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Histórico
1897 – David Talbot Day – Demonstrou que frações de petróleo quando passadas
através de terra Fuller fracionavam alterando a composição.
Os principais marcos na evolução da cromatografia foram:
1903 – Tswett – Fenômenos de adsorção em colunas.
1931 – Kuhn, Lederer e Winterstein – Primeiras separações preparativas de
importância.
1938 – Izmailov e Shraiber – Cromatografia em camada fina.
1941 – Martin e Synge – Cromatografia de partição líquido-líquido – CLL.
1944 – Consden, Gordon e Martin – Cromatografia em papel.
1949 – Speeding e Tompkins – Cromatografia de troca iônica.
1952 – James e Martin – Cromatografia a gás.
1957 – Golay – Colunas capilares para CG.
1959 – Porath e Flodin – Cromatografia por exclusão por tamanho.
1966 – Piel – Cromatografia a líquido moderna.
O cromatografo líquido de alta pressão foi desenvolvido nos meados de 1970's e
melhorado rapidamente com o desenvolvimento de materiais de embalagem da coluna e da
conveniência adicional de detectores em linha. Nos 1970's atrasados, os métodos novos
incluindo o cromatografo líquido de fase reversa permitiram a separação melhorada entre
compostos muito similares.
Por 1980's o HPLC foi usado geralmente para a separação de compostos químicos.
As técnicas novas melhoraram a separação, a identificação, a purificação e a quantificação
distante acima das técnicas precedentes. Os computadores e a automatização adicionaram à
conveniência do HPLC. As melhorias no tipo de colunas e reprodutibilidade foram feitas
assim enquanto termos como as micro-colunas, as colunas da afinidade, e o HPLC rápido
começaram a aparecer.
Princípios da cromatografia líquida de alta eficiência
A separação cromatográfica
Pratos teóricos
Resolução
Adsorção
Quando duas fases imiscíveis são postas em contato, sempre ocorre que a
concentração e uma fase são maiores na sua interface do no seu interior. A essa tendência
de acumulação de uma substância sobre a superfície de outra damos o nome de adsorção.
Ela ocorre porque os átomos de qualquer superfície não possuem as forças de
atração perpendiculares sobre o plano balanceados e, portanto, possuem, certo grau de
insaturação. A adsorção é um fenômeno espontâneo, ocorrendo, pois, com a diminuição da
energia livre superficial, e diminuição da desordem do sistema, isto é, as moléculas
adsorvidas perdem graus de liberdade e, portanto, há uma diminuição de entropia e
conseqüentemente o processo é exotérmico.
D G = D H - TD S
O fenômeno é importante na catálise e na cromatografia sólido-gás e sólido-líquido.
Neste caso, o sólido tem a superfície insaturada por cargas iônicas polares ou, como na
sílica, uma superfície recoberta por grupos hidroxila que são fortemente polares e
formadores de pontes de hidrogênio.
Adsorção química
Adsorção física
Partição
Quando uma substância I fica em contato com duas fases heterogêneas fluidas,
imiscíveis entre si, por exemplo, um gás e um líquido ou dois líquidos imiscíveis entre si,
existe uma tendência desta substância se dissolver em ambas as fases, formando duas
soluções imiscíveis, porém cada uma delas homogênea.
Um movimento dinâmico se estabelece entre as duas, e após um determinado
momento, geralmente bem pequeno, atinge-se um equilíbrio termodinâmico de maneira
que, a uma temperatura constante, as concentrações da substância dentro de cada uma das
soluções permanecem constantes.
Se uma das duas fases for removida por um processo conveniente, e substituída
pela mesma fase pura, e o sistema for deixado atingir o equilíbrio, as concentrações da
substância I, nas duas soluções, serão diferentes, porém suas relações permaneceram
constantes.
Para soluções diluídas, as relações das concentrações nos dois casos, se
determinadas as mesmas na mesma temperatura, darão sempre o mesmo valor. Esse valor
constante é chamado de coeficiente de partição, representado geralmente por Kp ou
simplesmente K.
Se representarmos por [I]s e por [I]m as concentrações no primeiro caso e por [I]si
e [I]mi as concentrações obtidas após i trocas de um dos solventes de partição terá sempre
o mesmo valor, a temperatura T, e igual a:
Kp = [I]s / [I]m = ... = [I]si / [I]mi =
Coeficiente de partição para a substância considerada i e para as fases imiscíveis s
e m, medidas na temperatura definida pela experiência.
Termodinamicamente, quando for atingido o equilíbrio, os potenciais químicos da
substância I nas fases m e s serão iguais.
De um modo geral, cada substância, em condições ideais, tem seu valor para o
coeficiente de partição, porém, em muitos casos, dependendo das condições, por exemplo,
temperatura, tipo de interações, o valor experimental do coeficiente de partição, para
diversas substâncias, poderá ser o mesmo, isto é, as partições e os tempos de retenção terão
o mesmo comportamento, acarretando a não separação cromatográfica dessas substâncias.
