PRÁCTICA No.

CARACTERIZACIÓN DEL ADN

DETERMINACIÓN DE ADN POR LA TÉCNICA DE LA DIFENILAMINA EN
BASE A SU CONTENIDO EN DESOXIRRIBOSA.

OBJETIVO GENERAL:

Determinar la concentración de ADN por medio de la técnica de difenilamina.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

• Determinar la concentración de desoxirribosa por medio de la técnica de la

difenilamina.
• Comparar la concentración de la pentosa con la concentración del ADN problema.

PRERREQUISITOS:

1.- Como esta formada una molécula de ADN.

2.- Principales diferencias entre nucleótidos y nucleósidos.
3.- Principales diferencias entre ADN, ARN y las proteínas.

INTRODUCCION:
El DNA es un polímero complejo que está organizado como una hélice doble . El
elemento fundamental es la secuencia de bases purínicas y pirimidínicas. Estas bases
están unidas a la posición C-1’ del azúcar desoxirribosa y se conservan juntas a través del
enlace de los residuos de azúcar en sus posiciones 3’, y 5’ por medio de un enlace
fosfodiéster. La alternancia de los grupos fosfato y desoxirribosa forman el esqueleto de
la doble hélice. Estos enlaces 3’- 5’ definen también la orientación de una tira dada de la
molécula de ADN y puesto que las dos tiras corren en dirección opuesta, se dice que son
antiparalelas.
Cuando se trata ADN con difenilamina en condiciones ácidas, se forma un compuesto
azul con una absorción definida máxima a 595 nm. Esta reacción la dan en general las 2-
desoxipentosas y nos es específica para el ADN. En solución ácida, la cadena lineal de
una desoxipentosa se convierte en la forma Β -hidroxilevulinoaldehído altamente reactiva
y que reacciona con la difenilamina para dar un complejo azul. En el ADN únicamente
reacciona la desoxirribosa del nucleótido de purina, así que el valor obtenido representa
la mitad del total de desoxirribosa presente.

METODOLOGIA :

CURVA TIPO DE DESOXIRRIBOSA

Tubo Sol. tipo TCA Difenilamina [ADN]

1 mg/ml 10% mg/ml
Testigo --- 2.0 6.0 0.0
1 0.1 1.9 6.0 0.0125
2 0.2 1.8 6.0 0.0250
3 0.4 1.6 6.0 0.0500
4 0.6 1.4 6.0 0.0750
5 0.8 1.2 6.0 0.1000
6 1.0 1.0 6.0 0.1250
Problema X * 6.0 Y

X .- Calcular la cantidad de ADN concentrado, para tener una concentración en el tubo entre 400
y 600 µ g.

* .- Llevar a 2 ml de forma que quede una concentración de ácido tricloroacético al 10%.

Colocar los tubos durante 10 minutos en baño a ebullición, enfriar y leer a 600 nm de longitud de
onda.
 PRACTICA No. 1

CUANTIFICACION DE ADN POR EL METODO DE DIFENILAMINA

RESULTADOS:

1.- Elaborar la gráfica (en papel milimétrico, no en computadora) de la curva tipo para la
desoxirribosa.

2.- En base a la interpolación del la muestra problema en la curva tipo de desoxirribosa la

concentración de ADN es de:________________

DISCUSION:

CONCLUSIONES:
CUESTIONARIO:
1.-Cual es la absorción de luz máxima y mínima de los ácidos nucleicos.
2.- Describa una técnica para identificar ARN.
3.-Describa las propiedades fisicoquímicas de los ácidos nucleicos.
4.- Esquematice como esta formada una molécula de ADN.
 PRACTICA No. 2

CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDO ÚRICO EN SUERO

OBJETIVO GENERAL:

Cuantificar la concentración de ácido úrico en suero por medio de la reacción del ácido
fosfotúngstico.

OBJETIVO ESPECÍFICO:

Comparar los resultados de la concentración del ácido úrico para descartar hiperuricemia
y gota.

