Ionización de la taurina en bebida energética (Pike) para

cuantificación de cafeína en UV
Nathalia Paredes Camacho, Yined Montilla Erazo
Departamento de Química, Universidad del Cauca, Colombia

Resumen

Se partió de una metodología propuesta, no referenciada en la literatura, pero si basada en la polaridad de la

taurina para convertirla en su sal sódica. El tratamiento llevó la bebida energética (Pike) a un pH cercano a
nueve para ionizar la molécula de taurina garantizando que en estado salino fuera más afín en la fase acuosa o
polar y no en la fase orgánica. Se realizó una curva de relación entre el pH de la taurina y su absorbancia
logrando que a un pH de 8,87 la absorbancia fuera de 4,16E-3 ± 2,92E-3, haciendo que la interferencia
prácticamente dejara de absorber. A cambios de pH, la cafeína produjo un mínimo en la señal que puede
asociársele al cambio entre un estado y otro, mientras el alcaloide alcanza la forma no iónica que se busca,
por su mayor constante de distribución en diclorometano (Kd=4,8) [1]. A un pH ligeramente por encima de la
neutralidad (7,17) la cafeína presenta mayor absorción y se mantiene constante al menos hacia estados más
básicos, lo que se interpreta como el rango en el que la cafeína alcanza transiciones y disposiciones que
favorecen una lectura de señal mayor. Con el objetivo de aceptar o rechazar la hipótesis nula (H0:
Cuantificación de cafeína en Pike descartando la presencia de taurina) por conversión de taurina en su sal
sódica, se llevó a cabo cromatografía de capa fina o TLC para caracterizar cafeína y taurina, comprobándose
la presencia tanto de cafeína como de taurina en la muestra problema pero esta última además, contenida en el
solvente de extracción, creando ambigüedad sobre H0 puesto que o se rechaza por contaminación o es incierta
por la misma razón.

Palabras clave: Polaridad; Taurina; Absorbancia; Cafeína; Hipotésis nula; TLC.

Abstract

Was based on a methodology proposed, it wasn´t referenced in literature, but that was based in polarity of
taurine to change the taurine in its sodium salt. The treatment basified energy drink (Pike) to a pH near to nine
to ionize molecule of taurine ensuring that in saline state was more akin to aqueous phase or polar but don´t in
organic phase. Was performed a curve of relation between pH versus absorbance respect to taurine achieving
that pH of 8,87 the absorbance was 0,004± ppp, doing that interference ceased to absorb. To changes of pH,
the caffeine produced a minimum can be associated a change from one state to another, while alkaloid reaches
ionic form due to its higher distribution constant in dichloromethane (Kd=4,8) [1]. To pH slightly above
neutrality (7,17) the caffeine presents major absorbane and remains constant at least to more basic states, that
means caffeine reaches major number of unsaturations favoring a highest reading of signal. With the objective
to accept or reject the null hypothesis (H0: Quantification of caffeine in Pike discarding presence of taurine)
by conversion of taurine in its sodium salt, was performed thin layer chromathography or TLC to characterize
caffeine and taurine, prove presence since caffeine as taurine in problem sample but this latter also, contained
in extraction solvent, creating ambiguity about H0 because it is rejected for contamination or it is uncertain for
the same reason.

Keywords: Polarity; Taurine; Absorbance; Caffeine; Null Hiphotesys; TLC.

