LEZIONE 7

Vitamine B6 e piridossal fosfato (PLP)

 PLP deriva dalla famiglia delle Vit B6 (deficienza porta dermatiti e disordini del metabolismo
proteico)   tre composti di base la piridossina, il piridossale e pirossiammina presentano lo stesso
nucleo piridinico
 La piridinaprotonata all’azoto, si forma un equilibrio tautomeric in protonazione all’azoto o
all’ossigeno, può essere rappresentata in entrambi le forme. C’è un CH2OH, un gruppo ossidrilico,
un CH3 sul carbonio 2. In posizione 4 possiamo avere il gruppo aldeidico presente nella forma attiva
del coenzima, piridossale; possiamo avere la forma ridotta (piridossina) o la forma azotata deriva da
una reazione di transaminazione con la formazione dell’ammina, piridosammina. La forma attiva del
coenzima è il piridossal 5 fosfato. Il nucleo del piridossale, l’aldeide piridinica viene fosforilata alla
catena laterale CH2OH.

La vitamina B6 è fosforilata per

formare PLP che e’ la forma
biologicamente attiva

Piridossal fosfato (PLP)

Il coenzima agisce sottoforma di un
gruppo prostetico.
PLP è un gruppo prostetico per enzimi che
catalizzano reazioni che coinvolgono il
metabolismo degli amminoacidi:
transaminazioni, decarbossilazioni,
eliminazioni, racemizzazioni e reazioni
aldoliche(scissioni aldoliche).
Questa chimica versatile è dovuta a: 
 Formazione di addotti di Schiff stabili
con gli α-amminogruppi degli
amminoacidi attraverso la funzione
aldeidica del piridossal, la forma attiva deve essere CHO (gruppo aldeidico).
 Un sistema piridinico coniugato elettron-povero: l’azoto elettronegativo esercita un effetto
consistente di attrazione elettronica e se avviene una protonazione all’azoto piridinico, si
forma uno ione piridinio, questo effetto viene ancora di più accentuato. L’anello piridinico
esercita l’effetto di attrazione elettronica per risonanza, che portano ad attrarre gli
elettroni verso il passo e quindi è in grado di stabilizzare gli intermedi di reazione che si
formano nel corso dei meccanismi di reazioni in cui reagisce il piridossal fosfato. Dobbiamo
tener presente che la struttura della molecola è in equilibrio tra queste due forme
tautomeriche uno con l’ossidrile ovvero con l’ossigeno protonato, l’altro in cui c’è la
protonazione all’azoto con una forma sostanzialmente dipolare.
ENZIMI DIPENDENTI DAL PIRIDOSSAL FOSFATO
Coinvolti in biosintesi, metabolismo e catabolismo degli amminoacidi.
Se abbiamo un amminoacido possiamo avere degli enzimi che si chiamano RACEMASI o EPIMERASI che
catalizzano la inversione di configurazione al carbonio alfa ovvero la trasformazione di un L-aa in D-aa e
viceversa. Abbiamo enzimi che agiscono come DECARBOSSILASI, catalizzano le reazioni di
decarbossilazione dell’aa con trasformazione di un aa in un’ammina
Abbiamo le TRANSAMINASI che convertono contemporaneamente con un processo duplicel’aa in un
chetoacido e un chetoacido in aa. Avvengono con trasferimento di azoto da uno e all’altro substrato.
Possiamo avere una serie di reazioni funzionalizzati in posizione beta o gamma della serina, della metionina
o della treonina, possiamo avere delle eliminazioni o anche dei processi che coinvolgono delle aldolasi con
delle scissione retroaldoliche, e altri tipi di degradazioni degli amminoacidi.

