DESENVOLVIMENTO DE UM BIOSSENSOR

ELECTROQUÍMICO DE GLICOSE
 Instituto Politécnico de Portalegre
Escola Superior de Tecnologia e Gestão de Portalegre
Licenciatura em Bioengenharia – Ramo Biomédica
3.º Ano – 1.º Sem.

Unidade de Transferência V
Biossensores

Docente: Prof. Rui Pulido Valente

Prof. Luiz Rodrigues

RELATÓRIO
DESENVOLVIMENTO DE UM BIOSSENSOR
ELECTROQUÍMICO DE GLICOSE

Discentes: Ana Jorge, n.º 11665

Isabel Martins, n.º11668
Vanda Alves nº 11396

Fevereiro
2011

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Resumo

Os biossensores assumem grande importância quando nos referimos a

aplicações clínicas dos mesmos. Como dispositivos de diagnóstico clínico, a
comercialização dos biossensores é uma área largamente em voga devido à fácil,
rápida e confiável utilização. Umas das doenças com mais incidência na actualidade
são os diabetes, afectando grande parte da população mundial. Uma maneira de
controlar esta doença é monitorizar o controlo da glicemia através da medição da
concentração dos níveis de glicose no sangue. Para controlar os níveis de glicose
utilizam-se o biossensores enzimáticos, que utilizam enzimas como elementos de
reconhecimento biológico, neste caso a glicose oxidase. A amostra não deve conter
interferentes de maneira que a medição seja efectuada nas melhores condições.

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Índice
Resumo ............................................................................................................................. 2
Índice de Figuras ............................................................................................................... 3
Objectivos ......................................................................................................................... 5
I - Introdução .................................................................................................................... 5
I.I - Biossensor............................................................................................................... 5
I.II. Biossensores Electroquímicos ................................................................................ 7
I.III. Voltametria cíclica ................................................................................................. 9
I.IV. Técnicas de imobilização enzimática .................................................................. 11
I. V Mediadores Electónicos usados em Biossensores ............................................... 16
I. VI- Diabetes Melitus ................................................................................................ 20
I.VII. Glicose Oxidase .................................................................................................. 21
I.VIII. Mel..................................................................................................................... 24
II. Material ...................................................................................................................... 28
III. Procedimento Experimental ...................................................................................... 28
IV. Resultados/ Discussão ............................................................................................... 32
V. Conclusão Primária ..................................................................................................... 33
Anexos I - Marcos da história dos biossensores ............................................................. 35

Índice de Figuras
1Esquema de um biossensor ............................................................................................ 6
Ilustração 2 - Biossensor e os seus elementos ................................................................. 6
Ilustração 3- Principais tipos de Biossensores .................................................................. 7
Ilustração 1 - Representação esquemática do funcionamento de um biossensor
amperometrico ................................................................................................................. 8
Ilustração 1_Represetação de uma célula electroquímica com três eléctrodos ........... 10
Ilustração 4 - Métodos de imobilização enzimática ....................................................... 12

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Ilustração 5- Esquema que mostra a interconversão de PANI entre os estados
oxidativos esmeraldina e leucoesmeraldina e a interconversão entre estados de sal e
base (em azul). ....................................................................................................................
Ilustração 6- Formula geral da Polianilina ...................................................................... 18
Ilustração 7 - Elétrodo a ser lixado ................................................................................. 29
Ilustração 8 - Medição da corrente do eléctrodo........................................................... 29
Ilustração 9 - Medição de HCL para proceder às outras soluções ................................. 29
Ilustração 10 - Pesagem de reagentes............................................................................ 30
Ilustração 11 - Software.................................................................................................. 30
Ilustração 12 - Eléctrodo Final ........................................................................................ 30

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Objectivos
Neste trabalho pretende-se montar um biossensor com transdutor de grafite e
mel como elemento de reconhecimento biológico.
Outro objectivo deste trabalho consiste em testar os biossensores construídos
em soluções e um novo biossensor de glicose utilizando o mel como elemento de
reconhecimento biológico.

I - Introdução

No âmbito da unidade curricular de Unidade de Transferência V e em parceria

com a unidade curricular de Biossensores leccionada pelo professor Luiz Rodrigues foi-
nos proposta a elaboração de um biossensor de glicose.

I.I - Biossensor

Os biossensores são definidos como qualquer dispositivo de detecção que

incorpore tanto um organismo vivo ou produtos derivados de sistemas biológicos
(enzimas, anticorpos, DNA, etc.), como um transdutor que fornece a indicação, sinal ou
outra forma de reconhecimento de uma substância específica no ambiente. [1]
Por outras palavras, os biossensores caracterizam-se como sendo um sensor químico
em que o elemento de reconhecimento é um componente biológico activo, ou seja a
fonte do sinal analítico tem como base um processo bioquímico, reacção estabelecida
entre o elemento de reconhecimento e o componente biológico. Assim sendo a alta
selectividade do biossensor na relação com um determinado analíto revela-se uma das
suas características principais.
A construção de um biossensor baseia-se na comunicação de duas partes: o
componente biológico activo (o elemento de reconhecimento) e um transdutor.
Um biossensor típico apresenta três componentes, o elemento de reconhecimento,
uma estrutura de transdução e um elemento de amplificação.

