EXTRACCION DE RNA DE FRUTO DE TOMATE (para northern)

Referencia: Concert Plant RNA Reagent

No. Catálogo 12322-012 Invitrogen Life Technologies

Preparación de la muestra.

• Moler el tejido en nitrógeno líquido hasta obtener un polvo fino (guardar a –70 °C).
• Enfriar tubos estériles en nitrógeno liquido antes de agregar el tejido.

Procedimiento de extracción.

• Pesar 0.5 gr de tejido molido congelado en los tubos previamente enfriados con
nitrógeno y adicionar 2.5 ml del reactivo “Plant RNA” frío y mezclar con vortex.
• Incubar 5 min a temperatura ambiente (T.A) y colocar el tubo horizontalmente.
• Centrifugar 2 min a 12,000 g a T.A y transferir el sobrenadante a otro tubo estéril.
• Agregar 0.5 ml de NaCl 5M al sobrenadante recuperado y mezclar brevemente.
• Adicionar 1.5 ml de cloroformo y mezclar por inmersión repetidas veces.
• Centrifugar a 4 °C/10 min/12,000 g y transferir la fase acuosa a 3 tubos eppendorff con
0.8 ml c/u.
• Agregar a cada tubo eppendorff 0.8 ml de isopropanol frío, mezclar y reposar 10min.
• Centrifugar a 4 °C/10 min/12,000 g.
• Eliminar sobrenadante (antes checar que no haya restos de cloroformo en la parte
inferior, si es así, eliminarlo con pipieta) por decantación y agregar 0.4 ml de etanol al
75% a T.A.
• Vortexear brevemente.
• Centrifugar a 4 °C/3 min/12,000 g y decantar el etanol con mucho cuidado para no
eliminar la pastilla.
• Centrifugar brevemente (un pulso) para colectar el etanol residual y removerlo con una
pipeta.
• Secar sobre la mesa los tres tubos durante 15 min o más.
• Resuspender la pastilla de primer tubo en 20 μl de agua (de ampolleta) y transferirlos al
segundo y tercer tubo para resuspender las otras dos pastillas.
• Lavar con 20 μl el primer y segundo tubo para finalmente transferirlos al tercero.
• Alicuotar 20 μl de RNA en el segundo y tercer tubo.
• Guardar las alícuotas a –70 °C (marcar con alguna etiqueta la alícuota que estará en uso
y la otra permanecerá sin descongelarse hasta su posterior uso).

Nota importante. Lavar todo el material empleado para la extracción con NaOH 0.05N
durante 1 o 2 horas, escurrir y esterilizar en autoclave a 121 °C/15 lb/15 min. Los tubos
para centrífuga de fondo redondeado se esterilizan destapados (tapas por separado) dentro
de una bolsa para evitar que se colapsen.

Nota . Es posible que las pastilla de RNA no se observe pero no indica que no haya.
 PROCEDIMIENTOS PARA REALIZAR NORTHERN

Referencia: Amersham Biosciences

Rediprime II. Random Prime Labelling System
No. Catálogo RPN1633

Día 1.
Contar con RNA de buena calidad previamente observado en un gel de agarosa al 1% (ver
foto).

Nota. Se deben de observar los RNAs ribosomales como dos bandas bien definidas, así
como se muestra en la foto. Esto indica que el RNA no esta degradado.

Día 2.
Preparación del gel desnaturalizante al 1% para correr el RNA
1.2 gr de agarosa pura
86.6 ml de agua desionizada ESTERIL y calentar hasta disolver.
Posteriormente enfriar lo suficiente (60 °C)
Adicionar 12 ml del buffer MOPS 10X y,
21.4 ml de formaldehído, mezclando a homogeneidad y vertiendo en porta gel.

Preparación de muestras de RNA para su corrida en gel desnaturalizante

10 μl de formamida
3.5 μl de formaldehido
2 μl de buffer MOPS 10X
1 μl de buffer de carga por cada 2.5 μl de RNA en la muestra
1 μl de EtBr por muestra
5-10 μl de RNA dependiendo de cómo se vió su concentración en el gel no
desnaturalizante
Calentar la muestra por 5 min a 65 °C y cargar en el gel desnaturalizante

Nota. El buffer de corrida es MOPS 1X ESTÉRIL.

NOTA IMPORTANTE. Al cargar la muestra en el pozo hacerlo con mucho cuidado

evitando sacar la punta inmediatamente, enjuagando ligeramente la punta con un poco de
buffer del mismo pozo. El gel se puede correr a 60-70 Volts por alrededor de una hora.

Transferencia del RNA del gel a una membrana de nylon

Se hace mediante capilaridad natural usando SSC al 10% para este fin.
La transferencia se realiza toda la noche a T. A.
Concluida la transferencia se entrecruza el RNA a la membrana con U.V en el modo
“optimal crosslink” dos veces por cada lado.
Nota. Todos los materiales que vayan a estar en contacto con el RNA se deben lavar por al
menos una hora en NaOH 0.05N.

Día 3.
Marcaje de la sonda

• Se tiene que contar con la sonda (el gen) purificada por “gene clean”
• Dilución de la sonda. Se toman 4 μl de la sonda purificada y adicionan 44.5 μl de agua
estéril (de ampolleta de preferencia).
• Desnaturalizar la sonda diluida a 95 °C por 5 min y se coloca en hielo por 5 min.
• Dar un pulso en la microfuga para bajar lo condensado.
• Se agrega todo al tubo de “Random Prime” SIN MEZCLAR.
• Se lleva el tubo al cuarto de radiactividad y se agregan 1.5 μl de marca NUEVA (32P
dCTP) previamente descongelada.
• Se lleva al cuarto de 37 °C en un contenedor de plomo para radiactividad y se incuba
de 0.5 a 1 hora.
• Desnaturalizar la sonda marcada entre 95 y 100°C por 5 min (aflojando ligeramente la
tapa del tubo)
• Colocar en hielo por 5 min
• Dar un pulso en microfuga.

Prehibridación de la membrana

• En tubos de prehibridación agregar 0.125 ml de buffer de prehibridación por cada cm2

de membrana
• Incubar a 70 °C en un horno giratorio por al menos 15 min
• Meter la membrana al tubo (la membrana siempre se mete cuando el líquido está
caliente).
• Prehibridar al menos 15 min.

Nota. La prehibridación se realiza al momento de incubar la sonda a 37 °C.

Hibridación

• La sonda radiactiva desnaturalizada se pone en contacto con el buffer de prehibridación

CALIENTE SIN que esta tenga CONTACTO con la membrana directamente.
• Mezclar perfectamente la sonda en el líquido.
• Hibridar a 65 °C por toda la noche en agitación.

Día 4.
Lavados de la membrana

Al siguiente día lavar la membrana en:

SSC 2X con 0.1% de SDS por 20 min a T.A en agitacion.
SSC 1X con 0.1% de SDS por 15 min a 65 °C en agitación.
SSC 0.1X con 0.1% de SDS por 15 min a 65 °C en agitación.

Nota. En ningún momento la membrana se debe de secar porque se pega la radiactividad

inespecífica y es muy difícil removerla.

Exposición

• Se coloca la membrana lavada en una bolsa de plástico

• Se mete en un casete de exposición a T.A.
• En el cuarto obscuro colocar una película fotográfica sobre la membrana y cerrar de
nuevo el casete de exposición.
• Exponer por cuatro horas a –80 °C y revelar
• Si no se observa nada exponer por 20 horas (dependiendo de las cuentas).