Le 7 classi di reazioni catalizzate dal PLP

La prima è una reazione di transaminazione un aa e un chetoacido, attraverso le transaminasi con il
supporto del gruppo prostetico del PLP, subiscono la trasformazione. L’aa viene convertito in chetoacido e
contestualmente il chetoacido originale riceve il gruppo amminico dell’amminoacido che lo ha ceduto e si
trasforma in aa. C’è un trasporto di una funzione amminica da un aa ad un chetoacido. Avviene attraverso
il PLP che accoglie il gruppo amminico, lo stacca da un aa e lo va a legare sulla funzione carbonilica di un
chetoacido per convertirlo in un altro aa.
La funzione di decarbossilazioneperdita della funzione carbossilica di aa con conversione in un’ammina;
sono reazioni molto importanti nella formazione di una serie di neurotrasmettitori. Abbiamo reazioni al
carbonio beta come reazioni di beta decarbossilazione o di beta eliminazione, l’ enzima che effettua questo
tipo di reazioni prende il nome di deidratasi, non c’è solo la deidratazione o eliminazione di acqua (di un
gruppo ossidrilico), ma è seguito da un’idrolisi di un gruppo imminico che si viene a generare a livello del
carbonio alfa e poi porta alla formazione di un chetoacido.
Reazione di gamma eliminazione che avviene sulla metionina con perdita del gruppo e contestuale
eliminazione della funzione amminica, con formazione di un chetoacido.
Reazione di racemizzazioneconversione di un L-aa ad un D-aa o viceversa
Scissione di tipo aldolico rottura/catabolismo della treonina in glicina e acetaldeide.
Un complesso di reazioni molto vasto ma applicato al mondo degli aa. Il PLP è fondamentale per il
metabolismo degli aa.
Meccanismi
Un aspetto base di tutte queste reazioni è il legame che si stabilisce
tra il PLP e una funzione azotata, il gruppo amminico terminale di
una lisina dell’enzima. La lisina è inserita nella sequenza
amminoacidica dell’enzima con il suo gruppo amminico terminale
nella catena laterale che forma una base di shiff stabile con la
funzione aldeidica del PLP e in questo modo si costituisce quello
che è il gruppo prostetico dell’enzima. Tra l’azoto della lisina legato
sotto forma di immina e l’H del gruppo OH si stabilisce un legame
ad idrogeno che tende a stabilizzare la struttura. Quando l’aa, che è il substrato, entra all’interno del sito
attivo dell’enzima, il gruppo amminico va a spiazzare il gruppo amminico della lisina cioè avviene la
transaldimminazione, c’è una conversione della base di shiff in cui viene espulsa la funzione amminica ed
entra la funzione ammina dell’aa. Avviene una sorta di attacco nucleofilo del gruppo NH2 dell’aa al
carbonio per poi formare la base di shiff con l’azoto e successivamente avviene la fuoriuscita del gruppo
amminico della lisina. E’ un tipo di reazione che avviene in tutti i processi in cui viene coinvolto un aa e
l’enzima che è supportato dal gruppo prostetico del PLP. In tutte le reazioni c’è questa fase iniziale, a volte
possiamo omettere per semplicità che ci sia stata trasformazione il PLPè sempre presente, legato
covalentemente come gruppo prostetico attraverso una base di shiff con la lisina, e questo legame poi
viene scisso nel momento in cui entra l’aa da metabolizzare.

Un punto chiave del metabolismo del PLP e’ la formazione del legame ad H il quale impartisce una parziale
carica + all’azoto e una parziale carica – sull’ossigeno, il protone è condiviso tra l’azoto e l’ossigeno. Il
legame H aumenta l’effetto di attrazione elettronica dell’azoto e tende ad accentuare l’acidità del protone
in α. Il protone sul carbonio in α può essere rimosso abbastanza facilmente e il carbanione che si forma e’
stabilizzato per delocalizzazione della carica sull’anello aromatico della piridina.  
Un altro aspetto importante è la formazione di un intermedio per successiva protonazione a livello del
carbonio aldeidico del PLP.

GLI INTERMEDI SONO TRAPPOLE ELETTORNICHE

COMPLESSO ENZIMA-
PIRIDOSSAL FOSFATO:
Punto di partenza dei processi
enzimaticiAbbiamo il gruppo
prostetico, la lisina con il suo
braccio laterale, il gruppo
amminico in posizione epsilon
della lisina che forma la base di
shiff con il PLP.

1O STADIOentra il substrato
nella reazione enzimatica,
spiazza la lisina, forma la base di
shiff con l’aa e il legame ad
Hreazione di
transaldimminazione.

2o STADIO intermedio 3 è l’intermedio base di α-decarbossilazione.