PRERREQUISITOS:

1.- Describir el metabolismo de los nucleótidos purícos

2.- Describir el catabolismo de las bases purínicas
3.- Enumerar las características metabólicas de la Gota.

INTRODUCCIÓN:

La síntesis de nucleótidos es un proceso celular dinámico y continuo. Se requiere de

nucleótidos para llevar a cabo diversas actividades metabólicas en el organismo, esto
último sin tomar en cuenta su función primaria que es la de ser monómeros estructurales
de los ácidos nucleicos.

La regulación de esta vía es compleja debido a que utiliza mecanismos de

retroalimentación negativa, regulación alostérica, así como procesos de recuperación de
metabolitos. Con frecuencia se presentan desajustes en esta regulación, siendo un
ejemplo clásico la sobreproducción de ácido úrico como parte de una descompensación
del catabolismo de los nucleótidos purínicos. En la mayoría de los organismos este
defecto no es perceptible, ya que al ser el ácido úrico un producto de excreción, es
eliminado en la orina. Sin embargo, en pacientes con insuficiencia renal, la excreción del
ácido úrico tiende a ser más lenta y por lo tanto su concentración en sangre aumenta en
forma considerable, generando un defecto conocido hiperuricemia. En algunos pacientes
la hiperuricemia es tal, que genera depósitos de monourato sódico en los tejidos de las
articulaciones de las extremidades inferiores. Estos depósitos tienden a formar cristales
que a menudo lesionan los tejidos provocando dolores muy intensos que son
característicos de la enfermedad llamada gota.

Para determinar la concentración de ácido úrico en sangre se utiliza el método del ácido
fosfotúngstico, en el cual precipita proteínas y hace reaccionar al ácido úrico con el ácido
fosfotúngstico en un medio alcalino para formar alantoína y azul de tungsteno, éste
último genera un color muy estable que se mide en espectrofotómetro a una longitud de
onda de 640 nm.

METODOLOGÍA:

Preparar una serie de tubos de acuerdo al siguiente cuadro:

Reactivo Tubo problema Tubo patrón Tubo blanco

Suero 0.3 ml --- ---
Sol patrón --- 0.3 ml ---
Agua destilada --- --- 0.3 ml
Ác. fosfotúngstico 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml

Mezclar bien cada tubo y centrifugar el tubo problema a 2,000 rpm durante 5 min. y
recuperar el sobrenadante. Los tubos patrón y problema no se centrifugan atendiendo a
las propiedades específicas de la reacción.

Prepara otra serie de tubos de acuerdo al siguiente cuadro.

Reactivo T. problema T. patrón T. blanco

Sobrenadante del T. 0.5 ml --- ---
problema
Sol. preparada del --- 0.5 ml ---
T. patrón
Sol. preparada del --- --- 0.5 ml
T. blanco
Carbonato de sodio 2.5 ml 2.5 ml 2.5 ml
al 3.5%

Mezclar bien cada tubo y dejar reposar durante 20 min..

Leer la absorbancia del problema y del patrón ajustando a cero el espectrofotómetro con
el tubo blanco.
Long. de onda 640 nm.
 PRACTICA No. 2

CUANTIFICACION DE ACIDO URICO EN SUERO

RESULTADOS:
Cálculo:

As. problema X (¿) = [ácido úrico]

As. patrón

Concentración de ácido úrico = __________________ mg/dl.

Valores normales:
Hombres: 3.5 – 7.5 mg/dl
Mujeres: 2.5 – 6.5 mg/dl

DISCUSION:
CONCLUSIONES:
CUESTIONARIO:
1.-Esquematice las bases puricas y pirimidinicas:
2.-Describa cuatro (4) alteraciones del metabolismo de las purinas.
3.-Mencione cuatro (4) alteraciones del metabolismo de las pirimidinas.
4.- Esquematice la degradación de las bases púricas hasta 2CO2 + 4NH4+
5.- Defina:
a) Uremia:
b) Uricemia:
c) Uricaciduria:

BIBLIOGRAFIA CONSULTADA: