Cromatografia liquida ad alta pressione

 Tipi di cromatografo
 Unità di pressione
 Fase mobile
 Rivelatori
 HPLC di adsorbimento
 HPLC di ripartizione
 La cromatografia ad alta pressione HPLC (High Performance Liquid
Chromatography o High Pressure Liquid Chromatography) si basa sui principi
generali delta cromatografia d’adsorbimento, di ripartizione, di scambio ionico
ecc.; essa permette di analizzare miscele difficilmente risolvibili con le tradizionali
cromatografie.
Le colonne HPLC hanno una maggiore risoluzione dovuta all’impiego di fasi
stazionarie molto finemente suddivise alto scopo di realizzare una superficie di
interazione molto grande ed un migliore impaccamento, questo comporta che la
fase mobile attraversi la fase stazionaria delta colonna ad una pressione molto alta
per permettere una eluizione accettabile net tempo. Per una simile tecnica
cromatografica, la fase stazionaria, che presenta una granulometria generalmente
compresa tra 5-10 m, deve avere requisiti particolari per adattarsi at tipo di
separazione da effettuare ed inoltre deve avere come requisiti indispensabili:

a) essere stabile idroliticamente e termicamente;

b) resistere all’azione meccanica del flusso dell’eluente.

Diversamente dalla gascromatografia, l’HPLC non separa sostanze che si trovano

allo stato di vapore, ma permette la separazione di tutte quelle sostanze che
difficilmente possono essere vaporizzabili o che in ogni modo possano alterarsi ad
una temperatura più alta di quella ambiente; si può affermare che la
gascromatografia e l’HPLC sono due tecniche cromatografiche che si completano a
vicenda in quanto permettono di separare i costituenti di una qualsiasi miscela.

I vantaggi dell’HPLC possono essere cosi riassunti:

1. tempi brevi d’esecuzione

2. riproducibilità delle condizioni sperimentali
3. le colonne possono essere usate più volte;
4. possono essere analizzate miscele di sostanze tremolabili, esplosive e non
volatili.
5. possono essere evidenziate piccolissime quantità di sostanze grazie all’alta
sensibilità dei rivelatori che si utilizzano;
6. semplicità d’uso

Schemi di cromatografi HPLC sono riportati nelle figure 1 e 2

Figura 1: HPLC in isocratica

 Figura 2: HPLC a gradiente

Le caratteristiche di uno strumento HPLC sono rappresentate nello schema a

blocchi delle figure. II solvente opportunamente filtrato e depurato, viene inviato
alla colonna; questa operazione viene effettuata tramite una pompa. Un
flussometro, posto dopo la pompa, regolerà la quantità di eluente che, nelle
condizioni d’esercizio scelte, sarà immesso nella colonna.
Prima della colonna cromatografica viene posto un iniettore, che permette
l’inserimento del campione sciolto in un solvente opportuno. Per evitare di
danneggiare la fase stazionaria della colonna é opportuno eseguire una
prefiltrazione, attraverso una analoga colonna più piccola posta in serie, contenente
lo stesso tipo di fase stazionaria con una dimensione delle particelle più grande,
allo scopo di eliminare le impurezze grossolane, le morchie e le particelle insolubili
contenute nel campione da analizzare.
 Alla fine della colonna cromatografia viene posto un adatto rivelatore che,
attraverso il cromatogramma, darà indicazioni sull’andamento della separazione.
Nel caso in cui si opera in isocratica é sufficiente una sola pompa (figura 1),
mentre nel caso in cui si opera a gradiente (figura 2), è necessario usare due pompe
per mescolare i solventi ed inviarli alta colonna ad un valore controllato di
pressione, le condizioni operative, in questo caso, verranno programmate in
anticipo tramite un calcolatore che automaticamente effettuerà le operazioni
necessarie. E’ importante osservare che, poiché l’HPLC opera con un alto flusso di
fase mobile e quindi in condizioni di alta pressione, tutto il sistema operativo deve
essere adatto per lavorare in queste condizioni.
In particolare la fase stazionaria è posta in una colonna cromatografica fatta con un
materiale adatto per sopportare pressioni elevate (generalmente sono d’acciaio) e la
colonna stessa deve essere inserita in una camicia all’interno della quale sarà
esercitata una pressione tale da equilibrare la pressione esercitata dalla fase mobile
all’interno della colonna.
Nel caso di una HPLC di tipo preparativo, il rivelatore darà informazioni sulla
separazione della miscela, per raccogliere le varie frazioni di eluito contenente le
sostanze purificate. Nel caso in cui la separazione dei vari costituenti risulterà
parziale, le frazioni raccolte che contengono i componenti puri verranno raccolte,
mentre le frazioni che contengono ancora le sostanze in miscela verranno dirottate
con un rubinetto ed inviate alla colonna per essere nuovamente cromatografate.
Oltre ai vantaggi precedentemente elencati per questo tipo di tecnica, l'HPLC
costituisce un sistema cromatografico altamente efficiente in quanto:
- usa delle fasi stazionarie altamente perfezionate e molto versatili anche per
separazioni particolarmente difficili,
- usa rivelatori molto sensibili che vengono adattati al tipo di sostanza da
separare;
- usa un alto flusso delta fase stazionaria che porta ad una esecuzione molto
rapida nel tempo ed efficace.