Ha un anello della piridina protonata, la base di Shiff con l’aa che è il
substrato della reazione, la base di shiff ha l’azoto che forma un
legame ad h con il protone dell’ossidrile, carica + sull’azoto, carica –
sull’o. Possiamo scrivere per semplicità + e – o delta+ e delta-. C’è un
effetto di attrazione elettronica abbastanza marcata verso il basso
che deriva dall’elettronegatività dell’azoto e dalla sua protonazione
ma anche dal sistema coniugato di doppi legami con il nucleo della
piridina che agisce da trappola di elettroni. Lungo tutta la sequenza di doppi legami coniugati che termina
con un azoto carico+ c’è un effetto di attrazione elettronica verso il bassodefinito elettron sink= scarico
di elettroni.

Intermedio 3 di base per la decarbossilazione; siccome accentua l’acidità del protone si abbassa il pka,
una base presente su un sistema enzimatico può staccare il protone generando un carbanione al carbonio
α. Il carbanione è fortemente stabilizzato dalla trappola elettrofila C-N-C-C-C-C-N e per risonanza: quindi
non è solo stabilizzato dal carbossile ma soprattutto dalla catena dei doppi legami coniugati.
Intermedio 4  ci sarà utile per le reazioni di beta eliminazione, di racemizzazione e le reazioni con
scissione aldolica. Abbiamo un ulteriore processo di protonazione, abbiamo la possibilità che il gruppo
acido dell’enzima vada a protonare l’atomo di C che inizialmente era l’atomo di carbonio aldeidico del PLP.
Le due strutture di risonanza non sono due intermedi diversi, ma l’intermedio 4 e 5 sono la stessa cosa e
sono due strutture di risonanza dello stesso intermedio.
Intermedio 6Successivamente alla protonazione, l’anello aromatico ritorna ad avere la struttura con
l’azoto carico, il C diventa un ch2 e si riforma il legame C=N. questo è l’intermedio 6 per le reazioni di
transamminazione. Dato che l’intermedio 4 e 5 è lo stesso intermedio in realtà questo sarà l’intermedio 5.

Ulteriore conversione è la possibilità di ottenere un’altra deprotonazione al C beta dell’amminoacido

perché abbiamo un doppio legame C=N con un azoto carico positivamente, grazie al legame ad idrogeno,
quindi abbiamo un altro protone relativamente acido, deprotonazione e otteniamo un altro intermedio.
Questo ha una carica negativa sul carbonio beta, possiamo scrivere
una struttura di risonanza con doppio legame C-C e la coppia di
elettroni che passa sull’azoto. Quindi abbiamo un effetto di
stabilizzazione dovuto alla delocalizzazione di questo azoto, di questo
gruppo imminio carico positivamente, il quale, allo stesso tempo,
impartisce anche acidità al protone. Questo intermedio è importante
per le reazioni di gamma eliminazione.
Questi intermedi non intervengono tutti in ogni reazione, dipende
dalla tipologia di reazione, dal meccanismo enzimatico, ma in ognuno
dei meccanismi enzimatici in cui interviene PLP possiamo avere
almeno un intermedio tra questi elencati, ce ne possono essere più di
uno perché sono in progressione. Perche se arriviamo all’intermedio 4/5 dobbiamo passare anche per
l’intermedio 3; se si passa attraverso il 6, si deve ovviamente passare, precedentemente, anche per il 3, 4/5
e così via.
α-Decabossilasi
Meccanismo delle α-Decarbossilasi catalizzato dal PLP semplice decarbossilazione di un amminoacido.
Questa è una reazione che richiede solo
dell’intermedio 3.

