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Università degli Studi di Parma

Facoltà di Scienze Matematiche Fisiche e Naturali


Classe delle Lauree in Scienze Biologiche

Fisiologia delle membrane biologiche

Massimiliano Zaniboni
PROGRAMMA DEL CORSO

1. Cenni sui trasporti di membrana


2. Proprietà elettriche passive della membrana cellulare
3. Equilibrio di Nernst
4. Equazione di Goldmann-Hodgkin-Katz
5. Canali ionici di membrana
6. Relazioni corrente-voltaggio per membrane ohmiche e voltaggio-dipendenti
7. Introduzione alle tecniche sperimentali per lo studio proprietà elettriche di membrane (current clamp e voltage clamp)
8. Membrane ohmiche, membrane non-ohmiche, membrane voltaggio e tempo dipendenti
9. Misura delle proprietà elettriche passive di membrana
10. La tecnica del patch clamp nelle sue diverse configurazioni
11. Dalla corrente di singolo canale alla corrente di whole cell
12. Teoria di Hodgkin e Huxley del gating voltaggio-dipendente dei canali ionici
13. Ricostruzione cinetica della corrente rapida di sodio a partire da dati sperimentali di voltage clamp
14. Eccitabilità di membrana e potenziale d’azione
15. Il potenziale d’azione locale e quello propagato
16. Teoria del cavo ed elettrotono
17. Interazione elettrotonica e gap junctions: struttura e gating
18. Un esempio ‘from cell to bedside’: il cuore
19. Il potenziale d’azione cardiaco e le correnti ioniche che lo generano
20. Meccanismo eccitabile delle cellule automatiche e di quelle di lavoro
21. Meccanismo molecolare della refrattarietà cardiaca
22. Meccanismi molecolari della regolazione simpatica e parasimpatica del cuore
23. Accoppiamento eccitazione-contrazione nel cuore
24. Meccanismo del calcium-induced-calcium-release
25. Dinamica del calcio intracellulare
26. Rest decay e rest potentiation
φύσις λόγος
"discorso sui fenomeni naturali"

[pron. “sheng li”]


Funzione eccitabile di membrana
V(t)

C.V.D.
•Il POTENZIALE D’AZIONE (PA) è l’evento alla base della eccitabilità cellulare

Sistema cardiocircolatorio Sistema muscolo-scheletrico Vasi, organi interni, sfinteri … Sistema nervoso

muscolo scheletrico

neuroni
muscolo cardiaco

muscolo liscio
gap junctions low resistance
SA nodal atrial gap junctions high resistance
Simulating the initiation of heart beat

This animation shows a computer model of a pacemaking SA node In this animation, cell-to-cell coupling within the atrium and at the SA
embedded in surrounding atrial tissue. Individual SA node cells are based node - atrial border is increased from 50 to 100 nS. This coupling level is
on the model of Cai, Winslow, and Noble (IEEE Trans. BME. 41(3):217- so high that electrotonic loading of peripheral SA node cells by surrounding
231). Atrial cells are modeled as described in Winslow et al. (Proc. Roy. atrial cells prevents them from oscillating, and the pacemaker potential fails
Soc. Lond. B, 254: 55-61). Cell-to-cell coupling in the SA node is 10 nS, to conduct onto the atrium. Electrotonic loading occurs since atrial cells have
and is 50 nS in the surrounding atrium. Coupling at the border a resting potential (roughly -90 mV) which is considerably more
between SA node and atrium is 50 nS. At this level of coupling, the hyperpolarized than the maximum diastolic potential of peripheral SA node
pacemaking node is able to generate a propagating wave of excitation in cells (-70 mV).
the atrium.
Neural networks
A logical calculus of the ideas
immanent in nervous activity
Warren S. McCulloch, Walter Pitts, Bulletin of
Mathematical Biophysics, Vol. 5, pp. 115–133
(1943). Warren McCulloch Walter Pitts
Neuropsychiatry Mathematics
Abstract Because of the “all-or-none”
character of nervous activity, neural events and
the relations among them can be treated by
means of propositional logic. It is found that the
behavior of every net can be described in these
terms, with the addition of more complicated
logical means for nets containing circles; and that
for any logical expression satisfying certain
conditions, one can find a net behaving in the
fashion it describes. It is shown that many
particular choices among possible
neurophysiological assumptions are equivalent, in
the sense that for every net behaving under one
assumption, there exists another net which
behaves under the other and gives the same
results, although perhaps not in the same time.
Various applications of the calculus are discussed.
Norbert Wiener (1894-1964) Haldan Keffer Hartline (1903-1983)

