Tricrómico de Masson

Las tinciones tricrómica son usadas frecuentemente para diferenciar

entre colágeno y músculo liso en tumores e identificar incrementos en
tejidos colagenosos en enfermedades como cirrosis hepática.
Tinción tricrómica más simple ya que ocupa solo dos colorantes
aniónicos después de la tinción nuclear con hematoxilina férrica. Se
pueden hacer variación utilizando distintos colorantes o soluciones con
distintos heteropoliácidos.

Fundamento

El rol jugado por el ácido fosfomolíbdico en la tinción selectiva de fibras

del tejido conectivo, fue investigado probando la hipótesis: el ácido se
une al tejido y de este modo conserva la capacidad de unir colorantes,
por la formación de enlaces salinos con sus grupos básicos (del ácido).
La reacción del azul de molibdeno demuestra que el ácido
fosfomolíbdico se une a muchas estructuras las cuales son teñidas
selectivamente por métodos tricromicos o por la combinación de tinción
acido-base del ácido fosfomolíbdico, particularmente tejido conectivo.
Así las propiedades adquiridas de la tinción por las fibras del tejido
conectivo, después del tratamiento con ácido fosfomolíbdico están
probablemente debido a la presencia de este acido sobre las fibras. El
ácido fosfomolíbdico no fue desplazado por el colorante, como sugirió
Zeiger, desde una reacción de azul de molibdeno de intensidad regular
podría ser aun obtenida después de la tinción con verde claro.
A cualquier velocidad el ácido fosfomolíbdico es intercambiado,
probablemente por un anión.
Esto, obviamente, no ocurre desde un colorante aniónico puro que no
tiñe fibra del tejido conectivo después del ácido fosfomolíbdico.
Se concluye que el ácido fosfomolíbdico es retenido por el tejido y por
enlaces moleculares de colorantes. Hay varias evidencias de que el
enlace entre el ácido fosfomolíbdico y el colorante es de naturaleza
salina:
1-. La presencia de grupos cationicos en el colorante era indispensable
para teñir después del ácido fosfomolíbdico.
2-. Grupos básicos fuertes producen tinción mas intensa
3-. Con colorantes débilmente básicos bajando el pH, y por lo tanto
aumentando la disociación de grupos básicos, también aumenta la
intensidad de colorantes.
4-. Otros enlaces tales como valencias residuales o puentes de
hidrogeno no juegan, probablemente, un rol esencial ya que un numero
de colorantes muestra distribución asimétrica de cargas eléctricas y H
(labiles) no fueron, o sólo escasamente, establecidos después del
tratamiento con ácido fosfomolíbdico. Se concluyó que el colorante y el
acido fosfomolíbdico forman una sal en la cual el colorante es el cation.
El hecho de que las fibras de tejido conectivo se unen a sustancias con
propiedades acidas (ácido fosfomolíbdico o colorantes con grupo ácido)
sugiere que estas fibras contienen grupos básicos, los que forman sales
con el ácido fosfomolíbdico. Así el ácido fosfomolíbdico polivalente
aparece para formar un puente entre los grupos básicos del sustrato y
los grupos básicos del colorante. En otras palabras la adición del ácido
fosfomolíbdico en tejido conectivo cambia su acidofilia por basofilia.

El ácido fosfomolíbdico no solamente produce una tinción intensa de las

fibras de tejido conectivo por colorantes de grupos básicos (colorantes
básicos o anfotéricos), pero también reduce la tinción del citoplasma, así
produce una tinción específica de fibras del tejido conectivo.
La explicación de este segundo efecto se encuentra en el hecho de que
en el citoplasma, el cual es conocido por teñirse con colorantes de
grupos ácidos (colorante acido o anfotérico), se producen algunos
enlaces de ácido fosfomolíbdico, aunque menos que en el tejido
conectivo.
Las cantidades pequeñas de ácido fosfomolíbdico en el citoplasma
previene la salida del colorante acido, y ocurre para tinciones escasas
obtenidas con colorantes anfoteritos y para tinciones moderadas
obtenidas con colorantes ácidos.

