TOSSICOLOGIA APPLICATA

Il tossicologo è lo studioso che ha il compito di:

1.Esaminare la natura degli effetti tossici, inclusi i meccanismi di azione a livello cellulare, biochimico e
molecolare.
2.Valutare le probabilità con cui questi effetti ricorrono.
3.Sviluppare mezzi e strumenti per la valutazione espositiva dell’uomo e dell’ambiente alle sostanze
chimiche.
Per l’effetto finale concorrono:
-tossicità intrinseca della sostanza
-tipo di esposizione, quali condizioni e dosi
-soggetto e bersaglio colpito dalla sostanza
Il tossicologo esamina se la sostanza ha tossicità intrinseca, qual è il bersaglio di azione e l’esposizione
attraverso cui uomo o ambiente entrano in contatto, quantità dosi e probabilità con cui si esplica e
qual è il rischio per salute dell’uomo e ambiente.

Campi di applicazione della tossicologia:

-clinica
-ambientale
-forensi
-industria alimentare
-ricerca universitaria, ecc..

ORGANIZZAZIONE DI UN LABORATORIO DI TOSSICOLOGIA

In laboratorio il tossicologo valuta se la sostanza è tossica o meno lavorando nelle massime condizioni
di sicurezza dell’operatore. Inoltre, le aree del laboratorio devono essere divise a seconda del campo di
applicazione: microbiologia, colture cellulari e tessuti, biochimica, stabulario (dove si trovano gli
animali) e istopatologia.
Si deve lavorare in un ambiente idoneo, per far sì che la sperimentazione sia facilitata, dove si può
eseguire quello che devo fare nelle migliori condizioni e in aree ben definite e separate per condurre le
attività .
Le colture cellulari devono essere manipolate in ambiente idoneo, si lavora sotto cappa a flusso
laminare in condizioni di sterilità . Si devono evitare le contaminazioni batteriche, perché
l’inquinamento può inficiare e danneggiare il risultato finale; i batteri competono con le cellule per i
nutrienti. Così si potrebbe incappare in un falso positivo, cellule tutte morte = sostanza utilizzata ha
indotto la morte cellulare.
Chi lavora con mutageni e cancerogeni deve utilizzare opportuni mezzi di contenimento, per garantire
che non ci sia una esposizione alle sostanze in questione.
Gli animali che vengono utilizzati devono essere mantenuti in un ambiente idoneo e separato
dall’edificio = stabulario ambienti separati dove vengono eseguite le procedure. Deve essere presente
una stanza dove vengono tenute le gabbie e una zona separata idonea per il sacrificio e le analisi
istopatologiche.
Le attrezzature di base ed i servizi per la preparazione di terreni di coltura, il lavaggio della vetreria, la
conservazione dei composti chimici, ecc. devono essere nelle vicinanze immediate dei laboratori
A causa del potenziale rischio derivante dai composti chimici, è essenziale che il personale dei
laboratori, gli eventuali visitatori e l’ambiente siano protetti, confinando questi materiali mediante
l’applicazione di procedure sperimentali definite, aree designate per l’uso specifico e sistemi di
controllo e di decontaminazione
Utilizzo di dispositivi di protezione:
-guanti
-mascherina
-occhiali

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INDAGINI TOSSICOLOGICHE RICHIESTE
La valutazione della possibile tossicità per la salute dell’uomo viene svolta su farmaci, qualsiasi
prodotto immesso in commercio, cosmetici, deodoranti, componenti del packaging per alimenti,
pesticidi ecc… la sostanza deve sottostare a norme e superare prove tossicologiche, queste sono
obbligatorie per i prodotti che devono essere messi in commercio.
Il numero di analisi e prove che vengono svolte varia a seconda della caratteristica della sostanza.

Studi condotti:
-studi di tossicità acuta: somministrazione singola, esposizione singola ad un’elevata quantità di
sostanza.
-somministrazione ripetuta: la somministrazione avviene più di una volta e può avere una diversa
durata d’esposizione: SUB-acuto, medio termine, sub-cronico, cronico
-studi di mutagenesi: tossicità genetica per valutare se la sostanza ha impatto sul DNA, collegati agli
studi di cancerogenesi. Genotossico non vuol dire cancerogeno!
Sostanza genotossica = interagisce e danneggia il DNA
Sostanza mutagena = fissa il danno genetico che può essere trasmesso alle progenie. Se la mutazione
avviene in oncogeni o oncosoppressori può iniziare processo di cancerogenesi.
-studi di cancerogenesi: viene valutato il potenziale cancerogeno di una sostanza
Non si procede mai con studi di cancerogenesi se la sostanza è risultata positiva alla mutagenesi, è già
abbastanza per bloccare la sperimentazione.
Questi studi vengono svolti se la sostanza non è mutagena, tenendo conto di studi fatti
precedentemente per valutare se è il caso di procedere o meno: se sostanza ha analogie strutturali con
cancerogeni, se la sostanza ha utilizzo cronico, ecc..
-studi di tossicità sul ciclo riproduttivo: si valuta l’impatto sul ciclo riproduttivo, comprendo tutto
l’arco temporale che compre l’età fertile. Prendendo in considerazione i danni di fertilità sia maschile
che femminile, la gravidanza (effetti causati in seguito ad esposizione in utero) e anche quello che
consegue durante l’allattamento, manifestazioni dopo la nascita.
-test di tollerabilità locale: si studia l’impatto della sostanza in seguito a via di esposizione cutanea o
oculare. Si valuta se l’esposizione può avere effetto tossico locale (colliri e pomate, sostanze che
accidentalmente posso avere contatto con occhi e pelle).

VIVO o VITRO?
Alcuni test si conducono in vitro altri in vivo, realtà ci sono molti test condotti in vitro fondamentali
per iniziale lo screening sulla molecola prima della sperimentazione animale. Se ad esempio se si parla
di un farmaco i test in vitro ci possono dare informazioni che giustifichino l’andare avanti con la
sperimentazione in vivo. In sperimentazione animale ci arrivano molecole effettivamente di interesse.

IN VIVO:
La sperimentazione animale, in alcuni casi è fondamentale per ottenere informazioni e conoscenze che
al momento non possono essere ottenute in altro modo. Non per questo però si stanno cercando
metodi alternativi per ridurla ed eliminarla il più possibile.
E’ obbligatorio seguire una normativa rigida e dettagliata, per la protezione degli animali, per il loro
benessere anche per tutelare i risultati della sperimentazione. Se l’animale non è in buona salute esso
può rispondere alla sostanza diversamente a seconda delle sue condizioni. Un animale in condizioni di
stress può manifestare eccessiva tossicità.
Al momento la sperimentazione animale è prevista per una serie di studi:
1.Sviluppo, produzione, prove di qualità, efficacia ed innocuità di preparati farmaceutici, alimenti ed
altre sostanze di utilità. Profilassi, diagnosi e cura di malattie (uomo, animali, piante). Valutazione,
rilevazione, controllo e modificazione delle condizioni fisiologiche (uomo, animale, piante).
2.Protezione dell’ambiente nell’interesse della salute e del benessere dell’uomo e degli animali.

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Ovviamente sono presenti animalisti contrari alla sperimentazione animale: (slide 8, principali
argomentazioni degli animalisti)
Metodi alternativi: incentivati per motivi etici e opinione pubblica, anche per motivi economici (costa
la sperimentazione animale)
Ente europeo: ECVAM, incentiva e sviluppa nuovi metodi: tollerabilità locale.
Loreal: nei laboratori i test di valutazione della tollerabilità locale non vengono più svolti sugli animali.
Durante la sperimentazione animale non si utilizzano animali randagi perché potrebbero essere in
condizioni fisiologiche non adatte.

LEGISLAZIONE SULLA SPERIMENTAZIONE ANIMALE:

Si cerca di uniformare le legislazioni e le norme a livello europeo e mondiale, sia per il libero
commercio sia per ampliare il bacino sperimentale di una sostanza che potrebbe coinvolgere più
centri di ricerca.
-Decreto legislativo 27 gennaio 1992, n.116: in materia di protezione degli animali utilizzati a fini
sperimentali o ad altri fini scientifici.
-Decreto legislativo 4 marzo 2014, n.26: sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici,
stabilisce misure relative alla protezione degli animali utilizzati ai fini scientifici.
Di seguito descrizione del decreto legislativo: (da slide 13 a slide 37)
1-oggetto ambito di applicazione: aspetti disciplinati.
a) reduce, replace an refine 3R, principio di base su cui si fonda il mondo dei metodi alternativi, si
spinge per una sostituzione o una riduzione dell’uso degli animali, il perfezionamento delle tecniche,
per ridurre il numero di animali e per arrivare alle miglior condizioni possibili.
Gli animali devono arrivare da allevamenti normati e devono essere seguiti per tutto l’iter della vita e
soppressi secondo metodi ben precisi.
L’utilizzo degli animali è consentito quando non è possibile utilizzare altro metodo, nel campo della
mutagenesi sono presenti tantissimi test in vitro per non arrivare fino al test sull’animale.
Vengono elencati quali sono gli animali idonei a seconda del test che deve essere svolto e quanti.
2-eccezioni in cui il decreto non si applica
3-definizioni
4- autorità competenti
5-finalità delle procedure
Deve essere garantito il benessere dell’animale prendendo in considerazione fattori e parametri fisici
da controllare (temperatura, rumore, illuminazione da rispettare), alimentazione controllata e
bilanciata, monitoraggio continuo del veterinario.
6-metodi di soppressione:
minimo dolore all’animale secondo metodi dell’allegato 4 e secondo metodi precisi. MINIMO DOLORE!!
7-specie minacciate di estinzione
8-primati non umani: utilizzati solo in casi eccezionali.
9-animali prelevati allo stato selvatico
10- quali sono gli animali utilizzati nelle procedure e che informazioni devo avere su di essi e su
come devono essere allevati ed utilizzati nei laboratori.
11- animali randagi e selvatici delle specie domestiche, cani, gatti
12-procedure
13-scelta dei metodi
14-anestesia: vietate procedure che non prevedono analgesia o anestesia.
Art: 31 autorizzazione dei progetti per fare sperimentazione animale, descrizione dettagliata di tutte le
varie procedure e step.
Alla fine dello studio si deve fare una valutazione retrospettiva.

ALLEGATO 4:metodi di soppressione che possono essere utilizzati, variano

a seconda della specie e
ognuna di esse ha il proprio metodo di sacrificio. Soppressione avviene al
termine dello studio o durante l’iter per effetti gravi e malessere
dell’animale. Se l’animale manifesta segni di malessere e stress eccessivo
3 deve essere umanamente sacrificato, se no obbligatoriamente al termine
dello studio viene sacrificato.
Numeri della tabella rimandano ad una legenda:
es 1: utilizzo previa sedazione, ecc.. (slide 37)
SPERIMENTAZIONE ANIMALE
Prima di avviare la sperimentazione animale devono essere effettuati studi chimico-fisici sulla
molecola e studi in vitro. Successivamente si passa alla scelta del modello animale tenendo conto delle
specie che devono essere utilizzate, devo scegliere un modello valido efficace e mirato. Il modello deve
essere idoneo per quel tipo di sperimentazione e efficace per rilevare il parametro tossicologico.
TOPO, RATTO, CONIGLIO sono i più utilizzati, provengono da allevamenti autorizzati, dove gli animali
sono controllati microbiologicamente (controllo se l’animale ha infezioni) e geneticamente. Le specie
animali utilizzate per la ricerca sono più di un centinaio.
Il modello animale utilizzato deve aver ricevuto una validazione che dimostri che esso funziona
veramente come modello per l’uomo o per la specie bersaglio.
Deve essere svolto un controllo dell’animale e deve essere munito di un foglietto di accompagnamento
con elencate le caratteristiche, malattie, vaccinazioni, il corredo genetico e le caratteristiche genetiche.
Nella maggioranza dei paesi, l’importazione degli animali è soggetta a numerose leggi che hanno il fine
di prevenire ed impedire l’insorgere di malattie contagiose e la protezione di certe specie.

TOPO:
-mammifero, roditore.
Ceppo più utilizzato: albino Swiss, bianco con occhi rossi.
Ogni ceppo ha le sue caratteristiche e sono diversamente suscettibili a malattie e presentano una
diversa risposta comportamentale a diverse condizioni sperimentali (specie più mansuete e altre più
aggressive e mordaci). Il topo viene utilizzato perché ha necessità di spazi ridotti e costa poco il suo
mantenimento. È l’animale più codificato a livello genetico ed è molto utile per creare modelli
transgenici e/o mutanti di geni endogeni.
Usi: Ricerca farmaceutica, tossicologica, oncologica, genetica ecc.
Vengono tenuti in gabbia, sono animali sociali: timidi e tendono a scappare, notturni (perciò bisogna
dargli ciclicamente da mangiare e da bere durante la notte). Si deve instaurare un rapporto tra
manipolatore e animale fino alle procedure.
L’animale per sua natura cerca di preparare il nido, se non lo fa può essere dovuto da condizione di
stress e malessere che manifesta in questo modo.
I maschi e le femmine devono essere stabulati separatamente, perché i maschi sono più aggressivi e
litigiosi; femmine litigano raramente ma diventano molto aggressive in difesa dei cuccioli.
Praticano il cannibalismo: dettato dalla natura, le madri alla nascita di piccoli con malformazioni o che
reputano non idonei alla sopravvivenza li mangano per recuperare i nutrienti in favore degli altri
cuccioli.
Se maneggiati in modo sbagliato tendono a mordere. Ci devono essere persone esperte nel maneggiarli
per non stressarli.
Devono essere fatte osservazioni quotidiane in termine di comportamento per monitorare il benessere
e la risposta alla sostanza: animale che gira su se stesso, se si sfrega le zampe, se si mordicchia. Questi
comportamenti devono essere monitorati e segnati nel report finale della sperimentazione.

Caratteristiche biologiche: (vengono prese in considerazione per selezionare il modello animale

adatto a seconda del test) durata della vita, età per la riproduzione, maturità sessuale, durata della
gravidanza, numero di neonati, peso alla nascita e l’età dello svezzamento.

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Esempio: selezionare un animale per sostanza tossica per esposizione cronica, se l’animale vive 24
mesi circa (topo) è idoneo per la sperimentazione.
La durata della gravidanza viene presa in considerazione per monitorare le varie fasi della gravidanza
dopo esposizione, che possono essere alterate dalla sostanza in studio. Prima fase della gravidanza:
sviluppo dell’embrione e passaggio da embrione a feto con sviluppo degli organi, può presentarsi
tossicità fetale, andando a studiare lo sviluppo degli organi e se sono presenti anomalie. Inoltre
l’animale viene monitorato anche vicino al momento del parto e post-parto. La durata della gestazione
o l’eventuale morte del feto ci può far capire in quale delle fasi la sostanza in studio ha esplicato la sua
tossicità .
Il numero di neonati viene monitorato perché se è minore rispetto alla norma, con eventuali aborti
spontanei, ci può indicare tossicità da parte della sostanza.
PESO: uno dei fattori più monitorati. Se è presente un calo ponderale del 10%, vuol dire che la
sostanza ha esplicato un minimo effetto tossico MDT. Anche il peso dei cuccioli alla nascita viene
monitorato e se pesano di meno, la tossicità può essere dovuta alla non corretta ossigenazione e
apporto di nutrimenti.

RATTO:
Viene utilizzato spesso per gli studi di cancerogenesi.
Sono animali più docili e meno mordaci, riconoscono l’operatore che li manipola; infatti, l’operatore
che segue il gruppo di animali deve essere lo stesso. Animali sociali, curiosi, notturni.
Peso maggiore dei topi.
Uso: in ricerca biomedica, farmacologica, tossicologica, studi di cancerogenesi, studi comportamentali,
neurologici, nutrizionali, endocrini, chirurgia, trapianti
Vantaggi: Gestazione breve, vita media breve, comportamento docile

CONIGLIO: lagomorfo
USO: in ricerca biomedica, farmacologica, tossicologia, studi di EMBRIOTOSSICITÀ
È obbligatorio il loro utilizzo per la sperimentazione dopo il caso della talidomide.
Sensibilità simile a quella dell’uomo ai teratogeni

STABULARIO:
Luogo dove vengono mantenuti gli animali per la sperimentazione.
Una corretta stabulazione degli animali da laboratorio, una applicazione dei sistemi di stabulazione
che sia adatta a scopi sperimentali specifici ed un adeguato uso di metodi di sanitizzazione serve a
garantire: un buon stato di salute degli animali, il loro benessere, la sicurezza del personale impiegato
nella ricerca. L’animale da laboratorio deve essere mantenuto in un ambiente sano, pulito e
confortevole.
Corretta stabulazione: attuazione di procedure tenendo conto delle caratteristiche della specie per
garantire il miglior stato di salute, fondamentale dal punto di vista etico e per dati puliti e privi di
errori dovuti dal fatto che l’animale non è sano.
Lo stabulario prevede aree separate e diverse a seconda dell’attività che viene svolta:
-aree di ricevimento: gli animali che arrivano dall’allevamento vengono trasferiti in una camera dove
vengono controllati dal punto di vista sanitario
-aree di quarantena: aree in cui gli animali devono stare per un pò di giorni per evitare di trasmettere
patologie a tutti gli animali già presenti nello stabulario.
-stanze dove vengono mantenuti, ecc….

Esistono due tipi di stabulario:

-convenzionale: locali che devono avere sistemi di controllo ambientali per garantire salute e
benessere degli animali. Vengono controllati: luce, rumore, temperatura, areazione, ventilazione.
-barriera: i locali hanno i requisiti minimi ambientali dello stabulario convenzionale modificate ed
adattate per garantire che i contaminanti rimangano all’esterno dell’area (sistema di ventilazione e
flusso dell’area).

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A seconda della pressione dell’ambiente, una avrò pressione + o – rispetto all’esterno io avrò un flusso
d’aria dall’esterno o al di fuori, esso viene controllato per eventuali ingressi e fuoriuscite di
contaminanti:
-Locale a pressione + rispetto alla pressione esterna: se si apre una porta l’aria fluisce fuori e i
contaminanti non entrano nei locali (sale chirurgiche)
-Locale a pressione – rispetto alla pressione esterna: se si apre una porta l’aria fluisce nel locale per far
sì che i contaminanti rimangano all’interno (virus e batteri, sale di quarantena).
Il flusso si dirige in una direzione dall’area pulita a quella sporca.
Lo stabulario può presentare una serie di stanze con 2 porte e 2 corridoi: corridoio contaminato e
quello pulito, si entra dal corridoio pulito e si esce dal corridoio sporco, per garantire la minor
contaminazione.

Sporco/pulito: è un sistema che garantisce e facilita il flusso in una direzione sola di tutto dalle
persone agli animali ai materiali, riducendo le possibilità di contaminazione accidentaledi materiali e
animali. Ogni locale ha una porta che dà sullo sporco ed un’altra che dà sul pulito.
Biohazard: strutture che vengono usate per studi condotti con materiale infettivo.
Esse sono dotate di doccia ad acqua per il personale sia in in entrata che in uscita.
Tutti i materiali devono essere sterilizzati (lettiera, mangime, acqua, materiali, carcasse, indumenti di
protezione dei tecnici, siringhe ecc.) sia in in entrata che in uscita.
AREE FUNZIONALI:
Nella progettazione di un nuovo complesso (“Facility”) per animali da laboratorio, bisogna tener conto
di diversi fattori: tipo di istituzione, dimensioni dell’istituzione, linea/e di ricerca, specie di animali e
categoria microbiologica degli animali, tipo di stabulazione, numero annuo di animali, norme
legislative e costi.