1. Estado del arte
Una técnica para la cuantificación de cafeína
en bebidas energéticas se ha aplicado en la
cromatografía de capa fina de alta resolución o
HPTLC [2]. El procedimiento se basa en la
centrifugación y sonicación de una muestra de
producto herbal o bebida energizante en medio
metanólico. La suspensión resultante es
decantada, filtrada, secada en corriente de
nitrógeno y aplicada sobre HPTLC. El
procedimiento no menciona un paso de
eliminación de interferencias puesto que el
factor de retención (Rf) de la cafeína en el
análisis en HPTLC es de 0.38 ± 0.01 y la
resolución de las bandas es ≥ 1. Además los Rf
de las otras sustancias son diferentes al
reportado por la cafeína. En otros
procedimientos, la absorción por
*
fluorescencia [3] previa derivatización y por
HPLC con pre-columna derivativa [4] son los
métodos empleados para la determinación de
taurina. No hay disponibilidad reciente de
procedimientos para cuantificar cafeína en
bebidas energéticas por absorción UV-visible.
En algunos procedimientos se hace necesaria
la derivatización de la taurina a NBD-taurina
la cual en un espectro de absorción muestra un
máximo de intensidad a 470 nm. La
derivatización o la conversión de la taurina en
otra especie que no altere la absorción de
cafeína, sería una forma de acortar la
interferencia. Otro procedimiento determina
simultáneamente cafeína, taurina y otros
componentes por cromatografía plana y
detección múltiple confirmada por
espectrometría de masas [6].
*
Método oficial aplicado en alimentos para mascotas,
pero que por su procedimiento podría ser adaptado a
bebidas energéticas con algunas modificaciones.
2. Metodología
2.1 Curva pH contra Absorbancia para
cafeína y taurina
2.1.1 Se preparó una solución de cafeína y
taurina de 10 ppm.
2.1.2 Se tomo la absorbancia de cada solución
desde el pH natural hasta grados alcalinos y
cercanos a nueve. Se tomaron 3 datos por
curva.
2.1.3 Los puntos se tomaron hasta que la señal
de la cafeína se mantuvo constante y en la
taurina hasta que la absorbancia se redujera al
mínimo.
2.1.4 Se preparo una solución de taurina y
cafeína de 10 ppm en diclorometano y se llevo
al grado de basicidad límite establecido en la
curva.
2.1.5 Se midió absorbancia sobre los pH
relacionados.
2.2 Extracción de cafeína de la bebida
energética
2.2.1 Se tomaron 80 mL de la bebida por
duplicado y se dispuso en sendos embudos. Se
marcaron como Muestra problema 1 (MP 1) y
muestra problema 2 (MP 2).
2.2.2 La MP 2 se dopó con 10 mL de 100 ppm
de un patrón de cafeína en agua.
2.2.3 Se realizaron 3 extracciones de 10 mL
aproximadamente para cada muestra con el fin
de alcanzar un porcentaje de recuperación del
80%.
2.2.4 Se llevaron al equipo y se realizaron dos
diluciones para la MP 1 y una para la MP 2
para que se establecieran dentro de la curva de
calibración. Pero antes se calibraron 2 balones
(10 mL y 25 mL) y una pipeta graduada.
2.3 Cromatografía de capa fina o TLC para
el resultado de la extracción.
2.3.1 Se realizó TLC para la MP 1, una placa ----- ----- 4,16E-3±2,92E-3 8,87
con el patrón de cafeína y otra con el patrón de
taurina.

2.3.2 Se empleo butanol, ácido acético y agua

(40:10:10) para la placa de cafeína y la MP 1.

2.3.3 Se empleo etanol para la placa de taurina

y la MP 1. Gráfica No. 1

2.3.4 Se realizó placa entre solvente y taurina

empleando etanol como eluyente. Gráfica No. 2

2.3.4 Se reveló con lámpara ultravioleta.

3. Resultados 4. Discusión de resultados

Tabla No. 1 Resultados del Tratamiento Estadístico La extracción de cafeína en matrices acuosas
Reactivo Concentración como café, chocolate, cola, té y bebidas
energéticas debe cuidar de interferencias que
*Bicarbonato de sodio 99,7% 0,10 M ± 1,9712E-3 son causantes de sobrestimaciones en el
pureza
resultado de la cuantificación. Existen otras
*Cafeína para pH 100% pureza 10,00 ppm ± bases xanticas como la teofilina y teobromina,
1,87030E-3 que vienen inmersas en algunas de las
*Taurina para pH 99% pureza 10,00 ppm ± mencionadas bebidas y que deben ser
3,8979E-3 separadas, aisladas o derivatizadas, antes de
proceder a extraer la cafeína. Sin embargo, en
Cafeína en muestra problema 172,40 ppm ±
5,2152E-3 las bebidas energéticas, un aminoácido
conocido como taurina es una sustancia que
Cafeína con dope en muestra 144,82 ppm ± absorbe a una longitud de onda cercana a la
problema 1,8705E-3
cafeína. Según se indica [3], la taurina tiene
* Incertidumbre expandida asociada a balanza, masa una longitud de onda de excitación y de
del reactivo, balones, pipeta, pureza del reactivo. emisión de 298 nm y 550 nm respectivamente,
(Anexo 8.1) y en determinaciones simultáneas de cafeína y
Tabla No. 2 Datos Gráfica No. 1 y Gráfica No. 2 taurina, esta última ha sido llevada a DNP-
Absorbancia Cafeína y Taurina vs pH. taurina para evitar dicho inconveniente.