Nas extrações o equilíbrio é obtido por simples agitação do sistema.
Na cromatografia, o processo é diferente, pois, um volume da fase móvel,
representada por Dm, se movimenta dentro da coluna renovando continuamente sobre um
elemento de volume Ds as composições de equilíbrio, satisfazendo sempre o valor do
coeficiente de partição para os componentes considerados s e m.
Nestas condições o sistema tenta atingir imediatamente o equilíbrio, e o coeficiente
de partição da substância será dado pela relação da concentração de I nos elementos de
volume de Ds e Dm.
Como a fase móvel passa imediatamente ao volume Ds seguinte, onde novamente
será atingido outro equilíbrio, o coeficiente de partição sempre se manterá o mesmo,
porém, dentro da coluna a distribuição da substância I viajará de acordo com uma
distribuição estatística exponencial, produzindo uma curva de erro e assim será detectada.
Outras substâncias existentes na amostra, com diferentes valores do coeficiente de
partição, viajarão dentro da coluna com velocidade maiores ou menores, dependendo se o
seu coeficiente de partição for menor ou maior daquele da substância I, pois o tempo de
retenção, como será demonstrado, para uma mesma coluna e mesmas condições
experimentais, é proporcional ao valor de seu coeficiente de partição na condição de
trabalho. Considerando que as substâncias se movem dentro da coluna somente quando
elas estão na fase móvel, a velocidade de eluição dentro da coluna será sempre
inversamente proporcional ao valor do coeficiente de partição, pois este é proporcional ao
número de moléculas distribuídas na fase estacionária, dividido pelo número de moléculas
distribuídas na fase móvel.
Repetindo, o tempo de retenção, isto é, o tempo necessário para eluir as
substâncias dentro da coluna, desde o instante da injeção até o máximo do pico, será tanto
menor quanto menor for o coeficiente de partição e maior for a velocidade da fase móvel.
Uma mudança de fase móvel acarretará uma competição com os centro ativos da
fase estacionária e o sistema se regerá, na grande maioria dos casos, por meio de valores de
outros coeficientes de partição ou pela existência de uma rede complexa de equilíbrios.
Por esses motivos é que na cromatografia a líquido a fase móvel tem um papel
extremamente importante, pois rege a distribuição dos compostos entre as duas fases e
portanto a ordem de aparecimento e tempo de retenção dos picos.
É importante notar desde já que a mudança da fase móvel poderá acarretar adsorção
lipofílica de grupos não polares sobre o filme da fase não polar, alterando a superfície
exposta para a fase móvel. Assim a adsorção de metanol da fase móvel, através dos grupos
metila adsorvidos nos grupos alquila da fase estacionária, forma uma nova espécie
estrutural que contém grupos hidroxila na superfície.
Esse fato acarreta uma diminuição dos grupos alquila na superfície, alterando as
suas propriedades e diminuindo a superfície unitária alquila, e um aumento dos grupos OH
na superfície, que irão atuar como uma nova fase com valores das constantes de equilíbrio
de partição e solubilidade diferentes, diminuindo portanto o tempo de retenção das
substâncias que anteriormente eram maiores. Um exemplo marcante pode ser dado pela
análise de compostos empregando uma fase de alquil-sílica C18, efetuada com água, e
quantidades de metanol crescentes.
Esse fenômeno tem larga aplicação na cromatografia, pois a superfície pode ser
alterada deixando expostos à fase móvel grupos polares, não polares, ácidos, básicos ou
complexantes.
Novamente esse é um dos fatos experimentais de maior importância, e que permite,
com uma única fase estacionária polar ou não polar, o uso de inúmeras fases móveis e seu
emprego em milhares de tipos de análises.
Eficiência
Nos sólidos porosos, dentro dos poros a movimentação da fase móvel é regida
pelos movimentos moleculares. Nesse caso algumas moléculas são mais retidas do que
outras e portanto temos possibilidade de alargamento dos picos. O diâmetro das partículas
tem grande importância pois a ele está relacionado o comprimento do poro e portanto a
possibilidade da molécula se distrair, durante algum tempo, dentro dele.
Hi = Csm . dp2 . u/Dm
Influência de transferência de massa com a fase estacionária
Após a difusão das moléculas dentro do poro, elas penetram na fase estacionária ou
se ligam a ela por algum mecanismo. Se algumas penetram mais profundamente dentro da
fase estacionária, também demorarão mais a sair e conseqüentemente se atrasarão em
relação a outras e como conseqüência o pico se alargará.
A contribuição ao valor de H será nesse caso de:
Hi = Cs . u . df2 / Ds
Onde df corresponde à espessura do filme da fase estacionária, u à velocidade da
fase móvel e Ds o coeficiente de difusão da substância da fase estacionária.
Difusão longitudinal