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UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI MODENA E REGGIO EMILIA

Dipartimento Di Scienze Della Vita

CORSO DI LAUREA DI PRIMO LIVELLO IN SCIENZE E TECNOLOGIE


AGRARIE E DEGLI ALIMENTI

GLI ACETI DI CEREALI


ASPETTI MICROBIOLOGICI
E
TECNOLOGICI

Relatore: Laureando:
Prof. Paolo Giudici Santini Giacomo

Anno Accademico 2015 - 2016


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Ringraziamenti

Vorrei ringraziare prima di tutto la mia famiglia che da sempre mi supporta sostenendo le mie scelte
e facendomi forza nei momenti più difficili e condividendo con entusiasmo ogni mio successo.
Inoltre un grazie particolare ai miei compagni di corso con cui ho condiviso esami, ore di studio,
ansie ma grandi soddisfazioni e gioie.
Voglio infine esprimere la mia profonda riconoscenza ai miei amici che da sempre mi sono accanto
e che senza di loro sarebbe tutto più difficile e noioso.

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Indice

1. RIASSUNTO…………………………………………………………………………………………………. 4

2. INTRODUZIONE……………………………………………………………………………………………. 5

2.1 Definizione di aceto…………………………………………………………………………………... 5

3. PROCESSO DI PRODUZIONE DELL’ACETO DI RISO…………………………………………. 8

3.1 Preparazione del Qu………………………………………………………………………………….. 9

3.2 Preparazione del riso………………………………………………………………………………… 9

3.3 Saccarificazione………………………………………………………………………………………… 10

3.4 Fermentazione alcolica…………………………………………………………………………….. 11

3.5 Fermentazione acetica……………………………………………………………………………… 12

3.6 Estrazione dell’aceto………………………………………………………………………………… 12

3.7 Invecchiamento e confezionamento…………………………………………………………. 13

4. I MICRORGANISMI DEL QU…………………………………..……………………………………… 15

4.1 Muffe………………………………………………………………………………………………………….15

4.2 Lieviti………………………………………………………………………………………………………….20

4.3 Batteri………………………………………………………………………………………………………..22

5. CONCLUSIONI……………………………………………………………………………………………….24

6. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI………………………………………………………………………...25

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1. RIASSUNTO

Nella prima parte della tesi triennale ho cercato di affrontare tutti gli aspetti tecnici e produttivi che
riguardano il processo di produzione dell’aceto di riso.
Mentre nella seconda parte dell’elaborato ho analizzato gli aspetti microbiologici del Qu, facendo
attenzione ai vari tipi di microrganismi presenti, al loro metabolismo e soprattutto come
interagissero tra loro, spiegando i meccanismi biologici e chimici di questa interazione simbiontica.
In particolare ho trattato il caso della formazione di biofilm da parte di muffe sulla superficie del
mosto fermentato e la co-aggregazione tra Lactobacillus plantarum ML11-11 e Saccharomyces
cerevisiae, con conseguente formazione di biofilm.

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2. INTRODUZIONE

Gli aceti di cereali sono prodotti alimentari diffusi in tutto il mondo. Le loro origini sono legate
all’introduzione dei processi ossidativi di etanolo derivante dalla fermentazione di cereali di diverso
tipo, dal riso delle zone asiatiche come Cina e Giappone, fino ad arrivare al malto d’orzo delle zone
europee e Stati Uniti orientali. È risaputo che la produzione di aceto risale fin dai tempi degli Egizi,
Sumeri e Babilonesi i quali erano abili nel produrre questo liquido da malto o altri tipi di frutto.
Questo prodotto non ha mai smesso di evolversi, partendo dalle produzioni casalinghe, fino ad
arrivare, come abbiamo oggi, a una produzione industriale vera e propria. In questo lavoro di tesi
sono prese in esame i processi produttivi che caratterizzano l’aceto di riso, approfondendo in
particolare la diversa composizione microbiologica.

2.1. Definizione di aceto

La definizione legislativa di aceto cambia in base al paese preso in considerazione. In Italia la


Legge 82 del 20 febbraio 2006 è intervenuta a disciplinare direttamente la produzione degli
aceti.

