Progresso_Vet_agosto 05 DEF 28-07-2005
Contributi
pratici
A. Dondo, S. Zoppi, M. Angelillo
G. Buonincontro, A. Garrone
S. Squadrone, A. Benedetto, M. Goria
I.Z.S. del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta
Introduzione
L’infezione da Mycobacterium bovis, in pas-
sato importante causa di tubercolosi nell’uo-
mo e negli animali, è stata ampiamente con-
trollata in Europa attraverso i programmi di
eradicazione. Tuttavia tale infezione persiste
tuttora in alcuni Stati Membri della Comunità
Europea, con una prevalenza negli alleva-
menti variabile da Paese a Paese.
L’Italia con il Decreto Ministeriale n° 592 del
15.12.1995 si prefiggeva l’eradicazione della
tubercolosi dagli allevamenti bovini e bufalini
entro tre anni. Come noto le maggiori difficol-
tà si presentano proprio nelle fasi finali del
processo di eradicazione per l’individuazione
delle fonti residue di infezione, spesso occul-
te o di difficile individuazione, e per discrimi-
nare le false positività alla prova intradermi-
ca dai casi in cui l’infezione è realmente pre-
sente, soprattutto in relazione al proporzio-
nale aumento dei soggetti falsi positivi, che
inevitabilmente si accompagna alla riduzione
della prevalenza della malattia.
In Piemonte, con il D.P.G.R. n. 20 del
5/03/2001 si è dato il via al piano straordina-
rio per l’eradicazione della tubercolosi nelle
province ancora prive di qualifica e i risultati
conseguiti alla conclusione di tale piano so-
no stati sostanzialmente aderenti agli obiet-
tivi del programma ed alle previsioni avan-
zate alla sua stesura.
L’utilizzo in parallelo della prova tubercolini-
ca e del test del gamma interferone ha con-
sentito di elevare il livello di sensibilità degli
interventi diagnostici in vita accelerando l’e-
14:35 Pagina 351
Diagnosi post mortem
di tubercolosi nei bovini:
esiti e considerazioni sul
protocollo diagnostico applicato
nel periodo 2001-2004 in Piemonte
stinzione dei focolai ancora aperti e favoren-
do l’individuazione di residue sacche occul-
te di infezione. In questo contesto la diagno-
si post mortem dell’infezione, eseguita me-
diante esame anatomo-patologico in fase di
ispezione dei capi macellati, è importante
che avvenga in modo accurato, ma soprat-
tutto deve essere integrata da indagini di
laboratorio che assicurino un compendio
diagnostico di sicura efficacia per l’individua-
zione e l’identificazione dell’agente eziologi-
co responsabile della malattia. Quindi diven-
ta fondamentale la presenza sul territorio di
laboratori forniti di attrezzature adeguate e
personale esperto in grado di eseguire, nei
tempi richiesti e con affidabilità, le procedu-
re di isolamento e di identificazione dei mi-
cobatteri responsabili di infezione tubercola-
re a partire da materiale patologico prove-
niente da diverse specie animali.
Al fine di effettuare un continuo monitoraggio
sul territorio e il coordinamento dei relativi
interventi, è stata implementata la collabora-
zione con l’Osservatorio Epidemiologico Ve-
terinario Regionale.
Il citato D.M. n° 592, nell’allegato 2, elenca le
metodiche ufficialmente applicabili per evi-
denziare lesioni e micobatteri tubercolari da
materiale patologico; in particolare, oltre alle
tecniche microbiologiche classiche, tra que-
ste vengono annoverate le tecniche anato-
mo-istopatologiche, l’ibridazione in situ e la
reazione a catena della polimerasi (PCR).
Nel corso degli ultimi anni, per rispondere al
meglio alle prescrizioni legislative dei decre-
ti nazionali e regionali per l’eradicazione
351 AGOSTO
2005
della tubercolosi, uno degli obiettivi che i
laboratori dell’Istituto hanno inteso tenace-
mente perseguire, è stato quello di indivi-
duare ed affinare il protocollo diagnostico
per la ricerca e l’identificazione dell’agente
eziologico, adeguando allo scopo il livello di
sicurezza dei laboratori preposti.