Absorbancia pH Absorbancia pH Tanto la cafeína como la taurina trazaron una

Cafeína Taurina variación inesperada con la graduación hacia
0,513 ± 4,04E-3 5,6 0,054 ± 5,77E-4 6,80 pH alcalino. Se esperaba que la absorbancia de
la cafeína permaneciera constante y que la de
0,461 ± 0,01 5,91 0,028 ± 2,08E-3 7,02
la taurina descendiera sin máximos respecto al
0,448 ± 6,55E-3 6,47 0,012 ±1,15E-3 7,34 pH. Sin embargo el objeto de estudio cambio
notoriamente lo esperado. Si se remite a la
0,482 ± 5,77E-3 7,17 0,019 ± 1,53E-3 7,57
gráfica No. 1, se puede identificar una
0,482 ± 5,29E-3 8,06 0,057 ± 1,15E-3 7,82 concavidad a medida que el grado de
----- ----- 0,035 ± 5,77E-4 8,26 alcalinidad pasa de 5,60 a 7,17 y que luego,
parece seguir una tendencia “cuasi lineal” que
se expresa en tales términos si no fuera porque CH3
solo se tomo un punto más después de
alcanzar las 7,17 unidades. N N O
H N CH3
Se cree, que considerando la acidez del agua N
(6,4), la cafeína disuelta se hallaba así:
CH3 O
CH3 CH3
H+
O
La taurina en cambio disminuyo su
N N N N OH
H H
absorbancia hasta pH 7,34 pero luego trazó un
N CH3 N CH3
N N ascenso hasta pH 7,82 y finalmente a pH 8,87
CH3 O OH la absorbancia se aproximó a cero. Análogo a
H+ la cafeína, la taurina debía estar en la siguiente
forma:
Y esta especie parece aportar menos a la
absorción por dos razones principales: O
O
1. Por transiciones n→σ* y n→¶*
O S O S
2. Por la especie en formación NH2 NH2
O
O
La primera de ellas está asociada a grupos
funcionales no saturados que aportan los
electrones ¶ (grupo amida, alqueno) y la Y alcanzando un pH mayor así:
segunda a heteroátomos capaces de
proporcionar los electrones no enlazados (tipo O
nitrógeno y oxígeno). “Tanto las transiciones
n→σ* y n→¶*, tienden a desplazarse hacia HO S
NH2
longitudes de onda más cortas en presencia de
disolventes polares como agua o etanol” [5]. O
El efecto hipsocrómico causado por el agua en
la cafeína probablemente explica el descenso Que es donde se alcanza el punto máximo
de la señal y no necesariamente se relaciona atribuido a la absorción de los grupos sulfonilo
con pérdida de cafeína, sino a transiciones que pero que dista del anterior en resonancia
alteran el máximo de absorción. Durante la porque tiene grupos auxocromo tipo OH y
basificación el alcaloide podría alcanzar el NH2 que pueden desplazar hacia longitudes de
estado no ionizado (Figura 1), logrando pues onda más largas.
que la cafeína presente un mayor número de
El descenso vuelve cuando la taurina llega
transiciones ¶→¶* y que en cambio se
nuevamente a su forma iónica pero esta vez
observen mayores longitudes de onda debido a
cargada positivamente, en la cual ya no hay
desplazamientos batocrómicos que también
aporte de resonancia, ni un efecto
causados por el solvente pueden estar
auxocrómico tan pronunciado, explicando la
complementados por la especie generada con
deficiencia en la absorción (Figura 2).
el cambio de medio. Lo que sí es cierto es que
en esta disposición química es más afín Figura 2
(Kd=4,8) al CH2Cl2 que al H2O [1].