1. "La denominazione di «aceto di […]», seguita dall'indicazione della materia prima da cui
deriva, è riservata al prodotto ottenuto esclusivamente dalla fermentazione acetica di
liquidi alcolici o zuccherini di origine agricola, che presenta al momento dell'immissione
al consumo umano diretto o indiretto un'acidità totale, espressa in acido acetico,
compresa tra 5 e 12 grammi per 100 millilitri, una quantità di alcol etilico non superiore
a 0,5 per cento in volume, che ha le caratteristiche o che contiene qualsiasi altra sostanza
o elemento in quantità non superiore ai limiti riconosciuti normali e non pregiudizievoli
per la salute […]" "In deroga al comma 1 del presente articolo, l'aceto di vino è il prodotto
definito dall'allegato I, punto 19, del citato regolamento (CE) nº 1493/1999, contenente
una quantità di alcol etilico non superiore a 1,5 per cento in volume." "I vini destinati
all'acetificazione devono avere un contenuto in acido acetico non superiore a 8 grammi
per litro.”
2. "L'utilizzo delle denominazioni di origine e delle indicazioni geografiche riservate ai vini
nella designazione di un aceto di vino può essere consentito a condizione che
l'elaborazione di quest'ultimo avvenga esclusivamente a partire da un vino a
denominazione di origine per il quale è stata rilasciata la certificazione di idoneità
prevista dall'articolo 13 della legge 10 febbraio 1992, nº 164, o, nel caso di vino ad IGT,
altra documentazione idonea."
3. "Nella preparazione degli aceti è inoltre consentita:
a) l'aggiunta di acqua, purché sia effettuata soltanto negli acetifici;
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b) la decolorazione con il carbone per uso enologico;
c) l'aggiunta di caramello negli aceti diversi da quello di vino."
4. "All'aceto possono essere aggiunte sostanze aromatizzanti, mediante macerazione
diretta o mediante impiego di infusi, nella misura massima del 5 per cento in volume, o
altri aromi naturali come definiti nel decreto legislativo 25 gennaio 1992, nº 107. È
consentito aromatizzare l'aceto di mele con il miele." "L'aceto preparato ai sensi del
comma 1 deve essere posto in commercio con la denominazione di «aceto di […]
aromatizzato» e con l'indicazione della materia prima da cui deriva."
5. Gli aceti "destinati al diretto consumo o impiegati nella preparazione di alimenti o di
liquidi di governo non devono contenere, per litro più di 5 milligrammi di zinco, 1
milligrammo di rame, 0,3 milligrammi di piombo, 1 milligrammo di bromo inorganico, 60
milligrammi di acido borico" e, ad eccezione degli aceti di frutta, "70 milligrammi di
sorbitolo."
In generale si può definire aceto come il prodotto dell’ossidazione da parte di batteri gram – del
genere Acetobacter di etanolo in acido acetico, a partire da un substrato alcolico fermentato.
La reazione generica la si può riassumere in:
CH3CH2OH + O2 → CH3COOH + H2O
la quale si divide in due stadi. Al primo stadio si ha l’ossidazione dell’etanolo in acetaldeide:
CH3CH2OH + ½O2 → CH3COH + H2O
catalizzata dall’enzima alcol deidrogenasi.
Al secondo stadio si hanno due sottoreazioni, in cui nella prima si ha l’ossidazione
dell’acetaldeide a triolo ad opera dell’enzima aldeide deidrogenasi in presenza d’acqua secondo
la reazione:
CH3COH + ½O2 + H2O → CH3C(OH)3
e successivamente avviene un’ulteriore ossidazione con formazione di acido acetico:
CH3C(OH)3 + ½O2 → CH3COOH + H2O.
Il suo uso principale è quello di condimento e conservante per altri alimenti, e in alcuni paesi è
usato come bevanda sanificante. La sua vasta diffusione è probabilmente dovuta al basso costo
di produzione e delle materie prime, in quanto è principalmente ricavato da scarti di produzione,
come ad esempio l’aceto di vino è ricavato dalla seconda torchiatura delle vinacce, più ricca di
tannini e quindi inadeguata alla vinificazione.
Oltre all’aceto di vino ci sono molti tipi di aceto, derivanti da materie prime e da processi di
produzione diversi, come ad esempio l’aceto di riso, di sorgo e di miglio diffusissimi in Cina,
Giappone e nell’Asia orientale, l’aceto di malto e d’orzo, derivati dalla birra, radicati nelle zone
europee e nord americane, oppure l’aceto di palma diffuso principalmente in Africa e nel Sud-
est asiatico.

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Tabella 1: panoramica dei vari tipi di aceti specificando la materia prima di partenza, l’intermedio

e la distribuzione geografica. Da “Vinegars of the world” di P. Giudici e L. Solieri.

Categoria Materia prima Intermedio Aceto Distribuzione geografica


Vegetali Riso Moromi Komesu, Kurosu (Giappone) Est e sud-est asiatico
Heicu (Cina)
Bamboo sap. Bamboo fermentato sap. Aceto di bamboo Giappone, Corea
Malto Birra Aceto di malto Nord Europa, USA
Palma sap. Vino di palma sap. Aceto di palma Sud-est asiatico, Africa
Orzo Birra Aceto di birra Germania, Austria, Olanda
Miglio Koji Aceto nero Cina, est Asia
Grano Koji Aceto nero Cina, est Asia
Sorgo Koji Aceto nero Cina, est Asia
Tea e zucchero Kombucha Aceto di kombucha Russia, Asia
Cipolla Alcool di cipolla Aceto di cipolla Est e sud-est asiatico
Pomodoro - Aceto di pomodoro Giappone, est Asia
Zucchero di canna Succo di zucchero di canna fermentato Aceto di canna Francia, USA
Basi Sukang iloko Filippine
Kibizu Giappone
Frutta Mela Sidro Aceto di sidro USA, Canada
Uva Uva passa Aceto di uva passa Turchia e Medio Oriente
Vino rosso o bianco Aceto di vino Molto diffuso
Vino di sherry Aceto di sherry Spagna
Mosto cotto Aceto balsamico Italia
Noce di cocco Latte di cocco fermentata Aceto di latte di cocco Filippine, Sri Lanka
Dattero Succo di dattero fermentato Aceto di dattero Medio Oriente
Mango Succo di mango fermentato Aceto di mango Est e sud-est asiatico
Dattero rosso Succo di jujube fermentato Aceto di jujube Cina
Lampone Succo di lampone fermentato Aceto di lampone Est e sud-est asiatico
Ribes nero Succo di ribes nero fermentato Aceto di ribes nero Est e sud-est asiatico
Mora Succo di mora fermentato Aceto di mora Est e sud-est asiatico
Gelso Succo di gelso fermentato Aceto di gelso Est e sud-est asiatico
Prugna Umeboshi e succo di prugna fermentato Ume-su Giappone
Mirtillo Succo di mirtillo fermentato Aceto di mirtillo Est e sud-est asiatico
Cachi Succo di cachi fermentato Aceto di cachi Corea del sud
Kakisu Giappone
Animali Siero Siero fermentato Aceto di siero Europa
Miele Vino di miele diluito, tej Aceto di miele Europa, America, Africa

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3. PROCESSO DI PRODUZIONE DELL’ACETO DI RISO