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 1Esquema de um biossensor
O analíto é parte da amostra que se considera como foco da análise química.
O elemento de reconhecimento biológico reconhece o analíto e reage, ou liga-
se a ele, gerando, por meio de uma reacção bioquímica, um sinal que pode ser produto
da variação de massa, absorção ou emissão de luz, emissão de calor, mudança de
estado de oxidação, libertação de gases.
O transdutor consiste no elemento que possibilita o controlo de um processo
ou fenómeno, ou realizar uma medição, através da conversão de um tipo de sinal
noutro, e objectivamente transformar uma forma de energia noutra. O transdutor é o
detector, que monitoriza a reacção bioquímica iniciada pelo analíto.

Ilustração 2 - Biossensor e os seus elementos

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 No biossensor verifica-se a especificidade do elemento de reconhecimento
biológico para uma determinada espécie em estudo. Em primeiro lugar, ocorre uma
reacção química ou física entre o elemento de reconhecimento e o analíto, após isso
obtém-se o sinal resultado dessa reacção.
Existem diversos tipos de biossensores tendo em conta o seu sistema de
transdução ou o parâmetro medido. De seguida, ilustração 2, encontram-se os
diversos tipos existentes.

Ilustração 3- Principais tipos de Biossensores

I.II. Biossensores Electroquímicos

O biossensor por nós produzido faz parte dos biossensores electroquímicos,

baseiam-se normalmente na catálise enzimática de uma reacção que produz ou
consome electrões, por exemplo as eximas óxido-redutases. Um sistema de
sensioramento electroquímico usualmente contém três eléctrodos, um eléctrodo de
referencia, que mantem o potencial constante, um contra eléctrodo e um eléctrodo de
trabalho, onde ocorre o processo biológico. O composto a ser analisado reage na
surpeficie do eléctrodo de trabalho, e os iões produzidos geram sinal.
Dos sensores electroquímicos o mais utilizado é o biossensor amperométrico
que se baseia na medida de corrente em função do tempo, quando o eléctrodo é
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mantido num potencial apropriado e constante. A mudança da corrente registada é
proporcional à quantidade de espécies electro-reduzidas/oxidadas, ou seja,
proporcional à concentração do analíto. O sinal deste biossensor é gerado pela troca
de electrões entre o sistema biológico na camada biorreceptora e o eléctrodo. A
ilustração mostra os princípios de trabalho de um biossensor amperométrico.

Ilustração 4 - Representação esquemática do funcionamento de um biossensor amperometrico

Biossensores amperometricos têm a vantagem de serem altamente sensíveis,

apresentarem resposta rápida e serem de baixo custo, em comparação aos
biossensores ópticos, calométricos e piezeléctricos. Porém, a contaminação da
superfície do eléctrodo pode causar falhas, o que tem sido evitado com o uso de uma
membrana excluindo interferentes ou sustâncias indesejáveis na reacção. Assim,
permite-se somente a passagem de oxigénio e peroxido de hidrogénio.
Moléculas de O2 (oxigénio) e H2O2 (peroxido de hidrogénio) em contacto com o
eléctrodo de trabalho em potenciais altos, oxidam e/ou reduzem espontaneamente,
gerando um sinal. Usando este principio, pesquisadores constroem eléctrodos com
enzimas oxidases que geram peroxido de hidrogénio detectado com altos potenciais.
Para estes eléctrodos não é conveniente usar membrana selectiva, uma vez que o
substrato (analíto) tem que interagir com a enzima fixada no eléctrodo. Por isso, esses
biossensores estão sujeitos a interferentes de outras espécies electroactivas, tais como
acido úrico e acido ascórbico, que também são oxidadas com altos potenciais. Uma
alternativa para este problema tem sido o uso de outras enzimas, as peroxidases, que
catalisam a redução de H2O2 e possibilitam a transferência de electrões entre o

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subproduto da enzima e o eléctrodo. Esta abordagem, embora apresente boa
sensibilidade e precisão, tem como desvantagem o alto custo e baixa estabilidade,
bem como a limitação na imobilização sobre um substrato sólido.
O problema dos interferentes vem sendo resolvido na últimas décadas com o
emprego de mediadores inorgânicos electroquímicos, que catalisam a oxidação ou
redução do peroxido de hidrogénio. Com mediadores, pode-se operar com um
potencial menor, eliminando os efeitos dos interferentes electroquímicos. Nesta
perspectiva neste trabalho experimental utilizamos o Azul da Prússia, a Polianilina e o
Mel.