Premio Nobel,1967

CIBERNETICA VISIONE
Moto di un grave

y
60

50

40

altezza (m)
30

20

10

0
v0
y0 m 0 200 400 600 800 1000 1200

tempo (s)
Oscillatore armonico

k m

4
0 x 3

escursione (cm)
1

-1

-2

-3

-4
-200 0 200 400 600 800 1000 1200

tempo (s)
Eccitabilità cellulare
(fenomeno non-lineare)

40

20

Vm (mV)
corrente -20

-40

-60

-80

-100
-50 0 50 100 150 200 250

time (ms)
La membrana cellulare è una STRUTTURA DISSIPATIVA
I trasporti di membrana
La membrana plasmatica

aqueous interior of cell

lipid bilayer
phospholipid

modello a ‘mosaico fluido’ di Singer e Nichols

aqueous exterior
Diffusione semplice attraverso il doppio strato
apolare polare

Molecole idrofobiche O2, CO2, N2, NO


Piccole molecole polari non cariche

Grandi molecole polari non cariche H2O, urea, glicerolo

Zuccheri

Ioni
Passaggio mediato da proteine di trasporto

Trasporti passivi (secondo gradiente chimico/elettrochimico)


Trasporti attivi secondari (dissipano gradienti)
Trasporti attivi primari (consumano energia metabolica)

Voltaggio-dipendenti (VOC)
Ligando-dipendenti (ROC)
1. CANALI IONICI
Dipendenti da secondi messaggeri (SMOC)
Meccano-dipendenti

Uniporti
2. TRASPORTATORI (CARRIERS) Antiporti
Simporti

3. POMPE IONICHE
Canali ionici

diversi stati possibili:

Aperti Voltaggio/ligando/
poro idrofilo
Chiusi SM-dipendenza
Attivati
Tempo-dipendenza
Inattivati
(transizioni probabilistiche)

selettività

Gap junctions
Attivazione - inattivazione
Selettività ionica

Nota: gli ioni Na+ sono più piccoli degli ioni K+

Come può un canale far passare ioni K+


e bloccare invece ioni più piccoli?

Energia di idratazione degli ioni


La prima shell di idratazione del Na+ e del K+ contiene 6 molecole di H2O

Per passare attraverso il FILTRO SELETTIVO del poro, entrambi gli


ioni devono rimuovere quattro molecole di H2O.

L’energia necessaria a rimuovere 4 molecole d’acqua dal potassio è


solo sufficiente per rimuoverne 3 dal sodio

Il piccolo ione Na+ richiede una maggiore energia di deidratazione del K+


dal momento che il suo nucleo è più vicino alle molecole d’acqua e
l’interazione è quindi più forte.

K K K K K K

Na Na
Na
Na Na
Na

Na
Na
Canali di potassio
data una certa Energia
~105/cellula

2 cm

~1 canale / 9X9 m2

NOI SIAMO
QUI
Canali di Potassio (correnti outward, polarizzanti)

Composti per lo più di 4 subunità, omologhe della cosiddetta proteina Shaker

Sequenza aminoacidica della proteina Shaker


con, evidenziati, i segmenti idrofobici (S1-S6) che
costituiscono i domini transmembrana. La regione P
è quella affacciata sul poro.
ESCLUSIONE PER CARICA

CATIONICA
Selettività
ANIONICA

Dovuta a residui aminoacidici


carichi esposti nel poro

Roderick MacKinnon
Nobel per la chimica 2003
inward recitifier

PRINCIPALI CLASSI

1. Canali Kir
2. Canali Kdr
3. Canali KTO
4. Canali KCa
5. Canali KATP

Dendrogram of the 71 cloned mammalian K+ channels


Canali di Sodio e di Calcio (correnti inward, depolarizzanti)

EC-coupling

Responsabili della fase iniziale


della eccitabilità cellulare
Responsabili, fra l’altro, dell’
(depolarizzazione rapida del
1. accoppiamento eccitazione
potenziale d’azione) e della sua
contrazione nelle cellule
propagazione
muscolari
2. plateau del PA delle cellule
cardiache
3. insorgenza PA cellule
autoritmiche
4. processi di secrezione
5. processi di rilascio di
neurotrasmettitore
6. … etc
Canali di Sodio e di Calcio

Consistono di una subunità principale che costituisce il poro (subunità α) e altre più piccole
subunità ausiliarie.
Ogni subunità α è suddivisa in 4 domini simili, ciascuno analogo alla proteina Shaker

subunità α di un canale di Sodio o di Calcio


Sodium channels

calcium channels

BLOCKERS

sodium ch. TTX, STX

calcium ch. Diidropiridine

potassium ch. 4-AP


Altri criteri di classificazione

• Omologia strutturale

• Proprietà farmacologiche

• Parentela filogenetica
Canali ionici voltaggio-dipendenti (VOC)