Prima di tutto gli aceti di riso possono essere suddivisi in due categorie in base al colore
che li caratterizza: uno di colore chiaro impiegato in cucina quotidianamente ed uno di colore
scuro usato come integratore alimentare o per cure mediche. A queste stesse categorie
appartengono inoltre numerose e diverse tipologie, ovvero prodotti intermedi, ai quali è
attribuito il nome generico di aceto di riso.
In Giappone gli aceti di riso prendono il nome di kurosu e di komesu, i quali si
differenziano fondamentalmente dal riso di partenza: il kurosu è preparato con un riso pulito
e sbiancato, mentre per il komesu si utilizza risone o chicchi con glumella. Le fasi principali
del processo di produzione si distinguono in 3 parti: la saccarificazione del riso, la
fermentazione alcolica e l’ossidazione acetica. In particolare quest’ultima può essere
effettuata secondo il metodo tradizionale, mediante l’uso di culture di superficie statiche,
oppure mediante colture sommerse. L’aceto ottenuto, chiamato moromi, viene
successivamente trasferito in cisterne o barili di legno, dove nel corso di un mese i batteri
acetici completano l’ossidazione. Il kurosu, di un colore chiaro e con un’acidità contenuta,
viene utilizzato come condimento abbinato a pesce e verdure, mentre il komesu, più scuro
e molto più ricco di aminoacidi e vitamine, è apprezzato come bevanda diluito in acqua.
Per quanto riguarda i processi produttivi dell’aceto di riso, si possono distinguere otto fasi
principali:
 Preparazione del Qu;
 Preparazione del riso;
 Saccarificazione del riso;
 Fermentazione alcolica;
 Fermentazione acetica;
 Estrazione dell’aceto;
 Maturazione;
 Confezionamento.

Naturalmente a seconda dell’aceto che si vuole ottenere ci saranno degli accorgimenti sul
processo come ad esempio la scelta del riso e la sua lavorazione, ecc.

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3.1 Preparazione del Qu

Il Qu (o koji in giapponese) si può definire come una coltura starter ottenuta dalla fermentazione
di cereali o legumi in cui la composizione microbica è molto eterogenea grazie alle materie
prime, la temperatura, il tasso di umidità e i rinnovi. In particolare troviamo una grande varietà
di muffe come Aspergillus spp., Rhizopus spp., Mucor spp. Più precisamente quando si ha la
prevalenza del Monascus si ha il Qu di colore rosso che viene conferito anche all’aceto risultante.
La loro attività idrolizzante è fondamentale perché, scomponendo le molecole complesse
derivate dai vegetali grazie all’azione di enzimi idrolitici (amilasi, glucoamilasi, tannasi, proteasi,
lipasi, ecc.), permettono ai lieviti e alla flora batterica di prosperare consumando le molecole
semplici formatisi. Fra i batteri si riscontrano la presenza del genere Lactobacillus e Bacillus ma
ancora non è stato definito il loro ruolo.
Il Qu viene prodotto e mantenuto nello stato disidratato, una parte viene aggiunto al riso prima
della fermentazione alcolica e la restante viene utilizzata come coltura starter per produrre
nuovo Qu.

Figura 1: Da Qu disidratato A) e serie di mattoncini Qu B).

3.2 Preparazione del riso

Il riso è una pianta erbacea annuale la cui altezza varia molto in funzione della varietà e della
fertilità del suolo, è ricca di radici, foglie verde chiaro che come una guaina avvolge parzialmente
il fusto. Da un punto di vista botanico l’infiorescenza è una pannocchia che comunemente è
definita, sbagliando, spiga. Il frutto è una cariosside ellittica più o meno allungata e con glumette
aderenti. La cariosside, prima di essere destinata all’alimentazione umana, è liberata dalle
glumette e lavorata fino per dare il chicco di ben noto aspetto.

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Le principali varietà di riso coltivato appartengono a due specie: Oryza sativa, e Oryza glaberrima,
rispettivamente di origine asiatica ed africana.
Secondo alcuni autori la specie O. sativa, nelle due
sottospecie O. sativa var. indica e O. sativa var.
japonica, deriverebbe dalla specie selvaggia asiatica
Oryza rufipogon . Inoltre la specie O. sativa secondo
alcuni comprenderebbe cinque gruppi, mentre
secondo altri sarebbe formata da tre soli gruppi,
caratterizzati dalle dimensioni del seme: le varietà di
Oryza sativa giapponesi a seme corto (japonica" o
"sinica); quelle a seme lungo (indica) esemplificate dal
“Basmati”; infine quelle a chicco di lunghezza variabile
(javanica). In complesso, le varietà coltivate di riso
sono moltissime, tanto che la più ampia collezione,
l“International Rice Research Insitute”, ne conta ben
Figura 2: piantagione di Oryza sativa
100.000.
Fotografia presa da pagina http/ www.qjure.com
Il risone è costituito dalle cariossidi ancora grezze e
vestite che risultano subito dopo la trebbiatura; esso diventa commestibile solo dopo una serie di
operazioni chiamate sbramatura, sbiancatura e lucidatura. La sbramatura serve ad eliminare dal
risone le glume e le glumelle, ossia le leggere lamelle vegetali che avvolgono il chicco, avendo cura
di evitare il più possibile le rotture. La sbiancatura consiste nella eliminazione della pellicola interna
con l’uso di macchine costituite da coni rotanti che determinano lo sfregamento dei chicchi sui coni
e fra di loro. Il risultato è il riso bianco a cui può seguire la lucidatura, il passaggio dei chicchi su coni
rivestiti di cuoio che li rendono bianchi e levigati. Il riso può essere confezionato e venduto, oppure
subire due ulteriori operazioni alternative: la brillatura viene effettuata per rendere il chicco di riso
più bianco e più brillante trattandolo con glucosio e talco, ma così facendo si rimuove la vitamina
B1; o il trattamento con oli vegetali ed il riso prende il nome di caolino. In cucina è molto diffuso
l’uso del riso “parboiled” perché molto resistente alla cottura e ciò è dovuto ad un trattamento di
parziale gelatinizzazione dell’amido e denaturazione delle proteine. I cultori del riso non lo amano
perché lo ritengono sensorialmente inferiore.

Figura 3: Diagramma di lavorazione del riso.

