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- En el laboratorio de Microbiología debe usarse siempre bata.
- Deben lavarse las manos con jabón, o con desinfectante si es necesario, después de
cada tarea, en cada momento que se requiera por posible contaminación, y siempre
antes de abandonar el laboratorio.
- Se usarán guantes (latex o polivinilo) en caso de riesgo de contaminación por contacto
(en función del material que se manipula, o en caso de rasguños o vías de entradas). No
obstante, deben
extremarse las precauciones (no utilizar guantes) cuando se trabaja en las proximidades
del mechero.
- Los productos inflamables (gases, alcohol, éter, etc.) deben mantenerse alejados de las
llamas de los
mecheros. Si se manejan mecheros de gas se debe tener mucho cuidado de cerrar las
llaves de paso al
apagar la llama.
- Cuando no se utilizan los mecheros, éstos deben apagarse y se debe estar seguro que
se les ha
apagado al final de cada laboratorio.
- Se deben tener las precauciones necesarias para no contaminar el área de trabajo, ni el
material, ni
contaminarse el manipulador.
- Todos los materiales de desecho que hayan entrado en contacto con microorganismos
(como pipetas
usadas, placas petri o tubos), deben colocarse en contenedores de residuos preparados
para tal efecto.
- El orden y la limpieza son esenciales en todas las experiencias de laboratorio. Cada
grupo de prácticas
se responsabilizará de su zona de trabajo y de su material.
- Antes de realizar una práctica, debe leerse detenidamente el guión para adquirir una
idea clara de su
objetivo, fundamento y técnica. (Los resultados deben ser siempre anotados
cuidadosamente apenas se
conozcan).
- Antes de utilizar un compuesto hay que fijarse en la etiqueta para asegurarse de que es
el que se
necesita y de los posibles riesgos de su manipulación.
- Los medios inoculados deben colocarse en las cámaras de cultivo con su identificación
respectiva, ej.:
número de mesa, nombre, naturaleza del espécimen o sustrato del cual se aísla.
- Todo el material, especialmente los aparatos delicados, como lupas y microscopios,
deben manejarse
con cuidado evitando los golpes o el forzar sus mecanismos.
- Accidentes personales, tales como derrame de reactivos, cortes y quemaduras,
deben comunicarse inmediatamente al instructor.
- Se usarían gafas protectoras y mascarillas en caso de posibles salpicaduras o
aerosoles. Los niveles de protección se incrementan en función del tipo de
microorganismos que se manipula. Microorganismos patógenos de alto riesgo
requerirían cabinas de seguridad o incluso instalaciones especiales (ej.:
laboratorio con presión negativa, cabinas de seguridad clase III, para
microorganismos de nivel de riesgo 4, en laboratorios altamente especializados).
- Nunca deben sustraerse cultivos de microorganismos del laboratorio
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È NDAMENTO TEÓRICO.

En Microbiología se utilizan metodologías específicas para la obtención y

mantenimiento de cultivos puros
(de un solo tipo de microorganismo) y para el mantenimiento de las condiciones
estériles, en general. Se
requiere que todo el material esté estéril y se debe trabajar en condiciones de
manipulación estéril, que
evite la contaminación de la muestra, del ambiente o el manipulador. Por tanto, es
importante:
- La esterilización del material de trabajo (asas de siembra, medios de cultivo, frascos de
toma de
muestras, etc.)
- El mantenimiento de un ambiente estéril (mechero bunsen, campanas de flujo laminar)
para la
manipulación de microorganismos.