Gruppo prostetico dell’enzima,

piridossale legato alla lisina, entra
l’amminoacido, si ha la reazione di
transaldimminazione, si distacca il
gruppo amminico dalla lisina ed entra
l’amminoacido che forma la base di shift
con il piridossale. Questo dà luogo
all’intermedio 3, in cui si stabilisce
immediatamente anche il legame ad H.
Anello piridinico protonato e carico,
base di shift con il C del piridossale, amminoacido, legame ad H tra azoto ed OH. La coppia di e- va a
formare la CO2, si scinde il legame perché la coppia di e- viene attratta verso il basso dall’effetto di
attrazione elettronica della trappola ionica o elettron sink dello ione piridinio, il flusso di elettroni scende
sull’anello elettron-povero della piridina. Tutto deve essere logico e consequenziale. Esce CO2, si rompe un
legame C-N e si forma il doppio legame con l’azoto verso il basso, la coppia di e scende verso il basso,
sull’azoto che non ha più la carica positiva. C’è sempre il legame a idrogeno, ed è avvenuta la
decarbossilazione. Subito dopo un gruppo acido dell’enzima va a riprotonare l’azoto e si inverte il flusso di
e- lungo il sistema coniugato, si riforma la base di shift, il nucleo piridinico protonato. Siamo tornati alla
condizione iniziale senza co2. Adesso succede il contrario della fase iniziale: avviene una
transaldimminazione in cui il gruppo NH2 della lisina enzimatica si va prendere il PLP ed esce l’ammina
derivata dalla decarbossilazione dell’amminoacido e il PLP si trova legato ad un altro amminoacido a
formare il gruppo prostetico pronto per un altro ciclo.
Sono tante queste alfa decarbossilasi, perché sono coinvolte nella produzione di importanti
neurotrasmettitori o nella formazione dei loro precursori.
Amino acidi come ormoni / neurotransmettitori e loro precursori
Gli amminoacidi che agiscono come trasmettitori: 
 1. Glicina
2. Glutammato

Derivati di aminoacidi trasmettitori e/o ormoni:

1. Tirosina → convertita in Dopamina e da qui si possono avere tutta una serie di altri ormoni,
neurotrasmettitori che derivano da questa conversione norepinefrina, epinefrina; triiodotironina,
tetraiodotironina, tutto un pool di neurotrasmettitori che deriva da questa conversione.
2. Glutammato → γ-Amminobutirrato
3. Istidina → Istamina
4. Triptofano → 5-Idrossitriptamina (Serotonina)
Tutto questo pool di molecole biologiche viene generato dalla decarbossilazione di amminoacidi
catalzzata da PLP.
Vediamo qualche esempio:

La DOPA= 3,4 diidrossifenilalanina è stata ossidata da un’ossidasi con introduzione di OH sull’anello

aromatico ed è stata poi decarbossilata con formazione di dopamina. Da qui tutto un pool di importanti
molecole biologicamente attive.
α-Decarbossilasi nel cervello: formazione di neurotrasmettitori
Qui vediamo la
decarbossilazione del
glutammato che porta
all’acido gamma
amminobutirrico e quella
dell’istidina che porta alla
biogenesi dell’istamina.

Un’altra importante classe di reazione in cui interviene il PLP è quella delle transaminasi.
Le transaminasi
La transaminazione agisce sull’alfa ammino gruppo
Queste reazioni agiscono sul gruppo amminico alfa di un amminoacido e lo trasferiscono su un gruppo
carbonilico di un chetoacido. L’amminoacido che agisce da donatore viene trasformato in chetoacido,
contestualmente il gruppo amminico viene in qualche prelevato dalla funzione aldeidica del PLP che si
trasforma in piridossammina fosfato, la quale trasferisce il gruppo amminico ad un altro chetoacido che
viene convertito in un secondo amminoacido e la piridossammina viene ritrasformata in piridossalfosfato
PLP, il quale può riprendere un altro ciclo di conversione. Entra l’amminoacido 1, esce il chetoacido 1
attraverso il trasferimento del gruppo amminico, grazie all’intervento del PLP che preleva la funzione
azotata, questa viene trasferita al chetoacido 2 che viene convertita all’amminoacido 2.

Transamminasi
La transaminazione agisce sull’α-amino gruppo

α-Chetoglutarato+ alanina glutammato+ piruvato

Questo è un esempio
in cui chetoglutarato
e alanina che
vengono convertiti,
rispettivamente, in
glutammato e
piruvato.