Organizzazione stabulario:
Gli animali vengono mantenuti in un gabbie, esposti al macro e micro ambiente. Deve essere assicurato
il mantenimento dei parametri fisici per garantire il benessere dell’animale.
L’ambiente deve essere standardizzato e costante, per evitare l’introduzione di variabili che
potrebbero inficiare sulle analisi: corretto ricambio di aria, ventilazione temperatura, ecc..
Affinché l’organismo possa adattarsi nel modo corretto e si possano ottimizzare i parametri
dell’animale.
Garanzia di benessere: monitoraggio sanitario
Deve essere presente un veterinario preposto al controllo della salute degli animali, che viene ad
intervalli regolari.
Gli animali vengono certificati, accompagnati da un passaporto, per capire età , alimentazione,
vaccinazioni, trattamenti terapeutici vari, ecc…
ALIMENTAIZONE: strettamente controllata, dieta equilibrata e bilanciata per il benessere dell’animale
L’acqua e l’aria devono essere controllate e ricambiate.

Adeguata stabulazione: parametri fisici per ambiente idoneo al benessere

-temperatura: caratteristica della specie, una non corretta temperatura può influire sull’ animale. Gli
animali topo, ratto hanno range tra 20-24 °C, i conigli vengono mantenuti a temperatura più bassa.
Questi valori si riferiscono al macroambiente, dove sono mantenuti gli animali (temperatura
mantenuta all’interno delle aree di stabulazione)
Microambiente: T all’interno delle gabbie che dipende dal tipo di gabbia e al numero di animali che
vengono mantenuti.
Esistono variazioni anche tra i piani bassi e alti, il calore va verso l’alto, tra un piano e l’altro delle
gabbie potrebbero esserci differenze.
T può alterare parametri che poi si riversano sui dati: alterazione attività di riproduzione, variazioni
del peso, ecc..
-umidità: valori ottimali tra 55+- 10%, bisogna evitare che l’umidità si alzi o si abbassi troppo, elevati
livelli di umidità favoriscono la sopravvivenza di agenti virali e agenti della flora microbica.

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Aria secca: fastidiosa per le vie aeree, la bassa umidità favorisce l’essiccamento delle mucose e
predispone irritazioni; riducendo l’efficacia della barriera per le infezioni respiratorie. Nel ratto è stata
studiata l’insorgenza di una patologia specifica (ring tail, desquamazione della coda dell’animale)
dovuta all’aria troppo secca.
-ventilazione: con la ventilazione si sostituisce in una determinata area l’aria presente e si introduce
aria fresca, al fine di mantenere basso il livello di odori, di gas nocivi, di polvere ed agenti infettivi. Il
flusso dell’aria deve essere uguale in ogni parte della stanza di stabulazione
Essa viene misurata in termini di ricambi d’aria effettuati dall’impianto di condizionamento ogni ora.
8-10 ricambi d’aria minima all’ora, optimum 15-20 ricambi d’aria l’ora.
Per evitare correnti d’aria direttamente sull’animale è presente un impianto apposito per il ricambio
dell’aria.
Un efficiente sistema di igiene e disinfezione delle gabbie e delle strutture unito ad un corretto
funzionamento del condizionamento riducono il rischio di contaminazione microbiologica.
-illuminazione: parametro importante fortemente incidente sull’equilibrio, biochimico e psico-fisico e
comportamentale dell’animale. Le 12h ore di luce e di buio sono ideali per alternanza dei cicli
circadiani, è importante anche l’intensità , fondamentale per evitare influenze anche di tipo
comportamentale.
Anche le alterazioni visive, luce troppo intensa potrebbero causare degenerazioni retiniche.
La maggior parte degli animali da laboratorio dimostra abitudini crepuscolari o notturne e
quindi risulta particolarmente sensibile all’esposizione ad elevate intensità luminose
Standardizzazione: -richiede l’assenza di finestre (o il totale oscuramento di quelle esistenti) e la
necessità di illuminare artificialmente le diverse aree
-rumore: l’esposizione di alcuni ratti a livelli sonori elevati per circa 5 giorni, ha causato la
diminuzione dell’appetito e la diminuzione della curva di crescita. Il rumore influenza il
comportamento e la risposta dell’organismo degli animali.
Gli animali hanno capacità uditiva più alta rispetto a quella umana, sentono suoni impercettibili, tutto
una serie di rumori che possono rappresentare fonti di stress per gli animali (impianto d’allarme,
telefono, porte che sbattono, ecc..).
Range desiderato: rumore di fondo < 50 dBA.

RICEVIMENTO, QUARANTENA E CONTROLLO DEGLI ANIMALI DA LABORATORIO

-aree di ricevimento:
Consentono l’ingresso degli animali provenienti da allevamenti esterni ed il trasferimento dei
medesimi dalle scatole o gabbie di trasporto nelle gabbie che utilizzerò nello stabulario. Gli animali
devono essere trasferiti nelle gabbie precedentemente sterilizzate.
Area fondamentale per il controllo dell’animale per evitare che possano essere veicolo per la
trasmissione di malattie.
Bisogna fare particolare attenzione, oltre che alle condizioni generali degli animali, anche alle scatole o
gabbie in cui sono stati trasportati. I contenitori possono rappresentare ottimi nascondigli per germi,
insetti e parassiti, nonché delle loro larve o uova quindi, non solo non vanno mai introdotti nello
stabulario e mai immagazzinati nelle aree adiacenti agli stabulari, ma devono essere eliminati al più
presto.
Per gli stessi motivi di protezione igienico-ambientale, l’accesso alle aree di quarantena deve essere
vietato anche al personale addetto al trasporto degli animali provenienti da allevamenti esterni.

-area di quarantena:
Le aree di quarantena hanno una duplice funzione:
a) Separare gli animali ricevuti da quelli già presenti nello stabulario, fino a che non sono state definite
le condizioni di salute degli animali in arrivo, in modo da minimizzare/azzerare l’introduzione di
eventuali agenti patogeni in colonie di animali già stabilizzate da un punto di vista sanitario
b) Permettere agli animali appena ricevuti di adattarsi alle nuove condizioni ambientali (clima, dieta)
per ripristinare i parametri fisiologici e metabolici normali.

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La durata della quarantena è correlata a diverse variabili: legislazione vigente, le condizioni di
trasporto, la specie animale considerata, la categoria microbiologica degli animali, il periodo di
incubazione delle eventuali patologie che possono essere introdotte.
In base a queste variabili il periodo di quarantena può essere compreso tra 5 e 60 giorni; se i
nuovi arrivi rimangono clinicamente in buone condizioni durante tale periodo, il rischio di introdurre
una patologia nelle colonie già esistenti è minimo.
Le aree di quarantena dovrebbero essere fisicamente separate dalle aree di normale stabulazione e
strutturate in modo da permettere la separazione tra le varie specie sia per prevenire la trasmissione
di patologie interspecie (soprattutto quando gli animali provengono da allevamenti diversi e sono in
condizioni microbiologiche diverse), sia per ridurre lo stress dovuta al conflitto interspecie.

Controllo ed osservazione degli animali all’arrivo:

-esame clinico morfologico per verificare l’assenza di anomalie cominciando dalla testa in modo
sistematico. (narici pulite e umide, occhi brillanti, bocca pulita, orecchie pulite, ecc..)
-rilievo comportamentale, comuni a tutti gli animali in buono stato di salute: aspetto vigile,
portamento equilibrato su tutte le zampe, interesse o reazione positiva verso l’ambiente circostante,
ecc..
Il controllo dello stato di salute deve essere fatto quotidianamente durante tutto il periodo di
permanenza in stabulario, compresa la quarantena; qualsiasi irregolarità̀ deve essere annotata e
segnalata.

ATTREZZATURE E SISTEMI DI STABULAZIONE:

Si devono utilizzare strutture e metodi operativi che consentono all’animale di crescere, maturare,
riprodursi e mantenersi in buona salute, e nello stesso tempo esse devono permette il controllo e il
monitoraggio delle variabili ambientali generali, fisiche, chimiche e microbiologiche, per rendere
minime quelle variazioni che possono modificare la risposta dell’animale durante l’esperimento.
Il sistema di stabulazione deve essere adeguato alla specie animali, al tipo di sperimentazione ed alle
esigenze dello sperimentatore.
Per ogni programma di stabulazione devono essere definite e scritte le procedure operative necessarie
per effettuare operazioni quali l’alimentazione, l’abbeverazione, il cambio delle gabbie, lo spostamento
degli animali, la pulizia e la disinfezione di carrelli, gabbie, mangiatoie, bottiglie ed altri accessori, la
registrazione della mortalità, la raccolta dei rifiuti, il cambio dei filtri, il tipo di gabbia, ecc.
In tali procedure devono essere anche specificare la persona responsabile e la frequenza temporale.
Nello stabilire delle procedure bisogna tener conto della legislazione vigente e delle linee guida
più recenti.
Al termine dello studio si deve risalire a tutto quello che è successo e si deve sapere quello che è stato
fatto e la persona responsabile che ha effettuato il tutto.

Alloggiamento: gli animali vengono tenuti in gabbia e anche la scelta della gabbia deve avvenire in
base alla specie, al tipo di allevamento e alla durata della sperimentazione.
Tutto deve mirare al benessere dell’animale anche le caratteristiche di costruzione della gabbia per
garantirne il benessere come: grandezze, materiale e garantire uno spazio confortevole per
l’assunzione delle posizioni funzionali dell’animale.
-Deve essere sicura: non devono essere presenti parti taglienti, appuntite; deve essere sicura anche dal
punto di vista della costruzione.
-Deve essere a prova di fuga, l’animale non deve fuggire, perché potrebbe rimanere incastrato nel
coperchio della gabbia.
-Deve essere controllata dal punto di vista igienico e deve essere costruita in modo che possano essere
sanificate nel modo corretto.
-Deve essere accessibile all’animale, garantire tutti i bisogni fisiologici dell’animale.
-Devo poter vedere gli animali all’interno per controllare quotidianamente lo stato di salute e il
comportamento.
-Controllare la legislazione vigente.

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TEST CONDOTTI SUGLI ANIMALI
Tossicità per somministrazione singola e ripetuta:
Rappresentano le indagini tossicologiche richieste per certificazioni e commercio di farmaci, additivi
alimentari, contaminanti. Sono studi obbligatori, ma che in generale possono essere fatti su tutte le
sostanze che potrebbero interagire con l’uomo, per capire l’effetto.
STUDI DI TOSSICITA’:
-acuta (s. singola)
-medio termine (s. ripetuta)
-lungo termine (s. ripetuta)
-mutagenesi
-cancerogenesi
-ciclo riproduttivo
L’effetto tossico dipende dalla durata dell’esposizione, dal tipo di esposixione e dalla dose.
La dose vale tanto più per alcune sostanze tanto meno per altre: per alcune si possono definire i valori
soglia (NOAEL, LOEAL, ecc..), per le sostanze mutagene non si può definire una dose soglia sotto la
quale l’effetto non si ha. Curva dose-risposta: effetto zero solo alla dose zero.
Tipo e durata dell’esposizione.
-studi di tossicità per singola somministrazione: ACUTA
-studi di tossicità in più somministrazioni, ripetute: diverse durate temporali
-breve termine (SUBACUTA): 14-21-28 gg
-prolungata (SUBCRONICA): 90 gg nel ratto e nel topo, 10-25 % della vita dell’animale
-CRONICA: 2 anni nel ratto o 18 mesi nel topo, >50% della vita dell’animale
La percentuale di vita che dipende dall’animale stesso.
La sperimentazione di solito viene fatta sui soggetti giovani adulti che hanno raggiunto un’età matura,
ma possono essere considerati giovani.

STUDI DI TOSSICITA’ ACUTA:

Sono esperimenti condotti su animali da laboratorio mediante i quali si definiscono le proprietà
tossiche di una sostanza dopo un’unica somministrazione.
-studi qualitativi e quantitativi del fenomeno tossico e della sua incidenza dopo somministrazione
singola
-danno indicazioni sugli effetti di un sovradosaggio acuto nell’uomo
-la concentrazione sperimentale deve permettere il rilevamento dei sintomi di tossicità acuta e della
modalità di morte.
Assunzione di una dose eccessiva rispetto al dosaggio terapeutico, può avvenire anche in caso
accidentale, oppure nei tentativi di suicidio o omicidio.
Esempio: si osserva nell’assunzione di droghe d’abuso.
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Si deve dare all’animale una conc. di sostanza che permetta il rivelamento associabile alla tossicità e
all’eventuale evento di morte. Vengono definite le dosi che assunte possono causare morte del
soggetto.

Disegno sperimentale: sono presenti delle linee guida di riferimento a seconda dell’analisi che si deve
condurre. Le tappe principali sono:
-selezione della specie animale (due specie di mammifero)
-numero di animali per gruppo sperimentale: di solito è un numero più basso rispetto alle altre
sperimentazioni, (10 maschi e femmine, 5 animali per sesso e per dose).
-attento controllo degli animali e dei fattori ambientali: protocollo sperimentale in cui viene spiegato
quello che farò sugli animali e che li riguarderà : parametri ambientali di mantenimento, come farli
arrivare, tempi di acclimatazione, ecc…
-via di somministrazione (due)
-livelli di dose (almeno 3)
-durata (14 gg)

ANIMALI:
Si selezionano due specie di mammifero: due roditori (topo e ratto), usando un numero uguale di
entrambi i sessi (differenza tra maschie e femmine di tipo ormonale, fisiologico e metabolico, possono
influenzare la risposta alla sostanza). Le differenze possono presentarsi anche tra una razza e l’altra.
Tutto si basa sul contenimento dei numeri degli animali, evitando il più possibile un utilizzo eccessivo
degli animali. Nelle linee guida è dichiarato che se non osservo differenze nelle risposte tra i due sessi
nella prima specie, posso decidere di testare solo un sesso nella seconda specie selezionata. Spesso
sono utilizzate le femmine perché più sensibili.
Per qualsiasi specie impiegata deve essere indicato: età , peso, origine (allevamento), tempo di
acclimatazione, se privi di specifici patogeni, vaccinazioni o altre procedure, condizione di
stimolazione ed ambientali, dieta.

TRATTAMENTO:
- via di somministrazione cambia a seconda del tipo di esposizione all’uomo e a seconda del tipo di
parametri di tossicità che si studiano al momento.
Due vie di somministrazione:
-una quella potenziale della via umana
-quella che dovrebbe assicurare il pieno accesso della sostanza immodificata al circolo sanguigno.
Bisogna andare a vedere al di là degli effetti legati all’ ADME, cosa succede se la sostanza arriva
immodificata al circolo sanguigno.
La somministrazione viene fatta tramite GAVAGGIO: sondino nello stomaco, stima se la sostanza viene
ingerita in un'unica volta. Non va bene la somministrazione tramite il cibo cibo perché l’animale
magari non mangia in un'unica dose il cibo.
L’altra somministrazione è quella parenterale.
-condizioni di somministrazione: bisogna specificare se la sostanza è contenuta in un certo veicolo,
la concentrazione della soluzione e se ha un certo volume: solvente, il volume del solvente che uso per
somministrare la sostanza deve essere certificato ed entro un certo limite (non volumi eccessivi).
Tipico veicolo: fisiologica o acqua. Se è richiesto volume eccessivo, si possono fare più
somministrazioni ad intervalli di tempo più ravvicinati entro le 24h.
La formulazione deve avere un pH od osmolarità fisiologiche.
-livelli di dose: vanno definiti e sono almeno 3. In tutte le specie deve essere permessa
l’identificazione dello spettro di tossicità, ottenendo una stima quantitativa della letalità approssimata
e della relazione dose-risposta.

RILIEVI, OSSERVAIOZNI ED ESAMI:

Le osservazioni devono essere fatte sia sugli animali trattati sia su un gruppo di animali di controllo:

10
animali che mantengo e non tratto con la sostanza in studio, ricevono tutto quello che ricevono gli altri
animali, anche le stesse pratiche ma non ricevono la sostanza in studio.
Per attribuzione dell’effetto della sostanza solo ad essa e non alle pratiche che sono state effettuate.
Stessa cosa in vitro: oltre alla piastra trattata è presente una piastra di controllo: che non riceve il
trattamento con la sostanza in studio.

Le osservazioni vengono effettuate ad intervalli regolari e tutti i segni di tossicità devono essere
documentati: cosa osservo, quando è comparso, quanto dura e come progredisce nel tempo.
Per quanto tempo osservo gli animali?
Tipicamente 2 settimane o qualcosa di più : tempo sufficientemente lungo, anche per danni che si
manifestano nei giorni successivi, e che possono anche evolvere.
Effetto che può anche migliorare nel tempo.
Se vedo segni di tossicità come progressiva perdita di peso o inibizione della crescita posso decidere di
continuare l’osservazione o meno.
Si deve documentare tutto soprattutto effetti comportamentali e sul SNC, bersagli di tossicità di tipo
acuto.
Deve essere documentata anche la modalità di decesso tramite una NECROPSIA: su tutti gli animali
deceduti durante il periodo di osservazione e alla fine dello studio. Ad ogni osservazione di variazione
macroscopica a livello di organi devono seguire esami istologici.

Osservazioni:
-effetti sul SNC: effetti simpaticomimetici e parasimpaticomimetici: piloerezione, miosi o nidriasi,
salivazione, secchezza, diarrea, sintomi collegabili al SNC.
Elenco dettagliato e lungo di sintomi comuni e osservazioni da fare in questo tipo di test.
Insufficienza respiratoria collegata a cambiamenti nella modalità di respirazione, cambiamenti nel
colore della cute dell’animale, cambiamenti legati all’attività motoria, convulsioni, riflessi (tipicamente
quelli corneali), segni oculari, analgesia (diminuzione risposta agli stimoli dolorosi)

Esempio: studio di tossicità acuta

Tabella (slide 13)
-le dosi selezionate vengono somministrate sia ai maschi che alle femmine.
-4 livelli di dose espressi in mg/kg, s
-anche dose 0, animali che vengono manipolati e mantenuti analogamente agli altri ma non gli viene
somministrato il farmaco.
-si va a contare il numero di animali che ha manifestato la tossicità dopo l’osservazione delle 2
settimane.
Via via che la dose aumenta, aumenta il numero di soggetti con tossicità e eventuale morte.

INFORMAZIONI OTTENIBILI:
In base ai risultati ottenuti si stabiliscono le dosi da utilizzare negli studi successivi
-livelli di dose da impiegare nelle prove di tossicità ripetuta (DL50). Capisco quali dosi testare negli
studi successivi: medio termine e lungo termine. In medio termine saranno frazioni della DL50.
-Indice terapeutico (DL50): dose che ha portato a morte il50% della popolazione degli animali in
studio. Nel caso in cui parliamo di farmaci essa è fondamentale, perchè definisce l’indice terapeutico:
quanto un farmaco è sicuro, dato dal rapporto tra DL50 e DE50 (dose efficace). Tanto più lontani sono
denominatore e numeratore più il farmaco sarà sicuro. Se dose efficace e letale sono vicine bisogna
stare attenti all’assunzione di quel dato farmaco.
-Effetti tossici specifici della sostanza in studio e meccanismo dell’azione tossica (esami macro- e
microscopici, quadro comportamentale)
Effetti della variazione della TEMPERATURA sulla DL50: (slide 15)
Esempio: sostanza come aspirina ha manifesto DL50 nel ratto, a dosi diverse a seconda della
temperatura.