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El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el crecimiento
de los
microorganismos.
Composición de un medio de cultivo:
- componentes indispensables: agua, nutrientes orgánicos (hidratos de carbono,
aminoácidos, vitaminas, etc.), nutrientes inorgánicos ( P, e, N, Mg, S, etc.)
- componentes alternativos: isosmotizantes (NaCl), agente solidificante (agar-agar),
tampones, indicadores de pH, etc.
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En función de su consistencia:
- medios líquidos
- medios sólidos (con agar-agar como solidificante) (en tubo, en placa)
- medios semisólidos
En función de su composición:
- medios complejos (caldo ordinario, extracto de levadura) ( medios ricos de los que no
se conoce la composición exacta de cada elemento, aminoácidos, azucares, sales,..)
- medios sintéticos (normalmente preparados en el laboratorio, de los que conocemos la
composición exacta de cada elemento, aminoácidos, azucares, sales,..)
Existen medios de cultivo cuya composición permite el crecimiento de una gran
diversidad de
microorganismos (agar nutritivo, caldo ordinario). Otros en cambio, se utilizan para la
selección de
determinados grupos de organismos, o se desarrollan para el estudio de determinadas
pruebas
fisiológicas o test bioquímicos.
- medios selectivos
- enriquecimientos
- medios para test bioquímicos
(utilización de citratos, acidificación
a partir de azúcares, etc.).

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El trabajo con microorganismos no se realiza con células aisladas, sino con poblaciones
extensas y
homogéneas del microorganismo a estudiar, por lo que el microbiólogo utiliza técnicas
que permiten
obtener un cultivo puro, y luego cultivar a gran escala dicho microorganismo.
A partir de un cultivo mixto, se pretende obtener un cultivo puro de bacterias, a través
de la obtención de
colonias aisladas. Cada colonia representa una población de microorganismos
procedentes de una sola
célula, a partir de la cual se posee la seguridad de obtener dicho cultivo puro de un solo
tipo de
microorganismo. Para ello se utilizan diferentes técnicas de aislamiento, basadas en
diluir la muestra
inicial para obtener colonias aisladas. na vez que se ha obtenido un cultivo puro, se
puede mantener
haciendo resiembras en tubos de agar inclinado o bien congelando las células en glicerol
(10-30%) a -70°
C, en Nitrógeno líquido a -173° C, o mediante liofilización.

MATERIALES TILIZADOS
Bata de laboartório
Guantes
mechero
MECHERO B NSEN
T BOS DE ENSAYO ESTÉRILES Y CON S ERO ÈISIOLÓGICO DE TAPA
VERDE
MEDIOS DE C LTIVO en placas petri.
AGAR N TRITIVO, AGAR MAC CONKEY, MEDIO SELECTIVO PARA
COLIÈORMES ÈECALES, AGAR SABO RA D
ASA DE DRIGALSKY
ESPAT LA

METODOLOGÍA

Manipulación estéril

- cPara obtener colonias aisladas por la técnica del agotamiento la muestra
se extiende
sobre la superficie según se indica en la figura, de forma que al final de dicha siembra
³por agotamiento´,
la cantidad de inóculo se espera sea lo suficientemente bajo como para que se depositen
células aisladas
y distanciadas en la superficie del agar a partir de las cuales surjan, tras incubar,
colonias aisladas.
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Manipulación estéril
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Obtención de cultivo puro: aislamiento
.Se toma una muestra del cultivo, con ayuda del asa de
siembras estéril (asa de platino previamente flameada o asa
desechable estéril). Debe flamearse la boca del tubo antes y
después de tomar la muestra. La muestra se extiende con
suavidad con el asa sobre la superficie del medio en placa
Petri. Para ello la placa se destapa ligeramente en las
proximidades del Mechero bunsen. na vez finalizado se
vuelve a tapar la placa y está se dispone en posición invertida
para llevar a incubar. Este es el proceso general para la
siembra de placas.
Para obtener colonias aisladas por este procedimiento,
se realizan una serie de
estrías sobre la superficie del medio, tras lo cual se
cierra la placa y se esteriliza el asa (se flamea el asa de
platino o se usa otra asa estéril desechable). Con el asa
estéril se realizan nuevas estrías arrastrando células de
las estrías anteriores, y por tanto diluyendo la muestra.
El proceso se repite varias veces, con el asa estéril entre
cada nuevo paso de estrías. Al final se puede realizar un
pequeño agotamiento. La placa se lleva a incubar,
invertida, como en el caso anterior.
Exiten varias técnicas a utilizar por este medio:Técnica de siembra en placa por estrías
contínuas
Técnica de siembra en placa por cuadrantes.Técnica de siembra en placas por estrías
cada 45º