I.III. Voltametria cíclica

A voltametria cíclica é uma técnica voltamétrica que pode ser considerada como uma
variação, mais elaborada, da voltametria linear. Embora possa ser aplicada com fins
quantitativos, é mais utilizada como técnica qualitativa. Nesta técnica aplica-se uma
rampa de potencial a um eléctrodo de trabalho, que varia entre um valor máximo e
mínimo de potencial que correspondem ao início e fim do varrimento, em cada um dos
sentidos no potencial. Este gráfico apresenta a forma descrita na Figura seguinte:

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Ilustração 2_Relação potencial-tempo em voltametria cíclica

Durante o varrimento do potencial, o potenciostato, para além de controlar o

potencial do eléctrodo de trabalho (relativamente ao do eléctrodo de referência),
mede a intensidade de corrente resultante dos fenómenos que ocorrem através da
interface.

Ilustração 5_Represetação de uma célula electroquímica com três eléctrodos

A Figura abaixo apresenta um voltamograma típico de transferência iónica em

interfaces líquido-líquido. A partir deste obtém-se os parâmetros mais importantes,

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como os valores da intensidade de corrente para a transferência iónica (Ip+ e Ip-) e o
potencial de pico (Ep+ e Ep-). Esta intensidade de corrente sob a forma de pico surge
quando os processos de difusão são predominantemente lineares.

Ilustração 3_Voltamograma cíclico teórico para uma transferência iónica.

De acordo com a figura anterior em (A) a espécie não se encontra transferida; (B)
Transferência de um catião Aq-Org ou anião Org-Aq; (C) inversão do sentido do
potencial; (D) Transferência de um anião Aq-Org ou catião Org-Aq.

I.I. II Vantagens dos Biossensores

Considera-se como principais vantagens dos biossensores os elevados níveis de
especificidade, boa estabilidade nas condições de operação (temperatura, pH, força
iónica, etc.) e também as condições de armazenamento bem como retenção de
actividade biológica, resposta em tempo útil precisa e reprodutível.

I.IV. Técnicas de imobilização enzimática

Muitas enzimas solúveis são pouco estáveis e retêm sua actividade catalítica
por um breve período de tempo. Imobilizando-as num estado próximo ao seu

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ambiente natural obtém-se enzimas mais estáveis e eficientes. A imobilização de
enzimas é um processo pelo qual se restringe, completa ou parcialmente, os graus de
liberdade de movimento das enzimas pela união destas a um suporte insolúvel.
Espera-se, com isto, um contacto íntimo entre a enzima e o eléctrodo mantendo, ou
aumentando, sua actividade catalítica, maior estabilidade e menor interferência de
compostos indesejáveis.
Em geral, os métodos para imobilização enzimática podem ser classificados em
retenção física, onde a enzima não sofre nenhuma alteração da sua estrutura química,
e em ligação química, onde a enzima é quimicamente ligada ao suporte por ligações
covalentes.

Ilustração 6 - Métodos de imobilização enzimática

I.II.I Métodos de imobilização de enzimas por retenção física

I.II.I.I Adsorção

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 As enzimas unem-se ao suporte mediante ligações fracas como forças de Van
der Waals ou ligações de hidrogénio. Sobre o ponto de vista mecânico, são pouco
estáveis e a união ao suporte é fraca (podendo haver desorção devido à mudança de
temperatura, pH, pelo substrato, solvente ou convecção), porém, o método é o mais
simples e pode ser realizado em condições brandas de imobilização, preservando-se a
enzima (mudança conformacional mínima ou nula). Coloca-se uma gota da solução
aquosa contendo a enzima em contacto com a superfície do suporte que, após seco,
estará pronto para uso.

I.II.I.II Retenção em membranas

A retenção de enzimas em membranas poliméricas foi a primeira técnica
descrita para fabricação de biossensores, onde a enzima foi colocada sobre o eléctrodo
e retida por uma membrana polimérica dialítica. Uma membrana adicional
semipermeável pode impedir elementos interferentes e possibilitar somente a
passagem dos produtos da reacção enzimática.

I.II.I.III Microencapsulamento
Nesta técnica, as enzimas estão envolvidas por membranas semipermeáveis
que permitem a passagem de moléculas de substrato e produto, mas não da enzima;
são de forma esférica com tamanhos entre 1 a 100 µm de diâmetro. A enzima e um
monómero hidrofílico são misturados em solução aquosa e adicionados em solvente
orgânico insolúvel em água. Com a adição de monómero hidrofóbico, inicia-se a
reacção de polimerização, levando à formação de microesferas. Com este método
pode-se encapsular simultaneamente uma grande variedade de enzimas, o que faz
com que reacções que se sucedem em múltiplas etapas possam ser levadas a cabo. Os
principais tipos de membranas utilizadas são: Teflon®, Nafion®, colagénio, acetato de
celulose e policarbonato.

