Crescimento mirobiano

Curva de crescimento

(cultura descontínua)

Quando uma cultura microbiana desenvolve-se em um sistema fechado,

pode-se confeccionar uma curva de crescimento. Esta pode ser dividida em
diferentes etapas: lag, log, estacionária e de declínio.

Curva de Crescimento Padrão, em um sistema fechado

Lag: período variável, onde ainda não há um aumento significativo da

população. Ao contrário, é um período onde o número de organismos
permanece praticamente inalterado. Esta fase é apenas observada quando o
inóculo inicial é proveniente de culturas mais antigas. A fase lag ocorre
porque as células de fase estacionária encontram-se depletadas de várias
coenzimas essenciais e/ou outros constituintes celulares necessários à
absorção dos nutrientes presentes no meio.

A fase lag também é observada quando as células sofrem traumas físicos

(choque térmico, radiações) ou químicos (produtos tóxicos), ou quando são
transferidas de um meio rico para outro de composição mais pobre, devido a
necessidade de síntese de várias enzimas. Assim, durante este período
observa-se um aumento na quantidade de proteínas, no peso seco e no
tamanho celular.

Log ou exponencial: nesta etapa, as células estão plenamente adaptadas,

absorvendo os nutrientes, sintetizando seus constituintes, crescendo e se
duplicando. Deve ser levado em conta também que neste momento, a
quantidade de produtos finais de metabolismo ainda é pequena. A taxa de
crescimento exponencial é variável, de acordo com o tempo de geração do
organismo em questão. Geralmente, procariotos crescem mais rapidamente
que eucariotos. Nesta fase são realizadas as medidas de tempo de geração.
Geralmente, ao final da fase log, as bactérias passam a apresentar fenótipos
novos, decorrentes do processo de comunicação denominado "quorum
sensing".

Estacionária: Nesta fase, os nutrientes estão escasseando e os produtos

tóxicos estão tornando-se mais abundantes. Nesta etapa não há um
crescimento líquido da população, ou seja, o número de células que se divide
é equivalente ao número de células que morrem. Na fase estacionária que
são sintetizados vários metabólitos secundários, que incluem antibióticos e
algumas enzimas. Nesta etapa ocorre também a esporulação das bactérias.
Foram detectados alguns genes (sur) que são necessários à sobrevivência
das células na fase estacionária. Além destes, existem outros genes (fatores
σ alternativos da RNA polimerase, proteínas protetoras contra dano
oxidativo).

Declínio: A maioria das células está em processo de morte, embora outras

ainda estejam se dividindo. A contagem total permanece relativamente
constante, enquanto a de viáveis cai lentamente. Em alguns casos há a lise
celular. Culturas descontínuas tendem a sofrer mutações que podem
repercutir na população como um todo. As próprias condições ambientais
tendem a promover variações de caráter fenotípico (reversível) nas culturas.

Efeito dos fatores ambientais no crescimento

O crescimento dos microrganismos é grandemente afetado pelas condições

físicas e químicas do ambiente onde se encontram, sendo que estas podem
influir positivamente ou negativamente de acordo com o microrganismo em
questão.

Temperatura: Corresponde a um dos principais fatores ambientais que

influenciam o desenvolvimento bacteriano. A medida que há um aumento da
temperatura, as reações químicas e enzimáticas na célula tendem a tornar-
se mais rápidas, acelerando a taxa de crescimento. Entretanto, em
determinadas temperaturas inicia-se o processo de desnaturação de
proteínas e ácidos nucléicos, inviabilizando a sobrevivência celular.
Assim, todos os microrganismos apresentam uma faixa de temperatura onde
desenvolvem-se plenamente. Nesta faixa de temperatura podemos
determinar as temperaturas mínima, ótima e máxima (temperaturas
cardeais), para cada microrganismo. A temperatura máxima provavelmente
reflete os processos de desnaturação mencionados acima, enquanto os
fatores que determinam a temperatura mínima ainda não são bem
conhecidos, embora certamente a fluidez da membrana seja um dos fatores
determinantes destes níveis térmicos baixos.
 Temperaturas cardeais dos microrganismos
(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