MacKinnon’s scheme

Alta selettività.
Si parla di:
canali di Na+, Ca2+, K+, Cl-, H+, …etc

α(V)
From the following article:
O C
Fifty years of inactivation
Richard W. Aldrich β(V)
Nature 411, 643-644 (7 June 2001)

Free
Energy
O
C
Canali ligando-dipendenti (ROC)

Legame nel versante


extracellulare

Esempi:
α([R])
Recettori per l’acetilcolina del muscolo scheletrico e dei neuroni
Recettori ionotropi per il glutammato O C
Recettori per acido γ-aminobutirrico (GABA) β([R])

Free
Energy
O
C
Canali dipendenti da secondi messaggeri (SMOC)
(tipicamente cGMP o cAMP)

Legame nel versante


intracellulare

Esempio tipico nei recettori olfattivi e visivi dei vertebrati


Canali attivati da stimoli meccanici
CARRIERS
3 types of transporters
un esempio:
regolazione intracellulare del pH nel muscolo cardiaco

Na+-HCO3- Cotransporter
Na+-H+Exchanger (NBC)
(NHE)

pH=7.4

[Na+]o = 145 mM
ACID EFFLUX [Na+]i = 12 mM
[Cl-]o = 123 mM
pH=7.1
[Cl-]i = 4.2 mM
ACID INFLUX

Cl--OH- Exchanger Cl--HCO3- Exchanger


(CHE) (AE)

AC
CO2 + H20 H2CO3 HCO3- + H+
un esempio:
lo scambiatore Sodio-Calcio nel muscolo cardiaco
trasporti attivi primari
( POMPE IONICHE )
Trasportano contro gradiente tramite reazioni accoppiate
Mantengono i gradienti fondamentali a:
• Potenziale di riposo
• Potenziale recettore digitalis
• Potenziale d’azione
• Secrezione esocrina
• Contrazione muscolare
• Controllo volume cellulare Pompa sodio-potassio
• Trasporto transepiteliale

Pompa di calcio sarcoplasmatica


Le leggi della diffusione

Le molecole tendono a mischiarsi a


causa dell’energia cinetica dei loro
movimenti casuali (moto browniano)
Diffusione di soluti non ionici

In generale: tridimensionale

Nella fisiologia cellulare: monodimensionale

out
Concentrazione omogenea
trasversalmente

in
x
1°legge di diffusione di Fick

Conservazione della massa

2°legge di diffusione di Fick


Soluzioni a tempo fissato

C(x)t

x
Soluzioni a spazio fissato

x0
x1

x0
C(t)x x1

x2

x3

time
Diffusione attraverso membrane

MEMBRANA OMOGENEA
Il soluto si scioglie nel solvente delle due parti e anche nella membrana
Il processo continua finchè C1=C2 (Jnetto = 0)

Ammettendo C1 e C2 sono costanti (è vero ad esempio nel caso di


sistemi dissipativi):

(C2 − C1 ) Legge di Fick


J = − Dm = Pm (C2 − C1 ); FORMA DISCRETA
∆x

C1
C2

∆x
Diffusione di elettroliti attraverso membrane selettivamente permeabili

E=0 E=EK

1 2 1 2

K+ K+ K+ K+

A- A- A- A-

Lavoro del gradiente elettrico We = zi F (V1 − V2 ) = zi F Vm


Lavoro del gradiente di concentrazione Wc = RT {ln c1 − ln c2 }
All’equilibrio:
We = − Wc
RT c2 EQUAZIONE
Vm = Ei = ln DI NERNST
zi F c1
H.W.Nernst (1864-1941); 1920 Nobel Prize in chemistry
C1 C2

Il lavoro necessario per trasferire una mole di soluto da una soluzione a concentrazione
C1 a una a concentrazione C2 (n volte maggiore)

è uguale al

lavoro che occorrerebbe spendere per comprimere, lentamente e isotermicamente, un


volume V1, contenente una mole di gas ideale, fino a un volume V2.

pV = nRT V1 V2

V2 dV V2
∫V1
W = pdV = RT ∫V1
=
V
= RT (ln V2 − ln V1 ) = RT (ln C1 − ln C2 )
RT c2 -98 mV

Ei = ln
zi F c1
K+ K+

155 mM 4 mM
+67 mV
+129 mV

Na+ Na+ Ca2+


Ca2+
12 mM 145 mM 1.5 mM
10-7 M

+
- +
- +
- +
[Na+]i = 12 mM - +
[K+]i = 155 mM - + [Na+]o = 145 mM
Es.
muscolo scheletrico [Ca+]i = 0.1 µM
- +
- +
[K+]o = 4 mM
di mammifero - - + [Ca+]o = 1.5 mM
Nel caso di una membrana permeabile a più specie ioniche si deriva la
EQUAZIONE DI GOLDMANN-HODGKIN-KATZ:

