge si plante hidrofite, in vederea dezvoltarii unei metode cat mai optime pentru indepartarea si recuperarea radiocationilor prezenti in apele reziduale.(Kilincarslan,2005) S-a propus utilizarea argilelor din Romania precum si a argilelor modificate cu Fe, Al, Cr in vederea depoluarii apelor radioactive. Argilele polimere precum si cele polimere modificate (stalpuite) au fost testate ca adsorbenti/schimbatori de ioni ieftini in vederea indepartarii radiocationilor din efluentii contaminati.(Wang, 2005) Scopul general al tratarii deseurilor radioactive de activitate medie si mica este de a reduce activitatea lor pana la un nivel corespunzator pentru a putea fi stocate si eliminate.

24

Metalele testate in prezentul studiu experimental au fost adaugate in mediu sub forma de saruri. Astfel, fiecare bacterie a fost cultivata pe medii cu CuSO4 - 0.5 mM, CuSO4 -1 mM, CuSO4 10 mM, FeSO4 0.5 mM, FeSO4 1 mM, FeSO4 10 mM si ZnSO4 tot in concentratii de 0.5, 1 si 10 mM.

4.1. Studiu experimental privind rezistenta la metale grele a tulpinilor de Pseudomonas putida P5 si P15, E.coli la Cu, Fe si Zn.
Testarea rezistentei la diferite metale s-a realizat prin cultivarea microroganismelor pe medii cuprinzand concentratii diferite de saruri ale metalelor cum ar fi CuSO4, FeSO4 si ZnSO4. In tabelul 3 sunt prezentate rezultatele experimentale privind rezistenta la metale a microorganismelor luate in studiu. Tabel.3. Teste preliminare privind rezistenta bacteriilor la metale
Metal CuSO4 mM FeSO4 mM ZnSO4 mM Martor

Bacterii

0,5

10

0,5

10

0,5

10

Pseudomona s P5

+++

+++

+++

++

+++

++

+++

E. coli Pseudomona s P15

+++

+++

+++

+++

++

+++

+++

+++

+++

++

+++

+++

+++

25

Primele date experimentale au aratat o rezistanta la concentratii de metal cuprinsa intre 0.5 si 1mM la toate cele trei bacterii testate. Pseudomonas tulpina P5 si tulpina P15 s-au dezvoltat cel mai bine pe mediile cu Cu si Zn la concentratii de 0,5 si 1 mM iar tulpina E.coli s-a dezvoltat bine pe mediul cu Cu la concentratiile de 0,5 si 1 mM si pe mediul cu Fe la concentratia de 0,5 mM si 1 mM, dar a avut o dezvoltare un pic mai slaba decat celelalte pe mediul cu Zn la concentratia de 0,5 mM. La concentratiile de 10 mM nici una dintre bacterii nu s-a dezvoltat.Bacteriile nu si-au schimbat aspectele morfologice pe variantele de mediu testate. In figurile 6, 7 si 8 se poate observa dezvoltarea bacteriilor pe medii cu: CuSO4 in concentratii de 0.5, 1 si 10 mM; FeSO4 in concentratii de 0.5, 1 si 10 mM; si ZnSO4 in concentratii de 0.5, 1 si 10 mM. Fig.6. Dezvoltarea bacteriei E. coli pe medii cu metale (a-h:dezvoltarea

microorganismului pe concentratii diferite de metal)

a). In stanga se observa dezvoltarea bacteriei E.coli pe mediu L.B.(martorul), iar in partea dreapta bacteria pe mediu L.B. cu 0.5 mM CuSO4.