Fotografia presa da pagina http/www.cialombardia.org

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Figura 4: Differenze tra riso sbramato, sbiancato e brillato.

Fotografia presa da pagina http/www.spazioprever.it

3.3 Saccarificazione

Questa fase ha lo scopo di rompere le proteine e gli amidi presenti all’interno dei chicchi di riso.
Il riso lavorato o grezzo, in funzione del tipo di aceto da ottenere, è grossolanamente sminuzzato
ed ammollato in acqua per circa 12 – 24 ore in funzione della stagione e viene cotto a vapore in
particolari panieri. L’azione principale del trattamento con vapore è la gelificazione dell’amido
che viene così più facilmente idrolizzato dagli enzimi. Il riso cotto viene miscelato con una
quantità definita di Qu, idratato e messo in speciali otri di ceramica a fermentare. In questa fase
è solito aggiungere una coltura di lievito (S. cerevisiae) a rinforzo della popolazione presente,
prevalentemente rappresentata da ceppi delle specie Saccharomyces cerevisiae, Hansenula
anomala, e Candida berkhout.

Figura 5: panieri contenenti riso dopo la saccarificazione. Fotografia presa da pagina http/www.japansociety.org

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3.4 Fermentazione alcolica

La fermentazione alcolica è una forma di metabolismo energetico che converte il glucosio in etanolo
e anidride carbonica e che avviene grazie all’azione di vari lieviti (S. cerevisiae, S. oryzae) in assenza
di ossigeno. Una volta liberato l’amido all’interno dei chicchi grazie alla saccarificazione dunque, ha
inizio il processo. La fermentazione si svolge in due fasi:
I. la prima fase si svolge con la scissione degli zuccheri complessi ad opera di enzimi invertasi
in monosaccaridi come il glucosio;
II. la seconda è caratterizzata dalla via glicolitica che trasforma il glucosio in piruvato. L’assenza
di ossigeno impedisce poi il normale susseguirsi dei fenomeni aerobici, favorendo così la
fermentazione del piruvato in etanolo.
È importante aggiungere che la fermentazione è un processo esotermico e questo è di fondamentale
importanza perché se non si controlla può provocare un aumento della temperatura tale da
compromettere la qualità del prodotto. Infatti il calore che si sviluppa durante la fermentazione
alcolica non dissipa molto facilmente negli spessi otri di ceramica, per cui si rendono necessari
travasi giornalieri del liquido dal un otre ad un altro vuoto per mantenere la temperatura di circa
28° C fino a che la fermentazione rallenta e non è più necessario raffreddare il liquido. Con questa
azione infatti, si impedisce l’evaporazione dell’etanolo e si ha un miglioramento dell’aria contenuta,
due fattori essenziali per una corretta ossidazione acetica. Il prodotto ottenuto alla fine della
fermentazione è il vino di riso (Pei in cinese) che successivamente viene acidificato in otri dello
stesso tipo e riempite con pula di riso, lo scarto che si ottiene dalla sbiancatura, per permettere un
aumento della porosità, fattore a favore dell’assorbimento dell’ossigeno e per il raffreddamento del
Pei.

Figura 6: vino Pei in fermentazione

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3.5 Fermentazione acetica

In questa fase si ha l’azione dei batteri acetici presenti nel Qu, i quali ossidano in presenza di
ossigeno atmosferico l’etanolo in acido acetico. La fermentazione acetica viene attuata in coltura
sommersa o su strato solido. Lo strato solido è costituito da pula di riso e sulla quale viene versato
il vino di riso in quantità tale da bagnare la pula senza dare continuità al liquido nel recipiente. La
pula viene periodicamente rivoltata, di solito una volta al giorno, con tre effetti principali, aerazione
e raffreddamento della massa, ridistribuzione del vino di riso sulla pula. In presenza di ossigeno, i
batteri acetici hanno una intensa attività metabolica e la temperatura si stabilizza intorno ai 38 - 40°
C, il processo termina rapidamente ed alla fine del quale gli otri vengono chiusi ermeticamente e
lasciati riposare per una decina di giorni.
PQQ PQQH2 PQQ PQQH2

CH3-CH2OH CH3-CH=O CH3-C-OH=O

etanolo Alcol deidrogenasi acetaldeide Aldeide deidrogenasi acido acetico

Figura 7: schema della fermentazione acetica. Fotografia presa da pagina http/www.page.unina.it

3.6 Estrazione dell’aceto

La pula di riso, intrisa di aceto, è posta in vasche di percolazione per raccogliere l’aceto che si libera
per gravità, seguono tre lavaggi successivi con quantità definite di acqua o di aceto di lavaggio di
fermentazioni precedenti, dando origine a diversi tipi di aceto: di primo, secondo e terzo livello. In
pratica, il secondo ed il terzo livello vengono impiegati per lavare la pula non ancora lavata delle
fermentazioni successive: I diversi tipi di aceto così ottenuti sono poi miscelati in proporzioni
definite, salati e messi ad invecchiare in otri esposte alle intemperie.
Il sale viene aggiunto in quantità di circa 2-5% rispetto al peso dell’aceto Pei che, oltre che
insaporirlo, ha una forte azione inibente sui batteri acetici, i quali interrompono l’ossidazione
dell’acido acetico in CO2, mantenendone il livello stabile.

3.7 Invecchiamento e confezionamento

L’aceto, chiuso ermeticamente in otri di ceramica per diversi mesi o anni, va incontro a
trasformazioni chimico fisiche che portano a forti modificazioni sensoriali. In particolare si ha la
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formazione di pigmenti colorati, probabilmente melanoidine, macromolecole di peso molecolare
che si aggira intorno ai 5000-40000 U, o di altri polimeri che assorbono nel visibile.
Contemporaneamente si ha una sedimentazione di tutto il particolato e l’aceto risulta brillante e
pulito. Questa procedura, detta percolazione, consiste nell’aggiungere all’aceto Pei dell’acqua per
dissolvere i componenti insolubili come zuccheri, amminoacidi e altri metabolito. Questa procedura
viene svolta tre volte da cui si ottiene l’aceto di primo, secondo e terzo livello a seconda del numero
di diluizioni. Dall’aggiunta dell’aceto di secondo livello in aceto Pei si ricava quello di primo livello,
dall’aggiunta dell’aceto di terzo livello ai solidi residui si ottiene l’aceto di secondo livello e infine
dall’aggiunta di acqua ai residui della fase precedente si ottiene l’aceto di terzo livello. Ecco uno
schema di come può essere la progressione del processo.

Aceto di secondo livello Aceto di terzo livello Acqua

Aceto di primo livello Aceto di secondo livello Aceto di terzo livello

Step 1 Step 2 Step 3

Figura 8: diagramma di flusso della percolazione dell’aceto. Immagine presa da Cereal vinegars by solid-state fermentation in China

Fusheng Chen, Li Li, Jiong Qu, Chunxu Chen

Prima del confezionamento e della filtrazione, l’aceto può essere ulteriormente addizionato di
aromatizzanti, spezie, zucchero di riso, salsa di soia o altro.
Inoltre quando i valori di acido acetico e altri componenti si sono regolati durante l’invecchiamento
si effettua una sterilizzazione a una temperatura di 80° C.

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4. I MICRORGANISMI DEL QU

Come si è accennato precedentemente, il Qu è la coltura starter eterogenea di microrganismi


ottenuta dalla fermentazione di cereali e legumi. In questo capitolo si cercherà di approfondire quali
microrganismi sono coinvolti, a seconda del tipo di aceto che si desidera ottenere, e qual è il loro
ruolo nel processo di fermentazione.
Visto che il Qu è un insieme eterogeneo di microrganismi, cominciamo con il dividerli in:

 Muffe;
 Lieviti;
 Batteri.

4.1. Muffe

Le muffe sono microrganismi pluricellulari appartenenti al regno dei funghi.


Come gli altri funghi l’apparato vegetativo di una muffa è costituito normalmente da ife che nel loro
insieme formano il micelio. Le muffe si riproducono per spore, che possono avere origine sia
sessuata che asessuata e vengono diffuse prevalentemente con l’aria.
Le spore di origine asessuata sono le più comuni; esse comprendono spore di diverso tipo, ma la
forma più comune è rappresentata dai conidi.
Dalla germinazione delle spore prende origine un micelio che, in un opportuno substrato, si sviluppa
tendenzialmente in modo radiale. In condizioni nutrizionali difficili, si verifica spesso il fenomeno di
anastomosi delle ife, cioè di fusione delle ife di differenti miceli per consentire la sopravvivenza del
fungo.
Le muffe necessitano prevalentemente di condizioni di umidità elevata; l’umidità è indispensabile
alla germinazione delle spore, ma è anche un fattore importante nello sviluppo del micelio e nella
produzione delle spore. Per quanto riguarda la temperatura le muffe sono normalmente mesofile e
richiedono in genere una temperatura tra i 15 e i 30 °C con una temperatura ottimale che oscilla
intorno ai 20-25 °C. Sono organismi aerobi e la maggior parte predilige un pH tra 4 e 8 anche se
alcuni funghi possono sopportare un pH decisamente acido o nettamente alcalino.
La maggior parte delle muffe, come i batteri e i lieviti, è inibita da una concentrazione salina
elevata, superiore al 2,5% ma diverse specie (muffe alofile) possono svilupparsi a concentrazioni
zuccherine molto elevate (muffe osmofile), come nelle marmellate.

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Il ruolo delle muffe nel Qu

Il Qu è la fonte più importante di muffe per la preparazione di aceti di cereali. La loro azione idrolitica
è fondamentale per la conversione di sostanze complesse in molecole più semplici.
Questo è possibile grazie all’azione idrolitica dei loro enzimi i quali scindono le macromolecole in
molecole più piccole permettendo ai lieviti e ai batteri di utilizzarli come nutrimento. Infatti le muffe
secernono grandi quantità di amilasi, glucoamilasi, proteasi, lipasi e tannasi che svolgono ruoli
importanti nell’idrolizzare l’amido e le proteine in molecole minori come destrine, glucosio e
amminoacidi, che forniscono le fonti nutrizionali per i lieviti durante la fermentazione di etanolo.
Infatti avendo bisogno di operare in condizioni di aerobiosi, formano insieme ai batteri acetici una
pellicola di biofilm in superficie creando così le condizioni di anaerobiosi all’interno del vaso,
fondamentale per il processo di fermentazione alcolica. (fig. 9/A)

Figura 9:
formazione di biofilm da parte di muffe A) e successivamente da batteri acetici B). Immagine presa da “Significance of microbial symbiotic coexistence
in traditional fermentation” di Soichi Furukawa, Taisuke Watanabe, Hirohide Toyama, and Yasushi Morinaga.

A seconda del tipo di Qu che si utilizza nella produzione si trovano tipi di muffe diverse che ne
compongono la microflora. Ad esempio nel Da Qu, utilizzato per la produzione di aceto Shanxi
invecchiato, si ha una prevalenza di Absidia spp. e di Mucor spp., utilizzando orzo, grano e piselli. Il
Mai Qu, originale del nord della Cina, viene fatto con il grano, assumendo la classica forma di
mattone e il suo microrganismo principale è Aspergillus spp. Xiao Qu è prodotto nel sud della Cina
ed è fatto con riso e lolla di riso in una forma a forma di uovo e il suo microrganismo principale è
Rhizopus spp. Hong Qu, chiamato anche lievito di riso rosso o riso fermentato rosso, è fatto di riso
in una forma sciolta e il microrganismo principale è Monascus spp. Fu Qu, sviluppatosi solo in questi
ultimi anni, è fatto con crusca di frumento inoculando una coltura pura di Aspergillus spp.
Gli aceti di cereali cinesi possono essere prodotti dalla fermentazione allo stato solido (SSF) o una
fermentazione allo stato liquido (LSF), ma la maggior parte di loro, soprattutto gli aceti tradizionali
cinesi, sono prodotte da processi SSF. SSF si riferisce alla crescita dei microrganismi su substrati solidi
umidi senza o quasi assenza di acqua a flusso libero. È ampiamente usato fin dai tempi antichi
nell'industria alimentare orientale per la produzione di distillato, vino di riso, salsa di soia, farina di
fave di soia fermentato, e altri alimenti fermentati locali della Cina. Negli ultimi anni SSF ha

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dimostrato di essere molto promettente per lo sviluppo di diversi bioprocessi e dei prodotti, come
gli enzimi industriali e metaboliti. Rispetto al LSF, chiamata anche come fermentazione sommersa,
SSF è considerata la tecnica più adatta e utile per la produzione di beni alimentari e industriali, a
causa dei bassi requisiti tecnologici ed energetici, utilizzando a buon mercato prodotti agricoli non
raffinati come substrati, investimenti di capitale e costi operativi moderati, elevata produttività e
una lavorazione asettica meno rigorosa.
In base al tipo di microrganismo in questione, i processi SSF possono essere classificati in due
principali gruppi:

 SSF naturali, detti indigeni;


 SSF a coltura pura, che possono essere singole o miste.
Le SSF naturali sono molto utilizzate nel compostaggio e negli insilati, mentre le SSF a coltura pura,
come ad esempio colture di koji con Aspergillus oryzae, sono utilizzate in processi industriali SSF per
migliorare il controllo di utilizzazione del substrato e della formazione del prodotto finale.
La selezione di un microrganismo è uno dei criteri più importanti in SSF.
La maggior parte dei microrganismi selvatici infatti sono incapaci di produrre rese
commerciabilmente accettabili a livello industriale.
L’importanza può risultare dal fatto che una coltura di A. niger può produrre più di 19 tipi di enzimi
(tabella 2/a) mentre solo α-amilasi può essere prodotta da 28 tipi diversi di coltura (tabella 2/b).
1. α-amilasi 11. Lipasi
2. β-amilasi 12. Cellulasi
3. Maltasi 13. Amidasi
4. Lattasi 14. Glucosio ossidasi
5. Catalasi 15. Glucosio diidrogenasi
6. Proteinasi 16. Ureasi
7. Triasi 17. Insulasi
8. Tannasi 18. Melibasi
9. Dipeptilasi 19. Zimasi (tracce)
10. Polipeptilasi
Tabella 2/a: enzimi prodotti da Aspergillus niger. Immagine presa da “Recent Process Development in Solid-State Fermentation”, Ashok Pandey.

1. Bacillus acidocaldrius 15. Thermonospora viridis


2. B. amyloliquefaciens 16. Pseudomonas saccharophilus
3. B. caldolyticus 17. AspergilIus awamori
4. B. coagulans 18. A. batatae
5. B. licheniformis 19. A. candidus
6. B. mesentericus 20. A. niger
7. B. stearothermophilus 21. A. oryzae
8. B. subtilis 22. A. terricola
9. Other Bacillus spp. 23. A. usmii
10. Eacteroides amylophilus 24. Mucor meihei
11. Closiridium acetobutylicum 25. M. pusillus
12. Thermoactinomyles vulgaricus 26. Neurospora crassa
13. Thermonospora curvata 27. Peniciliium expansum
14. T. vulgaricus 28. Rhizopur javanicus

Tabella 2/b: differenti culture da cui si può ricavare α-amilasi. Immagine presa da “Recent Process Development in Solid-State Fermentation”, Ashok
Pandey.

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Diversi gruppi di microrganismi possono crescere su substrati solidi. Funghi filamentosi ad esempio
hanno la capacità di crescere con un’attività dell’acqua ridotta. La coltivazione di questi funghi è
usata molto a scopi laboratoristici, ad esempio per la fermentazione di koji, per la fermentazione
della cellulosa, per spore fungine, e produzioni di micotossine.
Tra questi spiccano tre classi, i phycomycetes (Mucor e Rhizopus), gli ascomiceti (Aspergillus e
Penicillum) e i basidiomiceti (funghi del marciume bianco e polyporus). La figura 10 illustra i vari
microrganismi utilizzati negli ultimi anni nel processo di SSF.

Microorganism Process/product substrate


Aspergillus spp. Protein enrichment Starchy raw materials

Aspergillus niger Protein Banana waste


Koji for ethanol Corn
Growth and kinetic Cassava
studies
Aflatoxins Cassava
Protein, cellulase Corn cob
Cellulase, beta Bagasse, corn cobs,
glucosidase sawdust, computer
Protein enrichment and cards
growth studies Citrus peel
Amylase
Glucoamylase Wheat bran
Glucoamylase Wheat bran
Wheat bran
Aspergillus phoenicis Beta glucosidase Sugar beet pulp
Aspergillus oryzae Alcohol, aldehydes, Rice
ketones
Aspergillus terreus Protein Sugarcane by-products

Aspergillus flavus Protease Wheat bran

Aspergillus carbonarius Pectinase Wheat bran

Aspergillus niveus Catalase Wheat bran

Rhizopus oligosporus Kinetic studies Cassava


Kinetic studies Cassava
Protein food Chickpea
Growth studies Soyabean
Rhizopos oryzae Protein Cassava

Rhizopus oligosporus and Rennet Wheat bran


Mucor meihei
Trichoderma viride Cheese aroma Agar

Trichoderma viride Protein Sugar beet pulp


Hydrolase enzymes Wheat bran
Trichoderma reesei Hydrolase enzymes Wheat bran

T. reesei and yeast Protein Cassava

T. viride and A. niger Growth and kinetics, Sugar beet pulp


cellulase and amylase
T. reesei and Endomycopsis Protein Wheat straw
jibuleger
T. reesei, Chaetomium Protein Wheat straw
cellulolyticum, Candida utilis
Trichoderma spp., A. ustus, Cellulase, beta Wheat bran and rice
Botritis spp. and Sporotriehum glucosidase, xylanase straw
pulverulentum
T. viride, S. thermophile and Growth studies Sugar beet pulp
Thermoascus auranticus
T. reesei and Fusarium Protein Sugar beet pulp
oxysporum
T. reesei, A. terreus, Protein Wheat Pollard and bran
Chaetomium virescens and
Shizophyllum commune
Penicillium spp., Geotrichum Lipases Wheat bran
candidum, Mucor meihei,
R. arrhizus and R. delemer
Penicillium roqueforti Growth studies Buckwheat seeds
Growth studies and Inert porus

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spore production

Penicillium capsulatum Enzyme Sugar beet pulp

Penicillium chrysogenum Penicillin Bagasse

PenicilIium resticulosum Proteins and hydrolase Wheat bran


enzymes
Penicillium charlesii, Pectic enzymes Citrus pulp pellets
Talaromyces flavus and
Tubercularia vulgaris

Tabella 3: tratta da “Recent Process Development in Solid-State Fermentation”, Ashok Pandey.

Figura 10: processo di fermentazione allo stato solido.

4.2. Lieviti

I lieviti sono funghi monocellulari generalmente di forma sferica, ovoidale o ellittica. Alcuni lieviti
come certe specie appartenenti alla famiglia delle Saccharomycetaceae, in particolari condizioni
nutritive tendono a formare un micelio costituito da più ife, ma le quali tendono a disgregarsi
facilmente in singole cellule indipendenti.
La cellula dei lieviti, come quella degli altri funghi, è dotata oltre che da membrana citoplasmatica
anche da parete cellulare in cui risiedono diversi enzimi (esoenzimi).
Nel citoplasma sono immersi i vari organuli (nucleo, reticolo endoplasmatico, apparato di Golgi,
ribosomi, vacuoli, mitocondri, ecc.) e vi ritrovano anche i plasmidi, cioè particelle costituite da
filamenti di DNA e quindi portatori di geni che sono indipendenti da quelli contenuti nei cromosomi
nucleari, analogamente a quanto si riscontra nelle cellule batteriche.
I lieviti si riproducono per via sessuata o asessuata. Nella riproduzione asessuata la via più comune
è la gemmazione; poche invece le specie che si dividono per scissione. Nella riproduzione sessuata
si possono avere più modalità differenti: nelle Saccharomycetaceae (Ascomiceti) ad esempio la
riproduzione si attua attraverso una fusione di due normali cellule somatiche. La riproduzione
sessuata comporta la formazione di spore che a seconda che i lieviti siano Ascomiceti o Basidiomiceti
si chiameranno rispettivamente ascospore o basidiospore.
Come tutti gli altri funghi, i lieviti sono organismi eterotrofi e prevalentemente saprofiti. Essi
abbisognano normalmente dell’ossigeno per vivere e moltiplicarsi, ma diverse specie possono
vivere in assenza di ossigeno, fermentando.

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Sono organismi mesofili in quanto la temperatura ottimale per il loro sviluppo e la loro
moltiplicazione si aggira intorno ai 25-30 °C. La maggior parte delle specie non sopportano
temperature oltre i 40-42 °C e alcune forme, come anche Saccharomyces cerevisiae, possono
resistere fino a temperature minime intorno a 0 °C. Allo stato di spore invece resistono fino a -200
°C.
I lieviti prediligono un pH acido; il pH ottimale è compreso tra i 3,5 e i 4,5 con estremi che vanno da
2,5 fino a 7.
Tollerano elevate concentrazioni zuccherine e certe specie possono vivere a concentrazioni
elevatissime anche superiori al 70% (lieviti osmofili).

Il ruolo dei lieviti nel Qu

I lieviti sono fondamentali nel processo di vinificazione del riso. Essi infatti sono i principali
responsabili della fermentazione alcolica, processo anaerobio responsabile della produzione di
etanolo e anidride carbonica dagli zuccheri semplici ottenuti dall’azione idrolitica delle muffe. I lieviti
più usati nella fermentazione alcolica del riso sono Saccharomyces cerevisiae, Hansenula anomala,
e Candida Berkhout.
Il lavoro dei lieviti è molto legato a quello dei Lactobacillus. Infatti sono state studiate colture isolate
di lactobacillus e lieviti da sake moromi e si è scoperto che i lieviti presenti producevano acido
nicotinico necessario per la crescita dei lattobacilli. Si riferì inoltre che colture miste di LAB e lieviti
isolati da sake moromi diminuivano l’attività respiratoria dei lieviti, favorendo la via fermentativa.
Si scoprì infine che alcune specie di lattobacilli e di lieviti, come ad esempio Lactobacillus plantarum
ML11-11 e S. cerevisiae, avevano molta affinità nel formare co-aggregazioni, evitando la formazione
di schiuma e ottenendo così risultati migliori durante il processo di fermentazione.
Questa co-aggregazione è mediata dall’interazione tra la superficie proteica della cellula del
Lactobacillus plantarum ML11-11 e la superficie di mannano delle cellule del S. cerevisiae. Questa
interazione contribuisce significativamente alla formazione di biofilm con un mix di specie differenti.
Si è sperimentata l’attività di co-aggregazione di lieviti a cui sono stati rimossi i geni responsabili
della biosintesi del mannano cercando di chiarire la struttura necessaria del mannano affichè
avvenisse l’unione con lactobacillus plantarum ML11-11. Tra le 12 mutazioni effettuate si è visto che
solo il mmn2 perdeva l’attività di co-aggregazione. Nel mmn2 infatti, il gene codificante l’attività di
attacco della prima ramificazione del mannosio con la catena principale del mannano è eliminato e
quindi il mmn2 non forma ramificazioni. Da questo risultato si è capito che la struttura specifica,
formata dalla catena principale del mannano ai quali sono attaccati residui di mannosio, è cruciale
per la co-aggregazione con il Lactobacillus plantarum ML11-11 e quindi alla formazione di biofilm.

