CORONAVIRUS E COVID-19

I Coronavirus sono virus capsulati, a singolo filamento di RNA a polarità positiva, con un genoma compreso
tra 25 e 32 kb e un virione di 118-136 nm di diametro.

Sono state identificate due sottofamiglie: Coronavirinae e Torovirinae.

Sono responsabili di patologie che interessano principalmente il tratto respiratorio.

I CoVs erano considerati poco patogeni nei confronti degli esseri umani fino al 2002, quando è stato
identificato SARSCoV. Nel 2014, in relazione ad una patologia acuta respiratoria, è stato isolato un altro
coronavirus (MERS-CoV).

Nel 2019 nella città di Wuhan, Cina, è stato isolato SARS-CoV-2, responsabile di una sindrome respiratoria
acuta, che si è diffuso in tutto il mondo.

Il genoma virale del pangolino e del pipistrello

presentano rispettivamente il 91.02% e 90.55% di
identità rispetto a SARS-CoV-2. Cinque residui
aminoacidici coinvolti nel legame con ACE2 sono
identici tra Pangolin-CoV e SARS-CoV-2, mentre si
ritrovano quattro mutazioni nella sequenza virale
del pipistrello.

Genoma, geni e proteine:

Particelle avvolte e sferiche di 100-160 nm di diametro.

RNA a singolo filamento a senso positivo (ssRNA, dimensione 27-32 kb)

Poliproteina 5'-terminale (pp1ab: 16 proteine non strutturali coinvolte nella trascrizione e replicazione del
genoma)

3' terminale codifica per proteine strutturali: involucro glicoproteine spike (S), capside (E), proteine di
membrana (M) e nucleocapside (N)
Variazioni genomiche in SARS-CoV-2:

Il genoma di SARS-CoV-2 presenta l’80% di omologia strutturale rispetto ai coronavirus umani noti. Le
principali variazioni riguardano l’assenza della proteina 8a e fluttuazioni nel numero di aa delle proteine 8b
e 3c.

Struttura del virione:

Le proteine strutturali che costituiscono la

particella virale sono: la glicoproteina spike (S),
la proteina di membrana (M), il capside (E), il
dimero emagglutinina-esterasi (HE), il
nucleocapside (N)

Ciclo replicativo:
 L’ingresso del virus è mediato
dall’interazione tra la proteina spike e il
recettore ACE2 (angiotensin-converting
enzyme 2); il cleavage della proteina S a
opera della serin proteasi 2 dell’ospite.
(TMPRSS2) precede la fusione alla
membrana della cellula ospite.
Successivamente il virus si scompone
rilasciando il nucleocapside e il genoma
virale.

La sintesi delle poliproteine 1a/1b è realizzata nell’ospite a partire dall’RNA virale. La trascrizione avviene
attraverso il complesso RCT
(replication-transcription complex) e
mediante la sintesi di sequenze
subgenomiche di RNA (sgRNAs). La
terminazione del processo di
trascrizione avviene a livello di
specifiche sequenze regolatorie
localizzate tra i frammenti ORF (open
reading frames). Uno spostamento tra
ORF1a e ORF1b determina la
produzione dei polipeptidi pp1a e
pp1ab che sono processati dalla
proteasi 3CLpro (chymotrypsin-like
protease) o Mpro. Oltre ORF1a e
ORF1b, altre sequenze ORF codificano
per proteine strutturali. La patofiosologia e la virulenza di SARS-CoV-2 sono legate all’attività di nsp (non
structural protein) e di proteine strutturali: in particolare nsp sono in grado di bloccare la risposta
immunitaria innata nell’ospite, mentre il capside promuove l’assemblamento e il rilascio del virus.

Epidemiologia:

25 Novembre 2021: 258.830.438 di casi

confermati e 5.174.646 morti

Sintomatologia:
Diagnosi:

RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) di campioni

raccolti dal tratto respiratorio superiore (nasofaringei o orofaringei), o
dal tratto respiratorio inferiore (espettorato, aspirato
endotracheale/ fluido broncoalveolare in pazienti sottoposti a
ventilazione polmonare).

Test sierologici: attualmente i test sierologici presentano limitazioni legate a specificità e sensibilità. I test
per la rilevazione di anticorpi per SARS-CoV-2 non sono raccomandati per la diagnosi.

Sono di due tipi: qualitativi (o rapidi) e quantitativi.