26

b). In stanga se observa dezvoltarea bacteriei E.coli pe mediu L.B.(martorul), iar in partea dreapta bacteria pe mediu L.B. cu 1 mM CuSO4.

c). In stanga se observa dezvoltarea bacteriei E.coli pe mediu L.B.(martorul), iar in partea dreapta bacteria pe mediu L.B. cu 10 mM CuSO4.

d). In stanga se observa dezvoltarea bacteriei E.coli pe mediu L.B.(martorul), iar in partea

27

dreapta bacteria pe mediu L.B. cu 0.5 mM FeSO4.

e). In stanga se observa dezvoltarea bacteriei E.coli pe mediu L.B.(martorul), iar in partea dreapta bacteria pe mediu L.B. cu 10 mM FeSO4.

f). In stanga se observa dezvoltarea bacteriei E.coli pe mediu L.B.(martorul), iar in partea dreapta bacteria pe mediu L.B. cu 0.5 mM ZnSO4.

28

g). In stanga se observa dezvoltarea bacteriei E.coli pe mediu L.B.(martorul), iar in partea dreapta bacteria pe mediu L.B. cu 1 mM ZnSO4.

h). In stanga se observa dezvoltarea bacteriei E.coli pe mediu L.B.(martorul), iar in partea dreapta bacteria pe mediu L.B. cu 10 mM ZnSO4. Fig.7. Dezvoltarea bacteriei Pseudomonas (P5 ) pe medii cu metale (a-h: dezvoltarea microorganismului pe concentratii diferite de metal)

29

a).In stanga se observa dezvoltarea bacteriei P5 pe mediu L.B.(martorul), iar in partea dreapta bacteria pe mediu L.B. cu 0.5 mM CuSO4.

b).In stanga se observa dezvoltarea bacteriei P5 pe mediu L.B.(martorul), iar in partea dreapta bacteria pe mediu L.B. cu 1 mM CuSO4

30

c).In stanga se observa dezvoltarea bacteriei P5 pe mediu L.B.(martorul), iar in partea dreapta bacteria pe mediu L.B. cu 10 mM CuSO4.

d).In stanga se observa dezvoltarea bacteriei P5 pe mediu L.B.(martorul), iar in partea dreapta bacteria pe mediu L.B. cu 0.5 mM FeSO4.

e).In stanga se observa dezvoltarea bacteriei P5 pe mediu L.B.(martorul), iar in partea dreapta bacteria pe mediu L.B. cu 10 mM FeSO4.

31

f).In stanga se observa dezvoltarea bacteriei P5 pe mediu L.B.(martorul), iar in partea dreapta bacteria pe mediu L.B. cu 0.5 mM. ZnSO4.

g).In stanga se observa dezvoltarea bacteriei P5 pe mediu L.B.(martorul), iar in partea dreapta bacteria pe mediu L.B. cu 1 mM ZnSO4.

32

h).In stanga se observa dezvoltarea bacteriei P5 pe mediu L.B.(martorul), iar in partea dreapta bacteria pe mediu L.B. cu 10 mM ZnSO4. Fig.8. Dezvoltarea bacteriei Pseudomonas (P15 ) pe medii cu metale (a-g: dezvoltarea microorganismului pe concentratii diferite de metal)

a).In stanga se observa dezvoltarea bacteriei P15 pe mediu L.B.(martorul), iar in partea dreapta bacteria pe mediu L.B. cu 0.5 mM ZnSO4.

b).In stanga se observa dezvoltarea bacteriei P15 pe mediu L.B.(martorul), iar in partea dreapta bacteria pe mediu L.B. cu 1 mM ZnSO4.

33

c).In stanga se observa dezvoltarea bacteriei P15 pe mediu L.B.(martorul), iar in partea dreapta bacteria pe mediu L.B. cu 10 mM ZnSO4.

d).In stanga se observa dezvoltarea bacteriei P15 pe mediu L.B.(martorul), iar in partea dreapta bacteria pe mediu L.B. cu 0.5 mM FeSO4.

e).In stanga se observa dezvoltarea bacteriei P15 pe mediu L.B.(martorul), iar in partea

34

dreapta bacteria pe mediu L.B. cu 10 mM FeSO4.

f).In stanga se observa dezvoltarea bacteriei P15 pe mediu L.B.(martorul), iar in partea dreapta bacteria pe mediu L.B. cu 1 mM CuSO4.

g).In stanga se observa dezvoltarea bacteriei P15 pe mediu L.B.(martorul), iar in partea dreapta bacteria pe mediu L.B. cu 10 mM CuSO4.