Grazie a diversi progetti di ricerca nazionali e
regionali e alle collaborazioni con partner
internazionali, è stato possibile negli anni
studiare, elaborare e perfezionare un proto-
collo diagnostico in linea con le prescrizioni
legislative, sia nazionali che regionali, e con-
forme alle indicazioni tecnico-scientifiche
dell’O.I.E.. Tutto ciò al fine di garantire la
massima sensibilità diagnostica nell’indivi-
duazione e nell’identificazione delle diverse
specie di micobatteri, M. bovis in particolare,
da materiali biologici di varia natura, spesso
massivamente contaminati da flora microbi-
ca aspecifica. Il lavoro è stato quindi affron-
tato su diversi versanti: per quanto attiene
agli aspetti prettamente diagnostici, gli obiet-
tivi prevedevano, da un lato di affinare le
metodiche convenzionali di isolamento, cer-
cando di migliorare l’efficacia delle tecniche
di decontaminazione e selezionando i terreni
colturali più sensibili, dall’altro di sviluppare
l’approccio alle metodiche di biologia mole-
colare (sonde a DNA e PCR), applicate sia
all’individuazione dei micobatteri direttamen-
te su campioni di materiale patologico, sia
all’identificazione e caratterizzazione dei
ceppi isolati con le procedure convenzionali.
Lo scopo del presente lavoro è pertanto
quello di offrire una valutazione retrospettiva
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del protocollo diagnostico adottato presso i
laboratori della Sede dell’Istituto Zooprofilat-
tico Sperimentale di Piemonte, Liguria e
Valle d’Aosta ed effettuare un bilancio com-
plessivo dell’attività svolta per la diagnosi di
tubercolosi, analizzando l’operato nel qua-
driennio 2001-2004. Il periodo di tempo
preso in considerazione include anche le
attività collegate al Piano straordinario per
l’eradicazione della tubercolosi bovina nelle
province di Torino e Cuneo, che ha genera-
to un ulteriore incremento dell’attività dia-
gnostica di routine, in quanto anche la prova
del gamma interferone è stata riconosciuta
come prova ufficiale per la diagnosi in vita di
tubercolosi bovina, in linea con il Regola-
mento CE n. 1226 del 08/07/02 e la Deci-
sione 2002/943/CE del 28/11/02.
Tab. n° 1:
campioni di organi esaminati durante gli anni 2001-2004
presso l’IZS di Torino
Anno 2001 2002 2003 2004
Totale 605 865 627 469
Materiali e metodi
Campionamento
Dal 1° Gennaio 2001 al 30 Settembre 2004
sono stati esaminati 2566 campioni di orga-
ni (visceri e/o linfonodi) così ripartiti durante
il quadriennio di attività come riportato in
Tabella n°1. Al fine di standardizzare il più
possibile il campionamento in sede di
macello, è stata predisposta ad hoc una
scheda di prelievo campioni.
Figura n. 1
Selezione dei campioni di organi
14:35 Pagina 352
I campioni, come schematizzato in Figura
n°1, provenivano da:
• animali con lesioni sospette segnalate in
corso dell’attività ispettiva in sede di
macellazione;
• animali risultati positivi alle prove
diagnostiche in vivo (prova tubercolinica o
gamma IFN test), in cui non sono state
riscontrate lesioni macroscopicamente
visibili all’esame anatomo-patologico a
seguito dell’abbattimento del capo;
• animali provenienti da allevamenti infetti
macellati in seguito a provvedimento di
abbattimento totale.
La tipologia di campioni di organi differiva in
relazione alla presenza o meno di lesioni
sospette.
In caso di lesione a carattere granulomatoso
riferibile a tubercolosi, il campione era costi-
tuito dall’organo sede di lesione (polmone,
fegato o sierose e/o linfonodi annessi).
Figura n. 2
linfoadenite e epatite tubercolare
(complesso primario completo)
In caso di organi provenienti da animali
dichiarati infetti in vita che non presentavano
lesioni macroscopicamente visibili, il cam-
pione era costituito da un pool di linfonodi
(linfonodi della testa, mediastinici, epatici,
meseraici, sopramammari) possibili bersa-
glio dell’infezione tubercolare.
