OBJETIVO

Determinación de pirazinamida en comprimidos.

RESUMEN DEL OBJETIVO

Se realizo la determinación de pirazinamida a través de tres métodos diferentes:

espectrofotometria ultravioleta (UV), complejometria y cromatografía en capa fina (TLC).

Paralelamente se intento verificar si la valoración en fase heterogénea es un método

adecuado para la determinación del principio activo.

INTRODUCCIÓN

 Sinónimos(1,2,4)

Pirazinamidum.
Amida del ácido piranoico.
Pirazina-2-carboxamida.

 Propiedades farmacológicas

La pirazinamida se utiliza en el tratamiento de la tuberculosis siendo considerada como

fármaco de primera elección cuando se administra conjuntamente con la isoniaziada, el
etambutol, la rifampina y/o la estreptomicina, en particular cuando aparecen resistencias a la
isoniazida y a la rifampizina. La pirazinamida es más efectiva y menos tóxica que la cicloserina,
la capreomicina, la kanamicina, la etionamida y el ácido p-aminosalicílico.(2)

No se conoce con exactitud el mecanismo de acción de la pirazinamida. Esta posee

efecto bactericida únicamente sobre Mycobacterium tuberculosis; siendo la concentración
mínima inhibitoria de 20 µ g por ml a pH 5.6.(1) Las cepas este microgramo excretan una
enzima, la pirazinamidasa que convierte la pirazinamida en ácido pirazinoico. Es posible que
este metabolito sea, al menos parcialmente, el responsable de la actividad de la pirazinamida:
estudios "in vitro" han puesto de manifiesto que el ácido pirazinoico reduce el pH a un nivel que
impide el crecimiento de la M. tuberculosis. La pirazinamida exhibe una acción bacteriostática o
bactericida según las concentraciones que alcance en el lugar infectado y de la susceptibilidad
del microorganismo. Sus efectos más significativos tienen lugar cuando el germen crece
lentamente como, por ejemplo, dentro de los macrófagos. La experiencia acumulada indica que
la pirazinamida es más eficaz en los primeros estadíos de la enfermedad, probablemente debido
al menor número de macrófagos existentes en estos momentos. La Mycobacterium tuberculosis
es el único microorganismo susceptible a la pirazinamida.(2)

La hepatoxicidad es el efecto adverso mas serio en el tratamiento con pirazinamida y la

frecuencia de aparición puede ser relacionada con la dosis. Sin embargo, cuando es
administrada conjuntamente con isoniazida y rifampizina los casos de hepatitis reportados son
menores al 3 %. Pacientes han experimentado en forma transitoria aumento de los valores de las
enzimas hepáticas y mas seriamente hepatomegalia. Adicionalmente a sus efectos
antituberculosos, la pirazinamida inhibe la secreción tubular de ácido úrico. Otros efectos
adversos son anorexia, nauseas, anemia sideroblastica y disuria.(2)
 La pirazinamida se puede administrar diariamente o 3 veces por semana. Se
recomiendan dosis orales para adultos y niños encima de 35 mg por kilo de masa corporal
diariamente (la dosis máxima diaria es 3 g) o 50 mg por kilo tres veces por semana, o 75 mg dos
veces semanalmente. La dosis estandarizada, para pacientes de 50 Kg. es 1.5 g diariamente, 2.0
g tres veces por semana, o 3.0 g dos veces en la semana; para pacientes de mas de 50 Kg. la
dosis usual es de 2.0 g diarios, 2.5 g tres veces por semana o 3.5 g dos veces en la semana.(2)

Estructuralmente la pirazinamida esta formada por un anillo de pirazina junto a un

grupo amida como se observa en la figura 1:
O

N
NH2

Figura 1

 Propiedades fisicoquímicas(1,2,4)

Peso Molecular: 123.11

Aspecto: Polvo cristalino blanco o casi blanco, inodoro o casi inodoro.

Punto de fusión: 188 – 189 ºC

Solubilidad:

Según BP

− 1 en 70 de agua
− 1 en 70 de cloroformo
− levemente soluble en alcohol
− muy levemente soluble en éter

Según USP

− 1 en 67 de agua
− 1 en 175 en alcohol deshidratado
− 1 en 135 de cloroformo
− 1 en 1000 de éter
− 1 en 72 de alcohol metilico

Según Florey

A0ºC

− 0.64 g en 100 g de agua

− 0.28 g en 100 g de cloroformo.
− 0.84 g en 100 g de alcohol metilico.
− 0.29 g en 100 g de alcohol etílico.
 A 38 ºC

− 2.65 g en 100 g de agua

− No hay datos de solubilidad en cloroformo
− 1.63 g en 100 g de alcohol metilico
− 0.74 g en 100 g de alcohol etílico

Coeficiente de partición

− n-butanol – agua (1:1) P = 1.05 ± 0.01

− n-octanol – agua (1:0.2) P = 0.330 ± 0.003

 Estabilidad
O O
+
N H N
NH2 OH
-
OH
N N

Las amidas sufren hidrólisis formando ácidos carboxílicos, tanto en condiciones ácidas
como básicas. Las amidas son los derivados mas estables de los ácidos, y se necesitan
condiciones mas enérgicas para su hidrólisis en comparación con la de un ester.

La pirazinamida exhibe buena estabilidad en el estado sólido. No hay una degradación

aparente de las muestras a granel tanto en humedad como en atmósfera seca. También es estable
cuando es expuesta a la luz natural.

IDENTIFICACIÓN

− Según USP 22 NF 17

Pesar y pulverizar finamente no menos de 20 comprimidos de pirazinamida. Pesar

exactamente una porción del polvo, equivalente a 100 mg de pirazinamida y
transferirlos con ayuda de 200 ml de agua a un matraz de 500.0 ml. Dejar en
reposo cerca de 10 minutos, con ocasional agitación, agregar agua hasta el
volumen y mezclar. Filtrar utilizando filtro y matraz seco, desechar la primera
porción de líquido filtrado. Transferir 5.0 ml del filtrado a un matraz de 100.0 ml,
agregar agua hasta el volumen y mezclar. Disolver una cantidad exactamente
pesada de USP pirazinamida RS en agua y diluirla cuantitativamente y por etapas
con agua para obtener una solución de estándar que tiene una concentración
conocida cercana a 10 µ g / ml. Concomitantemente determinar las absorbancias
de ambas soluciones en celdas de 1 cm, a la longitud de onda correspondiente a la
absorbancia máxima, cercana a 268 nm con un espectrofotómetro adecuado y
utilizando agua como blanco. Calcular la cantidad de C5H5N3O, en mg, en la
porción de comprimidos tomados, mediante la siguiente fórmula:

AU Donde C es la concentración, en µ g / ml, de USP pirazinamida

10 C ×
AS RS en la solución estándar, y AU y AS son las absorbancias de
la solución de pirazinamida de tabletas y la solución estándar,
respectivamente.(5)

− Según USP 29 NF 24
 ･ Fase móvil: preparar buffer fosfato pH 8.0 (ver Buffer’s Solutions, en la
sección Reagents, Indicators, and Solutions), y ajustar con ácido fosforico pH
3.0. Mezclar con 10 ml de acetonitrilo con un litro de esta solución, filtrar y
desgasificar. Realizar ajustes si son necesarios. ( ver System Suitabbility dentro
de Chromatography < 621> )
･ Preparación del estándar: transferir una cantidad exactamente pesada
de USP pirazinamida RS a un matraz volumétrico adecuado, disolver en agua,
sonicando para disolver, diluir con agua hasta el volumen y diluir hasta obtener
una solución que tenga una concentración conocida cercana a 0.1 mg/ml.
Transferir 20.0 ml de esta solución a un matraz de 50.0 ml diluir con agua hasta el
volumen, y mezclar.
･ Solución para adecuabilidad del sistema: transferir 1 ml de ácido
clorhídrico a un matraz de 5.0 ml, diluir con preparación estándar hasta el
volumen y mezclar. Colocar esta solución en baño de agua caliente por 5 minutos
y enfriar.
･ Ensayo preparación: pesar exactamente no menos de 20 comprimidos
de pirazinamida y pulverizar finamente. Transferir una cantidad exactamente
pesada de polvo, equivalente a cerca de 100 mg de pirazinamida, a un matraz de
500.0 ml, agregar 300 ml de agua, y sonicar por 10 minutos. Diluir con agua hasta
el volumen, y mezclar. Filtrar una porción de la solución, descartando los
primeros ml del filtrado. Transferir 20.0 ml de ese filtrado a un matraz de 100.0
ml, diluir con agua hasta el volumen y mezclar.
･ Sistema cromatografico (ver Chromatography < 621> ): La unidad
cromatografica es equipada con un detector a 270 nm y una columna de 3.5 mm x
15 cm conteniendo empaque L1. el caudal es cercano a 1 ml por minuto.
Cromatografiar la preparación estándar y registrar los picos según lo indicado en
el procedimiento: la eficacia de la columna es no menor a 2500 platos teóricos; y
el factor de cola para el pico de pirazinamida es no mayor a 1.3. Cromatografiar
la solución para adecuabilidad del sistema, y registrar los picos según lo indicado
en el procedimiento: el tiempo de retención relativo es cercano a 0.45 para ácido
piranoico y 1.0 para pirazinamida; y la resolución, R, entre pirazinamida y el
ácido piranoico es no menor a 6.0.
･ Procedimiento: separadamente inyectar iguales volúmenes (cerca de 20
µ L) de preparación del estándar y del ensayo de preparación en el cromatógrafo
y registrar los cromatogramas, y medir las respuestas de los mejores picos.
Calcular la cantidad, en mg,, de pirazinamida (C5H5N3O) en la porción de
comprimidos tomada, de acuerdo a la siguiente fórmula:
rU
2.5C × Donde C es la concertación, en µ g, de USP pirazinamida RS en
rS la preparación estándar; y r y r son las respuestas de los picos
U S
obtenidos de el ensayo de preparación y la preparación estándar,
respectivamente.(6)

− Según BP 99

Pesar y pulverizar 20 comprimidos de pirazinamida. A una cantidad de polvo que

contenga 0.1 g de pirazinamida agregarle 200 ml de agua, dejar en reposo por 10
minutos con agitación ocasional; mezclar con ayuda de ultrasonido por 10
minutos y diluir con 500.0 ml de agua. Filtrar y descartar los primeros 20 ml de
filtrado. Diluir 5.0 ml del filtrado en 100.0 ml de agua y medir la absorbancia de
la solución resultante en el máximo a 268 nm, Appendix II B. Calcular el
contenido de pirazinamida, tomando 650 como la absorbancia especifica ( 1%, 1
cm) al máximo de 268 nm.(7)
MÉTODOS ANALÍTICOS ENCONTRADOS EN BIBLIOGRAFIA

− Análisis titrimetrico no acuoso

La pirazinamida puede ser titulada en medio no acuoso, utilizando como solvente

ácido acético glacial conteniendo acetato mercúrico, con ácido perclórico como titulante. La
determinación del punto final se puede realizar mediante el empleo de indicadores como violeta
cristal, verde malaquita o potenciometricamente(3,8).

− Métodos colorimétricos

La determinación de pirazinamida por métodos colorimetricos reportados en

bibliografía son (3):

･ La determinación se realiza hidrolizando la pirazinamida en medio alcalino

diluido obteniendo el ácido pirazinoico, el cual es determinado cuantitativamente
por el desarrollo de color rojo anaranjado con sulfato amonico ferroso.
･ Reacción con Nitroprusiato alcalino (nitropentaciano ferroato) dando un color
rojo anaranjado el cual presenta un máximo de absorción entre 490 – 500 nm.
Para la determinación separada de pirazinamida y ácido pirazinoico es descripta
una extracción con solvente diferencial preliminar; por ejemplo con una mezcla
benceno – n-butanol.
･ Para la determinación de la amida del ácido nicotínico en presencia de ácido
pirazinmonocarboxilico y ácido nicotínico, una solución de la droga es mezclada
con una solución de cloruro de cobalto (IV) 0.05 M, glicerol y hidróxido de
potasio 2 N, luego de dejar en reposo por 5 minutos se agrega una solución de
peroxido de hidrogeno al 3 %. El color amarillo desarrollado es medido
colorimetricamente.
･
− Método espectrofotometrico ultravioleta(3)

La pirazinamida puede ser determinada por la medida de la absorbancia a 269 nm en

solución acuosa siendo la absortividad específica (1%, 1 cm) igual a 655.(3)

− Métodos complejometricos(3)

El método se basa en la formación de un complejo entre pirazinamida – HgCl2 sólido

(punto fusión 245 ºC) en una solución de ácido cítrico conteniendo un exceso de HgCl 2. Luego
de la filtración del complejo el exceso de reactivo (HgCl 2) es titulado con una solución de
Complexon III usando negro de eriocromo T (pH = 10) como indicador.

− Métodos cromatograficos(3)

Cromatografía en papel
 La cromatografía en papel de pirazinamida ha sido reportada indicando 5 sistemas de
solventes y una variedad de reactivos reveladores adecuados. Los sistemas solventes usados
fueron(3)

a) 4.8 g de ácido cítrico en una mezcla de 130 ml de agua y 870 ml de n-butanol

b) Buffer acetato pH 4.58
c) Buffer fosfato pH 7.4
d) Acetato de butilo – ácido acetico – agua (5:1:1)
e) n-butanol - HCl 1N (1:1)

Los siguientes valores de Rf fueron obtenidos utilizando papel de filtro Whatman N 1:

(a) 0.56, (b) 0.83, (c) 0.80, (d) 0.57, (e) 0.58.

Las manchas fueron visualizadas usando:

a) luz UV
b) asperjando una solución acuosa al 1% de KMnO4
c) asperjando una solución yodo platinado
d) solución acuosa de nitroprusiato y NaOH (1:1)

Cromatografía en capa fina (TLC)(3)

Los métodos para la separación e identificación de pirazinamida se resumen en la

siguiente tabla(

Sistema de solvente Fase estacionaria Rf Referencia

I A 0.63 19
II B 0.26 73
III B 0.44 73
IV B 0.79 73
V B 0.76 73
VI B 0.48 57
VII C ----- 70

Sistema de solvente

a) I amoniaco cc: metanol (1.5:100)

b) II tolueno: acetato de etilo: ácido fórmico 85 %(50:45:5)

c) III Tolueno: isopropanol: amoniaco cc (70:29:1)

d) IV tolueno: acetato de etilo: isopropanol: ácido acetico (10:35:35:20)

e) V tolueno: dioxano: metanol: amoniaco cc (20:50:20:10)

f) VI Cloroformo: metanol: amoniaco cc (20:20:1)

g) VII benceno: cloroformo: ácido acetico (8:1:1)

Fase estacionaria
 a) A silica gel G

b) B Kieselgel 60F 254 (Merck)

c) C Al2O3 60F 254 (Merck)

Reveladores

a) Iodine – carbontetracloruro reactivo asperjador

b) Luz UV a 254 nm

c) Nitroprusiato de sodio 4% - NaOH 4 N (1:1)

d) Cloruro picrico 1.5 %

f) Detección directa con difenilamina 0.1 %

Cromatografía gaseosa

El método de cromatografía de gases ha sido descrito para la determinación de

pirazinamida, usando una columna de vidrio (1.8 m) de Versamide 900 sobre Chromosorb W
silanizada (100 – 120 mesh) operada a 165 º C con N2 (50 ml/m) como gas transportador y un
detector FID.

Cromatografía liquida de alta presión

El métodos de HPLC para la determinación de pirazinamida y separación del ácido

pirazinoico ha sido desarrollado bajo las siguientes condiciones operativas(3):

･ Aparato: Hewlett – Packard 1084B

･ Columna: 25 cm x 4 mm Hibar® columna empacada con Lichrosorb RPB (7
µm)
･ Inyección: 20 µl de solución acuosa (cerca de 10 mg / ml de pirazinamida )
･ Fase móvil A: solución acuosa de tetrabutil amonio fosfato 0.005 M (pH 7.5)
･ Fase móvil B: solución de tetrabutil amonio fosfato 0.005 M en metanol – agua
(8:2 v/v)
･ Flujo: 1.5 ml/min
･ Temperatura de la columna: 25 ºC
･ Detector de longitud de onda:254 nm
･ Tiempo de retención relativa: ácido pirazinoico 1.9 minutos; pirazinamida 1
minuto.

Polarografía

Se han reportado determinaciones cuantitativas de pirazinamida y sus metabolitos en

tejidos humano y plasma por medio de medidas polarograficas. (11, 12, 13)

Determinación de pirazinamida en fluidos corporales y tejidos(14)

La mayoría de los métodos utilizados para este tipo de determinaciones son similares a
otros métodos analíticos generales arriba descriptos, solo con diferencias en los procesos de
extracción.
 En primer termino, los métodos colorimetricos están basados en la reacción de la
pirazinamida o de sus productos de hidrólisis con sulfato de amonio ferroso, nitroprusiato
alcalino, cloruro de cobalto entre las sustancias utilizados(3).

Mas adelante, fueron preferidas, las medidas espectrofotometricas o los métodos

polarograficos sin una previa separación del fluido biológico(3).

En la bibliografía se encuentran descriptos una combinación de las técnicas de

cromatografía de gases con espectrometría de masas para una identificación simultanea y
determinación cuantitativa de pirazinamida y sus principales metabolitos en suero y orina de
humanos(3).

Fue reportada una muestra microbiológica usando una sepa se Mycobacterium sensible
a la pirazinamida(3).

METODOS ANALÍTICOS REALIZADOS

 Espectrofotometría de absorción ultravioleta.

La espectrofotometría de absorción ultravioleta (UV) es una técnica ampliamente

utilizada en la determinación de sustancias en la industria farmacéutica. Algunas características
del método incluyen(10):
− Amplia aplicación: gran cantidad de sustancias absorben en la región
ultravioleta-visible, siendo por lo tanto sensibles a ser determinadas
cuantitativamente. Y para aquellas sustancias que no absorben es posible
transformarlas en absorbentes mediante un tratamiento químico, el cual puede
consistir en una reacción química o no.
− Elevada sensibilidad: los limites del intervalo de detección se encuentran en el
entorno de 10-4 a 10-5 M, lo cual es debido a las elevadas absortividades molares
de las sustancias (5000 a 40.000)
− Selectividad: es un método selectivo si se encuentra un rango de longitudes de
onda en la cual el analito sea la única especie que absorbe haciendo innecesaria
una separación previa.
− Exactitud: el error relativo a cualquier medida espectrofotometría es del orden
del 1 al 3 %.
− Rapidez
− Sencillez

El método se basa en la disminución de la potencia de un haz de radiación

electromagnética al interactuar con el analito. Se define la transmitancia de una solución como
la fracción de radiación transmitida(10)
P Donde la potencia, P, se define como la energía del haz que llega por segundo a un
T =
PO área.

Se define también la absorbancia, como el logaritmo en base 10 del inverso de la

transmitancia y esta se relaciona con la concentración del analito de acuerdo con la siguiente
expresión(10):

A=a× b× c

Donde:

− b es el camino óptico, ancho de la celda.

 − c concentración de analito.
− a absortividad del analito, cuyas unidades dependerán de las unidades del
camino óptico y la concentración, pues la absorbancia es adimensional.

La expresión que relaciona la concentración con la absorbancia es conocida como la ley

de Beer. Esta ley afirma que la absorbancia es proporcional a la concentración de la especie
absorbente; es aplicable a radiación monocromática y es valida para las soluciones diluidas de la
mayoría de las sustancias.(8)

La ley de Beer presenta algunas limitaciones entre ellas podemos citar:

− es una ley limite, se aplica a concentraciones menores a 0.01 M.

− A concentraciones mayores a 0.01 M la distancia promedio entre las especies
disminuye hasta el punto en que cada una afecta la distribución de cargas de sus
vecina.
− Desviaciones químicas: asociaciones, disociaciones, o reacciones del analito
generan una nueva especie diferente absortividad.
− Desviaciones instrumentales: radiaciones policromaticas y parásitas.

La absorbancia especifica (A11) de una sustancia, es la absorbancia de la mima en una

solución al 1% medida en una cubeta de 1 cm. Sustancias con valores altos de A11 permiten
realizar una espectrofotometría de orden cero, sin interferencia de los excipientes presentes.(8)

La linealidad de un procedimiento analítico es su capacidad para obtener resultados de

prueba que sean proporcionales ya sea directamente, o por medio de una transformación
matemática bien definida, a la concentración de analito en muestras en un intervalo dado. El
objetivo es obtener un modelo que describa con precisión la relación de concentración versus
respuesta, ya sea lineal o no lineal.(6)

La linealidad se determina mediante la construcción de un grafico de señales en función

de concentraciones de analito conocidas de forma de abarcar el rango de concentraciones de
trabajo. Una vez establecida la ecuación de la recta, se calcula el coeficiente de correlación este
coeficiente puede tomar valores entre –1 y +1, cuanto mas se aproxime a 1 significa que existe
una correlación lineal con una probabilidad elevada entre la concentración y la respuesta en el
instrumento(10).

Cuando se usa el método de los mínimos cuadrados para generar una curva de
calibración lineal, se requieren dos presunciones. La primera es que realmente hay una relación
lineal entre la variable de medida( y) y la concentración del analito(x). Esta relación se establece
como(10):
y= mx + b

En donde b es el intercepto en y( el valor de y cuando x es cero) y m es la pendiente de

la línea. También se presume que cualquier desviación de la línea recta de los puntos
individuales es el resultado de un error en la medición. Esto es, se debe presumir que no hay
error en los valores x de los puntos. Para una curva de calibración, por ejemplo, se asume que
las concentraciones exactas de los estándares son conocidos a partir de la forma en que fueron
preparados. Estas dos presunciones son apropiadas para la mayor parte de los métodos
analíticos. La desviación vertical de cada punto a partir de la línea recta se llama residual. La
línea generada por el método de los cuadrados mínimos es la que minimiza la suma de los
cuadrados de los residuales de todos los puntos(10).
 El equipo para realizar las medidas espectroscópicas debe estar equipado con un
monocromador de prisma o red, lo cual permite la selección de cualquier longitud de onda
dentro de la capacidad del instrumento, una fuente estable de energía radiante, recipientes
transparentes para contener la muestra de material que varían de acuerdo a la región espectral a
la que se destina el instrumento, un detector de la radiación, un sistema de tratamiento y lectura
de la señal(10).

 Valoración complejométrica

El análisis volumétrico es una técnica de análisis químico cuantitativo. Se basa en la

medida del volumen de una disolución de concentración conocida necesario para reaccionar
completamente con el compuesto a determinar (analito).

El proceso de adición de volúmenes de la disolución conocida se denomina valoración.

Generalmente la disolución con el reactivo conocido (disolución patrón) se coloca en una bureta
y la disolución del analito en un matraz. La disolución patrón se añade gota a gota hasta que ha
reaccionado con todo el analito. Entonces se mide el volumen consumido y mediante un cálculo
estequiometrico sencillo se puede calcular la cantidad del compuesto problema(11).

El final de la valoración se aprecia por un cambio brusco de alguna propiedad de la

disolución en el matraz, generalmente un cambio de color que se ve a simple vista. Para que se
produzca este cambio es preciso poner en la disolución del matraz una pequeñísima cantidad de
una sustancia llamada indicador. El final de la valoración se denomina punto de equivalencia o
punto final(11).

Para que se pueda llevar a cabo la titulación es necesario que la reacción entre el analito
y el valorante cumpla algunos requisitos como(11):

− La reacción entre el analito y el valorante debe transcurrir con cierta rapidez .

Para sustancias donde la velocidad de reacción es lenta o cuando el punto
final no puede detectarse de modo simple, a menudo se agrega un exceso de
reactivo y se titula dicho exceso por retorno o con una solución valorada
adecuada, después que se ha completado la primera reacción. En caso que se
permita un aumento de la temperatura puede ayudar a una cinética de velocidad
mayor.
− La sustancia a determinar debe reaccionar estequiométricamente con el reactivo
y no deben producirse reacciones laterales.
− Las sustancias presentes, como excipientes, no deben interferir con la reacción
principal.
− Y debe disponerse de un indicador adecuado, que permita una visualización
nítida de cambio de color en el punto final de la valoración. Si no se encontrara
un indicador adecuado, el punto final puede determinarse mediante medidas
potenciométricas, conductimétricas, amperométricas.

Las titrimétrias se clasifican de acuerdo a la reacción que tiene lugar entre el analito y el
titulante, teniendo así(8):

− Reacciones ácido – base, en medio acuoso y en medio no acuoso.

− Reacciones de precipitación.
− Reacciones redox.
− Reacciones complejométricas.
− Reacciones aniónicas – catiónicas.
− Reacciones de diazotación.
 La titulaciones complejométricas utilizan reactivos denominados ligandos que forman
complejos para poder llevar a cabo la titulación de los cationes de interés. Los mas empleados
son compuestos orgánicos que tienen varios grupos donadores de electrones capaces de formar
enlaces covalentes con iones metálicos. Dentro del amplio espectro de ligandos utilizados, los
ligandos polidentados determinan la formación de una clase particular de compuestos de
coordinación denominados quelatos que determinan la formación de complejos metálicos mas
estables que los formados por ligandos monodentados similares. El incremento de la estabilidad
proviene principalmente por un efecto entrópico: la entropía de formación del complejo
favorece la unión con un ligando grande que con varios pequeños. Este fenómeno depende de
varios factores(18):

− Numero de anillos formados: aumenta ante el aumento de estos

− Tamaño del anillo: mas pronunciado para anillo de cinco o seis miembros

− Estructura del agente quelante y orientación preferida de los ligantes

− Efectos estericos

Los agentes complejeantes usados casi exclusivamente en estos días en complejometria

son los ácidos aminopolicarboxilicos (también denominados complexones), en donde el ácido
etilendiaminotetracetico (EDTA) es por lejos el mas importante. La molécula de EDTA es un
ligando hexadentado con seis sitios posibles para unirse a un ión metálico como puede verse en
el siguiente esquema(11)
HOOC CH2 H 2C COOH
H2 H2
N C C N

HOOC C C COOH
H2 H2

Es el único ligando que forma con la mayoría se los iones metálicos complejos con
relación estequiometrica 1:1 muy estables para ser usado en un método de titulación. Los
distintos complejos metal-EDTA presentan estabilidades que varían en un amplio margen; en
general, los cationes de elevada carga iónica forman los complejos mas estables. Para este tipo
de titulaciones se utilizan soluciones muy diluidas de EDTA (del orden de 0.01 M a 0.02 M)
para poder detectar pequeñas cantidades de metales(11).

Un punto fundamental de la titulación complejometrica es la detección del punto final.