11
Definizione delle dosi: (slide 16-17)
Sono presenti indicazioni ben precise sulla linea guida che dicono come orientarsi per definire le dosi
da testare, anche in base alle caratteristiche della sostanza e alle informazioni in possesso.
Tabelle in cui si parla di uno studio preliminare:
-prendo 1 animale a cui viene somministrata la concentrazione di 5mg/kg (altre in cui posso partire da
dosi più elevate a seconda delle informazioni della sostanza che io ho), e su esso osservo cosa succede,
a seconda dello scenario decido come proseguire:
Scenario A: muore, sostanza classificata nella categoria GHS 1.
Scenario B: evidente tossicità
Scenario C: animale sta bene
Se l’animale manifesta tossicità (B): nello studio principale parto da quella dose
Se l’animale non muore (C): si prende un altro animale e gli somministro una dose 10 volte più alta 50
mg/kg e di nuovo a seconda dello scenario si va avanti. Se l’animale muore si riparte dalla 5mg/kg poi
nello studio principale.
Le dosi stabilite sono: 5, 50, 300, 2000 mg/Kg.

Studio principale: il numero di animali a cui somministro la sostanza è diverso: 5 animali per sesso e
dose, per testare la tossicità acuta.
Inizio dalla dose stabilita dallo studio preliminare e testo i 5 animali.
Di conseguenza il diverso scenario A, B o C dipende da quanti animali hanno manifestato il particolare
scenario.
-Scenario A: su 5 animali quanti sono morti? Se il numero è maggiore o uguale a 2 morti la sostanza è
in categoria 1.
-Scenario B: numero di animali maggiore e uguale 1 manifesta segni di tossicità e/o meno di un
animale muore. Categoria 2 della sostanza.
-Scenario C: nessuna tossicità , allora testo con una dose 10 volte più alta.
Poi si va avanti come descritto sopra.
I 5 animali in ogni gruppo dello studio principale dovrebbero includere anche l’animale testato nel test
prima.
Lo studio principale serve per classificare le sostanze nelle categorie del GHS in base alle risposte alle
varie dosi testate. La classificazione GHS definisce il quadro di tossicità della sostanza.
Valori diversi: (slide 18 tabella)
-categoria 1: sostanze con DL50 < uguale a 5kg/kg.
Quello che rimane costante è una maggiore tossicità nella categoria 1 fino alla categoria 5 di minor
tossicità .
Tanto più alta è la DL50 tanto la tossicità sarà minore.

LIMIT TEST:
Se la sostanza non è tossica e devo definire la DL50?
Test che stabilisce delle dosi oltre alle quali comunque non si va, dose massima da testare per definire
la tossicità acuta, sono dosi limite in cui nei test non si va avanti anche se la sostanza non è tossica.
Dipendono dalla via di esposizione.
-5000 mg/kg per via orale
-5 mg/L per via inalatoria
-2000 mg/kg per via cutanea

Up-and down procedure:

Trattamento uno alla volta degli animali che vengono osservati per 24h. Viene effettuato il test di un
animale con una dose selezionata con lo schema di prima, si osserva l’effetto e in base ad esso si decide
cosa fare sull’animale successivo.
il primo riceve la dose ritenuta opportuna:
-se sopravvive la dose del successivo animale viene aumentata

12
-se muore la dose del successivo animale viene diminuita

SOMMINISTRAZIONE RIPETUTA:
Esperimenti condotti su animali da laboratorio e diretti ad ottenere informazioni sulla tossicità di una
sostanza quando è prevista un’esposizione ripetuta.
Possono durare più o meno nel tempo e questa diversa durata permetterà di avere diverse
informazioni. Essi sono: studi di tossicità a medio termine o a lungo termine.
La durata è determinata dall’uso proposto nell’uomo o dalla prevista durata di esposizione:
-se si assumono 1 o più dosi al giorno: lo studio dura 2 settimane
-se ripeto le dosi fino a 7 giorni: studio dura 4 settimane
-se le dosi sono previste tra i 7 e i 30 gg: 3 mesi
-dosi ripetute oltre 30 gg: 6 mesi.
In base alla durata prevista per l’uomo decido a quale linea guida a fare riferimento per capire la
durata dello studio.
Può esserci diversità a seconda della specie dell’animale usato anche in base alla durata totale della
vita; ci deve essere un periodo di tempo sufficiente per far sì che si verifichi la tossicità perché ad
esempio nella tossicità cronica si somministra una sostanza per un periodo superiore al 50% del
periodo di vita dell’animale. Generalmente si fanno 2 anni nel ratto e 18 mesi nel topo.
Ci possono essere differenze tra diverse linee guida internazionali:
si trovano concordi in alcuni segmenti di studio in altri gli USA si distinguono di più (grafico non
aggiornato però , slide 23).
A seconda della linea guida del paese ci potrebbero essere delle differenze e si sta cercando di
uniformarle per il libero commercio delle sostanze.

Disegno sperimentale: iter simile alla somministrazione singola

Differenze:
-occorre selezionare la specie su due specie di mammifero (roditore e non roditore); di solito coniglio
-numero di animali aumenta: 10 roditori e 4 non roditori. Più aumenta la durata dello studio più si
aumenta il tempo di somministrazione, più il numero di animali aumenta. L’animale può morire
durante il corso dello studio, più dura nel tempo più facilmente l’animale muore; devo arrivare al fine
dello studio con numero sufficiente di animali per avere un risultato robusto a livello statistico.
-Via di somministrazione prevista per l’uomo, se è quella orale, posso darla nel mangime agli animali,
non più gavaggio.
-durata: 3 mesi
-dose: livelli almeno 3 ricavati dagli studi di tossicità acuta. Definita la DL50 si può usare come punto
di partenza per decidere le dosi da testare negli studi successivi. (Esempio: frazioni della DL50)

OSSERVAZIONE:
Quotidianamente ad intervalli regolari devono essere osservate le manifestazioni fisiche e
comportamentali dell’animale: peso, consumo del mangime, anomalie motorie e comportamentali.
Devono essere effettuati esami di laboratorio su sangue e urine per andare a verificare i parametri di
riferimento.
Sia sugli animali deceduti che sugli animali effettuerò un sacrificio e l’esame necroptico sugli organi e
sui tessuti prelevati: fegato (organo di primo passaggio, manifestazione di tossicità ), reni
(eliminazione degli xenobiotici, anche loro possono avere un’attività metabolica; la tossicità a livello
renale è subdola perché essi sono compensatori, perciò , prima di avere manifestazione clinica devono
essere compromessi entrambi i reni) ed intestino (assorbimento delle sostanze).
Info anche sull’accumulo della sostanza.

Dosi e durata: RANGE-FINDING STUDY: per studi di 3 o 6 mesi, può essere condotto uno studio di
tossicità subacuta di 2-4 settimane per identificare le dosi da utilizzare negli studi.

Informazioni ottenibili dagli studi di tossicità a medio termine:

13
-grado di tossicità della sostanza: cosa succede dopo esposizione ripetuta per un tot di tempo
-organi bersaglio dell’azione tossica
-relazione dose-effetto: curva dose-risposta,
-massima dose tollerata: MDT, dose che corrisponde al minimo effetto tossico. Il minimo effetto tossico
classificabile che viene preso in considerazione è il calo ponderale del 10% del peso dell’animale.
(l’effetto tossico può essere dovuto sia dall’inappetenza dell’animale sia da un effetto diretto della
patologia/effetto dovuto alla sostanza). Nelle persone affette da tumore si verifica un forte calo di peso
anche continuando a mangiare più o meno normalmente.
MDT: punto di partenza per definire le dosi da testare negli studi successivi, essi sono molto simili a
quelli descritti in precedenza ma i tempi di procedura sono maggiori, comprenderanno un maggior
numero di animali e vengono testate dosi più base (cala allungano il tempo di esposizione).

STUDI DI TOSSICITA’ A LUNGO TERMINE

Disegno sperimentale
-specie animale: due specie di mammifero, roditore e non roditore.
-numero di animali: 20 per gruppo, maschi e femmine. Coprono più del 50% della vita dell’animale. Le
linee guida dicono che se non osservo differenze nella risposta tra i due sessi nella specie decido di
procedere solo con un sesso, spesso rivolta al sesso femminile perché più sensibile.
-via di somministrazione: prevista per uso terapeutico ed orale
-livelli di dose: MDT, ½ MDT, ¼ MDT
-durata del trattamento: 6-18 mesi. La durata è diversa a seconda del trattamento e della specie che
sto testando.
OSSERVAZIONI, RILIEVI ED ESAMI: stesse rilevazioni ed osservazioni degli studi a medio termine.
INFORMAZIONI OTTENIBILI:
-definizioni dell’effetto tossico
-NOEL: dose a cui non si osserva alcun effetto tossico. Parametro importante, nel caso si testino
sostanze a cui potrei essere cronicamente esposto (Es: ingestione quotidiana di un farmaco).
ADI (dose che possono ingerire ogni giorno senza manifestare effetto).
ADI = NOEL/FS
FS, Safety Factor: abbattimento dell’ADI utilizzando il fattore di rischio; esso è tanto più alto tanto più
tengo conto delle info che ho e della traslazione del valore ottenuto sull’animale ad un'altra specie
(passaggio animale uomo) e tiene conto delle differenze tra le specie. Nella popolazione ci possono
essere fasce più sensibili e possono rispondere differentemente alla sostanza.
FS= fattore 10, che può aumentare a seconda delle informazioni ricavate. Se la NOEL è stata ricavata da
uno studio che non ha valutato l’effetto per tutta la durata dell’esposizione a lungo termine ed è stata
ricavata solo con osservazioni a breve termine si deve tenere conto per l’abbattimento.

Interferenza immunologica (tossicità per somministrazione: alla fine dello studio si prevede l’esame
degli organi linfatici per tenere conto dell’interferenza immunologica. Esame macroscopico e
microscopico della milza, del timo e dei nodi linfatici al termine dello studio.
Gli effetti osservati a livello immunologico nella specie animale possono avere scarsa rilevanza per la
sicurezza del prodotto nell’uomo. Alcuni prodotti, es. le citochine, hanno profondi effetti sul sistema
immunologico e questi sono parte essenziale dell’azione terapeutica. Non esiste una batteria di test
prestabilita.

Esiste un elenco di tessuti per analisi istopatologica per vedere gli effetti a carico di organi e tessuti
specifici tenendo conto anche dell’accumulo, che può provocare conseguenze nel tempo.
(slides 31-32)

14
COSMETICI:
C’è importanza ed urgenza di trovare metodi alternativi alla sperimentazione animale. A partire dal
2004 si è cominciato a discutere, fino al divieto dal 2009 in tutta l’UE sulla sperimentazione dei
cosmetici sulla specie animale. Tranne per gli studi di tossicocinetica, tossicità riproduttiva, tossicità a
dosi ripetute, nei quali un’alternativa è difficile da ipotizzare. È stato introdotto il divieto di vendita di
cosmetici testati su animali (in qualunque paese siano stati prodotti) per la maggior parte dei test dal
2009. Un altro divieto inoltre è quello di vendita di cosmetici testati su animali comprese le 3 aree
rimaste escluse dal punto precedente entro il 2013, ma con possibilità di slittamento se non sono stati
sviluppati test alternativi adeguati. Ci sono state discussioni e contrattazioni sull’argomento, in linea
generale ha acceso una grande polemica perché viene limitato il commercio però , ha stimolato la
ricerca per produrre metodi alternativi e sopperire al divieto.
Proprio per questa legge molte aziende hanno immesso dei test alternativi validati che vengono
utilizzati dalle industrie farmaceutiche (Loreal: modello episkin)
Sistemi alternativi all’uso di animali: principio delle 3 R
E’ stata proposta per sottolineare come si potesse ridurre, sostituire e affinare la sperimentazione
animale.
-replace: sostituire l’uso di animali
-reduce: ridurre il numero di animali
-refine: affinare la metodologia di sperimentazione
I metodi alternatavi sono presenti in gran numero con tantissime sottocategorie, la prima cosa che si
pensa quando si parla della sperimentazione alternativa è quella in vitro con colture cellulari.
L’utilizzo di metodi alternativi o della sperimentazione hanno vantaggi e svantaggi.

VANTAGGI:
-riduzione numero animali, limitate anche tantissimo le procedure eseguite sugli animali.
Esempio: test genotossicità, attualmente sono stati sviluppati metodi in vitro per testare la
genotossicità e la mutagenicità . La normativa prevede di dare la priorità ai test in vitro per la
genotossicità e ricorrere alla sperimentazione animale solo in alcuni casi. Se si ottengono risultati
positivi in vitro il tutto si ferma, ottenendo un dato già abbastanza forte per permettere di evitare di
passare al vivo; se si hanno risultati dubbi o negativi, potrebbe essere richiesto di testare la sostanza in
vivo tenendo conto dei risultati in vitro. In mutagenesi e tollerabilità locale, molti test sono stati
validati.
-riduzione sofferenza dell’animale
15
-riduzione del tempo necessario per ottenere risultati. La sperimentazione animale può durare 3-4
settimane minimo, il tempo può aumentare aumentando le somministrazioni e la durata
dell’esposizione. Nel momento in cui testiamo se la sostanza è citotossica di solito si fa in un tempo
standard di 24h; tempi molto più brevi. La mutagenesi, molto più veloce in vitro che in vivo.
-possibilità di replicare l’esperimento, per la riduzione degli animali e dei tempi non è scontato che
siano previste più repliche dell’esperimento, significa che il dato ottenuto è meno forte, perché
l’esperimento non si replica. In vitro invece si può replicare l’esperimento se il dato ottenuto non è
convincete o per ricavare un dato più forte, si può replicare diverse volte più facilmente.
-riduzione del costo della ricerca. Il mantenimento degli animali ha dei costi molto elevati rispetto
all’utilizzo di cellule, i quantitativi di reagenti utilizzati in vitro sono minori e anche i costi per
mantenere gli animali gravidi aumenta ancora di più . Il test di genotossicità in vivo parte da 40-50 mila
euro.
-maggiore flessibilità nel protocollo sperimentale
-riduzione dell’errore dovuto a variabilità interindividuale. Ogni animale è affetto da variabilità
interindividuale che può influenzare i risultati dello studio.
Popolazione cellulare: estremamente omogenea, cellule in replicazione che derivano dalla stessa
cellula madre.

-studio di meccanismi a livello cellulare e molecolare

SVANTAGGI:
serie di informazioni e importanti valutazioni di risposta alla sostanza che non posso studiare in vitro.
-ridotta possibilità di studio nell’organismo dei processi di crescita e sviluppo
-ridotta possibilità di distinguere effetti legati al sesso. Possono essere effettuati studi di genere per
valutare la risposta alla sostanza a seconda del sesso, dell’influenza ormonale, delle vie metaboliche,
diversa risposta nelle diverse fasi della vita soprattutto del genere femminile.
Inoltre sono presenti anche diversi organi: prostata, seno, ovaie ecc.. la riproduzione in vitro non è
semplice.
-ridotta capacità di valutare azioni coordinate a livello cellulare, tissutale e di organo.
-ridotta capacità di studio di vie metaboliche e biochimiche integrate. Discorso fegato-rene che
influenzano la tossicità della sostanza.
-ridotta possibilità di studiare il comportamento
-ridotta possibilità di studiare il recupero dell’animale e la reversibilità di un danno tissutale
-ridotta possibilità di studiare le interazioni tra organismo e ambiente
-ridotta capacità di studiare fenomeni idiosincrasici e specie-specifici. E’ fondamentale utilizzare sia
coniglio che ratto per abbattere la specie-specificità per capire se la sostanza è tossica in varie specie, a
che dosi e qual è il meccanismo.

Alternative all’uso di animali:

-riduzione del numero di animali
-uso di sistemi viventi: microrganismi, invertebrati, colture in vitro do organi, tessuti, cellule
-uso di sistemi non viventi: sistemi chimici o fisici che mimano funzioni biologiche, data-base
-programmi computerizzati: software studiati per ottenere informazioni senza utilizzo di forme
viventi ma solo computer che stimano il rischio rispetto a quell’endpoint specifico.
Se si è a conoscenza di determinati target si può prevedere se una nuova molecola può effettivamente
essere ipotizzabile come danno tossicologico di stesso tipo.

Uso di sistemi viventi: permettono di identificare il sito bersaglio a livello molecolare e di capire il
meccanismo d’azione di uno xenobiotico.
T=(C)(R)ARC
T= effetto tossico
C= concentrazione del composto
R= numero di “recettori” endogeni
16
ARC= affinità verso il “recettore”
L’effetto tossico è conseguenza della concentrazione che arriva al bersaglio, dei metaboliti, del numero
di recettori endogeni (quanto la sostanza è in grado di interagire e di essere recepita dalla coltura) e
dall’affinità verso il target. Il mix dell’effetto tossico è dato da tutte queste variabili.

IN VITRO:
Sono sistemi di saggio validati (hanno ricevuto una validazione, ECVAM, centro per la validazione dei
metodi alternativi, che esamina i metodi e li riconosce per ottenere il risultato tossicologico) per avere
dati più forti. Vengono utilizzati:
-batteri
-lieviti (eucarioti inferiori)
-colture primarie di cellule animali e linee cellulari: le cellule vengono isolate dal loro ambiente e
vengono messe in condizioni di vivere all’interno di un sistema definito. Sono uno strumento
fondamentale per studi biochimici, tossicologici, farmacologici… inoltre sono utili nella produzione di
fattori di crescita, anticorpi monoclonali, vaccini…

COLTURA PRIMARIA:
Le cellule derivano direttamente dal tessuto d’origine, mantenendo molte caratteristiche funzionali
riscontrabili in vivo. Durante la crescita avviene una selezione in base al grado di proliferazione:
aumentano cellule attivamente proliferanti, restano stazionarie quelle in grado di sopravvivere ma
non di duplicarsi, mentre altri tipi di cellule sono incapaci di resistere. Questo comporta un’evoluzione
nel tempo delle proporzioni dei diversi tipi cellulari, fino ad un equilibrio notevolmente diverso dalla
situazione di partenza. Quando la proliferazione ha depauperato il mezzo di coltura, occorre
provvedere ad una sub-coltura in un nuovo recipiente con terreno fresco.
Esempio: tessuto tipico è il sangue, si isolano linfociti dal sangue periferico di un soggetto, quando si
attua l’isolamento dei linfociti, posso portarmi dietro degli eritrociti. Nel mezzo di coltura specifico dei
linfociti essi sopravvivono, invece gli eritrociti, qualcuno sopravvive qualcuno muore ma non sono in
grado di replicarsi.
Nel tempo ottengo una coltura omogenea, rispetto alla situazione di partenza. Quando ho selezionato
la popolazione di interesse, ho una popolazione diversa da quella originale ma ugualmente molto utile
per l’estrema omogeneità. Se gli eritrociti continuano ad essere presenti si applica l’eritrolisi,
eliminazione totale degli eritrociti.
Nel terreno di coltura è chiaramente presente il nutrimento per le cellule, esso viene consumato
quando le cellule proliferano perciò deve essere allestita una subcoltura, prelevando alcune cellule e
mettendole in terreno fresco.