AGOSTO 352
2005
Esame
anatomo-patologico
All’arrivo in laboratorio, i campioni, prima di
essere processati per l’esame batteriologi-
co, venivano ulteriormente controllati dal
punto di vista anatomo-patologico e sulla
base dell’esito di tale controllo venivano
classificati secondo il seguente criterio:
• GRUPPO A: campioni con lesioni di tipo
granulomatoso riferibili a tubercolosi
(Fig. n° 2);
• GRUPPO B: campioni con assenza di
lesioni macroscopicamente visibili (NVL);
• GRUPPO C: campioni con lesioni di tipo
essudativo di presunta natura non specifica
se riferita ad infezione tubercolare
(Fig. n°3).
Figura n. 3
epatite apostematosa a focolai
Esame
batteriologico
In via preliminare i campioni sono stati accu-
ratamente privati di tessuto adiposo e con-
nettivale prima di procedere con le fasi suc-
cessive per l’esame colturale.
Previo sminuzzamento, l’omogeneizzazione
dei campioni avveniva in Stomacher: l’omo-
genato veniva suddiviso in due aliquote per
essere sottoposto a due differenti metodi di
decontaminazione: idrossido di sodio 2% e
acido esadecilpiridinio 1,5% rispettivamente.
Ciascuna aliquota decontaminata, dopo
concentrazione in centrifuga, veniva semi-
nata su una batteria di terreni selettivi che
prevedeva: Stonebrink, Lowenstein Jensen
Medium, Lowenstein Jensen w/o glicerina.
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Figura n. 4
crescita di M. tuberculosis (A); M. bovis (B) e M. avium
(C) su STONEBRINK
L’incubazione avveniva per i primi 15 giorni
a 37°C in atmosfera modificata con l’aggiun-
ta di 5% CO2 e per il restante periodo a 37
°C in atmosfera normale (Fig. n°4).
Al fine di aumentare le probabilità di isola-
mento di micobatteri a lenta crescita, l’esa-
me batteriologico si considerava concluso a
90 giorni dalla semina. Tuttavia, a partire
dall’inizio dell’anno 2004, sia per aderire alle
linee guida del “Manual of Diagnostic Tests
and Vaccines for Terrestrial Animals” (O.I.E.)
che per accelerare l’estinzione o le procedu-
re di bonifica dei focolai di tubercolosi bovi-
na, si è ridotto a 60 giorni il tempo per la con-
clusione dell’esame colturale.
Diagnostica
molecolare
Heminested PCR in
campioni di tessuto
Dai campioni di tessuto, omogenati e decon-
taminati, il DNA è stato estratto utilizzando il kit
QIAamp DNA Minikit (Qiagen). La procedura
indicata dal produttore è stata opportunamen-
te modificata per migliorare l’efficacia estratti-
va del metodo nei confronti dei micobatteri.
Il DNA bersaglio dell’amplificazione per il rile-
vamento dei micobatteri appartenenti al
Mycobacterium tuberculosis complex è l’ele-
mento d’inserzione IS6110. Il prodotto finale
della heminested-PCR corrisponde ad un
amplicone di 200 bp, che viene generato al
termine di due fasi successive di amplifica-
zione. L’esito della reazione di amplificazione
è stato rilevato mediante elettroforesi in gel
d’agarosio al 2% contenente Etidio Bromuro.
14:36 Pagina 353
Identificazione e ripetute (spacer). La presenza o meno dei
singoli spacer costituisce caratteristica
tipizzazione
descrittiva dell’identità del microrganismo
molecolare dei analizzato, oltre che dell’assetto genico del
ceppi isolati locus bersaglio.
Essa viene determinata mediante ibridazio-
Il DNA delle colonie isolate mediante crescita
ne con sonde molecolari specifiche.
su terreni selettivi è stato estratto tramite bol-
La metodica di amplificazione, seguita da
litura; per la tipizzazione e differenziazione
ibridazione rilevata con tecnica ELISA (Fer-
delle diverse specie di micobatteri (Myco-
retti et al, 1998), è stata modificata ed ese-
bacterium spp, M. tb complex, M. avium e M.
guita in forma ridotta relativamente al nume-
tuberculosis) è stata messa a punto una
ro di spacer esaminati, in modo da adattare
Multiplex PCR, variazione “in house” dei me-
il metodo alla routine di laboratorio per l’i-
todi descritti da Kulski et al. (1995) e da
dentificazione di M. bovis.
Sinclair et al. (1995).
Nella Figura n° 5 è schematizzato il proto-
Questo sistema Multiplex PCR si basa sulla
collo diagnostico adottato per la diagnosi di
simultanea amplificazione di differenti target
micobatteriosi.
molecolari: l’rRNA 16S, l’elemento di inserzio-
ne IS986 e il gene mpt40.
Figura n. 5
La distinzione delle differenti specie di mico- processazione di un campione per la ricerca di
Mycobacterium spp.
batteri avviene sulla base del profilo elettrofo-
retico generato dai prodotti di amplificazione.
Le colonie che così sono state classificate
come appartenenti a M. tb complex, cluster
tassonomico in cui sono raggruppati diversi
micobatteri tubercolari (M. tuberculosis, M.
africanum, M. microti, M. bovis, M. bovis
BCG), sono state successivamente sottopo-
ste a Spoligotyping, metodica solitamente
usata per la caratterizzazione molecolare, e
di cui si sfrutta la capacità di individuare i
ceppi di M. bovis tra quelli classificati come
M. tb complex.
Il target genetico alla base del metodo, de-
scritto da Kamerbek et al. (1995), è il locus
DR, regione cromosomica contenente se-
quenze conservate e ripetute (Direct Re-
peat) di 36 bp, intervallate da sequenze non
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Risultati Tab. n. 2
ripartizione dei campioni secondo il quadro anatopatologico
La rappresentazione generale dei risultati
ottenuti nell’arco di tempo considerato, con
l’applicazione del protocollo diagnostico de-
scritto, non può essere svincolata da un’a-
nalisi approfondita che tenga conto di tutti
quei parametri (anamnesi, clinica, epide-
miologia, campionamento, metodologie dia-
gnostiche, ecc.) che caratterizzano la dia-
gnosi di tubercolosi sia in campo che in
laboratorio. Sulla base dell’esame anatomo-
patologico, i 2566 campioni sono stati così
ripartiti nei tre gruppi: 645 compresi nel
GRUPPO A, 1849 nel GRUPPO B e 72 nel
GRUPPO C (Tab. n° 2).
Esprimendo i risultati nella loro totalità,
senza elaborare alcuna correlazione tra il
metodo microbiologico tradizionale e il diagnostiche post mortem (esame batterio- suno nel gruppo C. Mycobacterium spp. è
metodo molecolare, su 2566 campioni, l’e- logico ed esame molecolare con PCR) stato isolato da 95 campioni, di cui 11 appar-
same batteriologico ha portato all’isolamen- hanno contemporaneamente fornito esito tenenti al GRUPPO A, 81 appartenenti al
to di 842 ceppi di micobatteri (provenienti da negativo. In particolare dalla Tab. n° 3, si gruppo B e 3 al gruppo C.
833 campioni, poiché si sono registrati 11 può osservare che M. bovis è stato isolato È da rilevare che in 11 casi è stata riscontra-
casi di infezione mista), di cui 730 sono stati da 592 campioni appartenenti al GRUPPO A ta una infezione mista, di cui un caso riguar-
identificati come M. bovis. (lesioni specifiche), 128 al GRUPPO B (no dava una coinfezione da M. bovis e M.
La ricerca diretta di micobatteri appartenen- visible lesions) e 10 al GRUPPO C (lesioni avium (gruppo A) e in 8 casi si registrava l’i-
ti al M. tb complex condotta con tecnica di non specifiche). M. avium è stato isolato su solamento contemporaneo di M. bovis e di
heminested-PCR, ha dato esito positivo in 18 campioni, di cui 3 appartenenti al GRUP- Mycobacterium spp. (4 in gruppo A e 4 in
674 campioni. Su 1506 campioni le prove PO A, 15 appartenenti al GRUPPO B e nes- gruppo B).