Como en toda curva de titulación, el punto de equivalencia ocurre en un cambio de pendiente
bien definido. Los puntos finales para las titulaciones con EDTA se vuelven menos definidos
cuando disminuye el pH como consecuencia de que la formación del complejo es menos
completa (efecto αo). Por esta razón, el punto final se localiza mas fácilmente a pH alto. Sin
embargo, en una titulación el pH no debe ser demasiado elevado para que no precipiten los
hidróxidos metálicos. Los indicadores metalocromicos son colorantes orgánicos que forman
quelatos coloreados con iones metálicos en un intervalo de pH característico del cation y
colorante. Para que el colorante sea útil debe cumplirse:

M-In + EDTA→ M-EDTA + In Kf M-In < Kf M-EDTA

 El mecanismo de acción es añadir una pequeña cantidad del indicador( In) al metal para
formar el complejo. A medida que se va agregando el EDTA, este en primer termino reacciona
con el M libre y luego con la pequeña cantidad del complejo M-In; por esta razón, el EDTA
debe complejearse con mayor fuerza al metal de lo que lo hace el indicador. Cuando ocurre el
cambio del M-In a la forma del indicador In no complejeado ocurre un viraje de color indicando
el punto final de la titulación.(18)

Para conseguir un punto final satisfactorio la relación Kf M-EDTA / Kf M-In debe

alcanzar como mínimo un valor de 104. Ejemplo negro de eriocromo T (NET), murexida,
calmagita. En el caso de la titulaciones que utilizan NET como indicador, es muy normal su uso
bajo forma sólida mediante el agregado de una punta de espátula ya que como solución son muy
poco estables y se descomponen lentamente con el transcurso del tiempo. Al colocarlo así es
una desventaja, pues nunca se sabe con precisión la cantidad de indicador agregado y por esta
razón existe una influencia en el pH del punto final. Para minimizar este error, se agrega una
muy pequeña cantidad de forma sólida hasta obtener una solución coloreada.(11)

En las titulaciones complejometricas donde se utiliza el par amoniacal NH4Cl/ NH3

para fijar el pH del medio, es de uso común el agregado de agentes complejeantes auxiliares
pues con ellos se obtiene una reacción cuantitativa y un salto pronunciado del punto final de la
valoración.(11)

 Titulación en fase heterogénea

Consiste en un método semimicrovolumetrico que se realiza en un sistema acuoso-

orgánico( no miscible con el agua) e involucra, producto de una atracción electrostática de
cargas, la formación de una especie química neutra denominada par iónico. Posteriormente
esta especie es sometida a una agitación enérgica en presencia de un indicador ácido o
básico, hidrófilo hidrofobico(17).

Un ejemplo de reactivos utilizados es el uso de cloroformo y agua como fases

inmiscibles y de laurilsulfato de sodio como titulante. La valoración se realiza en dos fases
y al realizarse el agregado del medio ácido a la fase acuosa, la droga va a estar protonada y
al interaccionar con el titulante cargado negativamente se va a producir la formación del par
iónico. Este par iónico al encontrarse en un medio como agua de alta constante dieléctrica,
se encuentra separado y por lo tanto no logro obtener un punto final si utilizará solo el
medio acuoso. Por esta razón se realiza la titulación en dos fases y cuando se forma el par
iónico pasa a la fase cloroformica al ser de alto peso molecular.(17)

Para poder determinar el punto final de la titulación, se utiliza un indicador mixto

constituido por amarrillo de dimetilo y azul de oracent B. Al titular, ante el primer exceso
de laurilsulfato de sodio va a reaccionar con el amarrillo de dimetilo quien tiene coloración
amarrilla en medio neutro y rojo en medio ácido. El azul de oracent B es un indicador de
contraste y no interviene en la reacción, provocando un cambio de color mas nítido de verde
a púrpura. Esta mayor visualización del punto final resulta crucial en casos donde la droga
es coloreada.(17)

Existe una serie de parámetros que inciden de manera importante en la formación del
par iónico y por lo tanto en el desarrollo normal de la titulación heterogénea:

 Estructura molecular del principio activo con la menor cantidad posible de

grupos polares

Es necesario que la molécula no sea muy polar ya que se busca que las cargas estén
ubicadas en una determinada región de la molécula. Si tengo cargas que están
 deslocalizadas a lo largo de la molécula, la estabilidad del par iónico va a estar afectada
y la extracción en la fase orgánica no va a ser la adecuada. La presencia de grupos como
O, OH, C=O polarizan a la molécula y determinan que se llegue al punto final antes de
que la reacción sea cuantitativa. En caso de que existan grupos polares en la molécula
puedo realizar una polarización de la fase cloroformica con el agregado de alcoholes
con altos largo de cadena. De esta manera tengo un mayor campo de aplicación al
aumentar el numero de drogas a analizar pero tiene la desventaja de que se pierde
discriminación entre ellas.(17)

 Presencia de nitrógenos terciarios o cuaternarios

 Alto peso molecular del principio activo

Es necesario para que el par iónico formado tenga un alto peso molecular y pueda pasar
de manera cuantitativa desde la fase acuosa a la fase cloroformica.

 Agitación vigorosa

Es una etapa critica ya que necesito que se realice de manera vigorosa para formar el
par iónico pero se corre el riesgo de formar emulsiones, que son especies muy difíciles de
romper. Existe una directa influencia sobre el coeficiente de reparto y en la cuantitatividad
de la reacción.

 Cromatografía en capa fina (TLC)

La cromatografía es una técnica de análisis químico utilizada para separar sustancias

puras de mezclas complejas. Esta técnica depende del principio de adsorción selectiva
principalmente pero también se pueden dar mecanismos de reparto, intercambio iónico,
inclusión o incluso combinación de estos, lo cual dependerá de la fase móvil utilizada . La
separación se consigue mediante la diferencia entre las fuerzas de adhesión de las moléculas de
los componentes a una fase móvil (normalmente, un disolvente) y a una fase estacionaria (la
llamada capa fina, que puede ser papel o gel de sílice). Esta diferencia se traduce en un mayor o
menor desplazamiento o movilidad de cada componente individual, lo cual permite su
separación e identificación.(10)

Las fases estacionarias mas utilizadas en TLC son(10):

− Silica gel.
− Óxido de aluminio o alúmina ( ácida, neutra ó básica).
− Tierra silícea.
− Celulosa (nativa o micro cristalina)
− Poliamidas.

A la hora de elegir una fase estacionaria se debe tener en cuenta una serie de
características como:

− Tamaño de partícula: volumen de poro, diámetro de poro y área superficial.

− Homogeneidad.
 − Pureza.

Como soporte para la fase estacionaria se usan laminas de vidrio, plásticos o metálicas.
Los tamaños de la placa de TLC convencionales son: 20 cm x 20 cm, 10 cm x 20 cm y 5 cm x 2
cm.(10)

La aplicación de la muestra dependerá de cual sea el objetivo de la TLC: analítica o

preparativa; sembrándose en banda o punto (o mancha), respectivamente(10).

El desarrollo de la placa se da mediante un proceso en el cual las sustancias son

transportadas a través la fase estacionaria por una fase móvil. Como fase móvil se puede
utilizar un único solvente, pero lo mas usual es utilizar una mezcla de solventes miscibles(10).