35

4.2. Studiu experimental privind rezistenta la metale grele a bacteriei Agrobacterium tumefaciens At 10

In tabelul 4 sunt prezentate rezultatele preliminare privind rezistenta la metale grele a bacteriei de sol Agrobacterium.

Tabel 2. Teste preliminare privind rezistenta Agrobacterium T10 la metale grele

Concentratia mM 0.5 Metale 1 2.5 5

ZnSO4

+ + +

CuSO4

+++

+ + +

FeSO4

+++

+++

++

Primele date experimentale au aratat o rezistenta la concentratii de metal cuprinsa intre 0.5 si 2.5 mM la toate cele trei metale testate. Singurul metal la care Agrobacterium a aratat o rezistenta si la concentratia de 5 mM a fost Fe. Bacteria nu si-a schimbat aspectul morfologic pe variantele de mediu testate.

36

In figura 9 se poate observa capacitatela de dezvoltare a bacteriei pe medii cuprinzand concentratii diferite de Cu, Zn si Fe adaugate in mediu sub forma de sulfat. Fig.9. Dezvoltarea bacteriei Agrobacterium pe medii cu metale (a-g: dezvoltarea microorganismului pe concentratii diferite de metal)

a).In stanga se observa dezvoltarea bacteriei Agrobacterium pe mediu L.B.(martorul), iar in partea dreapta bacteria pe mediu L.B. cu 1 mM FeSO4.

b).In stanga se observa dezvoltarea bacteriei Agrobacterium pe mediu L.B.(martorul), iar in partea dreapta bacteria pe mediu L.B. cu 2.5 mM FeSO4.

37

c).In stanga se observa dezvoltarea bacteriei Agrobacterium pe mediu L.B.(martorul), iar in partea dreapta bacteria pe mediu L.B. cu 1 mM ZnSO4. .

d).In stanga se observa dezvoltarea bacteriei Agrobacterium pe mediu L.B.(martorul), iar in partea dreapta bacteria pe mediu L.B. cu 2.5 mM ZnSO4.

e).In stanga se observa dezvoltarea bacteriei Agrobacterium pe mediu L.B.(martorul), iar in partea dreapta bacteria pe mediu L.B. cu 1 mM CuSO4.

38

f).In stanga se observa dezvoltarea bacteriei Agrobacterium pe mediu L.B.(martorul), iar in partea dreapta bacteria pe mediu L.B. cu 2.5 mM CuSO4.

g).In stanga se observa dezvoltarea bacteriei Agrobacterium pe mediu L.B.(martorul), iar in partea dreapta bacteria pe mediu L.B. cu 5 mM CuSO4.

4.3. Studiu experimental privind rezistenta microorganismelor la cadmiu in concentratie de 1mM, 2.5 mM si 5 mM.

In tabelul 5 se poate observa rezistenta bacteriilor pe medii cuprinzand concentratii diferite de cadmiu adaugat sub forma de clorura.

39

Tabel 5. Teste preliminare privind rezistenta bacteriilor la Cadmiu

Cadmiu 1 Bacterii mM mM 2.5 mM 5 Martor

Pseudomonas P5 + + + + + ++++

E. coli +++ +

Pseudomonas P 15 ++ + + + ++++

Primele date experimentale au aratat o rezistenta la toate concentratiile pentru Pseudomonas tulpina P5 si tulpina P15 .Bacteria E. coli nu a rezistat la nici una din cele trei

40

concentratii .Bacteriile nu si-au schimbat aspectele morfologice pe variantele de mediu testate.