Tab. n. 3
isolamenti batteriologici ripartiti per gruppo a seconda dell’esito dell’esame anatomo-patologico

AGOSTO 354
2005
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Nella Tab. n° 4, sono stati confrontati i risul- Tab. n. 4

tati ottenuti dall’isolamento batteriologico confronto fra isolamento batteriologico e PCR diretta da tessuto EB= esame colturale
con quelli ottenuti da tecniche di biologia
molecolare (PCR).
In 392 casi si è ottenuto un risultato concor-
dante tra le due prove eseguite (esame bat-
teriologico, PCR), nello specifico si tratta di
343 capi appartenenti al GRUPPO A, di 42
al GRUPPO B e di 7 al GRUPPO C. In 16
casi l’amplificazione genica da tessuto ha
rilevato la presenza di DNA specifico per
micobatteri appartenenti a M. tb complex su
campioni da cui è stato isolato Mycobacte-
rium spp., di cui 3 appartenenti al GRUPPO
A, 12 al GRUPPO B e 1 al GRUPPO C. Si
segnala la positività alla PCR per M. tb com-
plex da 1 campione appartenente al GRUP-
PO B su cui è stato isolato esclusivamente
M. avium. Infine, è interessante rilevare la
positività alla PCR su 282 capi negativi all’i-
solamento batteriologico, di cui 19 apparte-
nenti al GRUPPO A, 213 appartenenti al
GRUPPO B e 50 al GRUPPO C.

Discussione
L’attività descritta nel presente lavoro ben
rappresenta la consistenza degli investimen-
ti effettuati nel corso degli anni in termini di
risorse umane, economiche e strutturali fina-
lizzati alla diagnostica della tubercolosi nella
attività ordinaria e nella ricerca scientifica
applicata.
Nella valutazione dei dati presentati in que-
sto lavoro risulta importante, in particolare,
analizzare la discordanza degli esiti tra dia-
gnosi batteriologica e diagnosi molecolare
nelle differenti tipologie di campioni, così
come suddivisi nei tre gruppi (A, B, e C) in
base alla presenza o meno delle lesioni e
alla loro natura.
I due metodi hanno registrato “performance”
differenti e ciò è riconducibile alla natura dei
campioni tissutali di partenza, nonché alle
caratteristiche intrinseche delle due metodi-
che, che pur partendo dallo stesso campio-
ne seguono uno sviluppo differente. Nel
gruppo A, campioni con riscontro di lesioni
tipiche, in caso di esito positivo all’esame
PCR (tab. 4.1) la maggior parte dei campio-
ni ha avuto esito concordante con l’esame
batteriologico, e, in alcuni casi, la diagnosi
molecolare ha confermato la presenza del-
l’infezione non altrimenti registrata con l’esa-
me batteriologico. Questi casi interessano
una percentuale pressoché costante negli
anni con un andamento progressivamente
migliore, direttamente correlato al progressi-
vo affinamento tecnico della metodologia
molecolare applicata (circa 2% negli anni
2001-2002, circa 6% negli anni 2003-2004):
ciò è anche dimostrato dalla costanza con la
quale tutti i dati della casistica presentata
confermano il trend positivo dei risultati lungo
il periodo di tempo considerato.
Relativamente ai campioni del gruppo A che
hanno avuto esito negativo alle indagini
molecolari (tab. 4.4), va rilevato che nella
maggior parte di essi l’esito era discordante
con quello ottenuto con l’esame batteriologi-
co, ovvero l’esame PCR forniva esiti falsa-
mente negativi quando la presenza dell’infe-
zione era confermata sia dal riscontro di
lesioni tipiche che dall’isolamento di M. bovis
da questi campioni. Nella maggioranza di
questi campioni va tuttavia considerato che
le lesioni riscontrate erano di natura calcifica
(dati non mostrati) a cui potrebbe essere
associata una presenza più consistente di
sostanze chimicamente interferenti, che pos-
sono inibire la reazione polimerasica. La
rimozione poco efficiente di tali sostanze ad
opera dei sistemi di purificazione utilizzati
durante le analisi, potrebbe spiegare l’appa-
rente minore sensibilità riscontrata nel con-
fronto diretto del metodo molecolare con l’e-

355 AGOSTO
2005
Progresso_Vet_agosto 05 DEF 28-07-2005
same colturale. Viceversa, nei campioni NVL
(gruppo B), in cui le lesioni non sono morfo-
logicamente rilevanti e presumibilmente
sono connotati da una carica microbica
minore, oltre che da una ridotta concentra-
zione di sostanze che possono generare ini-
bizione della reazione polimerasica, la PCR
sembra mostrare una maggiore sensibilità
(tab 4.2). Tale riscontro si è manifestato sin
dai primi anni di applicazione del metodo
(2001-2002), con un andamento progressi-
vamente migliore, confermando quanto
sopra considerato. Analoghi risultati sono
stati registrati anche per i campioni inseriti nel
gruppo C (lesioni non tipiche- tab. 4.3 e 4.6).