MECCANISMO DELLA REAZIONE:

Ancora una volta abbiamo il passaggio della base iniziale, transaldimminazione, si forma l’intermedio 3,
deprotonazione al C alfa
dell’amminoacido con
flusso di e verso la trappola
dell’anione piridinio, a
questo punto abbiamo
un’ulteriore protonazione
al gruppo aldeidico
originario, ovvero quello
del piridossale, si forma il
cosiddetto intermedio 6, il
flusso di elettroni torna
verso l’alto, scissione
dell’immina, mediante
idrolisi con azoto legato al piridossale, formazione di piridossina fosfato ed eliminazione del chetoacido.
Successivamente abbiamo il processo inverso in cui il chetoacido due si lega alla piridossammina formando
l’intermedio 6, e così via fino a rigenerare il gruppo prostetico iniziale e liberare l’altro amminoacido.
Abbiamo quindi l’accoppiamento di due reazioni una che va verso destra e l’altra che va verso sinistra, per
la conversione del secondo chetoacido in amminoacido.
(Quando la reazione procede nel verso opposto si ha la biosintesi degli amminoacidi).
Stereochimica della reazione di transaminazione: il transfer di protone è mediato da una lisina del sito
attivo

È importante sottolineare, in queste reazioni di transaminazione, che grazie alla configurazione dell’enzima
alla sua specificità, queste reazioni sono stereospecifiche che hanno una ben determinata stereochimica.
L’amminoacido che viene generato dalla transaminazione di un chetoacido è di serie L. abbiamo infatti 2
protoni nel gruppo CH2, prochirali, uno pro R e l’altro pro S e nel corso della reazione viene rimosso
specificamente il protone pro S e viene generato l’amminoacido di serie L. Questo dipende dall’intorno
spaziale del sistema enzimatico del sito attivo dell’enzima, della modalità con cui il gruppo prostetico
legato al substrato è disposto all’interno del sito attivo dell’enzima e dalla posizione della catena laterale
della lisina che agisce da base o donatore di protoni a seconda della reazione. La lisina, grazie alla
disposizione sterica, preleva il protone pro S e poi dona un protone all’amminoacido generando un
ammnoacido naturale di serie L.

Reazioni ai carboni β- e γ- degli aminoacidi

Vediamo ora una serie di reazioni che avvengono sugli atomi di carbonio beta e gamma degli amminoacidi.

Treonina deidratasi:
Abbiamo la treonina legata al piridossale nel sito attivo dell’enzima, già è avvenuta la reazione di
transaminazione, abbiamo il primo intermedio 3, abbiamo avuto la deprotonazione al C alfa, con
conseguente shift di e- verso il basso, verso l’azoto e quindi si genera l’intermedio 4 con una carica
negativa stabilizzata a seguito dell’attrazione verso il basso. A questo punto c’è la protonazione della
funzione ossidrilica con eliminazione di acqua, favorita dal riflusso di elettroni verso l’alto e si forma un
doppio legame C=C, mentre si rigenera la struttura iniziale dell’intermedio 3, con il nucleo piridinico carico
positivamente, ione piridinio. C’è sempre una funzione imminica scissa tramite transaldimminazione con il
gruppo azotato della lisina, si lega la lisina, si rigenera il gruppo prostetico iniziale dell’enzima e viene
espulso un intermedio, ovvero un amm con doppio legame al c alfa. Questo protonato al C beta con
formazione di ammina,si ha un equilibrio tautomerico in cui abbiamo un gruppo imminico legato ad C sp2,
che somiglia molto ad un enolo. Attraverso questo equilibrio tautomerico si forma ione imminio che
subisce spontaneamente idrolisi con formazione del chetoacido. Alla fine questa treonina deidratasi
comporta eliminazione di acqua e una contestuale scissione della funzione amminica con formazione di
chetoacido.