Dentre os diferentes microrganismos observa-se uma ampla variedade de

faixas de temperatura, onde para alguns o ótimo encontra-se entre 5 e 10°C,
enquanto para outros é de 90 a 100°C. Assim, os microrganismos podem ser
classificados em quatro grupos, de acordo com os ótimos de temperatura:
psicrófilos (0 a 20°C, ótimo de ≈ 15°C - Flavobacterium), mesófilos (12 a
45°C, 37°C - E. coli), termófilos (42 a 68°C, 62°C - Thermococcus), e
hipertermófilos (80 a 113°C, 105°C - Pyrodictium brockii).

Tipos de bactérias em relação à temperatura

(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

Psicrófilos: os ambientes frios são predominantes na Terra (oceanos, polos,

solos) entretanto este grupo (bactérias, fungos e algas) é muito pouco
estudado. Destes, os mais conhecidos são as algas que crescem sob o gelo
ou em geleiras (Chlamydomonas nivalis), dando coloração vermelha.
Há os microrganismos psicrotolerantes que são aqueles cujo ótimo
encontra-se entre 20 e 40°C e que sobrevivem a 0°C. São um grupo amplo
(bactérias, fungos, algas e protozoários) que podem contaminar alimentos e
outros substratos refrigerados.

Mesófilos: crescem numa faixa de 20 a 40°C, com um ótimo em torno de

37°C, sendo os principais microrganismos encontrados em animais de
sangue quente.

Termófilos e Hipertermófilos: ótimos de 45 e ≥ 80°C, respectivamente.

São encontrados nos solos, silagem, fontes termais e no fundo oceânico, em
fontes. Geralmente são procariotos, sendo as Archaea as mais resistentes,
apresentando enzimas e proteínas termoestáveis, provavelmente devido à
substituição de aminoácidos, conferindo um novo folding. Têm também uma
maior concentração de ácidos graxos saturados na MC. As Archaea não tem
ácidos graxos na MC, mas sim hidrocarbonetos de cadeias com diferentes
comprimentos, compostas por unidades repetitivas de 5 C (fitano), ligadas a
glicerol fosfato, por ligação éter.

Os termófilos e hipertermófilos tem grande interesse biotecnológico porque

tendem a fazer os processo mais rapidamente, com menor contaminação por
outros microrganismos e possuem enzimas mais termoestáveis.

pH: Os ambientes naturais tem uma faixa de pH de 5 a 9, o que comporta o

crescimento de diferentes tipos de microrganismos. Bactérias - faixa entre 7,
com algumas acidófilas (Thiobacillus de 0,5 a 6,0 com ótimo entre 2 e 3,5) e
outras alcalifílicas (Bacillus e Archaea). Fungos - tendem a ser mais acidófilos
que as bactérias (pH <5).

Distribuição de alguns microrgansmos, de acordo com o pH

(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)
Tensão de O2: Extremamente importante no desenvolvimento, uma vez que
os microrganismos comportam-se de forma bastante distinta, sendo
classificados como aeróbios, anaeróbios facultativos, anaeróbios estritos,
anaeróbios aerotolerantes e microaerófilos (requerem concentrações baixas
de O2).

As condições de anaerobiose podem ser conseguidas pelo uso de agentes

redutores nos meios de cultura, tais como o tioglicolato de sódio, que reage
com o oxigênio, formando água; pela remoção mecânica do oxigênio, sendo
substituído por nitrogênio e CO2; pelo uso de sistemas comerciais do tipo
"GasPak", que gera hidrogênio e CO2 com um catalisador de paládio.
Adiciona-se água ao sistema, a qual gera hidrogênio, que reage com o
oxigênio na superfície do catalisador, formando água; ou ainda pelo uso de
"glove box" anaeróbias ou a mesa inoculadora desenvolvida pelo VPI.