Figura 1
 O 5. Conclusión
HO S taurina no se logró. Aunque existe una
NH3
O contaminación del solvente, la hipótesis nula
Aunque la cuantificación de cafeína en la
bebida sin interferencia de taurina es el
objetivo del análisis, la extracción que se
manejo fue errónea en dos sentidos: la primera
trató sobre el dopaje, que por errores propios
no permitió evaluar el porcentaje de
recuperación del método (ítem 2.2), y la
segunda, el solvente de extracción estaba
contaminado con taurina y seguramente
también con cafeína, la primera corroborada
por evidencia en placa cromatográfica (Ver
anexo 8.6.1). Esto hace que la hipótesis nula
adquiera cierto grado de ambigüedad porque la
decisión de aceptarla o rechazarla no es
concluyente por contaminación de taurina en
diclorometano, que al quedar expuesta en la
muestra problema arrojo un Factor de
retención equivalente al patrón de taurina
(0,84) empleando etanol como eluyente.
Aunque sigue siendo incierto si el propósito
con el método se logró, lo que no tiene margen
de duda es que durante la extracción, el
solvente aportó una cantidad no determinada
de taurina que concluye que la cuantificación
de cafeína sin evidencia de taurina no fue
posible.
En cuanto al porcentaje de recuperación, este
fue calculado en base a la concentración final
obtenida en la extracción, en relación con el
valor teórico por extraer de la bebida (Ver
anexo 8.5). Sin embargo se trata de un
porcentaje (30,12%) significativamente
incierto porque la desviación está asociada a la
posible saturación del solvente con cafeína y
otras sustancias, y a la recuperación del
método que no logró ser cuantificada por
errores propios y que por tanto se hallan como
incertidumbre NO determinada.
La cuantificación de cafeína en ausencia de
incertidumbre no determinada sobre la
se rechaza pese a que el método que se
propone asume que el solvente debería estar
en condiciones de pureza. Un nuevo
procedimiento, se debería aplicar para la
veracidad de la hipótesis nula en los
parámetros que demanda el método de
cuantificación, modificando en esta parte el
dopaje de la MP2. De manera que se
determine la veracidad de la hipótesis nula y el
porcentaje de recuperación del método sin que
este sea sub o sobreestimado por saturación
del diclorometano debido a extracciones
sucesivas anteriores.
6. Recomendaciones
Realizar una prueba de caracterización para la
taurina sobre la extracción conseguida,
buscando otra forma de confirmar el
aislamiento del aminoácido en la bebida. Por
ejemplo, la DNP-Taurina tiene la siguiente
fórmula estructural [6]:
O
H
N (CH2)2 S OH
2ON
NO2 O
Y es producto de la reacción de sustitución
nucleofílica del 2,4-dinitrofluorobenceno por
el grupo amino libre de la taurina. Esta sería
una prueba útil, además de TLC para
confirmación del aminoácido por absorción a
360 nm, en solvente y muestra problema.
También se podría emplear como una forma
de derivatización de taurina antes del
tratamiento de extracción.
7. Referencias
[1] A. Guarnizo, P. Martinez, Experimentos de
química orgánica con enfoque en ciencias de
la vida, Ediciones Elizcom, Pág. 76-81
Colombia.
[2] E. A. Abourashed, J. S. Mossa, HPTLC
determination of caffeine in stimulant herbal
products and power drinks, Departamento de
Pharmacognocy, College de Pharmacy, King
Saud University, Saudi Arabia.
[3] AOAC Official Method 999.12 Taurine in
Pet Food.
[4] Y. Sawabe, T. Tagami, K. Yamasaki,
Determination of Taurine in Energy Drinks by
HPLC Using a Precolumn-Derivative, Osaka
Prefectural Institute of Public Health, Japan.
[5] D. Skoog, F. Holler, T, Nieman, Principios
de Análisis Instrumental, 5ta Edición,
McGrawHill, Pág 355-356, Madrid.
[6] M. Aranda G. Morlock, Simultaneous
determination of riboflavin, pyridoxine,
nicotinamida, caffeine and taurina in energy
drinks by planar chromatography-multiple
detection with confirmation by electrospray
ionization mass spectrometry, Institute of
Food Chemistry, University of Hohenhemim,
Germany.
[6] R.T. Morrison, R. M. Boyd, New York
University, Química Orgánica, 5ta Edición,
Pearson Educación, Pág. 1336-1337, México.
[7] B. Uribe Ortega, N. Montes Beneitez, Ma.
J. Quintana, Instituto Nacional de Seguridad e
Higiene en el Trabajo, Determinación de la
incertidumbre de medida de agentes químicos,
Edita Instituto Nacional de Seguridad e
Higiene en el Trabajo, Pág. 5, Madrid.
8. Anexos

8.1 Incertidumbre expandida calculada así:

µ= s2 balanza+s2 masa reactivo+ s2 pipeta+ s2balon x mL+ s2 pureza reactivo

8.1.1 Incertidumbre asociada al reactivo calculada así [7]:

Si la indicación del fabricante es que la pureza es igual al 99%, la incertidumbre se calcularía así:
(1,00-0,99), y si es mayor del 99%, se calcularía como (1-0,99)/12.