In figurile 10, 11 si 12 se poate vizualiza dezvoltarea bacteriilor pe medii cuprinzand concentratii diferite cadmiu. Fig.10. Dezvoltarea bacteriei E. coli pe medii cu cadmiu

In coltul din stanga sus se observa dezvoltarea bacteriei pe mediu L.B. , in coltul din dreapta sus se afla bacteria pe mediu L.B. cu 1 mM cadmiu, in coltul din stanga jos se afla bacteria pe mediu L.B. cu 5 mM cadmiu, iar in coltul din dreapta jos se afla bacteria pe mediu L.B. cu 2.5mM cadmiu. Fig.11. Dezvoltarea bacteriei Pseudomonas(P5) pe medii cu cadmiu

41

In coltul din stanga sus se observa dezvoltarea bacteriei pe mediu L.B. , in coltul din dreapta sus se afla bacteria pe mediu L.B. cu 1 mM cadmiu, in coltul din stanga jos se afla bacteria pe mediu L.B. cu 5 mM cadmiu, iar in coltul din dreapta jos se afla bacteria pe mediu L.B. cu 2.5mM cadmiu.

Fig.12. Dezvoltarea bacteriei Pseudomonas(P15) pe medii cu cadmiu

42

In coltul din stanga sus se observa dezvoltarea bacteriei pe mediu L.B. , in coltul din dreapta sus se afla bacteria pe mediu L.B. cu 1 mM cadmiu, in coltul din stanga jos se afla bacteria pe mediu L.B. cu 5 mM cadmiu, iar in coltul din dreapta jos se afla bacteria pe mediu L.B. cu 2.5mM cadmiu.

4.4. Studiu experimental privind rezistenta microorganismelor la mercur in concentratie de 0.5mM, 1 mM si 2.5mM.

In tabelul 6 se poate observa rezistenta bacteriilor pe medii cuprinzand concentratii diferite de mercur adaugat sub forma de clorura.

Tabel 6. Teste preliminare privind rezistenta bacteriilor la Mercur

43

Mercur 0.5 Bacterii Pseudomonas P5 mM mM 1 mM 2.5 Martor

+++

E. coli Pseudomonas P 15 Agrobacteriu m At 10

++ +

+ -

+++ +++

Primele date experimentale au aratat rezistenta doar pentru concentratia de 0.5 mM a mercurului a speciei Pseudomonas ( P5 si P15 ).Celelalte bacterii E. coli si Agrobacterium nu au rezistat la nici una din concentratii. Se observa ca bacteriile sunt sensibile la concentratii chiar foarte scazute de mercur. Probabil ca mediul este destul de toxic si inhiba dezvoltarea bacteriei. In acest sens, se impune izolarea bacteriilor exact din situri ce contin mercur in vederea caracterizarii si testarii acestora pe medii selective cu mercur.

In figurile 13, 14, 15 si 16 se poate vizualiza dezvoltarea bacteriilor pe medii cuprinzand concentratii diferite de mercur. Fig.13. Dezvoltarea bacteriei Agrobacterium pe medii cu mercur (a-c: dezvoltarea

44

microorganismului pe concentratii diferite de mercur)

a).In stanga se observa dezvoltarea bacteriei Agrobacterium pe mediu L.B.(martorul), iar in partea dreapta bacteria pe mediu L.B. cu 0.5 mM HgCl2.

b).In stanga se observa dezvoltarea bacteriei Agrobacterium pe mediu L.B.(martorul), iar in

45

partea dreapta bacteria pe mediu L.B. cu 1 mM HgCl2.

c).In stanga se observa dezvoltarea bacteriei Agrobacterium pe mediu L.B.(martorul), iar in partea dreapta bacteria pe mediu L.B. cu 2.5 mM HgCl2.

Fig.14. Dezvoltarea bacteriei Pseudomonas (P15) pe medii cu mercur (a-c: dezvoltarea microorganismului pe concentratii diferite de mercur)

46

a).In stanga se observa dezvoltarea bacteriei P15 pe mediu L.B.(martorul), iar in partea dreapta bacteria pe mediu L.B. cu 0.5 mM HgCl2.

b).In stanga se observa dezvoltarea bacteriei P15 pe mediu L.B.(martorul), iar in partea dreapta bacteria pe mediu L.B. cu 1 mM HgCl2.