I.II.I.IV Eletropolimerização

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 No método da imobilização enzimática por electropolimerização, um
monómero em solução contendo a enzima, ao polimerizar-se pela acção de um
potencial eléctrico, sofre deposição na superfície do eléctrodo aprisionando
simultaneamente a enzima. O monómero é electricamente oxidado em potencial que
facilita o crescimento de radicais livres do monómero e, este é adsorvido pela
superfície do eléctrodo onde uma série de reacções ocorrem para a formação da
matriz polimérica. O processo será regido pelo potencial do eléctrodo e pelo tempo de
reacção, o que permite o controlo da espessura do filme resultante. Para algumas
reacções de polimerização, devido a acidez do meio, este pode não ser o mais
adequado, pois a enzima pode sofrer desnaturação e ter a actividade catalítica
comprometida.

I.II.I.V Oclusão em matriz polimérica

Neste método, a enzima é retida dentro de uma rede polimérica tridimensional
insolúvel em água. A oclusão pode ser feita em gel (a solução da enzima é misturada a
um monómero, que é então polimerizado a um gel, retendo a enzima), em eléctrodos
de pasta de carbono (a enzima pode ser misturada a uma pasta constituída por pó de
grafite e um óleo e a pasta pode ser misturada a diferentes componentes) e em
polímeros (a enzima pode ser adicionada a um monómero, em solução aquosa, e este
ser quimicamente polimerizado junto com a enzima). A enzima também pode ser
imobilizada dentro de matrizes sólidas porosas.

I.II.II Métodos de imobilização de enzimas por ligação química

Pode-se imobilizar a enzima num suporte, ou eléctrodo, por meio de reacções

químicas deste com grupos funcionais presentes na estrutura proteica, tais como
grupos amino, grupos carboxílicos, grupo imidazol da histidina e etc. Os métodos
químicos incluem ligação covalente e reticulação.

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I.II.II.I Ligação covalente
Este método consiste no uso de grupos químicos do suporte, por meio da
activação da matriz sólida, e consequente a união com a enzima. Dos 20 aminoácidos
que compõem a estrutura enzimática, os mais empregues para se ligarem ao suporte
são principalmente a lisina, cisteína, tirosina e histidina, e em menor grau, a metionina,
triptofano, arginina e os ácidos aspártico e glutâmico. Os restantes, devido ao carácter
hidrofóbico, não se encontram expostos na superfície proteica, e não podem então
intervir nas ligações. A activação da matriz pode consistir em silanização (Pt, vidro,
quartzo), reacção com carboimidas (amidas, nylon®, grafite), glutaraldeído (aminas) e
etc. Para tal método, é necessário conhecer a densidade de grupos funcionais por
unidade de superfície, já que este condiciona o número de uniões enzima-substrato
bem como prevê a posição da enzima na superfície do eléctrodo. O processo de
imobilização pode alterar a estrutura do centro activo inactivando, total ou
parcialmente, a enzima.

I.II.II.II Ligações covalentes reticuladas

Reagentes bi ou multifuncionais, que podem originar uniões intermoleculares
entre as moléculas de enzima, são usados para reagirem com os grupos amino livres
contidos na cadeia proteica, ocorre a formação de uma rede polimérica devido a
formação de ligações covalentes cruzadas entre as moléculas de enzima e/ou um
suporte com grupos funcionais. O agente mais aplicado para este fim tem sido o
glutaraldeído, por possuir baixa toxicidade e baixo custo comparado com os demais
reactivos químicos. O resultado é um reticulado com ligações intermoleculares
irreversíveis capazes de resistir a condições extremas de pH e temperatura e a
solventes orgânicos.

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O reticulado possibilita à enzima resistir a desnaturação por estar mais estável
estequiometricamente. A maior desvantagem é que muitas enzimas são sensíveis ao
acoplamento químico com glutaraldeído, podendo perder sua actividade por
desnaturação.

I. V Mediadores Electónicos usados em Biossensores

I.III.I Polianilina
A polianilina (PANI) é o mais estudado dentre os polímeros conjugados por ser
quimicamente estável em condições ambientes, facilmente sintetizada, altamente
condutora, além de poder ser dopada por protonação, sem que ocorra alteração no
número de electrões associados à cadeia polimérica. Neste sentido, a polianilina é
facilmente convertida nos seus vários estados de oxidação (o nitrogénio do tipo imina
destas espécies pode estar total ou parcialmente protonado). Estes estados de
oxidação diferem, um do outro, pelo número de anéis quinóides, os quais variam de
zero a dois na unidade elementar de quatro anéis, com os demais sendo anéis
benzenóides. A próxima figura mostra os principais estados de oxidação da PANI. A
PANI existe na forma condutora, como sal de esmeraldina, pela protonação da base de
esmeraldina ou pela oxidação parcial da base de leucoesmeraldina.

