Biologia molecolare

Il dna è il fattore trasformante

Esperimento di harshey-case esperimento del frullatore forsforo radiottivo per il dna e zolfo
radioattivo per le proteine.
Utilizzano un frullatore per staccare le particelle di fagi dai batteri e misurano la radioattività nel
sedimento e nel liquido. Misurando la radioattività troveranno nel primo caso nelle proteine i fagi
infettano i batteri non troviamo radioattività, nel secondo caso troviamo i la radioattività nei
batteri
La struttura del dna
La regola di Chargaff studia gli acidi nucleici e osserva la composizione in basi di varie specie e nota
che c’è sempre una corrispondenza tra le percentuali delle basi (adenina e timina hanno stesso
contenuto e citosina e guanina hanno stesso contenuto)
Franklin diffrazione ai raggi X e ottiene una particolare struttura del suo cristallo di dna
Successivamente watson e crick leggendo l’articolo di franklin, iniziano lo studio della struttura del
dna a doppia elica insieme a …
MOLECOLA DEL DNA
Struttura a doppia elica AT,CG e si trovano all’interno della doppia elica antiparalleli
L’appaiamento delle basi
Le purine si appaiano solo con le pirimidine
Tre legami idrogeno per legare citosina e guanina
Due legami ad h per legare adenina e timina
Una cellula umana impiega 8 ore per replicare il proprio DNA, si trovano 3 miliardi di coppie di basi
in circa due metri di DNA
Condividiamo circa il 99,9% del dna sono lo 0,01% ci rende unici
Il carattere acido è dato dall’acido fosforico, zucchero pentoso(desossiribosio DNA, ribosio RNA) e
una base azotata. Gli zuccheri sono presenti in forma ciclica. Purine hanno due anelli ciclici
adenina e guanina. Le pirimidine hanno un solo anello timina e citosina
La timina si trova solo nel DNA, nell’RNA troviamo al suo posto l’uracile
Le basi azotate si legano al C 1 dello zucchero e si legano all’azoto 9 o 1, legame N beta glicosidico
L’insieme dello zucchero e della base forma il nucleoside
Il legame glicosidico è libero di ruotare (sin e anti) determinante per la struttura del DNA
Il doppio legame si può trovare in forma enolica e chetonica
Metilazione (approfondisci)
Il nucleotide nucleoside e il gruppo fosfato, il gruppo fosfato si lega attraverso un legame
fosfodiesterico e si lega ai carbonio 1’ e 5’ dello zucchero
Nucleoside monofosfato di e tri
Polimero di nucleotidi=DNA
I due filamenti sono antiparalleli avvolti ad elica, larghezza di 20 A, solco minore e maggiore
(reagiscono con le proteine)
Il dna ha questa struttura poiche la piu stabile, le basi essendo idrofobiche sono poste all’interno
della doppia elica, la molecola di dna è definita anfipatica, lo scheletro fosfato e zucchero è +
L’appaiamento specifico è possibile per mantenere una distanza costante tra i due scheletri
antiparalleli
I perché della doppia elica 5’ 3’ andamento antiparallelo perché energicamente più stabile
Andamento elicoidale energeticamente favorevole per avvicinare le basi, impilamento delle basi.
Le forze di van der waals stabilizzano la doppia elica
Variazioni sul tema DNA A, B e Z
Derivano dalle variazioni nell’umidità relativa che causano variazioni della struttura(da B normale
ad A, in cui assume una struttura molto differente) e la conformazione dello zucchero.
Carbonio c2 r c3 dello zucchero possono assumere diverse conformazioni
Diff. Tra DNA A e DNA B
La forma A è forzata da proteine che danno queste struttura differente dalla B
Possiamo avere anche una conformazione differente del legame glicosidico che puo essere sin e
anti
Nel dna a e b il legame glicosidico si trova in anti, ma in quello z le purine sono in conformazione
sin e le pirimidine in anti
Il DNA z è l’unica struttura risolta a doppia elica sinistrorsa, è favorito dalla metilazione delle
citosine e dal legame con alcune proteine
La doppia elica del dna è una struttura flessibile e non sempre costante lungo tutta la sua
lunghezza. Alcune distorsioni dipendono dalle sequenze di basi. Unaltro esempio è la rotazione
dell basi, che tendoo a stare all’interno della doppia elica, ma possono essere ruotate verso
l’eserno attraverso enzimi, molto necessario nella rimozione degli appaiamneti sbagliati
Appaiamenti non canonici= coppie di hoogsten adenina adenina, adenina timina, timina citosina.
Appaiamenti a tre (triplette di hoogsten) A AT, C GC. O4 basi che si appaiano a livello dei telomeri
Sequenze ripetute e palindromiche (in entrambe le direzioni) a forcina e cruciforme
Similitudini tra DNA e RNA = zucchero, timina e uracile, doppio e singolo filamento