Meccanica:
-si prelevano delle cellule da un campione (organo, tessuto, embrione o uova)
-dissezione meccanica con bisturi: si spezzata il più possibile il tessuto per arrivare alle singole
cellule
-a questa segue la DIGESTIONE ENZIMATICA, trattamento con tripsina, enzima tipico in grado di
digerire le giunzioni tra una cellula e l’altra. L’azione della tripsina deve essere bloccata perché la
digestione può portare a morte le cellule, per evitare danneggiamento dei componenti cellulari. La
tripsina si utilizza per staccare anche le cellule adese dal contenitore per le cellule che crescono in
adesione. Le cellule possono crescere in sospensione (cellule del sangue) e in adesione (cellule, dei
tessuti, reni polmoni, ecc…). Se voglio prelevare un po’ di cellule da un contenitore, per fare una
subcoltura, si deve staccare le cellule dal contenitore tramite tripsina.
-blocco della digestione: viene aggiunto un inibitore, cioè del terreno fresco che è sufficiente a bloccare
l’azione della tripsina, dopo si centrifuga il mix, si tiene il pellet e si mettono in coltura le cellule con
nuovo terreno fresco.
-controllo della vitalità cellulare: durante la semina decido quante cellule voglio seminare, bisogna
controllare che le cellule siano effettivamente vive. Esempio test trypan blu, test che si basa su un

17
concetto semplice, esso è un colorante che normalmente non entra nelle cellule, se entra nelle cellule
le cellule sono morte perché la membrana cellulare non è integra.
-semina: poi si mette del terreno per avviare una coltura primaria.

Colture e linee cellulari:

Quando si parte da un tessuto ottengo la coltura d’organo o tessuto, essa ha breve vita; viene
mantenuta intatta l’organizzazione sovracellulare.
La coltura cellulare si ottiene partendo da un tessuto normale (o tumorale) e si disperdono le cellule
con mezzi meccanici o biologici (collagenasi, tripsina).
La coltura primaria deriva da una coltura cellulare che è simile a quella presente nel tessuto,
metabolicamente competente, e ha breve vita.
Se avviene una trasformazione spontanea o a meno che vengano rese le cellule immortali o stabilizzate
con mezzi chimici e biologici, in grado di sopravvivere per più tempo si ottiene la linea cellulare, con
vita pressoché infinita. Questa trasformazione avviene spontaneamente nei tessuti tumorali, le cellule
non rispondono più ai meccanismi di sopravvivenza ma prolifera più velocemente e non risponde più
a segnali di morte.
Linea tumorale: la trasformazione è spontanea, comoda per tessuti a bassa attività mitotica.

Evoluzione di una coltura cellulare: (grafico slide 76)

Tra la “semina” e la ripresa della crescita c ’è un intervallo (“lag”). Nel grafico, l’evoluzione del
logaritmo del numero di cellule nel tempo. La coltura primaria è caratterizzata da un tempo di
duplicazione lento, che aumenta notevolmente nei successivi passaggi in coltura, quando si parla di
linea cellulare primaria. Nella terza fase si nota la senescenza, con tempi di duplicazione
progressivamente più lunghi (sino alla morte), a meno che (porzione arancione) non intervenga una
trasformazione, che produce una linea cellulare immortalizzata in grado di replicarsi all’infinito.
La semina delle cellule avviene al giorno zero, quando vengono messe in coltura. Esse caleranno, con il
passare del tempo, perché la coltura si sta selezionando ed adattando finché quelle in grado di
sopravvivere proliferano e si ha una esponenziale crescita di numero. Il numero di cellule aumenta
molto velocemente. In questa fase si procede con la subcoltura.
La subcoltura si fa ogni paio di giorni, 2/3 volte alla settimana, il lasso di tempo necessario varierà in
base al tempo che ci mettono le cellule a replicare, dipende dal tipo di cellule.
Fino al raggiungimento di uno stato stazionario in cui il numero di cellule che nascono e muoiono si
ripareggiano, momento in cui so che la coltura comincerà a morire, finchè il numero di cellule arriva
zero. Parte arancione: a meno che ci sia modificazione spontanea o indotta fino alla trasformazione di
una linea cellulare, con cellule che sono immortali.

La trasformazione succede tipicamente nelle cellule tumorali, LINEE CELLULARI

-a vita finita: resistono in coltura un numero limitato di cicli, entrano in fase di senescenza dopo un
certo numero di passaggi (circa 50)
-continue: originano da colture primarie o da linee cellulari a vita finita sia spontaneamente che per
trasformazione
-clonali: derivano per mitosi da una singola cellula e consentono di ottenere popolazioni il più
possibile omogenee. Cloni di cellule molto omogenei a partire da cellula madre.
1951: ci sono stati scienziati che hanno capito che prelevando cellule da un tessuto tumorale e
mettendole in coltura potevano ottenere delle linee cellulari. Cellule HeLa, (nome della paziente, che è
morta di tumore, le sue cellule hanno dato origine alla storia dell’utilizzo delle linee cellulari
stabilizzate).

Trasformazione di una line cellulare

Utilizzo delle linee cellulari a vita finita: possono essere congelate e scongelate facilmente e andare
avanti all’infinito, possono essere utilizzate in tutti i laboratori le stesse identiche cellule.

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Il processo di trasformazione rende immortale una linea cellulare. Ha inizio con l’acquisizione da parte
della linea cellulare della capacità di proliferare indefinitamente (immortalizzazione); richiede un
certo numero di mutazioni
Questa trasformazione può essere indotta, tramite mezzi chimici, fisici o biologici. Operando con un
trattamento con una sostanza mutagena o radiazioni, per formare cellule immortale.
La mutazione è il passaggio chiave di tutto; se la mutazione è trasmissibile e colpisce oncogeni e
oncosoppressori, a quel punto la cellula è anche iniziata al processo cancerogenetico.
Si vedono i foci di trasformazione: cellule che non risentono più dell’inibizione da contatto (masserelle
di cellule simili a quelle tumorali).

CAMPI DI APPLICAZIONE COLTURE CELLULARI:

-messa a punto di saggi per lo screening di sostanze tossiche: test citotossicità, mutagenesi. Quando ho
tante sostanze da screenare, per particolari effetti tossici, posso servirm,i di colture cellulari per
ottenere informazioni su moltissime sostanze.
Hela
Fibroblasti umani
Origine dal topo e dal criceto, cellule del pipistrello
Cellule jurcat che derivano da una leucemia linfoblastica acuta: caratteristiche tumorali.
Adenovirus, inducendo dall’esterno tramite trattamento con adenovirus la mutazione che rende la
cellula stabilizzata: ci sono le banche cellulari (delle aziende) che producono e vendono cellule di
qualsiasi tipo.
Se sono immortalizzate e non di derivazione tumorale si specifica come sono state stabilizzate.
Cellule TK6, tipo linfocitario, derivato da sferocitosi e sono stabilizzate
-studio di meccanismi di tossicità : colture primarie. Se voglio vedere l’effetto che fa la sostanza, deve
essere il più rappresentativo possibile nell’organismo è importante che le cellule abbiano
caratteristiche più simili all’organismo intero. Se utilizzo cellule tumorali o mutate possono non
rispondere più in maniera analoga a quella che farebbero le cellule sane.
-studio di metabolismo e biotrasformazione degli xenobiotici: epatociti, cellule deputate al
metabolismo. Però ci sono eccezioni, che i meccanismi di tossicità , possono anche essere studiati su
linee cellulari con le dovute precisazioni. Si può mettere in atto l’attivazione metabolica estrinseca per
far sì che le cellule diventino metabolicamente attive, per mimare gli effetti del metabolismo
-mutagenesi: indicati tutti i tipi di cellule che posso utilizzare, validati e riconosciuti tra quelle di
origine umana, topo, criceto, cellule tumorali, cellule sane e linfociti.

Vantaggi nell’uso di colture cellulari:

-Controllo dell’ambiente chimico-fisico (pH, T, O2, CO2)
-Controllo dell’ambiente fisiologico (ormoni, sostanze nutritive, flusso)
-Caratterizzazione e omogeneità del campione (genotipo e fenotipo)
-Riduzione del numero di sperimentazioni in vivo
-Velocità , riproducibilità , maggiore sensibilità

ESEMPI.
Cellule diverse di morfologia e funzione, cambia l’aspetto tra cellule giovani o anziane.
HaCaT: cheratinociti umani che crescono in colture in adesione, le cellule riproducono il tessuto di
origine. Sono presenti zone fitte dove si vedono le cellule che riproducono il tessuto e zone non
coperte perché non hanno completato il percorso.
THP-1: monociti umani in sospensione, cellule che si vedono a fuoco altre non si vedono perché su
piani diversi, grappoli e aggregati.
SH-SY5Y: cellule di derivazione tumorale neuronale, possono essere più o meno differenziate, le
cellule hanno un diverso grado di specializzazione e lo si può ottenere
1-di meno con tanti spazi vuoti, in fase di crescita logaritmica
2-più fitte, a subclonfluenza.

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Su cellule in adesione si parla di confluenza, quanto le cellule hanno ricoperto lo spazio a disposizione
del recipiente.
Quando hanno raggiunto la confluenza, si procede alla subcoltura, oltre alla necessità di terreno fresco
si deve tenere conto che le cellule possono esaurire lo spazio a disposizione.
Altre cellule:
-Fibrobalsti 3T3
-Neuroni
-HTB-37
-HUVECs: cellule endoteliali, ombelicali umani. Si utilizzano negli studi dell’angiogenesi, quando si
valuta la crescita di nuovi vasi.
-Cardiomiociti: messe in coltura anche in piastra petri sono in grado di contrarsi, tipico movimento nel
muscolo cardiaco.
-Jurkat: anche le cellule in sospensione possono essere fitte, non si parla di confluenza, ma si parla di
densità che non deve essere superata, numero di cellule in un dato volume di liquido (1 milione di
cellule su ml). Quando sono al massimo 900 mila su ml deve essere splittata. La densità max è 1
milione su ml.

MEZZO EXTRACELLULARE
Sistema in cui le cellule sono messe in condizioni di vivere al di fuori dell’organismo.
Cellule mammifero: 37°C e 5% CO2
Le isolo le metto in un contenitore e la fiasca viene messa ad incubare a 37°C.
Incubatore: molti hanno una camicia di liquido che permette il mantenimento della T all’interno.
L’ingresso dei gas è garantito attraverso i tubi e l’aria che entra viene filtrata da un filtro HEPA.
L’ambiente deve essere il più controllato possibile dal punto di vista delle contaminazioni batteriche, è
presente una lampada UV, per permettere sterilizzazione dell’ambiente.
-ambiente saturo di umidità : è presente una vaschetta di acqua posta sul fundo dell’incubatore con un
sensore che controlla il livello dell’acqua. L’umidità permette maggior controllo della T.
Prima ci si accerta che l’ambiente sia saturo di umidità poi si setta la T a 37°C. Bisogna accertarsi che la
T sia mantenuta per almeno un paio di ore prima di mettere le cellule in incubatore.
-L’ossigeno è quello atmosferico, è presente un sensore dell’ossigeno, ma le cellule crescono bene
anche con percentuali di ossigeno atmosferico, non si setta quasi mai il valore.
-pH: fondamentale che venga rispettato e che rimanga 7,3. Si deve tenere il pH controllato, tramite un
sistema ottimizzato tra i gas presenti nell’ambiente la CO2 è il sistema tampone che è presente nel
mezzo di coltura.
Il liquido in cui metto le cellule dentro la fiasca, contiene anche il sistema tampone (bicarbonato/acido
carbonico) che se lo ho in soluzione una certa percentuale evapora e la CO2 presente nell’ambiente,
tiene tamponato il mezzo, si tiene bilanciata tra la CO2 che evapora nel mezzo mantenendo bilanciato
il pH del terreno in cui ho messo le cellule. È presente un indicatore di pH che è il rosso fenolo,
reagente che dà la colorazione aranciata al terreno ma è quella sostanza che cambia di colore a
seconda del pH del terreno:
-pH acido: giallo
-pH: basico, fuxia/rosso violaceo
-pH 7: arancio
È fondamentale tenere d’occhio che il pH sia quello corretto. Ad un certo punto il terreno può virare un
pò di colore verso uno o l’altro colore perché ci sono delle condizioni che fanno sì che il terreno si
acidifichi, mammano che le cellule hanno proliferato e hanno esaurito i nutrienti nel terreno (buon
segnale).
Mammano che il giallo diventa più intenso, è necessario procedere alla subcoltura.
Verso il basico: brutto segno, se il terreno rimane aperto per troppo tempo, entrando in contatto con i
gas dell’atmosfera, anche in fiasche lasciate in incubatore in cui le cellule sono morte, hanno riversato
nel mezzo i prodotti della necrosi.

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TERRENI DI COLTURA:
Sono diversi a seconda del tipo di cellule, ogni linea che si compra ha un suo foglietto che indica le
informazioni fondamentali e anche il tipo di terreno in cui devono essere coltivate.
Composizione generale di terreni incompleti (terreno che si compra dall’azienda):
-Sali inorganici (NA+, K+, Mg++, Ca++,…)
-vitamine
-amminoacidi
-glucosio e glutammina
-antibiotici (per evitare le contaminazioni batteriche, quando si lavora con le cellule bisogna stare
attenti alla contaminazione). Li si aggiungono per cercare di allontanare il rischio di contaminazione
batterica (penicillina + streptomicina).
Il terreno risulta ancora incompleto finché non si aggiunge siero fetale bovino, aggiunta fondamentale
per fornire alle cellule serie di caratteristiche e sostanze fondamentali per crescere.
Il siero introduce i fattori di crescita che si possono aggiungere anche singolarmente, ma in generale i
fattori di crescita si trovano direttamente nel siero fetale per la buona sopravvivenza delle cellule.
Sono presenti anche sostanze che inibiscono l’attività della TRIPSINA.

L’uso del siero è controverso: in generale si preferisce quello fetale perché contiene meno anticorpi.
SVANTAGGI:
Dal punto di vista etico esso si ottiene dalle mucche gravide, quindi, è una procedura un po’ invasiva.
Ci sono studi in corso in cui si parla dell’utilizzo del latte. In commercio sono presenti delle alternative
che sono mix dei fattori di crescita, ma non sono così performanti come il siero.
Il siero contiene anticorpi: le cellule potrebbero reagire agli anticorpi, vedendolo come estranee e
vengono indotte a morte. Quello fetale contiene meno anticorpi.
Variabilità da lotto a lotto: diversità interindividuale a seconda dell’animale. Da un lotto ad un altro c’è
variabilità.
Ci sono fattori di crescita che favoriscono alcuni tipi cellulari rispetto ad altri: ad esempio possono
favorire la crescita di fibroblasti, rispetto ad altri tipi di cellule.
VANTAGGI:
Protegge le membrane grazie al corretto grado di viscosità , introduce fattori di crescita ed ormoni,
veicola lipidi, ferro e molecole organiche, contiene inibitori della tripsina.

Il siero arriva congelato a -20°C si scongela a temperatura di frigo, quando è completamente

scongelato va SCOMPLEMENTATO, abbattere le proteine del complemento, riducendo la risposta
anticorpale a 57°C per 20 o 30 min, nel bagnetto termostatato (vasca di metallo in cui metto acqua che
si scalda), riscaldamento lento ed omogeneo.

CONSERVAZIONE/CONGELAMENTO
Quando le cellule non sono in coltura possono essere conservate:
-80°C ordine di mesi
-180°C ordine di anni.
Con le linee cellulari si fa agevolmente con le cellule jurkat.
Di fatto è chiaro che a -80°C, si possono tenere anche per anni, in azoto liquido si conservano meglio e
a lungo (-180°C), qualche appendorf di sicurezza viene mantenuta di N.
Meccanismo di congelamento/scongelamento, fattori che possono danneggiare le cellule:
-velocità può danneggiare le cellule, si deve congelare lentamente e scongelare velocemente (opposto
degli alimenti). La velocità di congelamento: 1°C al minuto, la sospensione cellulare si mette prima in
un barattolo con isopropanolo, con doppio fondo; contenitore di tanti buchi in cui incastro l’eppendorf.
Isopropanolo permette che la temperatura scenda gradatamente. Poi si mette il barattolo a -80°C, se si
vuole mettere a -180° si devono mantenere per un po di giorni a -80°C.
Devono essere congelate il numero di cellule in un opportuno volume. Si congelano in un terreno
opportuno di congelamento, con crioconservanti che sono (dimetilsolfossido e glicerolo). Alcune

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cellule non gradiscono metilsolfossido e alcune il glicerolo. Riducono la T di solidifcazione, così si fa sì
che non si creino cristalli di ghiaccio che potrebbero ledere le membrane delle cellule.
-Velocità di disidratazione e aumento salinità (congelamento troppo lento), potrebbe far ritrovare
cellule già morte o che muoiono da lì a poco.
Scongelamento: veloce, si tira fuori l’eppendorf e si mette nel bagnetto termostatato a 37C, o tenendola
ben stretta in mano.

Laboratorio:
-incubatore anche a più piani, con secondo sportello di vetro, bombola di CO2, display per controllare
le T.
-cappa: cappe a flusso laminare verticale, ideali per proteggere sia il contenuto della cappa sia chi
lavora sotto cappa.
-centrifuga: per cambiare terreno

CONTAMINAZIONE DELLE COLTURE:

L’ingresso indesiderato nel terreno di coltura di microrganismi è dannoso: questi competono con le
cellule in coltura (che generalmente hanno ritmo di crescita inferiore) e possono secernere sostanze
tossiche. Tipici contaminanti sono batteri, micoplasmi, lieviti, muffe. In caso di infezione batterica il
terreno vira in fretta (acidifica) e intorbidisce. Le infezioni da micoplasmi sono più subdole, in quanto
il microrganismo è meno visibile e richiede un paio di settimane per formare colonie visibili. Questo
pericolo determina la prassi di aggiungere antibiotici al terreno (ad esempio: streptomicina e
penicillina)
Se c’è contaminazione si potrebbero notare viraggi del pH troppo veloce, odori strani, al microscopio
pallini neri più piccoli. Lieviti sono ancorati alla plastica del recipiente.
Microplasmi si controllano con colorante specifico. Liquido torbido e giallino.

Plastica da laboratorio:
-piastre petri di vare dimensioni, per adesione o sospensione.
-fiasca: o da 10 ml fino a volumi maggiori. Dette anche T25 ecc... (T per la forma). Ha un tappo, che può
essere normale a vite, il tappo ventilato ha tanti buchi sulla superficie chiusi da una membrana che
permette il passaggio dei gas all’interno ma non permette l’ingresso di microrganismi. Con tappi non
ventilati i gas non entrano, devono essere tenuti un po' svitati per permettere l’ingresso dei gas.
-piastre multi-pozzetto: piastre con attaccati più piattini/pozzetti. A seconda della densità cellulare e
del numero di cellule, si sceglie il pozzetto.