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 Ilustração 7- Esquema que mostra a interconversão de PANI entre os estados oxidativos esmeraldina e
leucoesmeraldina e a interconversão entre estados de sal e base (em azul).

A PANI pode ser obtida via síntese química com o uso de agentes oxidantes
como K2Cr2O7, H2O2, Cr2O4 ou KClO3, em meio ácido (HCl, H2SO4, DBSA-ácido
dodecilbenzeno sulfúrico). Na electrodeposição, moléculas de anilina são oxidadas a
filme de PANI no ânodo por uma corrente eléctrica em meio ácido. Os electrões são
retirados da cadeia polimérica durante a oxidação e contra-íões, provenientes da
dissolução ácida, na solução são inseridos para balancear a carga eléctrica da cadeia. A
electrodeposição é, portanto, uma reacção interfacial. A via de síntese química é
vantajosa na produção em massa a baixo custo, porém, métodos electroquímicos
oferecem materiais com melhores propriedades de condução em forma de filmes finos
(ou nanoestruturas) devido a dopagem do polímero ser unicamente electroquímica,
sendo que, a quantidade de carga usada na reacção determina o seu grau de
dopagem.
A miniaturização e produção em massa de eléctrodos enzimáticos podem ser
levadas a cabo por deposição electroquímica de camadas de polímeros condutores na
superfície do eléctrodo, independentemente do seu tamanho e forma. Através da
funcionalização dos filmes poliméricos condutores, as superfícies podem ser
apropriadas para a imobilização de enzimas ou mediadores de electrões.

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A fórmula geral da polianilina é apresentada a seguir onde y representa o estado redox
da PANI e x, o grau de polimerização.

Ilustração 8- Formula geral da Polianilina

Por uma reacção reversível de oxiredução, a estrutura da PANI pode variar do

estado totalmente oxidado (pernigranilina), y = 0, passar por um estado de semi-
oxidação (esmeraldina), y = 0,5, à forma totalmente reduzida (Leucoesmeraldina), y =
1. Dessas, somente o sal de esmeraldina é condutora. Com a protonação, a
esmeraldina pode tornar-se electricamente condutora, como sal de esmeraldina,
quando sua coloração muda de azul para verde. A electrodeposição da polianilina em
eléctrodos possui muitas vantagens sobre os métodos tradicionais como revestimento
por imersão (dip-coating), sendo essas vantagens: controlo sobre a espessura do filme,
reprodutibilidade, completo recobrimento da superfície activa, além de promover um
meio para a oclusão da enzima e também de um mediador.
Os polímeros conjugados são facilmente electrosintetizados em eléctrodos
inertes tais como Pt, Au ou C, porém é muito mais difícil gerar os polímeros em
eléctrodos reactivos, como o alumínio. Quando da anodização do eléctrodo de Al há a
formação de óxido (Al2O3) que age como uma barreira, inibindo a transferência de
electrões e o processo de polimerização. Esta barreira também protege o eléctrodo da
sua dissolução. Há, portanto, um processo concorrente entre a formação de óxido e a
electrodeposição.

I.III.II Azul da Prússia

O azul da Prússia, hexacianoferrato férrico, ou do inglês Prussian Blue (PB).
A detecção do H2O2 gerado pela reacção catalítica das enzimas oxidases, é a
principal ferramenta de detecção em biossensores amperométricos, pois a sua
concentração é directamente proporcional à concentração do substrato (analíto) da

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enzima. Apos as de Neff e Italy, a primeira tentativa para estudar o azul da Prússia
como mediador electroquímico de peróxido de hidrogénio foi feita por Boyer e
colaboradores, em 1990 com o eléctrodo de pasta de carbono. Embora esses
eléctrodos tenham demonstrado um bom desempenho analítico, a experiencia
despertou pouco interesse até 1994 quando Karyakin e colaboradores demonstraram
o processo de optimização de PB sobre um substrato sólido aumentando a capacidade
catalítica para H2O2.
Mais tarde foi investigado o peróxido de hidrogénio em diferentes potenciais,
permitindo o uso de eléctrodos modificados com PB (azul da Prússia). Nas condições
óptimas, ou seja, deposição electroquímica de uma camada fina de PB, a detecção de
H2O2 foi muito similar ao obtido com o uso de enzimas peroxidases. Devido À alta
actividade catalítica e selectividade o PB foi considerado uma “peroxidase artificial”. O
potencial de detecção foi baixo o suficiente para evitar efeitos dos interferentes mais
comuns, como acido úrico e acido ascórbico. Após a optimização do PB na detecção de
H2O2, houve grande aumento na aplicação de biossensores com PB. Várias enzimas têm
sido acopladas com Pb, e em todos os caso tem-se verificado um bom desempenho em
termos de limite de detecção e a nível de interferentes, adequado para diferentes
procedimentos amperométricos.