Triptofano Sintasi:

Reattività dell’anello pentatomico

dell’indolo verso gli elettrofili.
È una reazione di formazione del
triptofano.
È infatti l’anello più elettronricco, si
ha una reazione di sostituzione
elettrofila aromatica nella posizione beta dell’anello a cinque termini.
La Triptofano sintasi ha un meccanismo simile alla treonina deiratasi:  partiamo dal complesso del PLP con
amminoacido, già è avvenuta la transaldimminazione, in questo caso abbiamo la serina legata al PLP, si
forma l’intermedio 3, deprotonazione al C4, si forma l’intermedio 4, eliminazione di OH in beta,
deidratazione, abbiamo una beta eliminazione. Dopo l’uscita dell’acqua si forma una lacuna elettronica,
saturata attraverso il flusso di elettroni verso l’alto, attraverso la sequenza di doppi legati coniugati. Questa
molecola invece di essere staccata attraverso la reazione di scissione di transaldimminazione, come visto
prima, agisce da elettrofilo perché è una forma enolica in cui il doppio legame subisce attrazione
elettronica da parte dell’azoto carico negativamente, abbiamo la trappola elettronica dell’anello piridinico;
il carbonio si impoverisce di elettroni e quindi può reagire con l’indolo.
 La reazione con l’indolo
porta un attacco
elettrofilo all’indolo,
questo si lega al carbonio,
abbiamo il flusso di
elettroni verso il basso,
abbiamo la formazione di
un intermedio, dopo di
che viene rimosso il
protone, abbiamo un
secondo intermedio,
rotonazione al C alfa e
flusso di elettroni verso
l’alto. Alla fine avremo l’indolo legato al piridossalfosfato. A questo punto interviene il gruppo amminico
della lisina, transaldimminazione, distacco dell’indolo e rigenerazione del gruppo prostetico enzimatico.

Metionina gamma liasi

In questo caso abbiamo la

metionina legato al PLP,
intermedio 3 di base a
tutti questi processi
enzimatici,
deprotonazione al C alfa,
formazione intermedio 4,
flusso di elettroni verso il
basso, azoto non carico.
Tutto questo impartisce
una sorta di acidità anche
al C beta, quindi il protone
di questo C può essere
rimosso, si ha la
formazione di un doppio
legato con protonazione
all’azoto imminico con
formazione di NH2, anche
questo è un equilibrio tautomerico su questo intermedio 4. Una volta avvenuto questo può essere
eliminato il gruppo in gamma (-SCH3). Abbiamo dapprima la deprotonazione sull’azoto, poi, shift della
coppia di elettroni, con formazione del doppio legame C=N, eliminazione del gruppo CH3SH, shift coppia di
elettroni. Si viene a formare un doppio legame C=C all’estremità del composto coniugato con il doppio
legame C=N. Abbiamo poi la protonazione all’estremità del sistema coniugato, shift della coppia di elettroni
e reflusso di elettroni verso l’alto; formazione immina, transaldimminazione, ricostituzione gruppo
prostetico enzimatico e fuoriuscita dell’amminoacido. A questo punto abbiamo come una forma enolica di
una ammina c’è, quindi un equilibrio tautomerico che porta alla formazione dell’immina che
spontaneamente idrolizza in ambiente acquoso e genera un chetoacido.

Treonina aldolasi

In questa reazione abbiamo una scissione tra il Calfa

e il Cbeta, tramite un processo simile alla reazione
retroaldolicaa. Questo porta alla formazione di
glicina sulla destra e acetaldeide sulla sinistra.
Questa, attraverso un’ossidazione che coinvolge
l’acetaldeide deidrogenasi e il coenzima NAD e il
coA, viene convertito in acetil coA.

MECCANISMO:
Abbiamo sempre il gruppo prostetico dell’enzima, entra il beta idrossi
amminoacido, la treonina, anche se può essere vista come una reazione di
tutti i beta idrossi amminoacidi, si forma il classico intermedio 3, abbiamo la
deprotonazione e l’eliminazione di acqua, attrazione della coppia di elettroni
verso il basso, formazione doppio legame C=O e scissione legame C-C.
Abbiamo, quindi, un’aldolasi a questo livello. Esce acetaldeide, mentre
dall’altra parte troviamo il legame imminico della glicina legato al residuo di
PLP. Abbiamo di nuovo il flusso di elettroni verso l’alto con riprotonazione al
C alfa al gruppo COO- e alla fine c’è la reazione di transaldimminazione con
fuoriuscita della glicina e riformazione del gruppo prostetico.

VITAMINA B6:FONTI ALIMENTARI

Vediamo qui una tabella di fonti alimentari di questa
vitamina, importante per tutti quei processi di
trasformazione e conversione dei numerosi amminoacidi
visti precedentemente.