STERILITA’:
Al fine di mantenere la sterilità, il laboratorio di colture cellulari deve essere esclusivo e occorre
lavorare sotto cappe a flusso laminare. La sterilizzazione dei materiali può avvenire:
-stufa a secco per sterilizzare la vetreria 150°C per 3 ore
-autoclave: 1 atm, 121°C sterilizzazione anche di acqua e soluzioni, acqua che uso come solvente, per
solubilizzare sostanze in polvere che devono andare a contatto con le cellule, anche per soluzioni
saline
-filtrazione con filtri da 0,22 micrometri, solubilizzazione in acqua se non si ha acqua sterile. Per casi di
emergenza. Filtri di varia natura: a seconda del solvente utilizzato è meglio o l’uno o l’altro.
-raggi gamma per la plastica, alcune cellule crescono su tipi di plastica diversi.

CAPPE: 3 categorie

1-è una cappa ventilata aperta frontalmente progettata per la protezione dell’operatore tramite un
flusso d’aria entrante che non viene rimandata in circolo. Può essere usate con agenti biologici che
presentino un rischio basso o moderato; protegge l’operatore da contaminanti presenti nella cappa,
ma non protegge dalla contaminazione i materiali situati all’interno della cappa stessa (la sterilità non
è garantita!)
22
2- è una cappa ventilata aperta frontalmente progettata per la protezione dell’operatore, dei prodotti
al suo interno e dell’ambiente circostante. E’ caratterizzata da un flusso d’aria in ingresso e con
filtrazione sia dell’aria aspirata sia di quella espulsa: il flusso laminare, proveniente dal sovrastante
filtro HEPA, scende perpendicolarmente al piano di lavoro evitando di investire l’operatore, l’aria
espulsa deve essere filtrata da un secondo filtro HEPA e, se ricircolata nello stesso locale, da un filtro
supplementare a carbone attivo posto a valle del filtro HEPA, per trattenere eventuali frazioni gassose.
FILTRAZIONE A FLUSSO LAMINARE
-Il flusso laminare è ottenuto dalla combinazione di un filtro assoluto (HEPA) con una massa d'aria che
lo attraversa alla velocità costante di 0,45 m/sec. (+/- 20%).
-Il flusso laminare è un flusso d'aria unidirezionale formato da masse d'aria sterili parallele che si
muovono alla medesima velocità in tutti i punti, così da creare una corrente d'aria omogenea senza
turbolenze.
-In un ambiente sterile così ottenuto ogni contaminante libero nella zona di lavoro viene trascinato via
da un fronte di aria sterile.
FLUSSO LAMINARE VERTICALE: Assicurano un ambiente microbiologicamente puro nella cappa e
protezione nei confronti dell’operatore:
-Tipo A: ricircolo del 70% dell’aria dopo passaggio attraverso filtri HEPA ed immissione nell’ambiente
previo passaggio attraverso HEPA, del 30% dell’aria
-Tipo B: ricircolo del 30% dell’aria ed emissione del 70%. L’emissione dovrebbe essere diretta fuori
dal laboratorio e con filtri a carbone attivato.

3- è una cappa ventilata totalmente chiusa che è a tenuta d’aria ed è mantenuta a pressione negativa.
L’aria in ingresso passa per un filtro HEPA e quella in uscita passa per due filtri HEPA posti in serie. Il
lavoro viene svolto con guanti a manica in gomma attaccati alla cappa. Sono usate per lavorare con
agenti biologici ad alto rischio e forniscono una barriera totale tra l’operatore e il lavoro.

Parametri di tossicità: in vitro

-morfologia della cellula: le cellule possono avere delle forme diverse, alcune che già a colpo d’occhio
si vede che sono rotondeggianti ed uniformi e non colorate, altre in cui si vedono dei puntini neri che
sono indicatore di stress cellulare (se sono rimaste per troppo poco tempo fuori dall’incubatore),
cellule che sono estroflesse fino a quelle che sono completamente di verse da quelle vive; forma più
frastagliata, cellule apoptotiche (modificazioni tipiche, restringimento e avvizzimento). Giunzioni, le
dimensioni del nucleo, vacuolizzazione, citoplasma e citoscheletro (ci sono saggi a posta per vedere
modifiche dei parametri morfologici della cellula).
-vitalità: test che sfruttano concetti diversi per vedere se la cellula è viva o morta.
Esclusione/inclusione, esclusine del colorante. Le cellule non sono permeabili ad alcuni coloranti e di
conseguenza se sono colorate vuol dire che sono morte.
Analogamente ci sono altri coloranti che permettono di visualizzare cellule vive o morte in
fluorescenza (ioduro di propidio, analogo al tripan blu ed eosina; cellule morte appariranno ad alta
fluorescenza rossa)
Un colorante che permette di vedere un diverso comportamento c’è inclusione: test del rosso neutro
(MRU), tipico test in cui le cellule accumulano colorante tanto più sono vive.
Distacco: le cellule che tipicamente crescono in adesione sulla piastra petri, se galleggiano sul liquido
vuol dire che sono morte, sono saltati gli ancoraggi con il substrato.
Conta cellulare: se il numero di cellule che mi aspetto di trovare è minore vuol dire che c’è poca
vitalità, o in parte hanno replicato e in parte sono morte, oppure non hanno replicato.
Posso monitorare le cellule per vedere il ciclo cellulare se sono entrate nelle fasi di replicazione o
meno, distribuzione delle cellule nelle varie fasi cellulari per vedere anche effetto della sostanza.

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-Integrità di membrana: rilascio di sostanze ed enzimi nel medium che posso monitorare. Può anche
non essere il parametro corretto per le informazioni che voglio ottenere, se voglio monitorare
l’apoptosi guardando l’integrità non si può fare perché è integra come le cellule vive.
-quantitativo energetico, contenuto cellulare di ATP
-competenza metabolica, deplezione di cofattori, inibizione della cooperazione metabolica
-sintesi di macromolecole
-proliferazione: di pari passo con la crescita e contenuto di DNA totale è quello che viene monitorato
per vedere la distribuzione delle cellule tra le varie fasi del ciclo cellulare. Conta cellulare, crescita
cellulare, contenuto proteico, DNA e RNA totale.

TEST DI CITOTOSSICITA’:
Primi test che si fanno per avere informazioni preliminari e permettono lo screening di tante sostanze,
si possono studiare varie sostanze anche contemporaneamente.
Se non si sa nulla della molecola in termini di tossicità, per sapere se la sostanza è mutagena: quanta
ne metto nel piattino? Quanta ne studio?
Si comincia dai test di citotossicità : prima analisi testando dei valori di concentrazione, andando a
vedere se la sostanza è citotossica.
È il miglior punto di partenza per orientarsi nelle successive indagini in vitro e in vivo.
CARATTERISTICHE:
-facili, economici e veloci
-sono sensibili ma non specifici
-riproducibili: lo stesso test lo posso fare sulle stesse cellule alle stesse condizioni.
-buona base scientifica

RAZIONALE:
Permettono di valutare in vitro la capacità di un agente di inibire la crescita cellulare o indurre la
morte cellulare in seguito a trattamento con sostanze di diversa natura (xenobiotici, famaci naturali e
di sintesi, contaminanti ambientali o presenti negli alimenti, etc).
Monitoro parametri presenti e uguali in tutte le cellule: quelle tumorali sono instabili geneticamente;
ma in linea generale la struttura e il metabolismo è uguale a quelle sane.
Gli effetti osservati sono indipendenti dalle cellule usate, si possono usare diverse cellule, ma se si deve
utilizzare cellule rappresentative si utilizzano quelle umane per andare a vedere cosa succede
nell’organismo.
Le cellule in coltura hanno il problema della scarsa competenza metabolica: non sono i grado di
riprodurre quello che succede a livello dell’organismo, sono limitatamente competenti, per monitorare
se i metaboliti sono tossici è fondamentale utilizzare cellule metabolicamente competenti, o si
aggiunge S9mix (surnatante degli epatociti, frazione microsomiale epatica; anche cofattori NAD
glutatione) viene aggiunto al terreno, mima quello che succede ad un organismo intero =
ATTIVAZIONE METABOLICA ESTRINSECA.
ESEMPI:
-Trypan Blue uptake
- Neutral Red uptake
- Lactate Dehydrogenase (LDH) leakage
- MTT assay

Permeabilità della membrana plasmatica:

1-Esclusione dei coloranti:
Membrane danneggiate permettono la penetrazione di molecole di grandi dimensioni nel citoplasma.
Il trypan blue assay viene comunemente utilizzato per la determinazione del numero delle cellule
mediante conta all’emocitometro. Questo colorante entra solo nelle cellule morte. Le cellule vive
escludono il colorante (da qui il nome della metodica Trypan blu exclusion). Questo test viene
24
utilizzato per stimare il numero di cellule vive in seguito a trattamento con una determinata sostanza o
anche dopo la procedura di trispinizzazione o isolamento di cellule da tessuto.
Alternative: Eosina, sostanze fluorescenti es. Ioduro propidio
Strumentazione: Microscopio/citofluorimetro

2-Accumulo di coloranti:
Vitalità valutata in termini di perdita della capacità di trattenere coloranti.
Il Neutral Red assay si basa sulla capacità delle cellule vive di incorporare e legare un colorante carico
positivamente che diffonde facilmente attraverso le membrane di tutte le cellule, si accumula nel
citosol e viene incorporato all’interno dei lisosomi. Il principio di questo test consiste nel fatto che il
NR può essere incorporato e legato solo dalle cellule vive, mentre questa capacità tende a diminuire
nelle cellule danneggiate o morte. La quantità di NR accumulato dalle cellule è direttamente
proporzionale al numero delle cellule vive presenti nella coltura.
Strumentazione: Spettrofotometro

3-Rilascio di costituenti cellulari: enzimi

• Misurati nel mezzo di coltura (non colorato)
• Lattico deidrogenasi (LDH) – kit commerciale
Questo test di citotossicità viene utilizzato come indicatore di un aumento della permeabilità di
membrana e successiva morte cellulare. L’aumento della permeabilità associato alla morte cellulare
determina il rilascio dell’enzima citoplasmatico LDH, presente nelle cellule di mammifero.
Piruvato + NADH vengono trasformati in Lattato + NAD+ per azione dell’enzima in questione.
Strumentazione: spettrofotometro alla lunghezza d’onda di 340 nm
Alternative: es. Fosfatasi alcalina

4-Saggi metabolici o funzionali:

Valutano la vitalità cellulare misurando i componenti e le attività enzimatiche necessarie per il
mantenimento dello stato energetico della cellula.
1-determinazione dei livelli di ATP, ADP, AMP, intracellulari: Sistema enzimatico a
bioluminescenza luciferina-luciferasi. Utilizza l’enzima luciferasi (identificato nella lucciola), che
catalizza in modo specifico l’idrolisi dell’ATP. La quantità di luce prodotta da questa reazione
enzimatica è direttamente proporzionale alla quantità di ATP presente nel campione ed è misurata con
un luminometro.
2-determinazione degli enzimi coinvolti nella sintesi di ATP (succinato deidrogenasi):
L’MTT assay utilizza il 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide o MTT, una
sostanza di colore giallo in soluzione acquosa. Il succinato deidrogenasi mitocondriale delle cellule
vitali taglia l’anello tetrazolico, portando alla formazione di cristalli di formazano color viola porpora
insolubili in acqua. I cristalli vengono poi sciolti con DMSO. La soluzione viola risultante viene
misurata spettrofotometricamente. Un aumento o diminuzione delle cellule vitali causa un
cambiamento concomitante nella quantità di formazano che si forma e che può essere considerato
come un indicatore del grado di citotossicità causato dall’esposizione ad una sostanza.

In vitro Mammalian Cell Micronucleus Test: OECD 487

Test validato dall’OECD nel 2014, poi sono stati fatti degli aggiornamenti, versione ultima luglio 2016.
Si basa su un concetto di fondo:
il micronucleo è un piccolo nucleo accessorio che si forma all’interno di una cellula pronta a dividersi
nelle due cellule figlie; piccolo nucleo accessorio monitorabile nel citoplasma di una cellula binucleata
perché è una cellula madre che si sta dividendo nelle due cellule figlie.
Esso può avere diversa origine: prodotto dalla rottura di un cromosoma, o da frammenti un po’ più
gradi o da un intero cromosoma dovuto ad una alterata formazione del fuso mitotico che forma questo
piccolo nucleo in più .

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Le sostanze che inducono un danno di questo tipo: CLASTOGENE, inducono rottura del cromosoma o
più cromosomi, inducendo aberrazione cromosomica strutturale.
O sostanze ANEUPLOIDOGENE, sostanze che inducono anaploidia (cromosoma in più o in meno a
carico di una singola coppia, trisomia 21, sindrome di Turner, cromosoma in meno; corredo genetico
alterato) e poliploidia (incompatibile con la vita, intero corredo genetico moltiplicato in un numero
maggiore di due), aberrazioni cromosomiche.
Entrambi questi tipi di danni provocano nella cellula la formazione di un micronucleo, simile ai nuclei
principali, forma tondeggiante e perfetta, non è collegato ai nuclei principali in nessun modo.

Utilità del test: semplice esecuzione, grande riproducibilità e versatile, sia danno indotto da
clastogeni che aneuploidogeni.
Per capire se una sostanza è clastogena o aneuploidogena, sono presenti test specifici.

Protocollo metodica classica (CBMN), Cytokinesis Block Micronucleus Assay

Avviene grazie al blocco in citodieresi, momento in cui la cellula madre forma l’anello di actina che
divide la cellula in due figlie.
Se si blocca questo passaggio si vede tante cellule con due nuclei.
Si blocca per poter controllare la replicazione, se è avvenuta correttamente; è fondamentale per fissare
la mutazione.
Dopo si può andare a vedere al microscopio le cellule che presentano due nuclei e quelle con un
nucleo, e si possono riscontrare i micronuclei.
Citocalasina B: sostanza che utilizzata nelle giuste condizioni non è tossica per le cellule, ma permette
la sopravvivenza impedendo la divisione.
-dopo si aspetta un periodo di trattamento e la popolazione cellulare è pronta per ricevere il
trattamento ipotonico e fissativo. Soluzioni che servono ad arrivare ad un vetrino comodo da leggere e
in cui le cellule siano ben visibili, ipotonico fa gonfiare le cellule più è gonfia più si vede all’interno per
distinguere i nuclei.
Soluzione fissativa: blocco azione soluzione ipotonica e fissa le cellule in quel particolare istante della
loro vita.
-si fanno i vetrini e si colorano: vetrino blu/violaceo di Colorazioni, Giemsa e May Grunwald; vetrino
con tappeto di cellule in cui si distinguono le cellule e i nuclei vari.

Lettura dei risultati: analizzando la citostasi, per vedere la corretta replicazione o eventuale danno
genetico, e se hanno acquisito un numero di micronuclei per apire se la sostanza è mutagena e
genotossica
TEST MUTAGENESI:
Fondamentali per tutte le sostanze, step chiave se una sostanza è mutagena l’iter si interrompe lì.
L’effetto di una mutazione non si vede nell’immediato, ma ha effetti molto gravi che vanno dalle
patologie neurodegenerative, ereditarie, ecc…
Se una sostanza è mutagena l’iter si interrompe lì, tranne per antitumorali, perché hanno questo
effetto insito perciò tutto questo decade.
Agli studi di mutagenesi possono seguire gli studi di cancerogenesi che non si fanno per tutte le
sostanze, non si effettuano per le sostanze positive agli studi di mutagenesi (mutageni sono già
potenziali cancerogeni).

Impatto delle mutazioni sulla salute dell’uomo:

Lo xenobiotico deve avere caratteristiche chimiche fondamentali per interagire con il DNA, devono
essere presenti siti elettrofili per interagire con le basi del DNA formando legami covalenti, forma
L’ADDOTTO.
L’addotto è una lesione pre-mutazionale, non è ancora un danno irreversibile ma è un’alterazione che
si è formata e che può essere riparata. Sono presenti sistemi di riparazione del DNA che possono
tagliare il DNA e ricucirlo. Qual ora il sistema non funzionasse, succede che il danno non viene riparato,
l’addotto può essere mandata a morte con meccanismo di morte cellulare programmata con apoptosi,
26
l’apoptosi è un meccanismo non patologico ma fisiologico perché è eliminazione selettiva di cellule
non considerate idonee anche durante la gravidanza per il rimodellamento degli organi nei bambini;
eliminazione di una cellula che rischia di portare un genoma aberrante.
Se no la cellula è in grado di sopravvivere e replicarsi, passaggio chiave fondamentale della
mutagenesi.
Possibili DANNI:
-Aberrazioni cromosomiche strutturali: tutti i danni che posso avere a carico di 1 o più cromosomi con
alterazioni di tipo strutturale.
-Aberrazioni genomiche (numeniche): aneuploide e poliploide; alterazione del numero dei cromosomi
Anaeoploide: perdita o acquisizione di un cromosoma a carico di una singola coppia
Poliploidie: moltiplicazione del nostro corredo cromosomico. Non compatibili con la vita, sono
anche causa di aborti spontanei.
Sostanze che non sono mutageni genotossiche ma sostanze che interferiscono con il fuso mitotico,
quando il DNA si è replicato e si formano i cromosomi, se questo non funziona si può avere danno:
alcaloidi della vinca, antitumorali (vincristina), utilizzati nei laboratori come controlli positivi, note
per indurre quel tipo di danno.
Sostanze note metil sulfonato sono noti clastogeni e mitomicina C: aberrazioni strutturali.
Controlli positivi valide per utilizzo nei test di mutagenesi: esistono delle tabelle che riportano i
controlli postivi riconosciuti come validi a seconda del tipo di danno (sostanza clastogena e una
sostanza aneuploidogena, nel test del micronucleo per evidenziare entrambi i danni si devono
prevedere entrambi i controlli).
-mutazioni geniche: mutazioni più piccole, puntiformi, a carico di singole coppie di basi. Non sono
coinvolti interi cromosomi, mutazioni qualitative e quantitative.
Si parla di transizioni e trasversioni: il numero non cambia sono qualitative cambia il tipo di base ma
non il numero.
Quantitative: aggiunta o perdita di basi, sia addizione che delezione. Spostamento del modulo di
lettura, frame shift, spostamento del modulo di lettura (può non causare nulla perché abbiamo più
triplette che codificano per lo stesso amminoacido, anche il cambio di amminoacido può non produrre
un effetto dannoso).

Potenziali conseguenze:
Possono essere colpite sia le cellule somatiche (l’individuo stesso portatore delle cellule che
manifestano la patologia) si parla di neoplasie, morte cellulare, invecchiamento, malattie cardiache,
ecc.. Se sono colpite quelle germinali, i danni possono essere trasmessi alla progenie, malformazioni,
malattie genetiche ed ereditarie.
Quando si deve fare studio di mutagenesi, utilizzo dei linfociti sani di un donatore, perché la linea
guida permette di utilizzare sia linee cellulari sia linfociti dal sangue di un donatore.
Si isolano i linfociti e si utilizzano come utilizzo le cellule Jurkat.
Il donatore deve avere caratteristiche < 35 anni, più bassa possibile soglia delle mutazioni spontanee,
non fumatore (fumo è induttore mutageno) e senza trattamento chemioterapico negli ultimi 6 mesi.
Le mutazioni spontanee del soggetto dipendono anche dallo stile di vita del soggetto.
Test del micronucleo si fanno anche su donatori come paziente affetto da patologia ed in trattamento,
per vedere se i pazienti sottoposti a chemioterapia dopo anni possono avere recidive o se hanno
maggiori mutazioni alla fine della terapia.