Proprietà del dna e applicazione in laboratorio

Il dna è solido (fibra) rna polvere, insolubili in solventi organici ma solubili in alcol, le basi azotate
contengono dei gruppi aromatici assorbono la luce a 260nm, la doppia elica è tenuta insieme da
energia e i due filamenti possono essere denaturati quindi separare la doppia elica
Il dna assorbe luce a 260nm, grazie alle basi azotate:
Applicazione 1 stima di concertazione di dna in base all’assorbanza, con la legge di iambert-beer
A=log
sperimentalmente una soluzione alla concentrazione di 50 yg/ml di dna a doppia elica ha un
assorbimento di 1.0, cioè 50yg/ml di dna a doppia elica leggono un valore di assorbanza a
260nm=1
esercizio concentrazione di un campione di dna che ha una assorbanza di 0.327?
50yg/ml:1=x:0,327
X=16,35 ug/ml
 33yg/ml di dna a singola elica leggono un valore di assorbanza a 260 nm=1
 40 yg/ml di rna leggono un valore di assorbanza a 260nm=1
Applicazione 2 stima la purezza del DNA in base all’assorbanza
La purezza del DNA si ricava dai rapporti tra le assorbanze 260, 280 e 230
Il rapporto A260/A280 ci permette di valutare la contaminazione da proteine: il valore ottimale è
per il DNA intorno 1,8, per RNA intorno a 2.
Il rapporto A260/A230 ci permette di valutare la contaminazione da carboidrati e solventi organici
il valore ottimale è uguale a 2,2
1. 50yg/ml:1=x:0,550
X= 27,5
1000/20=50
27,5*50=1375yg/ml
1,375yg/ml*50= 68,75
A260/a280=0,550/ 0,
2. A260=
 50yg/ml :

3. 5.8 esercizio
Xyg/ml/ 0.125OD = 33yg/ml/1OD
X yg/ml=0.125*33yg/ml=4.125

5.11
 Applicazione 3 il dna denaturato puo riassociarsi: tecniche di ibridazione
Il dna puo essere denaturato
Il fenomeno dell’appaiamento delle basi può essere applicato nelle tecniche di ibridazione: dna
complementare anche appartenenti a specie diverse possono riformare una doppia elica
Ibridazione > piccole sequenze di dna possono essere usate per cercare sequenze complementari:
 southern blots: dna:dna
 Northern blots: dna:rna
 In situ hybridization
 Dot blots..
 Applicazione 4 calcolare la temperatura di melting o annealing (appaiamento).
Quantità di di ponti H. Effetto ipercromico aumentando la temperatura aumenta anche
l’assorbanza, la temperatura alla quale si ha metà filamento si chiama temperatura melting
La temperatura di melting dipende dal contenuto in bas, lunghezza della molecola e dalla forza
ionica Tm=4°C*(N° di G+C)+2°C*(N° di A+T)

