Chips de DNA 2007

ChIP-on-Chip
ChrIP-Chip
ChrIP-DNA microarrays
Genome-Wide location
analysis
9 Objetivo: Permite analizar in vivo la interacción Proteína-DNA
a lo largo del genoma completo de la levadura.

9 Fundamento: el Método combina dos técnicas diferentes

- Inmunoprecipitación de cromatina
- Hibridación con Chip de DNA

FUNDAMENTO DEL MÉTODO DE

INMUNOPRECIPITACIÓN DE CROMATINA
(ChrIP)

CROSS-LINKING in vivo

LISIS Y
FRAGMENTACIÓN DEL DNA
POR SONICACIÓN
(400-1000 pb)

FUNDAMENTO DEL MÉTODO ChrIP

(cont.)

INMUNOPRECIPITACIÓN NO INMUNOPRECIPITACIÓN

(WCE)
Todos los posibles
fragmentos del genoma
(IP) Enriquecido de la levadura

Chip-ChrIP 1
Chips de DNA 2007

FUNDAMENTO DEL MÉTODO ChrIP

(cont.)
Reversión del cross-linking
(IP) Desproteinización y
(WCE)
purificación de DNA

AMPLIFICACIÓN POR PCR

IP WCE
ELECTROFORESIS DNA ASOCIADO
DEL PRODUCTO DNA NO ASOCIADO
DE PCR

CASO REAL DE ChrIP

9SpCENP-A es una
variante de la histona
H3 específica del
centrómero.

9 Para la
amplificación por
PCR se utilizan 4
diferente parejas de
oligos.

9 SpCENP-A está
etiquetada con un
triple epítopo HA.
Takahashi et al. (2000) Science 288, 2215

CARACTERÍSTICAS DEL ChrIP

9 Para poder inmunoprecipitar específicamente la proteína

(y al DNA asociado a ella) es necesario:
- O bien disponer de anticuerpos específicos frente a la
proteína de interés.
- O que la proteína objeto de estudio esté etiquetada
con HA, Myc, etc (la etiqueta no debe afectar a la función).

9 Solo es posible determinar la posible unión de la proteína a

sitios específicos del genoma (determinados por las parejas de
Oligos empleados en el PCR).

Chip-ChrIP 2
Chips de DNA 2007

ACOPLAMIENTO DEL ChrIP AL

ChrIP-Chip

1º- Cross-linking
2º- Fragmentación
3º- Inmunoprecipitación o no

Fragmentos de DNA Fragmentos de DNA

inmunoprecipitados no inmunoprecipitados
(IP) (WCE)

9 ¿Cómo se consigue amplificar por PCR todos los posibles

fragmentos generados?

Ligation Mediated-PCR
Lab. Richard Young, Cambridge

Producto de la
Sonicación (400 pb)

DNA-pol T4

Linker unidireccional
(25 y 12 N)
DNA-ligasa

PCR utlizando
el oligo (25 N)
+ Cy3 o Cy5

ROUND A/B/C/ RANDOM

Lab. Patrick Brown, Stanford

Round A: DNA pol: SEQUENASE

Oligo: GTTTCCCAGTCACGATCNNNNNNNNN
(N es una mezcla de 60% ATP+TTP y 40% CTP+GTP

Round B: DNA pol: Taq

Oligo: GTTTCCCAGTCACGATC
15 a 35 ciclos de PCR

Round C: Como el B, pero añadiendo Cy3 o Cy5 al dNTP mix

10 a 25 ciclos de PCR

Chip-ChrIP 3
Chips de DNA 2007

ChrIP-Chip

9 DNA del
inmunoprecipitado (IP)
marcado con Cy5

9 DNA del no
inmunoprecipitado (WCE)
marcado con Cy3

9Ambas muestras de DNA

se juntan y se hibridan con
el Chip de DNA
(Intergenic-Array)

HIBRIDACIÓN
DEL DNA AMPLIFICADO
CON EL Chip-DNA

9 Single-array error model:

-Eliminar ruido de fondo
-Estimar la confianza de la
unión (P) (Fig.B: 99,8% de los
genes dan la misma señal, con
intervalo de error de P=10-3)
9 Relación IP/no-IP se obtiene de tres
experimentos independientes

Ren et al. (2000) Science 290, 2306

¿Con qué proteínas se puede

aplicar el ChrIP-Chip?
Con cualquiera que interaccione directa o indirectamente
con el DNA
9 Activadores o represores transcripcionales