47

c).In stanga se observa dezvoltarea bacteriei P15 pe mediu L.B.(martorul), iar in partea dreapta bacteria pe mediu L.B. cu 2.5 mM HgCl2. Fig.15. Dezvoltarea bacteriei Pseudomonas (P5) pe medii cu mercur (a-c: dezvoltarea microorganismului pe concentratii diferite de mercur)

a).In stanga se observa dezvoltarea bacteriei P5 pe mediu L.B.(martorul), iar in partea dreapta bacteria pe mediu L.B. cu 0.5 mM HgCl2.

48

b).In stanga se observa dezvoltarea bacteriei P5 pe mediu L.B.(martorul), iar in partea dreapta bacteria pe mediu L.B. cu 1 mM HgCl2.

c).In stanga se observa dezvoltarea bacteriei P5 pe mediu L.B.(martorul), iar in partea dreapta bacteria pe mediu L.B. cu 2.5 mM HgCl2.

49

Fig.16. Dezvoltarea bacteriei E. coli pe medii cu mercur (a-b: dezvoltarea microorganismului pe concentratii diferite de mercur)

a).In stanga se observa dezvoltarea bacteriei E. coli pe mediu L.B.(martorul), iar in partea dreapta bacteria pe mediu L.B. cu 0.5 mM HgCl2.

b).In stanga se observa dezvoltarea bacteriei E. coli pe mediu L.B.(martorul), iar in partea dreapta bacteria pe mediu L.B. cu 1 mM HgCl2.

50

CONCLUZII

Prezentul studiu a urmarit pe de o parte selectarea, caracterizarea si testarea rezistentei la metale a micororganismelor din genurile Pseudomonas, E. coli si Agrobacterium in vederea dezvoltarii de noi metode de decontaminare cu ajurorul acestora a solurilor din siturile contaminate cu metale grele Astfel sunt prezentate principalele microoganisme utilizate in studiile de detozifiere a solurilor contaminate cu compusi toxici (Pseudomonas, Escherichia coli), dar si categoriile de metale cele mai studiate. Rezultatele experimentale preliminare sunt promitatoare si urmeaza a fi studiate in etapele urmatoare a proiectului de cercetare. Astfel, primele date experimentale prezentate aici demonstreaza capacitatea microorganismelor de a rezista la concentratii destul de ridicate de metale. De completat Bioremedierea reprezinta o tehnica de curatare a poluantilor prin intensificarea proceselor de biodegradare care au loc in natura. Astfel, intelegerea comunitatii microbiologice si raspunsul acestora la mediul inconjurator si al poluantilor ne va ajuta la cresterea cunostiintelor privind genetica microorganismelor si capacitatii acetora de a degrada poluantii, conducand astfel la dezvoltarea de noi tehnici de biodegradare pe baza de microorganismne cu costuri foarte reduse ce ofera astfel avantaje semnificative.

51

Bibliografie selectiva

1.

Alexander M., Biodegradation and Bioremediation, Academic Press, San Diego New

York Boston London Tokyo Toronto, 1994. 2. Anne Spain , Comunicated by : Dr. Elizabeth Alm Implications of Microbial Heavy

Metal Tolerance in the Environment .Reviews in Undergraduate Research. 2 (1-6), 2003. 3. Beard, S.J., Hashim, R., Hernandez, J., Hughes, M., and Poole R.K. (1997). Zinc (II)

tolerance in Escherichia coli K-12: Evidence that the zntA gene (o732) encodes a cation transport ATPase. Molecular Microbiology 25(5): 883-891 4. Brar SK, Verma M., Surampalli RY, Misra K., Tyagi RD, Meunier N, Blais JF-

Bioremediation of hazardous wastes : a review. Pract Periodical Hazard, Toxic Radioactive Waste Manag 2006, 10: 59-72. 5. Cecal, A., Popa, K. Radioactive wastes, p. 107122. capitol in: Waste Management,

(editori: J. Pretty, V. Oros, C. Draghici), ed. Academiei Romane, Bucuresti, 2003.

52

6.

Drochioiu, G., Damoc, E. N., Przybylski, M. Talanta, 69, 556-564, 2006.