Entrambi determinano la presenza immunoglobuline,
IgM e IgG. In caso di infezione, le IgM vengono
prodotte in una fase precoce e limitata nel tempo, le
IgG in una fase più tardiva e stabile nel tempo. Nei
primi giorni dopo l’infezione (7-10) gli anticorpi sono
negativi mentre il virus è presente. Nella fase
successiva (7/10-15/20 giorni) compaiono prima le
IgM poi le IgG. Il test anticorpale dovrebbe essere
correlato alla ricerca del virus per avere una
valutazione dello stadio dell’infezione, quindi per
valutazioni di siero prevalenza.

Sintomi lievi: Antipiretici, nutrimento adeguato, idratazione, nessuna terapia antibiotica

Sintomi moderati: Terapia antibiotica per il trattamento della polmonite (co-amoxicillina)

Sintomi severi: Somministrazione di ossigeno supplementare in pazienti con SpO2 ≤ 90%

Trattamento farmacologico: Clorochina e idrossiclorochina (+/- azitromicina), Antivirali: Lopinavir/ritonavir;

Remdesivir; Umifenovir; Favipiravir, Immunomodulatori: Tocilizumab, Interferone-β-1 a Plasma terapia.

In pazienti affetti da COVID-19 si osserva un’iperattivazione di

linfociti e macrofagi con conseguente produzione eccessiva di
citochine, tra cui interleuchina-6 che, in seguito al legame al
recettore, causa un’acuta risposta infiammatoria nei polmoni e in
altri tessuti e organi.

Tocilizumab, un anticorpo monoclonale, si lega al recettore di IL-6,

alleviando la risposta infiammatoria derivante dal legame del
substrato naturale.
Clorochina e Idrossiclorochina:

Inibizione di enzimi virali (DNA e RNA polimerasi) e processi virali (glicosilazione di proteine virali,
assemblaggio, trasporto e rilascio del virus);
inibizione del recettore ACE2, dei processi di fusione
e del rilascio di citochine. Trial clinici condotti su
pazienti ospedalizzati hanno evidenziato una
riduzione della concentrazione virale in pazienti
trattati con idrossichinolina e azitromicina.

Non approvati dalla FDA per il trattamento di

COVID-19.

Principale effetto collaterale: prolungamento dell’intervallo QT.

Target Virali:

Mpro (3CLpro o principale proteasi), essenziale per processare le poliproteine trasdotte dall’ RNA virale.

PLpro (Papain-like protease), enzima essenziale per processare le poliproteine virali al fine di generare un
complesso di replicazione funzionale.

Proteina S, coinvolta nell’interazione con la cellula ospite mediante le subunità S1 e S2.

RNA Polimerasi RNA-dipendente (RdRp) media la trascrizione e la replicazione del genoma durante
l’infezione virale.

NTPasi/elicasi (nsp13) è una proteina chiave nel complesso RCT di CoVs che catalizza la separazione degli
oligonucleotidi a doppio filamento in filamenti singoli, pertanto, risulta fondamentale nella sintesi di RNA
virale.

La principale proteasi di SARS-CoV-2 è costituita da tre domini. Il sito attivo della proteina si trova
all’interfaccia tra i domini I (residui 8–101) e II (residui 102–184) e presenta una caratteristica diade Cys-
His, un residuo attivatorio (His) che rimuove protoni dal gruppo tiolico della catena laterale di un secondo
residuo (Ser) che agisce come nucleofilo.
Inibitori di Mpro:

Target Virali:
PLpro è una cistein proteasi, il cui meccanismo d’azione prevede l’idrolisi delle proteine ubiquitina e ISG15
(interferon-induced gene 15) che hanno un ruolo fondamentale nella risposta immunitaria innata durante
le infezioni da SARS-CoV. PLpro inibisce la produzione di citochine, tra cui IFNb e chemochine come CXCL10
e CCL5.

Inibitori di PLpro:

Composti attivi a livello della proteina S:

Inibitori di RdRp:
Inibitori dell’elicasi nsp13:

Potenziali target dell’ospite:

L’entry di SARS-CoV-2 è mediato dall’interazione del virus con diversi recettori

localizzati sulla superficie della cellula ospite, tra cui il recettore ACE2. Si tratta
di una zinco metalloproteasi costituita da 805 amminoacidici, che può essere
funzionalmente divisa in un dominio catalitico amino-terminale e un dominio
carbossilico. Strategie per inibire l’interazione con il recettore ACE2:

1) Sviluppo di un vaccino basato sulla proteina Spike.