Unità di pressione utilizzate per l’HPLC

Per questa tecnica cromatografia, l’unità di pressione utilizzata è il pascal (pa)

1 pascal = 1 newton/m2 = 1x105 bar
1 bar = 0,9869 atm = 1,01 Kg/cm2
1 Megapascal (Mpa) = 10 bar = 9,869 atm = 10,1971 Kg/cm2

FASE MOBILE

Nell’HPLC Ia fase mobile verrà scelta in funzione delle sostanze da separare e

deve presentare alcune caratteristiche peculiari tali da non generare inconvenienti,
fra queste:
- deve presentare una bassa viscosità, in quanto questo permette di operare,
all'interno della colonna, in condizioni di pressione di eluizione non troppo
elevata;
- deve essere degasificato prima dell'introduzione in colonna; la presenza di aria
può modificare chimicamente le sostanze da separare oppure dare alterazioni
nella risposta del rivelatore
- deve essere puro, perchè la presenza di sostanze estranee può danneggiare la
colonna;
- deve avere una temperatura di ebollizione sufficientemente elevata per evitare
fenomeni di volatilizzazione alle temperature usate durante l'operazione
cromatografica.
RIVELATORI
I tipi di rivelatori che possono essere utilizzati per l'HPLC sono diversi, l'uso
di ciascuno in relazione alla natura delle sostanze che debbono essere evidenziate.
E' evidente che, qualunque sia il rivelatore usato, la fase mobile non deve in alcun
modo interferire nella determinazione ed il rumore di fondo dello strumento non
deve essere superiore al segnale più basso dovuto alle varie sostanze da analizzare.
I rivelatori più comunemente usati sono:
 spettrofotometrici, (IR, UV ecc.), concentrazione minima rilevabile 10 -8 - 10-9
g/ml;
 fluorimetrici, concentrazione minima rilevabile 10-10 - 10-11 g/ml;
 a indice di rifrazione, un rivelatore a bassa sensibiIità
 a ionizzazione di fiamma.
Per potere utilizzare il quarto dei rivelatori elencati, è necessario far passare la
soluzione da analizzare dalla fase liquida a quella gassosa per potere effettuare la
combustione. Per una maggiore sensibilità è anche necessario allontanare prima la
fase mobile, in modo da inviare alla combustione soltanto la sostanza separata (o le
sostanze, se ancora in miscela). Per fare questo si fa evaporare selettivamente la
fase mobile ed, effettuata tale operazione, si volatilizza la sostanza da bruciare nel
rivelatore. Il rivelatore a fiamma in ogni modo ha una più significativa applicazione
nella gascromatografia.
Altri rivelatori usati sono: a) conduttometrici, b) a misura di radioattività, c)
elettrochimici, d) polarografici.

HPLC DI ADSORBIMENTO
I principi su cui si basa la cromatografia di adsorbimento sono stati già trattati
nella parte generale. Si può operare in fase normale o in fase inversa in funzione
del materiale che si usa per la fase stazionaria. La fase stazionaria può essere
caratterizzata, in relazione alla sua struttura fisica, in due categorie:
1. materiale poroso sia in superficie che all’interno contraddistinto in
 microporous, se la dimensione vana fra 5-10 m;
 macroporous, se la dimensione varia fra 50-100 m
2. materiale, di dimensione compresa fra 20-40 m, compatto nella parte interna e
con una pellicola porosa in superficie dello spessore compreso fra 1-2 m, che
viene definito pellicular.

I macroporous e i pellicular vengono generalmente utilizzati per cromatografie

preparative.
I materiali più comunemente utilizzati sono: gel di silice, allumina, poliamidi,
cellulosa, acetato di cellulosa, chromosorb (polimeri del vinil- e divinilbenzene).

HPLC Dl RIPARTIZIONE
Per questo tipo di cromatografia la fase stazionaria é costituita da un liquido
che può essere legato ad un supporto inerte fisicamente o chimicamente. Nel caso
in cui la fase stazionaria è legata fisicamente, può verificarsi un trascinamento di
essa da parte della fase mobile; per evitare questo, che porterebbe ad una
cromatografia non perfettamente efficiente si usa saturare la fase mobile con la fase
stazionaria.
In generale per evitare trascinamenti della fase stazionaria si usa operare legando
chimicamente la fase stazionaria inerte che in genere è costituita da gel di silice, in
particolare vengono funzionalizzati in vario modo i gruppi silanolici (figura 3)
Alcuni metodi di funzionalizzazione vengono riportati nello schema seguente:
Se si adopera come fase stazionaria silice legata chimicamente con gruppi funzionali
(bonded phase chromatography) si può operare sia in fase normale che in fase inversa
in funzione della polarità dei gruppi legati al supporto, si avrà così:

 fase normale: silice legata a gruppi cianopropilici;

 fase inversa: silice legata a -C18, -C8, -fenile

L’ordine di polarità dei vari gruppi legati alla silice varia secondo la seguente scala
di polarità:

-CN > -NH2 > -C(CH3)2 > -C8> -fenile

Si può operare sia in fase normale che in fase inversa, tenendo conto del
tipo di fase mobile da usare in funzione del tipo di fase stazionaria.