Test mutagenesi:
Evidenziano le proprietà di un composto chimico di provocare, in un organismo target gli stessi tipi di
effetti mutageni che sono alla base di eventi genetici responsabili di numerose forme di patologie
(malattie ereditarie) o di processi biologici cellulari ritenuti essenziali per la trasformazione
neoplastica (mutazioni somatiche).
Servono per vedere se una sostanza è in grado di provocare una mutazione (danno irreversibile e
fissato che può avere conseguenze diverse).

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Finalità : i test sono moltissimi e sono in continua revisione, essi si suddividano sulla base della finalità
che hanno, sulla base del tipo di informazione che mi danno.
A cosa mi serve?
-test di screening: test di screening di farmaci, mutagene associati a cancerogeni.
-test di conferma dell’attività in vitro: ci son test che permettono in vitro di evidenziare se la
sostanza è mutagena o meno, conferma dell’attività in vitro anche in vivo. Per confermare in vivo,
richieste regolatorie nel momento, se ho un risultato in positivo in vitro non si va in vivo, risultato
forte per non ricorrere alla sperimentazione animale; conferma quando è negativo, può essere
presente qualche meccanismo legato al metabolismo che può dare effetti negativi sugli animali. Il
metabolismo può attivare alcune sostanze non attive (attivazione del paracetamolo). Pre-mutageni
vengono trasformati dal metabolismo, responsabile poi dell’effetto.
-test per valutazione degli effetti a livello germinale

Tipo di sistema di saggio che utilizzo: se prendo cellule somatiche o germinali si avranno effetti diversi.
Ci sono anche test che possono essere condotti in vitro e altri in vivo.
Esistono comunque test che si possono condurre sia in vitro che in vivo: test di citogenetica.
Questo test è anche chiamato test delle aberrazioni cromosomiche, test specificatamente rivolto
all’identificazione delle aberrazioni cromosomiche strutturali, test di citogenetica classica (solo
strutturali). Test del micronucleo anche le numeriche.
Altro tipo di classificazione dei test sulla base del tipo di danno che vanno ad evidenziare,
-test su salmonella e su E.Coli: oltre alle cellule si possono utilizzare test in vitro che utilizza batteri,
- lieviti
Il poter testare su organismi diversi è dato dal fatto che il bersaglio d’azione dell’eventuale tossico è
presente in tutti: DNA.
Ci sono stati importanti cambiamenti nel tempo che hanno portato all’eliminazione dei test in vivo; il
test del micronucleo in vitro ha dato grande spinta, è entrato in vigore nel 2010, poi revisionato nel
2014.
La sua efficienza ed affidabilità in tanti laboratori ha fatto sì che venisse introdotto nelle linee guida,
nelle ISO per genotossicita anche per i dispositivi medici e sottolinea di fare test sia per aberrazioni
che per mutazioni con test del micronucleo.

Gli studi di mutagenesi vengono fatti subito, sono considerati essenziali e l’evento mutageno si può
manifestare anche in acuto. È sufficiente una dose per avere quell’effetto.
Sono considerati quel pacchetto di minima per poter procedere con gli altri studi. Prima si parte con
acuta e mutagenesi poi si decide come proseguire.
Gli studi a breve medio termine necessitano delle info dell’acuta; il medio viene portato avanti con i
test di cancerogenesi e con il ciclo riproduttivo che si possono protrarre per diverso tempo
parallelamente.

I test di mutagenesi possono essere svolti anche se sono diversi perché quello che è universalmente
presente è il DNA,
Ogni nuova sostanza che ha un potenziale impatto nella salute dell’uomo va testata prima di essere
posta in commercio soprattutto per le proprietà mutagene.
REACH: si devono testare anche le sostanze già presenti in commercio se non sono disponibili dati di
tossicità specifici. Bisogna dare priorità ai test in vitro rispetto a quelli in vivo.
Deve permettere di evidenziare le classi principali di danno genetico: mutazioni ed aberrazioni.
Si deve tener conto che il materiale genetico anche se è trasversale è molto differente fra i due tipi di
organismi tra procarioti ed eucarioti.
Utilizzo sistemi di saggio diversi per coprire tutto lo spettro, se sono in vitro la situazione può
cambiare se sono in vivo causa il metabolismo, che lo ha trasformato inserendo gruppi funzionali,
responsabili della capacità mutagena.
-si possono scegliere cellule metabolicamente attive per far sì che avvenga quello che avviene in vivo
(epatociti),

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-TK6 validata e ottimale per gli studi di mutagenesi aggiungendo una fonte di attivazione metabolica
dall’esterno, estrinseco: S9mix: surnatante a 9 mila g. esso si ottiene dagli animali come il ratto che
viene trattato con un induttore enzimatico (fenobarbital), stimola nell’animale l’espressione dei livelli
di enzimi microsiomiali epatici che servono per metterteli nel medium di coltura.
Si preleva il fegato e si fa l’omogenato, una sorta di frullato: centrifugazione per eliminare la
componente più pesante e tengo il surnatante che possiede mix di enzimi.
All’ S9 si aggiungono cofattori che servono per far avvenire le reazioni. Si aggiunge di solito S9 a 2% a
seconda del volume finale in termine di volume e quantitativo di cellule. Si fanno prove con controlli
positivi: nel test del micronucleo ci sono in elenco sostanze che sono noti mutageni, vinblastina e
vincristina ecc… etil metansulfontao per clastogeno; anche noti mutageni che necessitano di
attivazione metabolica (citofosfamide), utilizzati per vedere se il sistema di attivazione metabolica e il
quantitativo è sufficiente per vedere l’effetto mutageno.
Esistono anche dei mix già completi, e si possono ottimizzare solo le concentrazioni.

La normativa dice di procedere con procedimento a batteria:

-2 vitro per mutazione e aberrazioni (micronucleo e ..) se i risultati sono positivi ci si ferma per ridurre
la sperimentazione animale.
-le sostanze che si sono dimostrate non mutagene, risultate negative sia in assenza che in presenza di
attivazione metabolica estrinseca. Se i risultati sono negativo si può pensare di prevedere una prova in
vivo per controllare che la sostanza effettivamente non lo sia, per tutelare la salute: approccio il più
possibile cautelativo.
Se la sostanza ha analogia strutturale con sostanze mutagene che necessitano di metabolismo, si
faranno anche le prove in vivo.

Test per le mutazioni geniche in batteri: test su salmonella. Test di reversione

Si utilizza salmonelle mutate, sono resi auxotrofi per l’istidina, non sopravvivono in un terreno privo di
istidina. Se la sostanza in studio aggiunta al terreno di coltivazione delle salmonelle fa sì che
sopravvivano e si moltiplichino vuol dire che la sostanza è mutagena, reverte la mutazione che era
dello stesso ceppo.
Mutazioni geniche: piccole mutazioni, una mutazione genica non si vede al microscopio; però si vede il
cambiamento fenotipico, effetto della mutazione.

Test per le aberrazioni cromosomiche in cellule di mammifero. Test di citogenetica

Linfociti umani e altre numerose linee di cellule di mammifero, danno evidenze tramite analisi delle
metafasi.
Le linee cellulari e i linfocitici umani prelavati da un donatore si possono utilizzare. Il donatore deve
avere alcune caratteristiche per diminuire la soglia di mutazioni.
s9mix si ottiene anche in commercio, anche s9 di origine umana, non solo dal ratto.
Anche in presenza o assenza di attivazione metabolica estrinseca.
Le aberrazioni le vedo al microscopio.

Micronuclei in vivo: strisce di sangue, viene svolto sugli eritrociti.

Aberrazioni cromosomiche: procedura analoga in vitro estraendo i linfociti dal midollo delle ossa
lunghe. Si può trattare l’animale per superare il discorso del metabolismo, poi prelevo il midollo ed
estraggo i linfociti e procedo analogamente per analisi dei risultati in vitro.

Formazione aberrazione cromosomiche:

1-formazione dell’addotto che può essere scisso tagliando il filamento, convertendosi a rottura a
doppio filamento quando si ha sintesi del DNA, rottura cromatidica, distacco di un piccolo frammento
dal cromatide e quello che si vede è un cromosoma mancante di un pezzo.
-intra-cromosomiche: coinvolgimento di un singolo cromosoma, riguardano entrambi o un singolo
cromatide , si possono avere tanti tipi di danno; delezione terminale, interstiziale, anello…ecc.
visualizzabili al microscopio.

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-iter-cromosomiche: dicentrico, associato alle radiazioni, scambio simmetrico di una porzione tra
due cromosomi, (cromosoma Philadlpia, dallo scambio tra cromosoma 9 e 21, leucemia)

Test aberrazioni cromosomiche in vitro:

Si riescono a vedere i singoli cromosomi e i diversi tipi di danno che posso avere, si evidenziano quelli
strutturali. Si possono anche dire che tipi di danni la sostanza ha causato.
Si analizzano le metafasi. I cromosomi in quel momento particolare della loro vita è massima la
condensazione della cromatina e sono visibili al microscopio.
Sin trattano le cellule con la colchicina inibitore del fuso mitotico, blocco la cellula in metafase, in cui
posso vedere al microscopio la forma X.
Vincristina e vinblastina: interferiscono con il fuso, a seconda del momento della vita della cellula in
cui fisso, nei trattati avremo la visione dei singoli cromosomi.
Si gonfia con l’ipotonico, voglio vedere i singoli cromosomi, non serve il fissativo ma ipotonico spinto
per fare disgregare la cellula e vedere solo i singoli cromosomi.

-micronucleo: vedo danno indotto da clastogeni e aneuploidogeni, utilizzo citocalasina, ipotonico

blando con terreno e lo si blocca con il fissativo per evitare lisi cellulare
-aberrazioni: solo clastogeni, per evidenziare il tipo di danno che inducono. Utilizzo della colchicina.
Ipotonico spinto con KCl, per portare cellule alla lisi.
Colorazione per le aberrazioni: solo con colorante Giemsa, colorante si lega al DNA e fa sì che si vedano
i cromosomi

Quando si pianifica lo studio di mutagenesi si fanno tanti trattati che devono comprendere controlli
negativi e postivi per la sostanza in studio.
Controllo +: con noto mutageno clastogeno
Controllo-: terreno con cellule non trattato
Controllo solvente: controllare la tossicità del solvente, (cloroformio, metanolo, dimetilsolfossido
DMSO), controllo tossicità del solvente. Colture con solvente che utilizzo per solubilizzare ma senza il
trattamento.
Dimetilsolfossido al massimo si aggiunge 1%, però è sempre bene avere un controllo solvente.
La sostanza in studio viene testata in 5 concentrazioni diverse, dopo se si ha 40% di citostasi si
selezionano 3 concentrazioni.

Serie di colture che non si trattano con s9 e altre che le tratto (attivazione metabolica). (slide 15,
tabella)
Diverso controllo positivo: sostanza che deve essere attivata metabolicamente, citofosfamide CP60.

Si controllano per ogni piastra il numero di gaps, rotture cromatidiche, frammenti, riarrangamenti
cromatidici, ecc..
Per abbattere problema della risposta interindividuale si utilizzano due donatori per vedere se la
sostanza induce lo stesso effetto e se la risposta è simile in entrambi i donatori, poi si fa analisi
statistica per capire se la sostanza è più o meno mutagena.

Test si può fare anche in VIVO:

-utilizzo gli animali e si procede analogamente al vitro, dopo estrazione delle cellule dal midollo.
-colchicina si fanno sull’animale colchicina 1h prima del sacrificio.

Test del micronucleo: linea guida 487

Linee cellulare TK6, stabilizzate o da sangue di donatore
Nella linea guida: il trattamento che si deve fare con la sostanza in studio si deve fare per uno short
time treatment o per un long time treatment.
-short: 3-6 h di trattamento, poi numero di ore in terreno completo senza trattamento per far si che le
cellule completino un ciclo e mezzo di replicazione.
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TK 6: 13. Ore di replicazione
Recovery period: tempo in terreno senza trattamento da aspettare prima di procedere all’analisi.
-long time: quando abbiamo avuto risultati negativi nello short, si procede con un periodo più lungo di
contatto tra le cellule e la sostanza. Tutto il tempo per far sì che completino un ciclo e mezzo in
contatto con la sostanza in studio (TK 6 tutte le 26 ore).
Il test del micronucleo può essere fatto in presenza o assenza di citoclastica B, inibitore della
citodieresi; trattamento o subito dopo il trattamento con la sostanza o in contemporanea se siamo nel
tempo breve o lungo. La citocalasina si lascia circa 24h.

ANALISI: microscopia ottica,

Per avere un’immagine migliore possibile e una lettura facile e comoda con risultato supportato da
un’analisi su un idoneo numero di cellule con minor possibilità di errore, le cellule devono essere né
troppo fitte né troppo rade e si deve visualizzare bene la cellula.
Si devono avere i nuclei ben in contrasto rispetto al citoplasma ed esso ben visibile rispetto al fondo
del vetrino.
-gonfiamo le cellule in modo che si distinguano bene: ipotonico + fissativo freddo (metanolo e acido
acetico), aggiunti lentamente e mantenuti in agitazione.
-campioni a – 20°C e lasciamo per 24h. Si possono anche congelare per molto tempo (anni).
-vetrini: lavare con sapone acqua ed etanolo, 100 microlitri di campione, messi in citocentrifuga.
Non serve più la sterilità perché le cellule non sono più vive però si deve lavorare in cappa chimica.
Vetrini asciugare 24h.
-colorazione: Giemsa- May Grunwald

ANALISI:
incremento della frequenza di micronuclei:
-controllo +: presenza di mutazioni con farmaco mutageno
-controllo – : controllo che il tutto funzioni
-controllo solvente: fondamentale per tossicità , monitoraggio che non sia lui responsabile di tossicità.
Controlli +: due
-un anaploidegeno
-una plastogeno
Sostanze incognite in tre concentrazioni diverse.
Tutto in assenza di S9 mix

Se le condizioni sono in presenza di S9mix: si prepara solo un controllo positivo, non ci sono
anaeuploidogeni che abbiano bisogno di attivazione metabolica estrinseca noti. Si usa citofosfamide.

Si controlla la vitalità delle colture:

-vitalità : si ottiene un valore (es:70%, normalizzato sui controlli).
3 valori di vitalità , la linea guida dice che la soglia che devo rispettare per andare avanti con l’analisi è
del 55+-5%, soglia di citotossicità massima. La vitalità deve essere almeno 40%, citotox max 60%
-procedo con la lettura dei vetrini solo per le concentrazioni che stanno dentro a quei valori.
A questo valore si aggiunge l’opportuna considerazione sulla citostasi, indice che permette di
controllare che almeno il 40% abbia correttamente replicato,
Se nel controllo-: hanno proliferato il 95% delle cellule
nel trattato - 70% delle cellule
il rapporto delle due proliferazioni si calcola la percentuale dei trattati che ha proliferato e se supera la
soglia del 40%.
Calcolo diverso a seconda del metodo utilizzato:
-ovviamente si tiene in considerazione se si è aggiunta o meno la citocalasina
Per controllare la citostasi in presenza di citocalasina al microscopio devo contare quante cellule più
nucleate ho sul vetrino su 500 cellule totali. Citocalasina blocca la divisione ma non la moltiplicazione

31
dei nuclei. Posso trovare mononucleate, binucleate, tetranucelate, trinucelata (la cellula madre pronta
a dividersi una delle due cellule è un po’ più avanti dell’altra e si possono andare a formare tre nuclei).
Se si contano 500 cellule in totale e quante bi, tri e tetra… si può calcolare la citostasi.
-Si contano nei controlli e nei trattati per paragonare il trattato con il controllo.

La genotossicità viene valutata su 1000 cellule binucleate contare quante hanno micronucleo e
stabilire numero di micronuclei nei C- e il numero di micronuclei nei trattati. Quante hanno di queste il
micronucleo?
Es: 5 micronuclei su 1000 controlli
10 micronuclei su 1000 nei trattati
Frequenza dei micronuclei è il doppio dei trattati, incremento dei micronuclei stabilisce se la sostanza
è mutagena rispetto ai controlli.
Per essere dichiarata mutagena il risultato deve essere statisticamente significativa, incremento dei
micronuclei deve essere statisticamente significativo rispetto al controllo (1 o 2 in più non è
sufficiente)
Per abbattere il problema della differenza tra gli errori casuali bisogna aumentare il numero dei
campioni e fare una media.
Ogni vetrino deve essere letto da persone diverse per abbattere la soggettività di lettura, non sapendo
cosa c’è nel vetrino.

CALCOLO: Linea guida

Formule valutazione citotossicità che tiene conto della citostasi
-con citocalsina:
CBPI e RI
CBPI = (numero mononucleate) + (2 x numero binucelate)+(3x multinucelate)/numero tot cellule
(500)
Sia nei trattati che nei controlli.
%citostasi = 100-100 ((CBPIr-1)+(CBPIc-1)) dai due valori che ottengo dai tratti e dai controlli. Esso
deve rispettare la soglia stabilita.
IR = numero binucelate +(2numero multinucelate)(numerio toatli di cellule ecc..
Quato sottratto a 100 mi darà la citostasi
Entrambi gli indici possono essere utilizzati.

Senza citocalasina: due possibili indici si usano RPD calcolando il population doubling
Guardare formule sulla linea guida

Linea guida OECD/OCDE 487 (da leggere)

Ultima revisione: 29 luglio 2016, è stato inserito il discorso della citocalasina.
Punto 4: fish test successivo nel caso in cui vogliamo identificare il meccanismo d’azione cercando il
centromero.

Cellule: possono essere utilizzate cellule CACO, cellule epatiche possono essere utilizzate per questi
test ma non sono validate: non è necessaria l’attivazione metabolica estrinseca, essi non sono
attualmente validati e neppure così tanto utilizzate per dire che sono un sistema valido.
Testando ai fini regolatori per determinare se la sostanza è mutagena: usare linee validate o linfociti
da sangue periferico di donatore.

Come coltivare le cellule:

utilizzo dell’appropriato terreno e condizioni di incubazione.

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LINFOCITI: estrazione da sangue intero:
Metodica: tipo di separazione che possiamo identificare anche per altre tipi di cellule: separazione per
gradiente di densità .
Si separano le cellule in base alla densità , una parte del sangue donato si può utilizzare a scopo di
ricerca, si chiede un buffycoat: parte del sangue prelevato che è stato privato da una parte di plasma,
per avere sangue concentrato, più facilmente utilizzato per la separazione dei linfociti.
Con esso si separano le componenti in base alla densità , si utilizza un reagente opportuno: histopaque.
Reagenti che permettono di stratificare il sangue in base alla densità .