Una vez desarrollada la placa cromatografica, y la muestra no es coloreada (la mancha)

se requiere de algún método que permita visualizar el (los) componente(s) presentes,
generalmente este procedimiento es conocido como revelado del cromatograma. Para este
revelado se tienen dos métodos(10):

− Químicos (por inmersión o rociado) en el cual la placa es rociada (o asperjada)

con la solución del agente relevante adecuada obteniendo derivados coloreados
o fluorescentes.
− Físicos: generalmente las manchas se visualizan bajo luz UV.

En análisis cualitativo las manchas obtenidas en el cromatograma se caracterizan por la

distancia que avanzan con respecto a la distancia que recorre la fase móvil. El parámetro que se
emplea para evaluar esta relación es el factor de retención o relación de frente (Rf).

Rf = distancia del origen a la mancha .

distancia del origen al frente del solvente

El valor de Rf (menor o igual a 1) depende de condiciones experimentales, tales como

identidad y composición de las fases estacionaria y móvil, temperatura y estructura química de
los compuestos que se separan, siendo independiente del tiempo y de las dimensiones de la
placa. Comúnmente se siembran muestras del analito junto con estándares del analito sobre la
misma placa cromatografica de modo de poder comparar los Rf.
Es importante señalar que es posible afirmar que sustancias con diferentes Rf son
distintas (siempre que se desarrollen en idénticas condiciones), pero no se puede asegurar que
dos manchas con igual Rf corresponden a la misma sustancia. Para asegurarlo es necesario
realizar otros análisis que permitan confirmar la igualdad.(10)

PARTE EXPERIMENTAL

 Técnicas

 Determinación de pirazinamida por espectrofotometría UV

 Preparación de la solución estándar secundario para verificar linealidad

 Pesar en forma exacta 75.0 mg de pirazinamida estándar secundario y transferir a
un matraz de 50.0 ml, disolver la muestra en agua, completar el volumen con el
mismo solvente. Transferir 1.0 ml de dicha solución a un matraz de 100.0 ml.
Tomar de esta solución 2.0, 4.0, 6.0, 8.0 y 10.0 ml y transferirlos en cada caso a un
matraz de 100.0 ml y llevar a volumen con agua.

 Preparación de la solución de muestra

Pesar una cantidad de comprimidos en polvo, equivalente a cerca de 150.0 mg de

pirazinamida y transferir a un matraz de 100.0 ml, disolver la muestra en agua,
completar el volumen con el mismo solvente. Filtrar y descartar los primeros
mililitros de filtrado. Transferir 1.0 ml del filtrado a un matraz de 100.0 ml y
completar con agua.

 Determinación complejométrica de pirazinamida.

 Preparación de la solución de ácido etilendiamintetraacetico (EDTA) aprox. 0.05 M

Pesar en forma exacta una cantidad aproximada a 9.30 g de EDTA di sódico

calidad reactivo, transferir a un matraz de 500.0 ml y disolver en agua. Completar el
volumen con el mismo solvente. Almacenar en botella de plástico claramente
etiquetada.(10)

 Preparación de la solución de cloruro de mercurio 0.05 M

Pesar en forma exacta una cantidad aproximada a 6.78 g de HgCl2, transferir a un

matraz de 500 ml y disolver en agua. Almacenar en botella claramente etiquetada.
(11)

 Preparación de la solución de sulfato de magnesio(†) 0.2 M

Pesar 2.46 g de MgSO4.7H2O, transferir a un matraz de 50 ml y disolver en agua.

Almacenar en botella claramente etiquetada.(11)

† se sustituyo el MgSO4.7H2O por una solución saturada de MgCl2, densidad 1.56

g/ml, solubilidad de MgCl2.6H2O: 1 g en 0.6 ml de agua. Se toman 2.1 ml de
solución saturada y se lleva a volumen con agua.

 Preparación de la solución de carbonato de calcio 0.0625 M

Pesar una cantidad cercana a 1.0 g de CaCO3 calidad reactivo. Secar en estufa a
100 ºC durante 2 horas, retirar de la estufa y dejar enfriar en desecador por 30
minutos. Pesar exactamente en forma aproximada 0.63 g de CaCO3 seco y transferir
a un matraz de 100.0 ml, disolver en la mínima cantidad de HCl 0.2 M y llevar a
volumen con agua.(2) Almacenar en botella claramente etiquetada.(16)

 Preparación de la solución de ácido etilendiamintetraacetico (EDTA) 0.2 M

Pesar aproximadamente 3.72 g de EDTA, transferir a un matraz de 50 ml y

disolver en agua. Almacenar en botella plástica claramente etiquetada.(16)

 Preparación de la solución del complejo Mg-EDTA

 Mezclar iguales volúmenes de una solución de EDTA 0.2 M y una solución de
MgSO4 0.2 M. Almacenar en botella plástica claramente etiquetada.(16)

 Preparación de la solución buffer pH 10

Pesar una cantidad próxima a 70 g de NH4Cl, disolver en 513 ml de NH3 y agregar

agua hasta completar 1000 ml. Almacenar en botella claramente etiquetada.(16)

 Preparación de la solución de muestra

Pesar la cantidad de comprimidos en polvo equivalentes a 0.6 g de pirazinamida,

transferir a un matraz de 50 ml y agregar 45.0 ml de HgCl2, la solución resultante
se calienta por 5 minutos y a continuación se enfría en baño de hielo. Agregar 50 ml
de agua y filtrar, descartando los primeros mililitros del filtrado 2. Transferir 25.0
del filtrado 2 a un matraz de 250 ml y agregar 75 ml de agua, 5 ml de solución del
complejo Mg-EDTA, 5 ml de buffer pH 10 y una punta de espátula de NET (negro
de eriocromo T). Tratar inmediatamente con EDTA 0.05 M hasta viraje del
indicador. Registrar el volumen de solución utilizado.(19)

 Preparación de la solución estándar secundario de pirazinamida

Pesar una cantidad aproximada a 0.60 g de pirazinamida estándar secundario,

transferir a un matraz de 50 ml, agregar 45.0 ml de HgCl2, la solución resultante se
calienta por 5 minutos y a continuación se enfría en baño de hielo. Agregar 50 ml
de agua y filtrar, descartando los primeros mililitros del filtrado 2’. Transferir 25.0
del filtrado 2’ a un matraz de 250 ml y agregar 75 ml de agua, 5 ml de solución del
complejo Mg-EDTA, 5 ml de buffer pH 10 y una punta de espátula de NET (negro
de eriocromo T). Tratar inmediatamente con EDTA 0.05 M hasta viraje del
indicador Registrar el volumen de solución utilizado.(19)

 Normalización de la solución de EDTA 0.05 M

Transferir a un matraz de 250 ml, 10.0 ml de solución de EDTA 0.05 M, 35 ml de

agua, aproximadamente 5 ml de NaOH 0.25 M y una punta de espátula de indicador
Murexida. Tratar inmediatamente con solución de CaCO3 0.0625 M hasta viraje del
indicador. Registrar el volumen de solución utilizado(11).