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 I. VI- Diabetes Melitus

A diabetes melitus abrange um leque de doenças metabólicas caracterizadas

por hiperglicemia, que apresenta como consequência incorrecção na secreção de
insulina. A sua descoberta é datada do século XV antes de Cristo. Actualmente, têm-se
o conhecimento que a diabetes se exterioriza de diferentes maneiras, sendo as formas
mais frequentes a diabetes tipo 1, tipo 2 e diabetes gestacional.
A diabetes tipo 1 é o tipo de diabetes mais hostil. Neste tipo de diabetes acorre
uma destruição das células produtoras de insulina, células beta. O organismo
compreende estas células beta como corpo estranhos e começa a destrui-las. É assim
gerada uma resposta imunitária, conhecida por resposta auto-imune. A ciência ainda
não possui uma explicação plausível para este fenómeno, porém factores hereditários
parecem estar ligados ao aparecimento da diabetes tipo 1.
Bem mais comum que o diabetes tipo 1, o diabetes tipo 2 possui um factor de
hereditariedade ainda maior que o primeiro, além da obesidade e sedentarismo,
factores que estão relacionados a esse tipo de diabetes. A maioria dos diabéticos tipo
2 são pessoas obesas, sendo que a maior incidência ocorre após os 40 anos.
A ingestão em demasia de açúcar induz a produção de uma grande quantidade de
insulina; o que leva ao metabolismo de uma quantidade maior de glicose, resultando
em baixos níveis de glicose no sangue (hipoglicemia). A hipoglicemia leva o pâncreas a
se “acomodar” com a não produção de insulina e quando a glicemia se torna alta
novamente (frequente ingestão de açúcar, por exemplo), o pâncreas já não produz
toda a insulina suficiente.
Portanto, a diabetes tipo 2 é caracterizado pela secreção inadequada de
insulina pelo pâncreas; assim sendo, as células não conseguem metabolizar toda a
glicose contida na corrente sanguínea (resistência insulínica).
Por fim, a diabetes gestacional é a alteração das taxas de glicose no sangue que
aparece ou é detectada pela primeira vez na gravidez. A doença pode persistir ou
desaparecer após o parto.

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 Nos estágios mais avançados da doença, a diabetes pode causar cegueira total
(retinopatia), enfarto do miocárdio, paralisação total ou parcial dos rins (nefropatia) e
necrose, o que pode levar a morte do doente.
A taxa de glicemia, dentro dos níveis fisiológicos normais, situa-se entre 80 e
-1 -1
110 mg.dL em jejum e em torno 140 a 200 mg.dL após alimentação. Os níveis de
glicose, acima dos citados acima, caracterizam a pré-disposição à diabetes, sendo
necessário um tratamento preventivo para controlo da glicemia sanguínea. O
acompanhamento clínico do paciente é indispensável para impedir as graves
consequências dessa enfermidade.

I.VII. Glicose Oxidase

A glicose é um carbohidrato do tipo monossacarídeo encontrada em vários

frutos podendo ser obtida industrialmente pela hidrólise do amido. A glicose também
é designada por açúcar do sangue, pois é a forma mais simples de açúcar que circula
nos vasos sanguíneos. A Figura abaixo dá a conhecer a fórmula estrutural da molécula
de glicose. Como é visível na figura a molécula da glicose apresenta seis átomos de
carbono e um grupo aldeído.

Ilustração …Fórmula estrutural da molécula de glicose

No metabolismo do nosso organismo, a glicose faz parte de uma das principais

fontes de energia gerando assim quatro quilocalorias de energia por um grama de

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glicose. No processo de aquisição de energia, uma molécula de glicose é degradada
numa sequência de reacções .
A glicose oxidase é uma enzima que catalisa a oxidação da ß-D-glucose com
formação de d-gluconolactona. A enzima contém um grupo prostético, a flavina
adenina dinucleótido (FAD), que confere à proteína a capacidade para catalisar
reacções de oxidaçãoredução.
A reacção dá-se em dois passos, no primeiro dos quais a coenzima oxidada
sofre uma
redução a FADH2, que é acompanhada pela oxidação da ß-D-glucose a d---
gluconolactona. No segundo passo a flavina reoxida-se por acção do dioxigénio, que,
por sua vez, se converte em peróxido de hidrogénio.