Metto histopaque in una falcon da 50 e stratifico il sangue sopra questo reagente che forma una
membrana dove appoggio il sangue. I due mezzi rimangono momentaneamente separati. Sopra sangue
sotto histopaque.
Si fa percolare lungo la parete della falcon il sangue, il più lentamente possibile affinchè il sangue si
appoggi sulla membrana. Con la pipetta mi appoggio su una delle pareti e si fa scendere abbassando la
velocità di discesa dal pipettatore per far si che il liquido scenda giù scorrendo dalle pareti della falcon
e si appoggia sulla membrana dell’histopaque, bisogna andare lentamente per stratificare il sangue sul
reagente.
Mettendoli in centrifuga grazie al reagente quello che pesa di più andrà sul fondo e si formeranno
strati in cui si identifica un anello lattiginoso costituito dalla componente leucocitaria. Prelevandoli si
ottiene una coltura di linfociti.
Il sangue va trattato con anticoagulante (eparina), linfociti coltivati in presenza di un mitogeno
esempio PHA, fitoemoagglutinina; serve per indurre la divisione cellulare prima dell’esposizione alla
sostanza test.
I Linfoociti sono in stato G0, nel momento in cui lo estraggo devo stimolare la replicazione e la
divisione cellulare, stimolo mitogeno PHA, derivato dal fagiolo vulgare, qualcosa che non riconoscono
come self, e si stimolano a proliferare.
Se metto nel medium di coltura PHA, si ha questo stimolo mitogeno per la proliferazione dei linfociti,
coltura 48 H; e si procede con il trattamento, poi devono essere monitorate affinchè avvenga la
replicazione per andare avanti con il test.

Attivazione metabolica:
S9 mix: induttori enzimatici per implementare la frazione microsomiale epatica. S9 utilizzato in
concentrazioni basse fino ad un max del 10%.

Solventi più utilizzati: acqua e DMSO. Acqua non aggiunta fino max 10% e DMSO max 1%, e questo per
controllare il potenziale tossicità del solvente (controllo solvente per monitorare tossicità del
solvente).

Si selezionano 5 concentrazioni e poi a seconda di quello che avviene si scelgono 3 concentrazioni da

testare con il micronucelo.

Almeno 1000 cellule a vetrino.

La frequenza di micronuceli nei trattati de dare un valore statisticamente significativo, se il trattato

rispetto al controllo è significativamente diverso allora la sostanza può essere considerata positiva.
Devono essere abbastanza diversi per far sì che venga positivo il test statistico.

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 TEST CANCEROGENESI
Gli studi di cancerogenesi seguono quelli di mutagenesi, se una sostanza risulta mutagena, l’iter si
interrompe.
Stadi del processo di cancerogenesi: multifattoriale, probabilistico e multistadio, si identificano 3
momenti principali, per testare se la sostanza è cancerogena.
Le sostanze chimiche-fisiche e biologiche che inducono mutazione in una cellula, in grado di fissare un
danno genetico e colpire geni che controllano la proliferazione oncogeni e oncosoppressori, la cellula
da sana oltre che mutata si può considerare iniziata.
La mutazione è irreversibile quando i cancerogeni sono inizianti e genotossici che esplicitano la loro
azione impedendo ad una cellula di rispondere ai normali meccanismi di riparazione e svicola da
questi normali meccanismi, essa è in grado di proliferare senza controlli = cellula iniziata; essa può
rimanere così anche per sempre, può anche non originare un tumore, senza evidenza clinica.
La cellula iniziata si trasforma per esposizione ad un promuovente ed entra nella fase di promozione.
Cancerogeno promuovente, agisce in diversi modi e ha come effetto finale lo stimolo della
proliferazione favorendo l’espansione clonale, dando luogo alla lesione preneoplastica, trasformandosi
in neoplasia vera e propria, anche malignità e metastasi.
E’un processo multifasico che mi porta alla manifestazione clinica del tumore fino a cancro invasivo
che dà luogo a metastasi.
Noi possiamo evidenziare i cancerogeni inizianti e promoventi.
-Inizianti: genotossici, il meccanismo viene evidenziato già dagli studi di mutagenesi. Essi non
permettono di evidenziare se è promovente.

Studi di cancerogenesi:
-Identificare il potenziale cancerogeno nell’animale da esperimento e valutare il rischio per l’uomo
-Dispendiosi, lunghi e quindi applicabili solo per composti per cui è previsto un trattamento a lunga
durata (minimo 6 mesi) o per cui esistono indicazioni da precedenti studi di potenziale effetto
-Richiesti per farmaci per cui è previsto un uso discontinuo ma cronico o ricorrente (riniti allergiche,
depressione, ansia).
-Farmaci con uso infrequente o con brevi regimi di trattamento (anestetici, traccianti marcati) non
necessitano questi studi
La mutagenesi è un evento acuto per avere un effetto basta un’unica esposizione non c’è una NOEL
identificabile. Aumentando l’esposizione aumenta la probabilità che l’evento si verifichi.
Basta un'unica esposizione e si può accusare il danno che è irreversibile.

Sostanze cancerogene promuoventi: sarà possibile definire una dose una NOEL
Necessarie più esposizioni per stimolare l’espansione clonale e dosi ripetute e di conseguenza
esposizione cronica ripetuta per molto tempo.
Mutagenesi si fa per tutte le sostanze, se hanno potenziale impatto sulla salute. Se i risultati sono
negativi se la sostanza è un potenziale farmaco che prevede esposizione ripetuta si va avanti con la
cancerogenesi.
FATTORI DA CONSIDERARE:
-Indicazioni di potenziale effetto: mi baso su quello che so sulla particolare molecola, ed esposizione
prevista per l’uomo e studi disponibili fino a quel momento. Se si hanno sostanze che hanno relazione
struttura-attività, se esse hanno strutture simili a sostanze già precedenti in studio chiaramente
bisogna procedere.
Se si hanno studi sull’animale con lesioni preneoplastiche dopo una somministrazione ripetuta,
quando si fanno analisi istopatologiche si vedono se ci sono lesioni di tipo preneoplastico per capire se
la sostanza da già delle lesioni. Questa sostanza anche si può accumulare nei tessuti, campanello
dall’arme per cancerogenesi.
-Genotossicità: deve essere negativa
-Indicazioni e pazienti: fattori collegati all’indicazione terapeutica della sostanza e al tipo di pazienti.
Se i farmaci sono stati sviluppati per patologie degenerative e altamente debilitanti, potrebbe
34
migliorare la sintomatologia del paziente. Questi studi possono essere condotti anche dopo
immissione in commercio. Passa in secondo piano l’essere potenzialmente cancerogeno più
importante migliorare le condizioni di vita dei pazienti, sapendo che il paziente non avrà
un’aspettativa di vita tale per lo sviluppo di un tumore.
Se l’aspettativa di vita della popolazione è breve (<2-3 anni) non vengono richiesti.

Disegno sperimentale:
Identificazione delle specie animali più opportune per il test della sostanza. Si seguono le linee guida
che dice quali specie utilizzare per gli studi: ratto e topo, che richiedono poco spazio, costi contenuti.
Ci sono specie animali particolarmente sensibili a determinate sostanze, alta incidenza spontanea di
tumori.
-Animali: 2 specie, scartando quelle con alta incidenza spontanea di tumori, 50 animali per sesso e per
dose
-Via di somministrazione: quella proposta per l’uso clinico, con somministrazione giornaliera
-Dosi: 3 livelli di dosi. La più alta deve produrre un minimo effetto tossico (calo ponderale del 10%). La
dose più bassa è quella che produce l’effetto farmacologico nell’animale. Quella intermedia è la media
geometrica tra le altre.
-Durata: 24 mesi per il ratto, 18 mesi per il topo

I Livelli di dose vengono definiti dagli studi precedenti, tossicità per estrazione singola e tossicità
subcronica, avere indicazioni sulla MDT. Dose che mi dà effetto tossico evidente ma che non porta a
grave tossicità ma che permette di evidenziare un certo effetto tossico.
La dose più alta testata è la MDT: si evidenzia un calo ponderale del 10% del peso dell’animale.
Si deve arrivare in fondo allo studio definendo una NOEL.

Osservazione dell’animale:
-osservazione comportamentale
-necropsia,
-istopatologia (si parte dagli animali tratti con la dose più elevata e se si osservano tumori si va alle
dosi più bassa per definire la NOEL): indagine microscopica su organi e tessuti degli animali trattati
con la dose massima, per vedere se una sostanza è cancerogena. Posso evidenziare una serie di altre
informazioni che sono tipicamente collegabili al meccanismo d’azione: sviluppo di tumori comuni vs
rari, progressione da neoplasie benigne a maligne, combinazione di tumori benigni e maligni, latenza
nell’induzione di tumore, molteplicità di induzione, presenza di metastasi

-lista di tessuti da studiare per identificare le possibili lesioni causate a carico di specifici organi a
seconda della sostanza (slide 8)

Saggi di cancerogenesi a medio termine in vivo:

Durata compresa tra 1-6 mesi, costituiscono riduzione nel numero di animali utilizzati e del tempo,
durata collegata al medio termine.
Unici validati: posso trattare l’animale ma non aspetto tutto il lungo termine, utilizzo questi test per
avere informazioni in un tempo più veloce.
Se essi sono in grado di dare risultati positivi non si va oltre, si va al lungo termine se sono negativi.
Permettono di dare informazioni preliminari, se è presente positività è già sufficiente. Non si potrà ma
avere la visione di una massa tumorale a carico di organi perché il tempo non è abbastanza per lo
sviluppo, però ci può dare evidenze di lesioni preneoplastiche.

Test di ITO: a medio termine su fegato di ratto.

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Tratto l’animale con la sostanza in studio, dopo si va a vedere se nel fegato sono presenti dei foci
positivi per la forma placentare della GSH-transferasi (forma enzimatica che non c’è nell’individuo
adulto sano). Alto grado di proliferazione e differenziamento cellulare.
Cellule tumorali analogamente a quelle fetali sono caratterizzate da una grande proliferazione e scarsa
differenziazione.
Si fa sul fegato perché è l’organo di primo passaggio, perché deputato al metabolismo, e dove avviene
la trasformazione in metaboliti.
Test a medio termine multiorgano
Si inizia la cancerogenesi in vari organi in base alla organospecificità dei singoli cancerogeni che
agiscono con meccanismi di azione diversi

TEST SUL FEGATo DI RATTO

Si può identificare il meccanismo d’azione con cui agisce il cancerogeno, si discrimina se la sostanza in
studio è un iniziante o un promuovente.
Prima si applica un trattamento con DENA, noto iniziante; successivamente viene applicato il
trattamento con il composto in studio. Se ci sono foci si conclude che la sostanza è un promuovente.
Composto in studio è un promuovente, perché ha seguito l’azione di un noto iniziante.
Se inverto l’ordine degli eventi: sostanza in studio + stimolo promuovente e compaiono foci replicativi
si conclude che è un iniziante.
Stimolo promuovente: epatectomia parziale, piccola resezione del fegato che sfrutta la capacità
dell’organo di autorigenerarsi, per far sì che parta la replicazione compensativa del danno che è un
perfetto stimolo promuovente, cellule proliferano causa l’operazione chirurgica, il fegato viene
stimolato a riparare la lesione e lo fa stimolando la proliferazione.
La comparsa di foci positivi alla comparsa di GSH: trasformante.

Questo test e altri di cancerogenesi si possono fare anche in vitro, sfruttando la trasformazione
cellulare: metto cellule in coltura poi, si applica il trattamento con noto promuovente e evado a vedere
se ho foci positivi per la GSH transferasi.
Promuovente: esteri del forbolo.
Invertendo i fattori: prima iniziante poi trattamento cronico con la sostanza e si va a vedere se ho foci
positivi.
Permette di avere delle importanti informazioni sulla sostanza e fare un primo screening.
Si può cominciare a capire se la sostanza è da tenere d’occhio o se è un potenziale cancerogeno o se
non da problemi in vitro ecc.. poi si può procedere con test in vivo sull’animale.

Albero decisionale per valutare la cancerogenicità di un composto: (slide 12)

Se si ha una sostanza da saggiare, si fa un micronucleo o saggi in vitro di mutagenesi: micronucleo e
Ames. In base al risultato si procede:
-sostanza è mutagena (frequenza dei micronuclei alta): possibile cancerogeno e si ferma la
sperimentazione
-se la risposta è negativa o dubbia (non si è guardato il metabolismo, ecc): si procede con il test di ITO,
modello NDEA ed epatectomia parziale. Questa sostanza viene somministrata e posso avere risposta
positiva o negativa:
-se la risposta è positiva: la sostanza è cancerogena, quindi ci si ferma.
-se la risposta è negativa si procede in altri organi, modello multiorgano, in cui analogamente al test di
ito
-se la risposta è positiva: si conclude che è un cancerogeno
-negativa: si procede con i saggi a lungo termine sull’animale con esposizione ripetuta nel tempo con
esposizione maggiore del 50% della vita. Se si ha esito negativo la sostanza non è cancerogena.

Potrebbero esserci saggi a breve termine tra i saggi di mutagenesi e quello NDEA, per avere
informazioni in vitro in senso di studio di cancerogenesi vera e propria.

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Si utilizzano anche studi già presenti in letteratura, su analoghi strutturali, per capire come procedere
su quelle sostanze.

LINEA GUIDA: 451

TEST AMES: mutagenesi

Permette di evidenziare un tipo di danno diverso,
Si sfrutta l’idea di utilizzare salmonelle rese auxotrofe per l’istidina, non in grado di replicarsi in un
terreno privo dell’amminoacido. Se la sostanza reverte questa mutazione: la sostanza è mutagena. Se le
salmonelle sopravvivono in un terreno privo di istidina.
Vedo le colonie che proliferano e contandole posso vedere se la differenza tra controllo e trattato
giustifica la capacità mutagena della sostanza.
Test di Ames + micronucleo: Ames permette di identificare le mutazioni puntiformi geniche, rispetto
alle aberrazioni che vengono evidenziate dal test del micronucleo. Linee guida ci chiedono di farle
entrambi.

TOSSICITA’ A LIVELLO DEL CICLO RIPRODUTTIVO:

Studi che permettono di valutare la tossicità di una sostanza durante gli specifici stadi del processo
riproduttivo, quando si parla di studi di tossicità, non è solo la gravidanza, una sostanza può anche
essere tossica causando infertilità e impattando sulla capacità riproduttiva.
Le sostanze possono colpire i diversi stadi dello sviluppo di un bambino, fino alla maturità sessuale
(ragazzina passa alla maturità sessuale e assume capacità riproduttive), gravidanza (situazione
diversa), menopausa (donne sono caratterizzate dalla perdita della fertilità ). Le donne sono diverse
dal maschio, che potenzialmente è in grado di riprodursi lungo l’arco della loro intera vita.
Bisogna tenere conto se ha senso per la particolare molecola valutare se ha impatto sul ciclo
riproduttivo, se ha o meno lo stesso impatto sull’uomo e la donna.
Se la donna è in gravidanza, in che diversa fase essa si trova: nelle 40 settimane ci sono stadi diversi;
stadi embrionali e fetali che giustificano potenziale di sostanze tossiche assolutamente diverse.
Valutazione della tossicità estremamente complessa, bisogna valutare: il tipo di sostanza sostanza, chi
è il soggetto a rischio e cosa rischia.
Tossicità sul ciclo riproduttivo: TALIDOMIDE.
La prima fase di gravidanza: vomito e rischio di malformazioni, quando si formano gli organi è il
periodo più a rischio per attività di teratogeni. Avviene durante l’embriogenesi e le prime settimane in
cui l’embrione si sviluppa.
Dopo embriogenesi si ha lo stadio fetale in cui possono intervenire danni di tipo funzionale non più
morfologici; danni a carico del corretto sviluppo dell’organo e della sua funzionalità .

Agli studi che valutano la tossicità di una sostanza nelle prime fasi del ciclo riproduttivo: fertilità ,
capacità che si instauri una gravidanza, ecc…
a questi studi seguono gli studi che valutano i vari stadi di gravidanza.

Si possono affiancare gli studi generazionali: rappresentano esposizioni a lungo termine anche a
basse dosi, permettono di vedere se l’esposizione sul lungo termine anche di generazioni produce un
effetto tossico.
Si deve sempre considerare l’uso del prodotto: ci sono farmaci tipicamente rivolti per le donne in
menopausa, non mi interessa se impatta sulla riproduzione del soggetto. Invece un farmaco che viene

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somministrato in età fertile: farmaco per acne cistica che viene somministrato spesso in associazione
alla pillola, viene fatto firmare un foglio per far sì che la paziente non instauri una gravidanza.
Si devono considerare pure i dati di tossicità che io già possiedo riguardanti analoghi strutturali.
Farmacodinamica e cinetica sono fondamentali per capire se la sostanza ha impatto sul nascituro
anche se è in grado di passare la placenta, se la sostanza passa nel latte materno.
La combinazione degli studi sul processo riproduttivo e su quelli generazionali consente l’esposizione
dell’animale adulto e a tutti gli stadi di sviluppo, dal concepimento alla maturità sessuale.

Vengono fatti sull’animale, sono studi validati solo sull’animale.

Scelta dell’animale: utilizzo specie raccomandate sulle linee guide, che non mostrano alta incidenza
spontanea del particolare effetto tossico che la sostanza può indurre.
E’ fondamentale anche sapere quanto dura la gravidanza, devono essere ben definiti per fertilità,
fecondità , incidenza di anomalie, morti embriofetali. Si sceglie la specie più utilizzata in studi
precedenti: ratto
STUDI EMBRIOTOSSICITA’ si usa anche un non roditore: coniglio.
Coniglio specie che in termine di sensibilità ai teratogeni è il più simile alla donna. E’ presente l’obbligo
di testare sia sul ratto che sul coniglio.

Specie che si devono utilizzare nel singolo segmento di studio:

-segmento 1: ratto
-segmento2: ratto e coniglio
-segmento 3: ratto
Specie tipicamente utilizzare in ogni segmento sulla base del fatto che ci son specie con diversa
sensibilità e quindi possono essere selezionate per quel particolare segmento di studio.
a seconda delle caratteristiche e del farmaco si possono scegliere un animale rispetto ad un altro.
-Ratto: è molto sensibile agli ormoni sessuali e presenta alta suscettibilità ai FANS nell’ultima fase
della gravidanza.
-Topo: ha un metabolismo veloce, i feti sono piccoli e suscettibili a stress e malformazioni.
-Coniglio: meno utilizzato rispetto a ratto e topo, meno dati di tossicità disponibili, non c’è background
di dati storici, periodo di gestazione più lungo.
-Mini pig: meno dati storici, sono richieste grandi dosi dei composti, ampi spazi di stabulazione,
suscettibili a malformazioni.
-Hamster: feti piccoli, animali molto aggressivi e suscettibili a disturbi intestinali e ipersensibili alla
teratogenesi.

DOSI:
Le dosi vengono scelte sulla base delle informazioni derivanti dagli studi di tossicità condotti
precedentemente, frazioni della MDT (dose più alta che genera effetti tossici, non così gravi da
compromettere condizioni di vita dell’animale ma segni di tossicità rilevabili). I livelli di dose sno tre:
-la dose più alta è quella che genera i minimi effetti tossici es. riduzione del peso corporeo MDT.
-Ridotta di 2-4-10 volte.
-devono permettere di ricavare la NOAEL. Essa può essere ricavata da diversi studi e in base a questo
si ha un diverso impatto in base al rischio sull’uomo.
Noel: dose più alta in cui non abbiamo effetto tossico. Si ricava anche dagli studi di tossicità a lungo
termine, animali esposti per un tempo superiore al 50% della loro vita.