Classes de organismos, em relação à tensão de oxigênio

(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

Água: Essencial a qualquer microrganismo, embora as necessidades sejam

variadas. É o solvente universal, mas sua disponibilidade é variável (soluções
com açúcares ou sais têm menos água disponível).

Aw: pressão do vapor em equilíbrio com a solução/ pv da água, variando de 0

a 1. Os organismos que vivem em ambientes onde a disponibilidade de água
é baixa desenvolvem mecanismos para extrair água do ambiente, pelo
aumento da concentração de solutos internos, seja bombeando íons para o
interior ou sintetizando ou concentrando solutos orgânicos (solutos
compatíveis), que podem ser açucares, álcoois ou aminoácidos (prolina,
betaine, glicerol).

Pressão osmótica: Fator extremamente importante, principalmente a partir

do maior conhecimento sobre as Archaea, visto que vários membros deste
domínio requerem altas concentrações de sais para seu desenvolvimento.
 Classes de organismos, em relação à salinidade
(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

Fatores adicionais:

Fonte luminosa para fototróficos autotróficos.

Pressão atmosférica, para aqueles que vivem em profundidades.

Medidas do crescimento microbiano

O crescimento dos microrganismos pode ser mensurado por diferentes

técnicas, tais como pelo acompanhamento da variação no número ou peso
de células, por exemplo. Dentre as diferentes técnicas utilizadas,
descreveremos alguns exemplos.

Contagem total de células: esta metodologia envolve a contagem direta

das células em um microscópio, seja de amostras fixadas (e coradas) ou
analisadas a fresco, (sendo aplicados cerca de 10 µl da suspensão, na
maioria dos casos), utilizando-se câmaras de contagem. A contagem direta é
uma técnica rápida, mas tem como principais limitações a impossibilidade de
distinção entre células vivas e mortas (o que pode ser contornado pelo uso
de corantes vitais, para leveduras) e contagens errôneas, devido às
pequenas dimensões de algumas células, ou pela formação de agregados
celulares.
Em preparações não coradas, deve-se utilizar microscópio de contraste de
fase, o qual deve ser empregado apenas quando as células não estão muito
diluídas (<106 células/ml).
 Exemplo ilustrando o procedimento de contagem direta
(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

Há também os contadores eletrônicos (do tipo Coulter) usados em

hematologia, que podem ser empregados na contagem de células
microbianas. Em determinadas situações, por exemplo quando se requer
apenas uma estimativa da quantidade de microrganismos, pode-se empregar
a contagem proporcional, que corresponde a uma análise comparativa das
culturas com suspensões padrão. Como exemplo de uma suspensão padrão
podemos citar a escala de MacFarland, que corresponde a uma série de
tubos contendo uma solução de BaSO4 em diferentes concentrações,
apresentando assim, graus de turvação distintos. Desta forma, comparando-
se a turvação da cultura em estudo com os tubos de MacFarland, pode-se
obter uma estimativa do número de células presentes na amostra.