Tuttavia la migliore sensibilità delle tecniche
molecolari per la ricerca diretta di DNA
appartenente a micobatteri tb complex in
campioni tissutali deve essere confermata
con una valutazione più estesa, che tenga
conto delle caratteristiche sanitarie dell’alle-
vamento, nonché degli animali, relativamen-
te alla presenza dell’infezione tubercolare
(anamnesi storica, dati epidemiologici, prove
diagnostiche in vita). Queste valutazioni at-
tualmente sono ancora in corso.
Relativamente alle valutazioni sulla specificità
delle indagini molecolari, queste sono state
condotte dal punto di vista teorico: la hemine-
sted-PCR è stata messa a punto su un target
14:36 Pagina 356
molecolare estremamente specifico ed esclu-
sivo dei micobatteri appartenenti al tb com-
plex, che è stato verificato attraverso prove di
allineamento dei primers e della sequenza tra
essi compresa su microrganismi tassonomi-
camente correlati. Per questa ragione, la spe-
cificità analitica della prova può essere consi-
derata estremamente elevata.
Nella valutazione complessiva dei dati pre-
sentati in tab. 4, alcune considerazioni meri-
tano ancora attenzione. Nei quattro anni di
attività presentati, su 645 campioni con lesio-
ni specifiche, 34 non hanno avuto una con-
ferma dell’infezione da entrambi i metodi
d’indagine di laboratorio (circa 5,2%, tab. 4.1
e 4.4). Inoltre, sui campioni negativi al riscon-
tro di lesioni riconducibili a tubercolosi (grup-
pi B e C), considerando le due metodiche in
modo indipendente, il 7,2% è risultato positi-
vo all’esame batteriologico e il 16,2% alla
heminested-PCR e questo dato sale al
20,9% se i due metodi di conferma post mor-
tem sono associati in parallelo.
Lo studio preliminare di questi risultati sem-
bra avvalorare quindi l’utilizzo combinato
delle due metodiche, che permette di au-
mentare significativamente la sensibilità del
protocollo diagnostico applicato.
La necessità di maggiore sensibilità diagno-
stica è infatti un elemento cruciale per rag-
giungere l’eradicazione, molto più ardua da
conseguire proprio nelle fasi finali, in cui i
tassi d’infezione sono estremamente ridotti.
L’attività diagnostica applicata alla tubercolo-
si descritta nel presente lavoro, intesa nella
sua globalità, non solo ha permesso di acqui-
sire dati ed esperienza, ma ha reso possibile
la creazione di infrastrutture, quali una vasta
ceppoteca e un database specifico che oltre
alla registrazione dei dati epidemiologici
classici, consente anche la gestione di infor-
mazioni epidemiologico-molecolari.
Tutto ciò potrà consentire ulteriori approfon-
dimenti anche su base retrospettica, utili al
trasferimento delle conoscenze scientifiche
nella attività pratica, con ricaduta diretta del
servizio reso nella Sanità Pubblica regionale
e nazionale.
Riconoscimenti
Il presente lavoro è stato in parte reso pos-
sibile grazie ai finanziamenti per la ricerca
sanitaria e il progresso scientifico del Mini-
stero della Salute, della Regione Piemonte e
della Comunità Europea.
La bibliografia è disponibile
presso gli autori