Ilustração …Reacção da glicose oxidase

A ideia de um eléctrodo que na sua estrutura tivesse contida a enzima de

glicose foi proposto em 1962 por Clark e Lyons. O seu primeiro dispositivo consistia de
uma fina camada de glicose oxidase (GOD) incorporada sobre um eléctrodo de
oxigénio (através de uma membrana semipermeável de diálise), onde o oxigénio
consumido é verificado pela reacção catalisada pelas enzimas:

A patente original de Clark aborda o uso de uma ou mais enzimas para

converter substratos electroinactivos em produtos eletroactivos. O efeito de

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interferentes foi corrigido por meio de dois eléctrodos (um coberto com GOD), que
media a corrente diferencial entre os dois electrodos. A tecnologia de Clark foi
posteriormente transferida para Yellow Spring Instrument Company, que lançou em
1975 o analisador de glicose (o analisador YSI modelo 23) para a medição directa da
glicose em amostras de 25 mL de sangue. Updike e Hicks, desenvolveram o este
princípio de usar dois eléctrodos de oxigénio de trabalho (um coberto com a enzima) e
medir a corrente diferencial para a variação da concentração de oxigénio nas
amostras. Guilbault e Lubrano descreveram em 1973 um eléctrodo com uma enzima
para a determinação de glicose no sangue com base na monitorização (anódica)
amperimétrica do peróxido de hidrogénio libertado:

A boa precisão e exactidão foram obtidas em relação a 100 mL de amostra de

sangue. Durante a década de 1980 os biossensores tornaram-se um tópico "quente",
reflectindo a crescente ênfase na biotecnologia. Esforços intensos durante esta década
focavam-se no desenvolvimento de biossensores de mediador baseado em 'segunda
geração ' de glicose, a introdução de tiras comerciais para o auto-monitoramento da
glicose no sangue, o que se verificou que o uso de eléctrodos modificados melhorou o
desempenho do sensor. Na década de 1990 assistimos a uma intensa actividade para o
estabelecimento da comunicação eléctrica entre o centro redox da enzima GOD e a
superfície do eléctrodo, desenvolvendo-se assim dispositivos minimamente invasivos
implantáveis subcutaneamente.
Na figura seguinte podemos visualizar a construção de um biossensor de glicose
tradicional.

Ao longo de mais 40 anos foram desenvolvidos diferentes métodos de

transferência de electrões entre a enzima e o transdutor electroquímico, que permite
diferenciar as seguintes gerações de biossensores:

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Ilustração 4_Configuração dos três tipos de eléctrodos a) primeira b)segunda c) terceira geração

Primeira geração: mede um dos produtos (H2O2) da reacção enzimática.

Segunda geração: incorpora um medidor que facilita a transferência electrónica entre
o sítio activo da enzima e a superfície do eléctrodo.
Terceira geração: realiza a transferência directa entre o sitio activo da enzima e a
superfície do eléctrodo.

I.VIII. Mel

O mel é a substância viscosa, aromática e açucarada obtida a partir do néctar

das flores e/ou exsudatos sacarínicos que as abelhas melíficas produzem.

O seu aroma, paladar, coloração, viscosidade e propriedades medicinais estão

directamente relacionados com a fonte de néctar que o originou e também com a
espécie de abelha que o produziu.

O néctar é transportado para a colmeia, onde irá sofrer mudanças na sua

concentração e composição química, para então ser armazenado nos alvéolos.
Entretanto, mesmo durante o seu transporte para a colmeia, a secreções de várias
glândulas, principalmente das glândulas hipofaringeanas, são acrescentadas,

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introduzindo ao material original enzimas como a invertase (a -glicosidase), diastase (a
e β amilase), glicose oxidase, catalase e fosfatase.

Apesar de o mel ser basicamente uma solução saturada de açúcares e água,os

seus outros componentes, aliados às características da fonte floral que o originou,
conferem-lhe um alto grau de complexidade.

Segundo Campos (1987), a composição média do mel, em termos

esquemáticos, pode ser resumida em três componentes principais: açúcares, água e
diversos. Por detrás dessa aparente simplicidade, esconde-se um dos produtos
biológicos mais complexos. A tabela seguinte apresenta a composição básica do mel.

Segundo Crane (1987), a adição de enzimas pelas abelhas ao néctar irá causar
mudanças químicas, que irão aumentar a quantidade de açúcar, o que não seria
possível sem essa acção enzimática.

A enzima invertase adicionada pelas abelhas transforma 3/4 da sacarose inicial

do néctar colectado nos açúcares invertidos de glicose e frutose, ao mesmo tempo,
que açúcares superiores são sintetizados, não sendo presentes no material vegetal
original. A sua acção é contínua até que o "amadurecimento" total do mel ocorra.

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 Dessa forma, pode-se definir o amadurecimento do mel como a inversão da
sacarose do néctar pela enzima invertase e sua simultânea mudança de concentração.

A enzima invertase irá permanecer no mel conservando sua actividade por

algum tempo, a menos que seja inactivada pelo aquecimento; mesmo assim, o
conteúdo da sacarose do mel nunca chega a zero. Essa inversão de sacarose em glicose
e frutose produz uma solução mais concentrada de açúcares, aumentando a
resistência desse material à deterioração por fermentação e promovendo assim o
armazenamento de um alimento altamente energético em um espaço mínimo.