7. Gupta, S.D., Lee, B., Camakaris, J., and Wu, H.C. (1995). Identification of cutC and cutF (nlpE) genes involved in copper tolerance in Escherichia coli. J Bacteriol 177(15): 42074215. 8. Haferburg, G., Kothe, E. Microbes and metals: interactions in the environment. J. Basic

Microbiol., 47, 453-467, 2007. 9. H. Seidel, C. Loser, A. Zehnsdorf, P. Hoffman, R. Schmerold Bioremediation Process

for Sediments Contaminated by Heavy Metals: Feasibility Study on a Pilot Scale Environmental Science Technology. 38: 1582-1588. (2004) 10. K. Vig, M. Megharaj, N. Sethunathan, R. Naidu Bioavailability and toxicity of cadmium to microorganisms and their activities in soil: a review. Advances in Environmental Research 8: 121-135 (2003). 11. Kilincarslan, A., Akyil, S. J. Radioanal. Nucl.Chem., 264(3) 541-544, 2005. 12. Lawrence, J.G. (2000). Clustering of antibiotic resistance genes: beyond the selfish operon. ASM News 66(5): 281-286. 13. Lloyd, Jonathan R. 2002. Bioremediation of metals; the application of micro- organisms that make and break minerals. Microbiology Today 29: 67-69. 14. Nies, D.H. (1999). Microbial heavy metal resistance. Appl Microbiol Biotechnol 51: 730-750. 15. Nies, D.H., and Silver, S. (1995). Ion efflux systems involved in bacterial metal resistances. Journal of Industrial Microbiology 14: 186-199. 16. Neagoe A., V. Iordache, and H. Bergmann, Experimental basses for bioremediation of soils contaminated with metals, 2004 17. Popa, K. M.N. Palamaru, A.R. Iordan, Humelnicu, D., Drochioiu, G. Cecal, Al. J. Environ. Health Studies, 42(1), 1-9, 2006. 18. Popa, K., Murariu, M., Schlosser, G., Molnar, R., Cecal, A., Drochioiu, G. Isot. Environ. Health Stud., 2, 105-116, 2007. 19. Radmila Kucerova, VSB-Technical university of Ostrava, APPLICATION OF

53

PSEUDOMONAS PUTIDA AND RHODOCOCCUS SP. BYBIODEGRADATION 20. 21. Saleem, M. Hussain, S., Arshad, M. Promoting biotechnology. Dawn. Rabi-ul-Awwal Sasikumar C. Sheela and Taniya Papinazath Enviromental Management

20, 1428, April 09, 2007. Bioremediation of Polluted Environment in Martin J. Bunch, V. Madhaa Suresh and T. Vasantha Kumaran,eds,Proceedings of the Third International Conference on Environment and Health,Chennai, India. Department of Geography,University of Madras and Faculty of Environmental Studies, York University: 465-469 (2003). 22. Selenska-Pobell, S.,Kampf, G., Fleming K.,Radeva, G. si Satchanska, G. Bacterial diversity in soil samples from two uranium mining waste piles as determined by rep-APD, RISA and 16S rDNA retrieval. Antonie van Leeuwenhoek, 79, 149-161. (2001). 23. 43-50. 24. 25. Silver S., 1996. Bacterial resistance to toxic metal ions. Gene, 179(1): 9-10. Toti M., M. Dumitru, Anca Rovena Voiculescu, Gabriela Mihalache, Carolina Shakoori, A. R., and Muneer, B., 2002. Copper resistant bacteria from industrial effluents and their role in remediation of heavy metals in waste water. Folia Microbiol., 47:

Constantin, M. Mihalache, 2003, "Metodologia de remediere a solurilor poluate cu titei cu ajutorul microorganismelor specifice slectionate din microflora autohtona", Editura GNP MINISCHOOL, Bucuresti. 26. Wang, X. K., Chen, C. L., Zhan, X., Tan, X. L., Hu, W. P. Radiochim. Acta, 93, 273276, 2005. 27.lucrare Biometac

54