Discovery of restriction enzymes enzimi di restrizione (le forbici molecolari del DNA)
 Le esonucleasi, tagliano il DNA dall’esterno verso l’interno, riconoscono il terminale del
DNA e lo digeriscono (bal31 e esonucleasi III)
 Le endonucleasi tagliano il DNA all’interno riconoscono il terminale e li digeriscono verso
l’interno (nucleasi S1, DNasi I, endonucleasi di restrizione)
Le endonucleasi di restrizione riconoscono sequenze specifiche di dna e restringono la gamma
di fagi. Nel genoma batterico le sequenze che rappresentano i siti di restrizione sono protette da
metilazione (in A oC), mentre in altri organismi non sono metilate e quindi possono essere
riconosciute e tagliate.
 metilazione delle basi impedisce il riconoscimento del sito di taglio dalla maggior parte del
filamneto??
I siti di restrizione sono spesso sequenze palindrome (es. Hannah hannaH) ATTIVITÀ ENZIMATICA
Ogni nucleasi riconosce una sequenza specifica (Ecor1, escherichia coli r13 il primo enzima
individuato)
Una sequenza può essere riconosciuta da più enzimi (isoschizomeri)
Un enzima=una sequenza una sequenza=più enzimi (più isdcoschizomeri)
Estremità piatte e coesive
Coesive quando tagliano in modo sfasato, chiamate così in quanto possono a riappaiarsi
Piatte quando si taglia in modo piatto, netto
Ogni enzima taglia in presenza di determinate sostanze (buffer) ed ad una specifica temperatura
(solitamente 37°C), alcuni enzimi sono metilazione dipendenti, alcuni danno star activity (quando
si hanno dei tagli al difuori delle sequenze), possono essere inattivati con il calore.
ALLESTIRE UNS REAZIONE DI DIGESTIONE
 Buffer
 100yg/ml BSA
 DNA
  Enzima di restrizione (1 unità di enzima digerisce 1yg di DNA in un ora)
 Incubare a temperatura richiesta
Applicazioni pratiche
Come capire se l’enzima ha digerito il DNA “vedere” il DNA
 È necessario costruire una mappa di restrizione del nostro DNA
Gel elettroforesi
 il DNA è una macromolecola con carica globale negativa
 in un campo elettrico il dna si muoverà in base alla dimensione e alla conformazione
il gel è fatto di mannosio e galattosio che formerà l’arnosio, forma delle maglie attraverso i quale il
DNA si muove. Come visualizzare il DNA:
un intercalante presenta una struttura che si può inserire (ed ha un grande incremento della
fluorescenza quando è legato), la fluorescenza si osserva illuminando il gel con luce un UV. Il dna
corre in base alla dimensione dei frammenti e per sapere la grandezza di questi frammenti si
utilizzano
il secondo criterio è la conformazione del dna (circolare chiuso avremo diverse bande, più è
avvolto più migrerà nelle bande del gel)
gel di poliacrilamide Davide chi è formato da due elementi l'acrilamide e la bis acrilamide e con lo
stesso principio formano delle mani lunghe queste maglie però sono molto più strette rispetto a
quella della della garosio e gli permettono di separare dei frammenti di massimo 1000 paia di basi
quindi se sono più grandi di 1000 non entrano nelle maglie In altre parole ma soprattutto hanno
una risoluzione molto più elevata rispetto al gel di agarosio perché vi permettono di separare dei
frammenti che differiscono l'uno dall'altro per un solo nucleo e quindi li saranno molto utili per i
gel di sequenza quando impareremo qual è il principio di che viene applicato che era sequenziare
un frammento di DNA se torniamo un secondo indietro ai nostri gel di agarosio invece la loro
risoluzione che la croce poi il granaio la cri l'ala di monomeri i polimeri di acrilamide hanno una
concentrazione fissa mentre con la garosio potete giocare sulla concentrazione di agarosio la
droga è una polvere quindi potete pesare più agarosio e ottenere delle maglie più strette ok quindi
se dovete separare dei frammenti grandi ta 60 da 5 a 60 kg basi dovete utilizzare delle maglie
l'asse perché altrimenti il 60 kg basi non riesce a entrare all'interno delle maglie del gel e quindi
usate una concentrazione dello zero 3% di agarosio e poi salite in base a quello che volete vedere
per esempio con frammenti da 100 paia di basi fino a 3 kg basi potete arrivare a 2% di agarosio
potete arrivare ancora più alti come concentrazione anche tre 03:30 per 100 utilizzando della
garosi particolari che hanno una da una capacità di sciogliersi anche la concentrazione elevata ok e
quindi abbiamo visto come fare una mappa di restrizione come tagliare il DNA quali enzimi
utilizzare la temperatura il buffer e siamo sappiamo costruire una reazione di digestione sappiamo