2) Inibizione dell’attività della serin proteasi transmembrana 2
(TMPRSS2), che è coinvolta nell’attivazione della proteina spike che si
lega al recettore ACE2.
3) Blocco del recettore ACE2 mediante l’utilizzo di small molecules o
anticorpi.
4) Somministrazione di una forma solubile di ACE2, in grado di
competere con il recettore della cellula ospite nel legame con la
glicoproteina S.
Serin Proteasi Transmembrana 2 (TMPRSS2):

É in grado di innescare il processo di fusione tra il virus e la membrana della cellula ospite. TMPRSS2 è
maggiormente espressa a livello dell’epitelio del tratto gastrointestinale, urogenitale e respiratorio e attiva
la proteina S.

Catepsina L:

L’attivazione
della proteina
spike di SARS-
CoV-2 effettuato
ad opera di
diverse proteasi
è un processo
chiave nel processo di infezione virale. La catepsina L
(CatL), una delle principali cistein proteasi espressa nelle
cellule animali, è coinvolta nell’endocitosi del virus. Essa
agisce mediando il cleavage della subunità S1 della
glicoproteina spike. Strutturalmente è costituita da due
domini, all’interfaccia dei quali è localizzato il sito attivo che contiene i residui catalitici Cys25 e His163.
Meccanismo d’azione di CatL:

In seguito al legame della subunità S1 della

proteina S ad ACE2 si innesca un processo di
endocitosi. SARS-CoV-2 resta legato ad ACE2
all’interno delle vescicole neoformate, quindi, a
livello degli endosomi CatL stacca la subunità S1
liberando il virus. La subunità S2 sulla superficie
del virus media la fusione con gli endosomi,
determinando il rilascio di RNA virale nel citosol.

Vaccini:

I principali target identificati per la produzione di vaccini sono la glicoproteina S e il complesso RBD.

La proteina S è coinvolta nell’indurre la risposta immunitaria durante l’infezione da SARS-CoV evocando la

produzione di anticorpi e cellule T.

Le strategie adottate prevedono l’utilizzo di anticorpi in grado di neutralizzare l’intera sequenza della
proteina spike o il complesso RBD (S1-receptor-binding domain) e la loro espressione all’interno di vettori
virali, DNA o particelle simil virali.

Questo tipo di vaccino può indurre anticorpi che bloccano sia il legame al recettore che l’uncoating del
virus.
Attualmente vengono utilizzati due tipi di approccio nello sviluppo di un vaccino:

1) L’approccio whole-microbe:

 Vaccino inattivato: consiste di particelle virali, inattivate tramite agenti chimici, calore o radiazioni,
che vengono somministrate per indurre una risposta immunitaria adattativa (vaccino per la
poliomelite).
 Vaccino vivo-attenuato: utilizza una versione indebolita del virus, ma ancora viva; non può essere
utilizzato in pazienti immunodepressi (vaccino per il morbillo).
 Vaccino a vettore virale: utilizza un virus inattivato per sviluppare specifiche proteine (antigeni) in
grado di generare una risposta immunitaria nell’ospite; le istruzioni per sintetizzare queste proteine
vengono inserite in un virus inattivato, che funge da vettore per il loro trasporto nell’organismo.
Esempio è il vaccino Janssen che utilizza un adenovirus umano di tipo 26 inattivato in cui sono state
inserite le informazioni per la produzione della proteina Spike.

2) L’approccio subunit:

 Vaccini ad acido nucleico: utilizzano una sezione di materiale genetico che trasporta le istruzioni
per la sintesi di specifiche proteine. Agisce tramite inoculazione di frammenti di mRNA o DNA nelle
cellule umane, le quali vengono indotte a produrre antigeni di organismi patogeni o antigeni
tumorali, che poi stimolano una risposta immunitaria adattativa.

I due vaccini COVID-19 a mRNA approvati per la campagna vaccinale utilizzano molecole di mRNA che
contengono le istruzioni per la sintesi della proteina Spike.

Le proteine prodotte stimolano il sistema immunitario a produrre anticorpi specifici. In chi si è vaccinato e
viene esposto al contagio virale, gli anticorpi così prodotti bloccano le proteine Spike e ne impediscono
l’ingresso nelle cellule.

Vaccini a mRNA sono: BNT162b2, noto come Pfizer-BioNTech e Spikevax, noto come Moderna.