Contagem de viáveis: Procedimento também conhecido como contagem

em placa, que estima o número de células viáveis (isto é, capazes de se
reproduzir) em uma amostra. Esta metodologia envolve a coleta de alíquotas
de uma cultura microbiana em diferentes tempos de crescimento, as quais
são então inoculadas em meio sólido. Após a incubação dos meios,
geralmente por uma noite, o número de colônias é contado. Como uma
colônia normalmente é originada a partir de um organismo, o total de
colônias que se desenvolvem no meio corresponde ao número de células
viáveis presentes na alíquota analisada. Esta técnica deve sempre realizada
empregando-se várias diluições (100 a 104 células) das amostras. A
contagem de viáveis pode ser feita pela semeadura em superfície ou em
profundidade ("pour plate"). Geralmente o volume a ser inoculado não deve
ultrapassar 0,1 ml, para evitar a confluência das colônias. Se a técnica de
semeadura em profundidade for utilizada, pode-se inocular de 0,1 a 1,0 ml
de células. Esta técnica é precisa quando o número de colônias (ou placas de
lise, no caso de partículas virais ) contadas situa-se entre 30 e 300 e quando
as condições culturais e ambientais estão adequadas para os microrganismos
analisados. Este tipo de contagem está sujeito a grandes erros (agregados,
duas células próximas, originando uma colônia), que podem ser minimizados
pela realização de triplicatas para cada diluição. Esta metodologia é
amplamente utilizada, exibindo elevada sensibilidade, detectando baixos
números de células e permitindo também a contagem de diferentes tipos de
microrganismos, pelo emprego de meios seletivos (meios que favorecem o
crescimento de um determinado tipo ou grupo de organismo) e/ou seletivos
e diferenciais (meios que além de favorecerem o desenvolvimento de um
tipo ou grupo de organismo, também permite sua distinção, a partir de
alguma característica fenotípica). Também podem ser usadas membranas
filtrantes, onde os líquidos são filtrados e as membranas colocadas
diretamente sobre os meios de cultura.

Técnica de contagem de viáveis

(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

Massa de células: pode ser determinada a partir da estimativa do peso

seco ou do peso úmido de uma cultura. Este tipo de procedimento é
realizado quando não é necessário determinar o número preciso de
microrganismos presentes.

Peso seco: Muito utilizado na quantificação de fungos, onde o micélio é

retirado da cultura, lavado e transferido para um frasco e submetido à
secagem. Realizam-se então sucessivas pesagens, até o momento onde não
observa-se mais variações. Este procedimento pode também ser realizado
centrifugando-se a cultura e pesando o sedimento, ou então secando-o (100
- 150°C/16 horas) e depois pesando-o.

Turbidimetria: quantificação em espectrofotômetro ou colorímetro a 660

nm, uma vez que neste comprimento de onda, a cor geralmente parda dos
meios de cultura não interfere com os resultados. Nestes comprimentos, a
absorção de luz por componentes celulares corados é desprezível, mas, se
necessário, outros comprimentos de onda podem ser usados. Tal
metodologia requer a confecção de uma curva padrão. Embora a análise
turbidimétrica seja menos sensível, é de rápida e fácil execução, não
destruindo a amostra. Entretanto, não permite a determinação de células
viáveis.

Análises químicas: A partir da quantificação de proteínas ou de nitrogênio,

ou por meio da análise de diferentes atividades metabólicas.

Número Mais Provável (NMP): Amplamente utilizado em laboratórios de

microbiologia de alimentos ou ambiental, na quantificação de
microrganismos em água, leite e outros produtos. Esta metodologia é
basicamente utilizada para a pesquisa de coliformes totais e coliformes
fecais, que são microrganismos indicadores de poluição fecal, o que pode ter
como consequência a presença de outros organismos, tais como protozoários
e vírus. Esta técnica foi desenvolvida após análises estatísticas complexas. A
determinação do NMP é realizada inoculando-se 3 séries de 5 tubos, com 10,
1 e 0,1 ml da água ou do produto homogeneizado em solução salina, em
meios seletivos para coliformes totais contendo tubos de Durham invertidos
em seu interior. Estes são incubados por 48 hs/37°C sendo então analisados
quanto ao crescimento e à presença de gás no interior dos tubos de Durham.
Tal resultado é considerado como positivo para a presença de coliformes
totais. Amostras dos tubos positivos são então repicados para caldos
seletivos para coliforme fecais, também contendo tubos de Durham, os quais
são incubados por mais 24 ou 48 hs a 42°C. De todos os tubos positivos faz-
se uma semeadura em placa com meio seletivo e posterior identificação
bioquímica. De acordo com o número de tubos que apresentam gás
determina-se o NMP, pela consulta de uma tabela desenvolvida por Hoskins
(1934). Este é um teste apenas presuntivo para a presença de coliformes.