Outras diversas enzimas, como a diastase, catalase, alfa-glicosidase, peroxidase,

lipase, amilase, fosfatase ácida e inulase, já foram detectadas no mel por diferentes
autores (Schepartz & Subers, 1966; White & Kushinir, 1967; Huidobro et al., 1995).

A diastase quebra o amido, sendo sua função na fisiologia da abelha ainda não
claramente compreendida, podendo estar envolvida com a digestão do pólen.

Como a diastase apresenta alto grau de instabilidade em frente às

temperaturas elevadas, sua presença ou não se faz importante na tentativa de
detectar possíveis aquecimentos do mel comercialmente vendido, apesar de que
também em temperaturas ambientes ela pode vir a deteriorar-se quando o
armazenamento for prolongado.

A catalase e a fosfatase são enzimas que facilitam a associação açúcar-álcool,

sendo um dos factores que auxiliam na desintoxicação alcoólica pelo mel (Serrano et
al., 1994). Entretanto, segundo Weston (2000), a catalase presente no mel tem origina
no pólen da flor e a sua quantidade no mel depende da fonte floral e da quantidade de
pólen colhido pelas abelhas.

A glicose-oxidase, que em soluções diluídas é mais activa (White, 1975), reage

com a glicose formando ácido glucónico (principal composto ácido do mel) e peróxido
de hidrogénio, esse último capaz de proteger o mel contra a decomposição bacteriana
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até que seu conteúdo de açúcares esteja alto o suficiente para fazê-lo ( Schepartz et
al., 1966; Mendes & Coelho, 1983).

Segundo White et al. (1963), a principal substância antibacteriana do mel é o

peróxido de hidrogénio, cuja quantidade presente no mel é dependente tanto dos
níveis de glicose-oxidase, quanto de catalase, uma vez que a catalase destrói o
peróxido de hidrogénio (Weston et al., 2000).

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II. Material

- Gobelés;
- Pipetas;
- Pompetes;
- Balões Erlenmeyer;
- Grafite;
- Tubos de vidro;
- Cola;
- Teflon;
- Várias lixas;
- Eléctrodo de referência;
- Software Gamry Instrumments;
- Reagentes: Glicose, NaCl, KCl, HCl, KFe(CN)6 e FeCl3, solução de polianilina, Azul da
Prúcia.

III. Procedimento Experimental

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- Começou-se a actividade experimental por produzir os eléctrodos de grafite;
- De modo a ficar com a superfície lisa, lixou se a superfície do tubo de vidro, ver
próxima imagem.

Ilustração 9 - Elétrodo a ser lixado

- Colocou-se a grafite dentro dos tubos de vidro;

- Verificação da corrente dos eléctrodos;

Ilustração 10 - Medição da corrente do eléctrodo

- Entretanto procedeu-se à formação das soluções pretendidas;

- Prepararam-se cinco soluções de glicose, a primeira foi feita mediante a
pesagem do reagente no estado sólido e as outras mediante diluições com NaCl de
modo a que a solução tivesse aproximadamente a mesma concentração de sal do
sangue.

- Preparação das outras soluções necessárias, KCl, HCl, KFe(CN)6 e FeCl3, solução
de polianilina;

Ilustração 11 - Medição de HCL para proceder às outras soluções

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 Ilustração 12 - Pesagem de reagentes

- Ainda na construção dos eléctrodos colocou-se uma gotícula de mel e colocou-se

teflon de modo a agarrar a solução de mel permitindo a passagem por ser permeável;

- Os eléctrodos foram colocados nas soluções de glicose e foram retirados os

resultados com recurso ao software Gamry Instrumments;

Ilustração 13 - Software

- Como os resultados obtidos não foram os esperados substituiu-se o eléctrodo de

grafite por um de platina anteriormente adquirido.

Ilustração 14 - Eléctrodo Final

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-Obtenção dos resultados com uso do software Gamry Instrumments.

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IV. Resultados/ Discussão

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V. Conclusão Primária

Com este trabalho experimental podemos tirar como primeira conclusão a

importância da realização deste tipo de trabalhos em parceira de varias unidades
curriculares, neste caso Unidade de Transferência V e Biossensores.
Este projecto revelou-se muito interessante, pelo que alargou os nossos
horizontes para novas realidades, e uma nova perspectiva de futuro profissional, pois
sendo os biossensores uma área em larga expansão, será uma boa aposta.
De salientar o empenho do professor Luiz Rodrigues para que este projecto de
construção do biossensor electroquímico de glicose obtivesse os melhores resultados.

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Anexos

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Anexos I - Marcos da história dos biossensores

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