 Determinación de pirazinamida por cromatografía en capa fina(TLC)

 Preparación de la solución test

Pesar en forma aproximada la cantidad de polvo de comprimidos equivalente a 0.1

g de pirazinamida, transferir a un matraz de 10.0 ml y disolver con agua. Completar
el volumen con el mismo solvente.

 Preparación de la solución de referencia

Pesar en forma aproximada 0.1 g de pirazinamida estándar secundario, transferir a

un matraz de 10.0 ml y disolver con agua. Completar el volumen con el mismo
solvente.

 Preparación de una solución de hidróxido de potasio 0.1 M en metanol

 Disolver en forma aproximada 0.56 g de KOH en 100 ml de metanol. Almacenar
en botella claramente etiquetada.

 Preparación de una solución de ninhidrina 1.25 % p/v

Disolver en forma aproximada 0.5 g de ninhidrina en polvo en 40 ml de acetona.

Almacenar en botella claramente etiquetada.

 Fase móvil 1(4)

Ciclohexano: tolueno: dietanolamina (75: 15: 10)

 Fase móvil 2(4)

Metanol: amoniaco (100: 1.5)

 Fase móvil 3(4)

Cloroformo: metanol (90 : 10)

 Fase móvil 4(4)

Acetona

 Siembra de las soluciones

Sobre una placa cromatográfica de 10 x 20 cm cubierta con silica gel de 250 µm

de espesor previamente asperjada con una solución de KOH 0.1 M en metanol y
secada, aplicar separadamente 10 µl de solución test y solución de referencia. Secar
en corriente de aire. Para cada una de las fases móviles propuestas desarrollar la
placa en cámara cromatográfica cerrada(4). Una vez finalizado el desarrollo de la
placa, secar la misma en corriente de aire y luego aplicar una solución de ninhidrina
en acetona en forma de fina niebla, secar en estufa a 100 ºC durante 5 minutos.
Observar visualmente las manchas obtenidas.

 Determinación de pirazinamida por titulación en fase heterogénea

 Preparación de una solución de laurilsulfato de sodio aprox. 0.005 M

Pesar en forma aproximada 0.53 g de laurilsulfato de sodio, transferir a un matraz

de 100.0 ml y disolver en agua. Completar el volumen con el mismo solvente.
Almacenar en botella claramente etiquetada.

 Preparación de la solución del indicador combinado

Pesar en forma aproximada y separadamente 3 mg de amarillo de metilo y azul de

oracent B y disolver por separado en 50 ml de cloroformo. Preparar el indicador
combinado un instante antes de utilizarlo mezclando volúmenes iguales de las
soluciones anteriores. Almacenar en botella claramente etiquetada.

 Titulación de la solución de muestra

 Pesar en forma aproximada la cantidad de polvo equivalente a 52 mg de
pirazinamida, transferir a un matraz de 50.0 ml disolver en agua, completar en
volumen con el mismo solvente. Filtrar descartando los primeros mililitros del
filtrado. En un matraz de 250 ml adicionar 3 ml de agua y 2.5 ml de H2SO4 2 N.
Tomar 2.0 ml del filtrado de la muestra y verterlos en el matraz, adicionar luego 20
ml de cloroformo y 2.5 ml de indicador combinado. Agitar hasta que la fase
clorofórmica aparezca de color verde uniforme. Titular con laurilsulfato de sodio
0.005 M con agitación constante. En las cercanías del punto final dejar reposar 30
segundos a 1 minuto después de cada adición. El punto final viene dado por el
viraje del indicador a verde malva-gris y posterior aparición de un color púrpura en
la fase clorofórmica. Considerar este punto como final.

 Titulación de la solución estándar secundario

Pesar en forma aproximada 52 mg de pirazinamida estándar secundario, transferir a

un matraz de 50.0 ml disolver en agua, completar en volumen con el mismo
solvente. Si fuera necesario filtrar descartando los primeros mililitros del filtrado.
En un matraz de 250 ml adicionar 3 ml de agua y 2.5 ml de H 2SO4 2 N. Tomar 2.0
ml de la solución estándar secundario y verterlos en el matraz, adicionar luego 20
ml de cloroformo y 2.5 ml de indicador combinado. Agitar hasta que la fase
clorofórmica aparezca de color verde uniforme. Titular con laurilsulfato de sodio
0.005 M con agitación constante. En las cercanías del punto final dejar reposar 30
segundos a 1 minuto después de cada adición. El punto final viene dado por el
viraje del indicador a verde malva-gris y posterior aparición de un color púrpura en
la fase clorofórmica. Considerar este punto como final.

Datos de la muestra

 Formula cuali-cuantitativa

Pirazinamida…………………….500 mg.
Excipientes……………………...csp 1 comprimido.

 Otros datos

Lote…………………………….18.
Vencimiento……………………10/05.

 Descripción: comprimidos planos con bordes aplanados, de coloración blanca sin

recubrimiento, sin ranuras y sin partículas extrañas. Se encuentran depositados en frasco
de vidrio transparente con tapa de metal
RESULTADOS

 Masa, diámetro y espesor de los comprimidos

Comprimido Diámetro (cm) Espesor Peso (g)

(cm)
1 1.30 0.400 0.6518
2 1.31 0.400 0.6486
3 1.30 0.400 0.6538
4 1.30 0.400 0.6460
5 1.305 0.400 0.6478
6 1.305 0.415 0.6442
7 1.305 0.400 0.6335
8 1.300 0.385 0.6252
9 1.305 0.415 0.6475
10 1.305 0.390 0.6411
11 1.305 0.400 0.6386
12 1.305 0.400 0.6318
13 1.305 0.405 0.6377
14 1.305 0.415 0.6497
15 1.305 0.410 0.6429
16 1.305 0.400 0.6359
17 1.305 0.390 0.6385
18 1.305 0.410 0.6381
19 1.305 0.400 0.6412
20 1.305 0.400 0.6461

 Determinación de pirazinamida por espectrofotometría UV

 Verificación de la linealidad

Potencia St (100 − AguaKF )

Toma St × Dil St × ×
CSt = 100 100
VSt

Donde
− TomaSt.............................Toma de estándar secundario.
− Dil St................................Dilución del estándar secundario.
− Potencia St........................Potencia del estándar secundario.
− Agua KF..........................Agua determinada por KF.
− VSt....................................Volumen de estándar secundario.
− CSt....................................Concentración del estándar secundario.
 − Toma de estándar............25.7 mg.
Dil St (ml) PotenciaSt (%) Agua KF (%) VSt (ml) CSt (mg/ml)
2/100 99.4 0.5 100.0 0.0051
4/100 99.4 0.5 100.0 0.0102
6/100 99.4 0.5 100.0 0.0152
8/100 99.4 0.5 100.0 0.0203
10/100 99.4 0.5 100.0 0.0254

 Espectro de orden cero

Concentración de estándar secundario Absorbancia ( UA)