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Figura 11: struttura del mannano di S. cerevisiae
con relativi geni per la biosintesi. Immagine presa da “Yeast mannan structure necessary for co-aggregation with Lactobacillus plantarum ML11-11”
di Satoru Hirayama, Soichi Furukawa, Hirokazu Ogihara, Yasushi Morinaga.

4.3. Batteri

Per quanto riguarda i batteri dobbiamo prendere in considerazione due tipi fondamentali:
i batteri lattici e i batteri acetici.
I batteri lattici sono Gram +, privi di movimento e non formano spore; essi sono anaerobi o aerobi
facoltativi. Sono i responsabili della fermentazione malolattica nei vini che prevede la
trasformazione di acido malico in acido lattico e CO2 in condizioni anaerobiche.
Essi sono batteri eterotrofi, saprofiti (chemioorganotrofi), prevalentemente a forma di bastoncino
(bacilli) o tondeggianti (cocchi). Le cellule possono essere isolate o unite due a due, oppure a
formare lunghi filamenti (certi lattobacilli).
Per quanto riguarda il pH, buona parte dei batteri lattici si sviluppa bene a pH 7, ma alcune possono
sviluppare anche a pH più bassi, fino a tollerare livelli di pH 3.
Possono vivere a concentrazioni saline maggiori del 2,5% (alofili) e si sviluppano in genere a
temperature comprese tra i 10 e i 52 °C.
I batteri acetici sono procarioti Gram – generalmente appartenenti alla famiglia delle
Acetobacteriaceae che comprende batteri aerobi, il cui metabolismo è di tipo respiratorio e non
fermentativo. Essendo batteri aerobi, il loro sviluppo è strettamente legato alla presenza di aria;
inoltre le condizioni ottimali di sviluppo di questi batteri si hanno ad una temperatura tra i 25 e 30
°C, quindi mesofili (al di sotto dei 10 °C stentano a crescere ed il loro sviluppo si arresta a
temperature inferiori di 5 °C).
Sono marcatamente acidofili in quanto le condizioni ottimali di sviluppo si registrano a pH 4.
Si possono definire chemio-eterotrofi e psicrotrofi.

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Il ruolo dei batteri nel Qu

Come già detto in precedenza, i batteri lattici, provenienti in gran parte dal genere Lactobacillus,
sono molto legati all’attività dei lieviti. La loro attività consiste nel fermentare gli zuccheri
fermentescibili in acido lattico e CO2 e attraverso la fermentazione malolattica trasformano l’acido
malico in acido lattico e anidride carbonica. Attraverso questo processo conferiscono all’aceto un
gusto più morbido, eliminando il sapore pungente e irritante di acido. Si è riferito che il 70/80% di
acido non volatile presente negli aceti cinesi è composto da acido lattico.
Per quanto riguarda i batteri acetici invece il loro destino è più simile alle muffe in quanto avendo
un metabolismo aerobio, formano un biofilm in superficie, ossidando l’etanolo in acido acetico.
Le specie di batteri più usati in SSF possono essere Acetobacter pasteurianus, A. Aceti, A.
liquefaciens, A. rancens, A. hanseii, A. xylinum, e Gluconobacter spp.
È stato riscontrato però che A. pasteurianus può interagire anche con batteri lattici formando un
biofilm. La formazione di questa pellicola è indotta anche dall’esposizione di acido lattico, il quale
induce A. pasteurianus a produrre sulla superficie del mosto in fermentazione contenente acido
lattico, mentre convertono etanolo in acido acetico.
Come notato sopra per le muffe del koji, questo processo costituisce un doppio strato di biofilm di
fermentazione. Questo biofilm formato da un misto di specie potrebbe rivelare un’immobilizzazione
delle cellule durante il processo di fermentazione, come avviene nella produzione di etanolo.

Figura 12: formazione di biofilm da parte di muffe e successivamente da batteri acetici. Immagine presa da “Significance of microbial symbiotic
coexistence in traditional fermentation” di Soichi Furukawa, Taisuke Watanabe, Hirohide Toyama, and Yasushi Morinaga.

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5. CONCLUSIONI

Esistono molteplici tipologie di aceti, ognuno dei quali ha le sue proprietà sensoriali, derivate da
differenze nella composizione della materia prima o microbiologica. Per esempio per quanto
riguarda le materie prime si possono elencare differenti fonti di zuccheri fermentescibili. Altri fattori
caratterizzanti questo prodotto fermentato sono la zona di origine e il processo evolutivo storico
subito. È infatti possibile notare come gli aceti nati in diverse regioni della Cina differiscano non solo
per quanto riguarda le materie prime, ma anche per quanto riguarda il processo di produzione,
utilizzando tempi di fermentazione, temperature e microrganismi diversi.
La sfida odierna nello studio dei microrganismi è quella di ottenere, grazie al miglioramento genetico
e alla selezione, ceppi più efficienti, tendendo ad ottimizzare i processi produttivi senza andare ad
alterare quelle che sono le caratteristiche organolettiche dei prodotti. Al fine di questo presupposto
è importante conoscere le proprietà metaboliche espresse dai microrganismi selezionati. È quindi
necessario studiare il percorso evolutivo che ha caratterizzato il cambiamento dei microrganismi
nella storia del loro utilizzo.
Dal mio lavoro di tesi ho voluto mettere in risalto il rapporto di simbiosi tra microrganismi
totalmente diversi fra loro, accentuando il discorso sui meccanismi in gioco utilizzati da essi, e di
come l’uomo li abbia sfruttati e li sfrutti anche oggi per ottenere un prodotto molto diffuso in tutto
il mondo.

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6. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI

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