8.2 Datos de las medidas de masa y volumen para reactivos y material volumétrico.

Masa Masa Cafeína Masa Cafeína Volumen Balón Volumen Balón Pipeta 1,0 Pipeta 0,5
patrón(g) dope(g) 10mL 25mL mL mL
Bicarbonato
(g)

,0964 ,0010 ,0010 9,9117 24,8406 1,0410 ,5277

,0963 ,0012 ,0012 9,9111 24,8360 1,0405 ,5272

,0962 ,0013 ,0010 9,9101 24,8341 1,0395 ,5269

,0963 ,0012 ,0011 9,9089 24,8329 1,0390 ,5266

,0962 ,0012 ,0010 9,9074 24,8305 1,0381 ,5262

,0960 ,0011 ,0012 9,9068 24,8263 1,0376 ,5268

,0960 ,0011 ,0013 9,9056 24,8250 1,0368 ,5255

,0963 ,0011 ,0011 9,9055 24,8250 1,0361 ,5251

,0963 ,0011 ,0011 9,9051 24,8249 1,0357 ,5247

,0961 ,0013 ,0010 9,9046 24,8416 1,0352 ,5244

8.3 Desviación estándar de 8.2

Reactivo o Material Desviación estándar

Masa Bicarbonato (g) 1,3700E-4

Masa Cafeína patrón(g) 9,6600E-5

Masa Cafeína dope(g) 1,0540E-4

Volumen Balón 10mL 2,6093E-3

Volumen Balón 25mL 6,4077E-3

Pipeta 1,0 mL 2,0228E-3

Pipeta 0,5 mL 1,1239E-3

8.4 Incertidumbre expandida en material de vidrio

 Material Media ± µ W estadístico

Balón 10 mL 9,9077 ± 1,8690E-3 0,909

Balón 25 mL 24,8616 ± 4,5811E-3 0,889

Balones y pipeta descalibrados
Pipeta 1 mL 1,0380 ± 1,6585E -3
0,953
8.5 Extracción de cafeína en bebida energética
(Pike) a pH cercano a nueve

Concentración de cafeína en la bebida 321 ppm

n=3; % Recuperación teórico=80; Volumen extractante 11-12 mL; Volumen de muestra = 80 mL;
Volumen de dopado de 10 mL de 100 ppm

Cantidad de cafeína en 80 mL de Pike = 25,71mg

Cantidad de cafeína final de la extracción = 6,21 mg

% Recuperación experimental = (6,21/20,60) * 100 = 30,12%

Dope inefectivo, debido a que se manejo una concentración inadecuada que ocasionó la dilución en
vez de la concentración.

8.6 Cromatografía de Capa Fina o TLC

Rf= dR/dM

dR= distancia del recorrido de la mancha

dM= distancia del recorrido del solvente

8.6.1 Para Taurina

Taurina vs Muestra problema

Rf experimental = 3/3,2=0,94

Taurina vs Diclorometano empleado para extracción

Rf experimental = 1,6/1,9=0,84

La diferencia en los Rf puede deberse a: Distinta saturación del vapor del disolvente entre una placa
y otra, calidad de la placa (diferentes soportes, aluminio y vidrio), aplicación de la muestra.

8.6.2 Para Cafeína

Cafeína vs Muestra problema

Rf experimental = 2,2/3,6= 0,61,

Rf teórico = 0,59
Aunque la taurina según evidencia experimental y contrastado con la literatura sobre su solubilidad en
solventes polares, no es soluble en diclorometano, presenta una solubilidad parcial en pequeñas cantidades
(menos de 10 mg/L) sobre el extractante, de manera que para aislar en definitiva la presencia de taurina y
comprobar su actividad a diferentes grados de acidez