(mg/ml)
0.0051 0.335
0.0102 0.636
0.0153 0.955
0.0203 1.266
0.0254 1.563
 Gráfico de linealidad

1.8 y = 60.867x + 0.0222

R2 = 0.9998
1.6
1.4
Absorbancia (UA)

1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 0.01 0.02 0.03
Concnetración (mg/ml)

 Análisis de residuos

ŷ (yi-ŷ)
1 0.3326 0.0024
2 0.6430 -0.0070
3 0.9534 0.0016
4 1.2578 0.0082
5 1.5682 -0.0051
 0.01
0.008
0.006
0.004

(y - y)
0.002
0
-0.002 0 0.5 1 1.5 2
-0.004
-0.006
-0.008
y

 Determinación de pirazinamida

Toma Absorbancia
(mg)
Estándar 1 75.7 0.952
Estándar 2 75.9 0.940
Muestra 1 192.9 0.945
Muestra 2 193.0 0.918

CM..................AbsM
CSt..................AbsSt Abs M
CM = × CSt
Abs St
Potencia St (100 − AguaKF )
Abs M × Toma St × Dil St × ×
mg Pirazinami da 100 100
=
VM Abs St × VSt

TomaM..................mgPirazinamida −
PComp.....................x PComp × mg Pirazinami da
x=
Toma M

Potencia St (100 − AguaKF ) −

Abs M × Toma St × Dil St × × × P Comp ×VM
C( mg / comp ) = 100 100
Abs St × Toma M × Dil M ×VSt

mg/comprimid % VD
o
Muestra 494.7 98.9
1
Muestra 487.7 97.5
2
Promedio 491.2 98.2
RSD (%) 1.00 1.00
 Determinación complejometrica de pirazinamida

 Normalización de la solución de EDTA 0.05 M aprox.

Gasto de CaCO3 (ml)

1 7.70
2 7.65

En el punto final

MolesEDTA = MolesCaCO3
MolaridadEDTA x Volumen pipeta = MolaridadCaCO3 x Gasto CaCO3

Molaridad CaCO 3 × Gasto CaCO 3

Molaridad EDTA =
V pipeta
Molaridad de EDTA
1 0.048
2 0.048
Promedio 0.048

Concentración EDTA...............0.048 M

 Determinación de pirazinamida

Toma Gasto 1 EDTA 0.048 M (ml) Gasto 2 EDTA 0.048 M (ml)

(mg)
Estándar 1 0.6007 6.60 6.50
Estándar 2 0.6003 6.30 6.25
Muestra 1 0.7706 6.75 6.65
Muestra 2 0.7706 6.45 6.35

Moles Pirazinamida = 2 ( Moles HgCl2 totales – Moles HgCl2 Retrovalorados )

Moles Pirazinamida = 2 {( Molaridad HgCl2 x Volumen ) – ( Molaridad EDTA x Gasto EDTA x Dil )}

Moles Pirazinamida = 2 {(0.05 x 45 x 10-3) – (0.048 x (25/110) x Gasto EDTA)}

mg Pirazinamida = Moles Pirazinamida x PM Pirazinamida

Moles mg mg pirazinamida /comp % VD

Pirazinamida Pirazinamida
Estándar 1 4.356e-3 536.0 --- ---
4.358e-3 536.0
Estándar 2 4.362e-3 537.0 --- ---
4.364e-3 537.0
Muestra 1 4.353e-3 535.8 446.4 89.3
4.356e-3 536.0 446.7 89.3
Muestra 2 0.004336 536.6 447.0 89.4
 0.004361 536.7 447.3 89.5

DISCUSIÓN

Con relación a la espectrofotometría ultravioleta, el único comentario importante para

realizar es que la gráfica de linealidad no pasa exactamente por el cero. Esto puede ser debido a
alguna mínima interferencia que puede eliminarse con un blanco(8).
En el método complejometrico el resultado obtenido comparado con el de la medición
espectrofotometrica, puede deber su diferencia a que la precipitación de la pirazinamida con
mercúrico no sea cuantitativa. A los efectos de realizar el calculo en la valoración
complejometrica, es importante tomar en cuenta la relación estequiometrica entre la
pirazinamida y el mercúrico precipitado. Para dar una mayor fiabilidad de los
resultados, hubiera sido necesario realizar un estudio pormenorizado de la estructura del
precipitado, el cual se sospecha que tiene relación molar 2:1 de mercúrico respecto a la
pirazinamida(18). Una alternativa podría ser el estudio mediante rayos X de la estructura
cristalina del precipitado.

Fue realizada una titulación en fase heterogénea con el fin de verificar si esta
metodología analítica es adecuada para la determinación del analito. En el inicio de nuestro
trabajo no se podía asegurar que esta técnica funcionaria debido a la naturaleza estructural de la
molécula de pirazinamida de acuerdo a los datos brindados por bibliografía(17). Aunque la
molécula presenta nitrógenos terciarios, el par de electrones libres no iba a poder estar lo
adecuadamente disponible para realizar la protonación en medio ácido que se realiza de acuerdo
a la técnica, debido al sistema resonante presente en el anillo de pirazina. Otro dato que servia
para afirmar esta situación era el valor de los pKa respectivos de la primera y segunda
protonación de estos nitrógenos(15). Al realizar la titulación, los gastos obtenidos de laurilsulfato
de sodio eran realmente muy bajos y era un dato que no hizo mas que, afirmar que la molécula
de pirazinamida había sido protonada en un porcentaje muy bajo; con lo cual se puede afirmar
que esta metodología es inadecuada para llevar a cabo la determinación de pirazinamida.

En cuanto a la cromatografía en capa delgada (TLC), no se observo la aparición de

manchas una vez revelado el cromatograma. Esto puede deberse a que en la técnica seguida,
proponía utilizar un revelador especifico para compuestos heterocíclicos nitrogenados a base
de yoduro de potasio y cloruro platinico(4). Como no se disponía del cloruro platinico para la
preparación de dicho revelador, se decidió probar otro revelador especifico para aminas, la
ninhidrina. Si bien la pirazinamida en su estructura molecular posee aminas, están incluidas en
un ciclo aromático, lo cual seguramente fue un factor determinante en la eficacia del revelador.
Otro punto a tener en cuenta, es que una de las fases móviles a utilizar contenía dietanolamina,
pero en la práctica se sustituyo por trietanolamina diluida. Lo cual en por lo menos ese sistema
cromatografico pudo influir en la corrida de las sustancias.

CONCLUSIONES

Comparando obtenidos en las técnicas espectrofotometrica y complejometrica se

concluye que la primera es más rápida, sencilla y especifica.

Se verifica que la valoración en fase heterogénea no es un método adecuado para la

determinación del principio activo en estudio, no cumpliendo con el objetivo prestablecido en el
trabajo.
 En relación a la TLC, para concluir algo acerca de su utilidad para identificar
pirazinamida por esta técnica es necesario repetir el procedimiento pero utilizando el revelador
indicado por la bibliografía.

BIBLIOGRAFIA
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