Di
pi = Coefficiente di permeabilità
∆X dell’i-esimo ione
•Le cellule eccitabili sono polarizzate, con l’interno negativo rispetto all’esterno

OUT + + gK
+ +
+
- - +
- -
-
-
+
+ Cm
- +
-
EK
+
IN - +
- +
-
- +

Vrest ~ -90 mV

1 µF/cm2

Campo elettrico = 90 mV/7 nm ~ 105 V/cm


Differenza di potenziale: diverse centinaia di milioni di Volt
Altezza: p.es 5 Km
Campo elettrico: ~200 V/cm
gNa gK gCl

ENa EK ECl
Capacità elettrica q+

∆V
A
Q+
d Q
C=
Q- ∆V
dQ A
iC = −
dt C∝
dV d
iC = − C corrente capacitiva
dt
Bottiglie di Leida
Macchine elettrostatiche

Tesla Coil

Generatore di Van de Graaf


Luigi Galvani (1737-1798)
Alessandro Volta (1745-1827)
Autore Marco Piccolino

Coautore Marco Bresadola


Titolo Rane, torpedini e scintille

Sottotitolo Galvani, Volta e l'elettricità animale


Bollati Boringhieri, Torino, 2003 , pag. 728,
Edizione
dim. 147x220x35 mm , Isbn 88-339-1470-4
Corrente trans-membranaria

B gK
++
++
+
q dq Cm
- - -
+
+
i= EK
-
-
+
+
dt
-
- +
A - +
- +

+ +
++
++ +
+
+ +
- - - + Legge di Ohm per un canale ionico
- +
- +
-
- +
+
ii = g i (Vm − Ei )
-
- +
Ei = -60 mV
+ +
++
++ +
+
+ +
- - - +
-
-
+
+
ii = g i (Vm − Ei )
-
- +
- +
- + 1
gi = = 20 nS
Ei = -60 mV 50 MΩ
Relazione corrente-voltaggio
i (nA)
4

Ei
2
‘Potenziale di inversione’
1

0
-100 -50 0 50 100
Vm (mV)
-1
dV
i=−C
dt

dV
i=−C + g Vm
dt
[K+]o

gK

[K+]i
EK
dV
i=−C + g i (Vm − Ei )
dt

+] [K+]o
[Ca2+][Na
o o

gNa gK gCl

ENa EK ECl [K+]i


[Ca2+]i [Na+]i

dV
i= −C + g Na (Vm − VNa ) + g K (Vm − VK ) + g Cl (Vm − VCl )
dt
eccitabilità

gNa(V,t) gCl(V,t)
gK(V,t)

ENa EK ECl
POTENZIALE DI RIPOSO [Na+]o = 145 mM
[K+]o = 4 mM
[Ca+]o = 1.5 mM
+ RT c2
-
+ [Cl-]o = 123 mM Vm = Ei = ln
- +
- + zi F c1
[Na+]i = 12 mM - +
[K+]i = 155 mM EQUAZIONE
- +
DI NERNST
[Ca+]i = 0.1 mM - +
[Cl-]i = 4.2 mM - +
-
- +

ENa = +67 mV
EK = -98 mV gNa gK gCl
ECa = 129 mV
ECl = -90 mV
ENa EK ECl
Na+ 2K+

3Na+ POTENZIALE DI MEMBRANA


A RIPOSO

~ -90 mV
gNa gK gCl

ENa EK ECl

La corrente che fluisce in ciascun ramo resistivo è: I i = g i ⋅ (Vm − Ei )


I tot = I C + I Na + I K + I Cl =
dV
= −C + g Na (Vm − VNa ) + g K (Vm − VK ) + g Cl (Vm − VCl )
dt
VOLTAGGIO DIPENDENZA

i
Legge di Ohm
Vm
i = g.Vm

canali
i = g.Vm
voltaggio-
voltaggio-dipendenti

canali ohmici i = g(Vm).(Vm - Ei)

i = g.(Vm - Ei)
Relazioni corrente-voltaggio
[K +
[Na]+o]o

[K++]]ii
[Na

La conduttanza è un buon Canali non-selettivi


indicatore del numero dei oppure
canali Non c’è gradiente
Rettificazione
Corrente di Sodio rapida Corrente di Calcio di tipo L

Corrente di Potassio t.o. Corrente di Potassio D.R.


Corrente di Potassio IK1 (inward rectifier)

5 mM

[K+]o
10 mM

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