guardare i frammenti e quindi vediamo un po alcune applicazioni pratiche di queste due tecniche
messe insieme quindi la prima applicazione e può essere diagnostica l'abbiamo già accennato alla
volta scorsa quindi ad esempio se noi abbiamo un individuo che è eterozigote per un determinato
snipe quindi avrà su un cromosoma questa sequenza su un'altro cromosoma quest'altra sequenza
la differenza sta soltanto nella a vedete che qui è la sequenza ECCPGAPACCT GTGG
Che è questo signore quso
Souther prendere il gel e trasferire il dna su un supporto fiddo e immobilizzarlo su un substrato
vediamo un po questo esempio allora qui abbiamo preso l'enzima di questa pianta quando
abbiamo digerito abbiamo fatto l'elettroforesi abbiamo ottenuto questi frammenti che abbiamo
detto il suggello di agarosio non distinguiamo allora questi diennea viene trasferito su un supporto
di nitrocellulosa viene fissato questa nitrocellulosa quindi questa volta questa struttura questa
situazione qua ce l'avete fissata su carta su questa membrana di nitrocellulosa una volta che è
fissata sulla membrana dovete denaturare DNA perché altrimenti la vostra sonda radioattiva un po
trovare il proprio complementare quindi sotto ponente la membrana a una serie di tampone
utilizzando utilizzate dei tamponi che denaturano il DNAE quindi avete sulla vostra membrana e
ina la copia del vostro gel con il DNA dei nastri ok e quindi avete trasferito tutto quanto sulla
vostra membrana ok scusate la denaturazione l'ha fatto ovviamente al prima del trasferimento
quando è ancora all'interno del genere altrimenti la carta si quindi ripeti a te correre su gel
denaturate DNAE trasferite viene ha già denaturato sulla membrana allora marcate la sonda
quindi semplicemente copiato un tratto di DNA mettendo all'interno della reazione di effettuata
da una normale diennea polimerasi un isotopo radioattivo del futuro che creerà quindi la vostra
sonda marcata radioattivamente vado veloce qua non mi importa comunque come facciamo oh a
questo punto avete diennea sulla vostra membrana lo mettete a contatto con la vostra sonda
marcata radioattivamente e lei andrà a cercare il proprio complementare può trovare una banda
ne può trovare più di una a seconda di come è stato tagliato il nostro gene di Internet bene te
ingrandito quello che succede quindi la vostra sonda cercherà il suo complementare e si Lega
lavaggi per eliminare tutto quello che non sia attaccato e poi coprite la vostra nitrocellulosa con
una lastra fotografica lasciate al buio e le emissioni le particelle beta emesse dal vostro chicos
fosforo radioattivo andranno a imprimere la lastra fotografica quindi farete una auto radiografia
estrai la lastra quindi qui avete la vostra sonda che emette le particelle beta perché è radioattiva ci
appoggiate sopra la nostra per particelle in primo no la lastra fotografica sviluppate la lastra
fotografica e ottenete quindi una la presenza di bande specifiche che vanno a identificare la
presenza del vostro gel all'interno di quella strisciata che avevate all'inizio ok quindi dalla da qui
avete delle bande radioattive che vi dicono che il vostro genere va in questi tre posizione ok devo
ripetere bene ok allora sulla base di queste informazioni qui abbiamo riassunto con gli estratti gli
anni ha digerite fate l'elettroforesi trasferite ibridate e fate l'autorita grafia sviluppate alla lastra
OK sulla base di queste informazioni io vi queste e
DNA POLIMERASI (guarda registrazione)

RIMOZIONE DEGLI INNESCHI

La RNasi H riconosce un ibrido DNA:RNA e idrolizza l’RNA associato lasciando l’ultimo
ribonucleotide
L’ultimo ribonucleotide, quello al 5’-P, viene rimosso dalla DNA polimerasi I
La DNA polimerasi I sintetizza i nucleotidi mancanti
La DNA ligasi ricrea il legame fosfodiesterico tra l’estremità 5’-P e il 3’-OH
TERMINAZIONE DELLA REPLICAZIONE
Nel cromosoma circolare di E. Coli esistono due punti di terminazione posti a circa 100Kb di
distanza. Queste sequenze di una ventina di bp sono riconosciute da una proteina (Tus) che blocca
le forcine di replicazione
Quando una forcella reggiunge la fine del cromosoma
Quando viene sintetizzato l’ultimo frammento di okazaki primasi sinteetizza l’innesco a RNA
Allungamento de parte di DNA polimersi eliminazione dell’innesco riempimento del gap, unione

Telomeri ripetizioni di tandem di sequenze ricche in G

La telomerasi è un ezima che sintetizza DNA da un temlato di RNA
Malattie date dalla riparazione del DNA