9 Proteínas implicadas en los orígenes de replicación

9 Proteínas implicadas en la recombinanción

9 Complejos remodeladores de la estructura de la cromatina

9 Factores transcripcionales de iniciación o de elongación

9 Modificaciones específicas de las histonas

Chip-ChrIP 4
Chips de DNA 2007

Activadores o represores
transcripcionales
9 Laboratorio de R.A. Young 9 Laboratorio de P.O. Brown
http://web.wi.mit.edu/young/location http://genome-stanford.edu/chromatinip/
- Gal4 - Swi4
Diciembre 2000
- Ste12 - Swi6 Enero 2001
- Mbp1 - Mbp1
- Swi4 - Rap1
- Swi6 - Sir2 Agosto 2001
- Mcm1 - Sir3
- Fkh1 Septiembre 2001 - Sir4
- Fkh2
- Ndd1
- Swi5
- Ace2
- TODOS los conocidos Octubre 2002

Gal4p
9 Proteína activadora de genes necesarios para el metabolismo
de la galactosa:
-GAL1, GAL2, GAL3, GAL7, GAL10, GAL80 y GCY1

9 Secuencia de unión consenso: CGGN11CCG

9 Chip-DNA: 6361 fragmentos de DNA correspondientes a todas

las regiones intergénicas del genoma de la levadura

9 Número de genes en los que coincide:

- Unión de Gal4p al promotor (detectada por el ChrIP-Chip)
- Activación transcripcional del gen (detectada por Chip)
10 genes

Gal4p

Ren et al. (2000) Science 290, 2306

Chip-ChrIP 5
Chips de DNA 2007

CONCLUSIONES CON Gal4p

9 La activación por Gal4p no solo activa los genes

implicados en metabolizar directamente la
galactosa
9 También produce otros efectos que, por deducción
directa hubiera sido muy difícil imaginar:
- Activación de la incorporación de Uracilo (FUR1)
- Represión de la glicogénesis (PCL10)
- Represión de la incorporación de glucosa (MTH1)

Spo11p
9 HOTSPOTS: regiones de alta frecuencia de recombinación.
9 La mayoría son intergénicas y no intragénicas
9 En ellos se produce rotura de ambas cadenas del DNA (DSB)
9 La formación de DSB requiere Spo11p (proteína relacionada a las
topoisomerasas tipo II)
9 Spo11p se une covalentemente, de forma transitoria a los extremos
5’ de los fragmentos de DNA en los DSB (no se usa pues
formaldehido)
9 COLDSPOTS: regiones de baja frecuencia de recombinación.

9 Chip-DNA: 6200 ORF’s de levadura

Gerton et al. (2000) PNAS 97, 11383

Detección de sitios de recombinación

Detectan:

- 177 cluster
HOTSPOTS

- 40 cluster
COLDSPOTS

En verde “cold spots”, en rojo “hot spots”. Gerton et al. (2000) PNAS 97, 11383

Chip-ChrIP 6
Chips de DNA 2007

LAS HOTSPOTS
CORRELACIONAN
CON ALTOS G+C
Fig. 5. Correlation of hotspots with
peaks of high G + C content on
chromosome III. (Upper) A scan of base
composition at 1-kb intervals (5-kb
sliding window). The marked peaks have
a G + C base composition 3% above
the average for chromosome III (38.7%).
In addition, we show the log values of
the median hybridization ratio (DSB-
enriched probe/total genomic DNA).
(Lower) The ORFs (two lines of black
rectangles) and the positions of a number
of structural chromosomal elements are
indicated. Gerton et al. (2000) PNAS 97, 11383

Novel TRF1/BRF target genes revealed by

genomewide analysis of Drosophila Pol III
transcription
Figure 1 Overview of ChIP-on-chip
data analysis. (A) TileHGMM: a
statistical framework for the analysis
of Chip-on-chip data. (B) Genome-wide
colocalization of TRF1/BRF-binding
sites. (C) Distribution of TRF1/BRF
bound regions across the genome.
Number of total TRF/BRF-binding sites
per each chromosome is plotted on the
graph.

Isogai et al. (2007) EMBO J. 26, 76

Figure 2. Spatial structure of enrichment by

TRF1/BRF ChIP.
High-resolution detection of TRF1/BRF ChIP
By genomic tiling microarrays. Top plot is
the averaged log ratios of ChIP and
control binding intensities over two
TRF1 replicate experiments, bottom
plot is the same for BRF1. Dashed lines
mark the predicted peak start and end
positions. Brown bars indicate tRNA
genes, and light blue bars indicate
snmRNA genes.

Isogai et al. (2007) EMBO J. 26, 76

Chip-ChrIP 7
Chips de DNA 2007

Figure 3. Classification of TRF1 and BRF occupied regions

Isogai et al. (2007) EMBO J. 26, 76

Chip-ChrIP 8