Los procedimientos tricrómicos son nombrados así porque se usan tres

tipos de tinciones, que pueden incluir o no la tinción nuclear.
Las secciones se tiñen primero con un colorante ácido como el escarlata
biebrich, todos los elementos acidofilicos del tejido como citoplasma,
músculo y colágeno se unirán a los colorantes ácidos.
Las secciones después son tratadas con acido fosfotúngstico y/o ácido
fosfomolíbdico.
Dado que el citoplasma es mucho menos permeable que el colágeno, el
ácido fosfotúngstico y ácido fosfomolíbdico, causan que el colorante
escarlata biebrich difunda hacia fuera del colágeno pero no del
citoplasma.
Acido fosfotúngstico y/o ácido fosfomolíbdico tienen numerosos grupos
acídicos que muy probablemente actuaran como un enlace entre el
colágeno descolorado y el azul de anilina, el colorante de colágeno.
Probablemente el pH de la solución ácida fosfotúngstico/ácido
fosfomolíbdico también incremente la coloración selectiva del colágeno
y contribuye a la difusión o remoción del escarlata de biebrich.

Reactivos

Solución de hematoxilina férrica de Weigert.

Solución A:
Solución B:
- Hematoxilina cristalizada 1 gr
- Alcohol 95-100% 100 - Cloruro Ferrico 1.5 gr
ml - Agua destilada 95 ml
- Dejar reposar unos 8 min - Acido Clorhídrico 1 ml
antes de usar concentrado
Solución Biebrich Scarlett- fucsina acida:

- Biebrich Scarlett 1% solución acuosa (C.I 26905) 45 ml

- Fucsina Acida 1% solución acuosa (C.I 42685) 5 ml

- Acido Acético glacial 1 ml

Solución PMA-PTA (Ac. Fosfomolibdico- fosfotungstico)

- Acido Fosfomolibdico 1.25

gr
- Acido Fosfotungstico 1.25
gr
- Agua estilada 50
ml
Solución de Anilina

- Azul de Anilina (C.I 42755) 1.25

gr
- Acido Acético glacial 1
ml
- Agua estilada 50
ml

Solución acuosa de ácido acético glacial al 1%.

Reacción

a) Hematoxilina férrica de Weigert (I)

*Colorante aniónico
*Actúa como mordiente
- Aplicación de alcohol acido para la diferenciación de la tinción nuclear.

b) Solución de Biebrich scarlett-Fucsina ácida (II)

*Colorante aniónico

c) Solución ácido fosfomolíbdico-fosfotúngstico (PMA-PTA)

*Actúa como mordiente y diferenciador
*Solución muy aniónica y de moléculas grandes
*Saca el exceso de colorante y se queda unido al tejido conectivo favoreciendo que el
azul de anilina se una por medio del ácido.

d) Azul de anilina o azul de metileno (III)

*Colorante catiónico

e) Solución de ácido acido acetico.

Procedimiento de Tinción Masson
1. Desparafinar (Xilol I, II, III cada uno por 5 min)

2. Hidratar (OH 100º I, II, III; OH 95º I, II y OH 70º I, cada uno 5 min)

3. Agua destilada (5 min)

4. En material fijado en soluciones de formaldehído o alcohólicas se

recomienda hacer un mordentaje previo con líquido de Bouin durante 1
hora a 56-60 ºC o toda la noche a temperatura ambiente.

5. Enfriar y lavar con agua destilada hasta que desaparezca el color

amarillo

6. Lavar en agua destilada

7. Teñir con Hematoxilina Ferrica de Weigert (10 min)

8. Lavar con abundante agua corriente (hasta que los núcleos se vean
nítidamente negros)

9. Lavar con agua destilada

10. Teñir en solución Biebrich Scarlett- fucsina acida (2 min)

11.Lavar en agua destilada

12. Colocar en solución PMA-PTA (10-15 min)

13.Lavar con agua destilada

14. Teñir en azul de anilina (5 min)

 15.Lavar con agua destilada

16. Colocar en solución Acido Acético 1% (3-4 min)

17. Deshidratar (desde alcohol de 95º por 2 min, OH 100º I, II, III cada uno
por 5 min)

18. Aclaramiento (Xilol I, II, III cada uno por 5 min)

19.Montar

Resultados Esperados Masson

Estructura celular color

Fibras colágenas Azul o verde
Musculatura Rojo
Citoplasma Rojo
Queratina Rojo
Fibras Musculares Rojo
Núcleos Azules