SEGMENTO DI STUDIO:
-fertilità : maschio e femmina
-sviluppo embrio-fetale: femmina in gravidanza
-sviluppo peri- e post-natale: femmina in gravidanza

Studi di fertilità :

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Una cosa che bisogna prendere in considerazione è la grossa differenza tra sesso maschile, le donne
nascono con numero di ovociti fisso alla nascita ed essi matureranno nel corso della vita della donna,
ad ogni ciclo ci sarà maturazione di un ovulo. Questi ovuli finiscono e la donna va in menopausa. Al
maschio non succede: la spermatogenesi si protrae per tutto l’arco della vita.
L’impatto a carico degli ovociti è più grave, un impatto su spermatozoi è molto meno grave, perché
spermatogenesi può durare tutta la vita e produrre nuovi spermatozoi: l’infertilità può durare per un
periodo breve.

Durante gli studi di fertilità la somministrazione dello xenobiotico avviene prima e durante il periodo
dell’accoppiamento, si simula quello che può avvenire. Bisogna valutare se l’accoppiamento avviene in
maniera corretta: ci sono sostanze che diminuiscono la libido e le capacità eiaculazione.
Si va a vedere se si ha una corretta ovulazione e fecondazione e se poi viene portata avanti la
gravidanza dall’impianto dell’ovulo (fase delicata).
Si valuta la condizione dell’omeostasi materna per vedere se procede correttamente la gravidanza.

Sono studi costosi in termine di tempo e numero di animali:

-20/30 animali per gruppo.
-Somministrazione della sostanza: ai maschi 60 giorni (spermiogenesi) prima dell’accoppiamento, alle
femmine 14 giorni (2 cicli estrali) prima dell’accoppiamento. Al 20° giorno di gravidanza metà delle
ratte viene sacrificata, l’altra metà viene fatta partorire e sacrificata al termine dello studio (21 giorni
post-partum).
Sacrificio: prima che partoriscano spontaneamente. Si sacrificano gli animali perché potrebbe
succedere che la femmina partorisca piccoli malformati o affetti da tossicità , nato morto o mancanze
tali che comporterebbe la non compatibilità con la vita e solitamente la madre decide di mangiarlo, per
recuperare le forze, protezione della specie e portare avanti i cuccioli sani.
OSSERVAZIONI ED ESAMI:
-striscio o tappo vaginale: sollevando la coda si vede un tappo che chiude l’apertura della vagina,
pellicola che chiude. In questo modo si preserva l’ambiente interno.
-sintomatologia giornaliera, ma soprattutto se l’animale manifesta qualsiasi tipo di tossicità :
modificazioni nel peso corporeo e consumo di cibo e acqua (settimanale).
-viene valutato il numero di femmine che sono state in grado di rimanere gravide.
-Sulle ratte sacrificate si va a vedere se ci sono riassorbimenti: cicatrici che rimangono sulle pareti
dell’utero che è indice di avvenuto aborto, il numero di feti vivi e morti, malformazioni esterne.
-Sulle femmine che hanno partorito spontaneamente si studiano gli effetti del parto, effetti tossici
manifestati durante il parto.
-Piccoli nati: valutazioni delle funzionalità , sviluppo morfologico e neuromuscolare.
Unità osservazionale: NIDIATA.

Ogni maschio viene stabulato con più femmine, si valuta quante femmine rimangono gravide.
Per ogni femmina ci si aspetta che nascano certo numero di piccoli, si va a valutare quanti sono sani e
quanti presentano anomalie.

Corretto sviluppo morfologico:

peso, distacco orecchie [dal 2° giorno], crescita peluria/pelo [dal 5° g la peluria, tra 8°-9° g il pelo],
eruzione incisivi [dall’8°g], apertura occhi [dal 14°g], discesa testicoli [dal 25°g], apertura vaginale [dal
30°g

ES: effetti del fumo di sigaretta: nascita di bambini sottopeso, non corretta ossigenazione della
placenta e non corretto passaggio dei nutrimenti al bambino.
Maturazione funzionale: stimolazione palpebrale, corneale ed auricolare.
Sviluppo neuromuscolare: primi segni di movimento [1° giorno], passaggio da strisciare a camminare
[9°-10°g], riflesso di raddrizzamento statico ed in aria.

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Riflesso raddrizzamento statico in aria: quanto impiega il cucciolo a posizionarsi correttamente per
cadere e atterrare sulle 4 zampe. Si prende il cucciolo per la coda si fa perdere l’orientamento e lo si
lascia cadere e osservando cosa fa l’animale si dà un diverso punteggio e si osserva quante volte
l’animale atterra correttamente.
Punteggio crescete in funzione del numero di volte che non cade correttamente.
L’animale tende a cadere sul fianco per proteggere schiena e testa. Se l’animale cade sulla schiena
quanto tempo ci mette a riassumere una posizione corretta?

STUDI DI TERATOGENESI ED EMBRIOTOSSICITA’:

La sostanza viene somministrata alle femmine gravide.
Stadio embrionale: si studiano gli effetti sull’organogenesi. Nei ratti dal 5o al 15o giorno. Conoscendo la
durata ben precisa in cui avviene organogenesi nell’animale, se somministro la sostanza posso vedere
se essa ha uno specifico effetto a carico di uno specifico organo. Danno di tipo morfologico, induzione
di malformazione: sostanze teratogene.
Teratogeni sono molti e diversi e possono essere farmaci, sostanze chimiche, virus, agenti fisici
(radiazioni).
Assunazione di alcool: FAS, sindrome fetale alcolica.
Trypan blu: noto per essere teratogeno.
La talidomide rendeva i bambini focomelici, gli effetti a livello scheletrico non sono gli unici, se
somministrata durante le fasi precoci impattava sullo scheletro. Le sostanze teratogene impattano
sull’organo che si sta formando nel momento. Il momento in cui la donna gravida si espone alla
sostanza fa la differenza, se viene esposta quando la corretta formazione è completata non avrò effetti
che osservo sull’organo perché è già formato.
Dopo il sacrificio si vanno a contare i cuccioli che presentano malformazioni. Il sacrificio avviene il
giorno prima del parto spontaneo.

Gli animali si osservano quotidianamente o settimanalmente. Viene valutato il consumo di cibo e

acqua, se l’animale è in buona salute, se ha meccanismi stereotipati, ecc.. controllo il peso corporeo.
Al termine dello studio dopo il sacrificio, viene effettuato l’esame necroptico e analizzo il contenuto
della camera gestazionale e del prodotto del concepimento; si vanno a vedere una serie di parametri:
-corpi lutei, impianti, assorbimenti, feti vivi e morti, il sesso dei fati stessi, il peso degli animali, il peso
individuale della placenta.
-esame esterno dei feti: quanti piccoli sono affetti da malformazioni. Si effettuano esami dei feti a
livello di morfologia, essi vengono divisi in due gruppi:
1-difanizzati con KOH e colorati con rosso alizarina, sbiancamento, rendo i tessuti trasparenti e coloro
lo scheletro con il rosso; per vedere se ci sono malformazioni a carico dello scheletro.
2-fissati per l’analisi viscerale: fissati con formalina ed analisi dei singoli organi e tutti. La sostanza
mantiene l’organo identico com’era e li permette di conservarli e procedere all’analisi.

Questo test definisce la teratogenicità di una sostanza: si valutano quante deviazioni dal normale
sviluppo ho, quanti cuccioli sarebbero nati con ridotto peso, aborti spontanei (gravi aneuploidie,
poliploidie), e si vanno a valutare anomalie e malformazioni.

STUDI DI TOSSICITA’ PERI-E POST-NATALE

La somministrazione della sostanza in esame viene effettuata sulle femmine gravide nel periodo peri-
e post-natale (dal 15o giorno della gestazione fino al 21o dopo il parto).
Serve a coprire il periodo in cui l’embrione si è trasformato in feto, fino alla nascita. Si possono
studiare lo sviluppo funzionale degli organi e gli effetti sul piccolo nato, la conseguenza di esposizione
in utero e durante l’allattamento. Ci permette di avere informazioni sull’ultima fase di gestazione,
allattamento e sviluppo dei piccoli.
-Osservazioni: sviluppo dei neonati, sia fisico che funzionale (comparsa pelo, eruzione incisivi, riflessi
come funzione visiva e capacità coordinamento motorio, sviluppo comportamentale).

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-Informazioni: effetti sull’ultima fase di gestazione, sul parto, sull’allattamento e sullo sviluppo dei
piccoli

STUDIO MULTIGENERAZIONALE:
Si testano 3 livelli di dose, somministrati a 25 ratti di entrambi i sessi/gruppo.
Generazione P: parentali maschi e femmine che vengono esposti in età fertile, prima del concepimento.
Oppure vengono esposti durate tutto il periodo dell’allevamento per simulare un’esposizione più
prolungata. Le femmine gravide continuano l’esposizione durante la gravidanza e l’allattamento.
Piccoli nati: Generazione F1
I neonati vengono esposti in utero e durante l’allattamento, l’esposizione continua con la dieta, e poi
vengono fatti accoppiare.
Piccoli nati: Generazione F2
Esposta in utero e durante l’allattamento, stop allo svezzamento.

Osservazioni ed esami: percentuale di femmine (F1 e F0) che rimangono gravide; il numero di
gravidanze che giungono al termine senza problemi, il numero di neonati per cucciolata, il numero dei
cuccioli nati vivi e dei cuccioli nati morti. I neonati delle diverse generazioni vengono periodicamente
pesati e viene assegnato loro un punteggio indicativo della vitalità .
Informazioni:
-Generazione P: dati sulla fertilità e la gestazione
-Generazione F1: dati su ambiente intra-uterino, allattamento, sviluppo; indicazioni sul possibile
accumulo di sostanze.
-Generazione F2: dati su possibili danni ereditari

TEST DI SCREENING IN VITRO:

Possono essere utilizzati come screening per avere informazioni preliminari ed associarle ai dati
disponibili della sostanza e se ha senso proseguire la sperimentazione.
Vengono utilizzate colture di organi per analizzare corretta morfogenesi e studiare corretta
differenziazione dell’organo.
Possono essere utilizzate anche colture di embrioni di topo e ratto in presenza di siero umano,
ottenuto da pazienti trattati con farmaci, si simula quello che succede in seguito all’esposizione di un
soggetto alla sostanza. Si acquisiscono informazioni sulla tossicità a carico di embrioni. Vengono
valutati: la morfologia, le proprietà funzionali, strutturali ed istologiche.

TOLLERABILITA’ LOCALE
Finalità : valutare se un prodotto medicinale è tollerato in siti dell’organismo che possono venire a
contatto con il prodotto come risultato della sua somministrazione nell’uso clinico o di esposizione
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accidentale o inevitabile. Nel disegno sperimentale si devono considerare: ¨le proprietà chimico-fisiche
del prodotto nella sua formulazione prevista ¨i dati farmacodinamici, tossicologici, farmacocinetici
Vengono effettuati a livello dermico ed oculare. Si valuta come viene tollerato dall’organismo un
prodotto medicinale o si stima un’eventuale esposizione dermica od oculare ad una sostanza in caso di
incidente.
Pomate e colliri sono preparazioni che prevedono un mix e devono essere testate in toto, tutta la
formulazione deve essere testata. Si testa la pomata e il collirio così come sono, prendendo in
considerazione le proprietà chimico-fisiche (pH) e tutte le caratteristiche degli eccipienti e dei principi
attivi contenuti nella formulazione.
Una volta assorbita la sostanza, gli effetti sono monitorati e si può verificare:
-tollerabilità locale
-effetti sistemici del principio attivo.
Assorbimento: quando si parla di contatto con la cute e con l’occhio, quanto prodotto viene assorbito?
I cosmetici non devono contenere sostanze che penetrino oltre un certo livello nel derma. Se
l’assorbimento si devono escludere gli effetti sistemici, perciò non vengono richiesti ulteriori studi.
Non vengono richiesti ulteriori studi anche se il prodotto è assorbito, ma la tossicità sistemica è già
stata studiata adeguatamente.

-test in vivo (Draize): coniglio

-test in vitro validati
I test in vivo sono quasi completamente inutilizzati. Per i test sui cosmetici la sperimentazione animale
è vietata, grosso impulso alla ricerca di metodi alternativi, test in vitro tra cui episkin.
-Preparazione e dose: viene scelta la preparazione sviluppata per l’uomo (veicolo ed eccipienti). La
dose impiegata è quella della sostanza attiva nella preparazione per uso umano

Tollerabilità locale
-tossicità cutanea
-tossicità oculare

TOSSICITA’ CUTANEA
-Cute: epidermide e derma
-Epidermide: epitelio pavimentoso stratificato (strato corneo, strato lucido, strato granuloso, strato
spinoso, strato basale) Cheratinociti, melanociti, cellule di Langherans.
-Derma: lamina di tessuto connettivo, vasi sanguigni e formazioni nervose, apparati piliferi e
ghiandolari.
-Ipoderma: strato di connettivo lasso ricco di fibre elastiche
Concetto di assorbimento: spalmo la preparazione sulla cute e verrà più o meno assorbita in funzione
di parametri e fattori: permeabilità, tempo di esposizione, concentrazione della sostanza, superficie
cutanea, modalità di applicazione, stato di salute della cute, veicolo. Inoltre bisogna tenere conto della
lipofilia della sostanza, più essa è lipofila più sarà assorbita in maniera efficiente.

Manifestazioni a livello cutaneo:

-irritazione (dermatite irritativa da contatto)
-corrosione: sostanze basiche, danno necrotico
-acne, cloracne: esposizione alle diossine, tossicità indotta da accumulo nei tessuti esposti
-ipersensibilità : dermatite allergica da contatto, dermatite atopica
-alterazione nella pigmentazione: ipo-iper pigmentazione
-fototossicità : esposizione alle radiazioni solari

Irritazione: fenomeno infiammatorio reversibile a seguito dell’esposizione sostanze acide. Cute più o
meno irritata, il grado viene valutato in seguito a somministrazione singola ad intervalli precisi.
Corrosione: danno tissutale irreversibile, sostanze basiche. Necrosi, danno profondo del tessuto

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Fasi sperimentali: test Drize
L’animale scelto è il coniglio perché è di facile stabulazione ed è di dimensioni tali da permettere
l’osservazione sulla stessa superficie in cui è avvenuta l’applicazione in maniera efficiente. La sostanza
viene applicata sulla schiena divisa in zone e si controlla l’effetto paragonandola ad una zona non
trattata. Si considerano almeno 3 animali.
Dose: 0,5 ml di liquido o 0,5 g di solido applicati sulla cute rasata con un bendaggio semi-occlusivo
(esposizione: 4h) , per favorire l’assorbimento della sostanza applicata. La differenza la fa il fatto di
avere la cute coperta o meno; fasciare la zona permette un maggior contatto con la sostanza e crea un
ambiente umido e caldo che favorisce assorbimento della pomata. L’osservazione dura fino a 14 gg
osservando effetto a diversi intervalli di tempo. Osservo ad intervalli più ravvicinati e poi
quotidianamente (valutazione di eritema ed edema a 30 e 60 min e 24, 48, 72 h dopo la rimozione del
bendaggio), si dà un punteggio visivamente, è l’operatore che osserva la cute e decide il punteggio a
seconda dell’entità dell’effetto prodotto (punteggio da 0 a 4).
Le zone cutanee sul coniglio possono essere trattate con nulla e fungere da Ctr -, con la sostanza in
studio o con il solvente se è responsabile dell’effetto tossico.
Sono presenti anche Ctr +, vengono trattati con una sostanza che da nota irritazione e si paragonano le
varie zone trattate e in funzione di quanto si reputa grave si attribuisce un punteggio da 0 a 4.
L’animale viene immobilizzato, oppure vengono messi quei collari per evitare di leccare le ferite,
criticato dagli animalisti; stress per l’animale.

TOSSICITA’ OCULARE
Indica l’esistenza di un possibile pericolo derivante dal contatto con l’occhio o membrane mucose.
L’occhio è composto da tantissime parti che possono subire diversamente il danno a seconda
dell’esposizione ed esso può avere conseguenze più o meno gravi.
Prima barriera: cornea e congiuntiva, cornea barriera protettiva sull’occhio che non deve essere
danneggiata.
Congiuntiva: irrorata di sangue, possono manifestarsi infiammazioni e infezioni (congiuntivite),
reazione immediata, la principale.
Altre strutture: iride, cristallino, corpo ciliare e umor acqueo, retina, coroide, nervo ottico (cecità ).

Danni: irritazione e corrosione. Si valuta se la sostanza può costituire un possibile pericolo, se a

contatto con occhio o mucose, producendo IRRITAZIONE o CORROSIONE.
Quando questa tossicità viene valutata, viene valutata come la tossicità cutanea, grado di severità della
manifestazione in seguito a manifestazione singola ad intervalli precisi.

Animale: coniglio, si usano almeno tre animali, iniettando nell’occhio dei quantitativi di liquido che
corrispondono alla posologia o 0,2 ml di liquido.
Le proprietà chimico-fisiche devono essere tenute in considerazione: non vengono valutate sostanze
con pH<2 o pH>11.5
Osservazione: 21 gg e ad intervalli precisi (1, 24, 48, 72 h dopo l’applicazione).
Valutazione: punteggio da 0 a 4 in funzione della gravità del danno che vedo osservando l’occhio
esternamente
Danno: arrossamento evidente e visibile a tutti.

Saggi in vitro di irritazione/corrosione dermale:

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Modelli che utilizzano dischi di pelle di ratto, sacrificati per altri motivi.
Validati dall’ECVAM come test validi ed idonei per irritazione e corrosione a livello dermico.

Transucutaneous electrical resistence (TER) Test Methods

Potenziale corrosivo predetto dagli effetti sulla resistenza elettrica transcutanea della pelle di ratto e
dagli effetti nella penetrazione attraverso la pelle del colorante Sulforodamina B
Test No. 430: In vitro skin corrosion: Transcutaneous Electrical Resistance Test Method

EPISKIN
Coltivazione di cheratinociti umani su una matrice di collagene in condizioni tali da permettere il loro
differenziamento e la ricostituzione di epidermide con strato corneo funzionale. Il potenziale tossico è
predetto dalla capacità di indurre effetti citotossici (MTT).
Test No. 431: In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RHE) test method
Test No. 439: In Vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method
Marchio brevettato dai laboratori Loreal,

Saggi in vitro di irritazione oculare

-HET-CAM (Hen’s Egg Test-membrana corioallonntoidea): membrana che si forma nell’uovo fecondato
di gallina, membrana che è simile alla placenta, che avvolge l’uovo fecondato per proteggerlo e fornire
nutrimento necessario. Concetto di fondo: grande irrorazione come nell’occhio; effetti sulla
congiuntiva li vedo sfruttando questa membrana. Utilizzando uova fecondate si inietta la sostanza
sulla membrana e si vanno a vedere i danni vascolari
-BCOP (bovine cornea opacity and permeability): si valuta se la sostanza è tossica o meno a livello
oculare, se la cornea diventa opaca e permeabile, tanto più diventa opaca e permeabile tanto maggiore
è il danno.
Si espiantano le cornee dagli occhi dei bovini macellati, esse vengono messe su una camerina in cui si
hanno dei blocchi di plastica che tengono ferme le cornee e si applica la sostanza. Successivamente si
valuta se è più o meno opaca o permeabile.

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