Sei sulla pagina 1di 152

Mazzuccato. Biotecnologie del seme e miglioramento genetico.

Plant Breeding : migliorare la composizione genetica delle piante relazione al loro uso economico; chiamato
anche come raccolto di miglioramento.

DOGMA CENTRALE DEL MIGLIORAMENTO GENETICO:

1) Produzione di variabilità genomica ( ibridazione sessuale/somatica, mutagenesi, colture in vitro,


trasformazione genetica, aplodizzazione/diplodizzazione)
2) Selezione ( in campo-serra, in laboratorio, a livello cellulare, a livello del DNA)
3) NUOVA CULTIVAR

Ecotipi = varietà locali = varietà tradizionali= landraces

Varietà migliorate = cultivar

Diverse tipologie di MG :

1) In base all’intensità d’uso della tecnologia :


MG convenzionale (incrocio e selezione)
MG avanzato (uso biotecnologie, es. MAS)
MG “by design” (di precisione)
MG “post-genomico”, “Next Generation
Breeding”, “genomic selection”, NBTs
2) In base alla destinazione del prodotto o all’approccio strategico
MG “ professionale”
MG per l’agricoltura biologica
MG partecipativo

Strategie di MG

• Breeding secondo ideotipo = costituire una pianta ‘nuova’ (concetto relativo di


ideotipo), conoscere le varietà diffuse, l’ideotipo cambia nel tempo
• Miglioramento per gradi = partire da una buona varietà e indrodurre gradualmente
i caratteri di nuovo interesse (o eliminare i difetti)
Obiettivi del breeding moderno

Obiettivi «assoluti» e «relativi»; Resa migliorata (quantità e qualità); Stabilità del rendimento ; Resistenza /
resilienza agli abiotici (termo-tollerante, stress da siccità, salinità, gelo, freddo ecc.); Resistenza / resilienza
agli stress biotici (malattie e insetti nocivi); Caratteristiche a valore aggiunto [ad es. produzione di ancora di
più forme curiose (novità)], elevato “input efficienza ”e risposta ecc

Breve storia di Plant Breeding (PB) → Domesticazione ( • 9000 First evidence of plant domestication in hills
above Tigris River • 5000 Agricultural communities exist in Mesopotamia Mesopotamia • 4000 Egyptians
used yeast in wine and bread making) ; Allevamento di piante empiriche prima del XVI ° secolo ( • 1665 Hooke
(England) - Described the cell; 1753 Linnaeus Linnaeus - Published "Species Plantarum". Binomial
nomenclature of plant taxonomy officially begins with his general list of plant species, ; ) Allevamento di
piante empiriche dopo il XVI ° secolo (1801 Lamarck - Theory of evolution through inheritance of acquired
characters ) ; PB moderno, "scientifico" (1859-89 *Darwin - Published "Origin of Species”; 1866 *Mendel -
Published "Experiments in plant hybridization" ) ; Mutagenesi sperimentale (1970 Berg, Cohen and Boyer -
introduced recombinant DNA techniques, 1982 GMO - used to produce human insulin, 1990 GMO - used to
produce chymosin, an enzyme used in cheese-making, 1993 Monsanto - used GMO to produce BST (Posilac),
1994 FlavrSavr tomato introduced. 1995 Bt corn introduced, 1996 Roundup Ready Soybeans introduced)
Biotecnologie ed era post-genomica; “Allevamento / allevatori di nuova generazione.

Flowering plant reproduction LEZIONE 2

schema pianta MODELLO: A.T.

1) Dimensioni ridotte 2) Ciclo breve 3) Autocompatibile 4) Facile all’incrocio 5) Genoma ‘piccolo’


6) Mappa genetica sviluppata 7) Disponibilità di mutanti 8) Buona risposta al “vitro” 9) Facile
trasformazione genetica

SPERMATOFITE ( divisione ) : Gimnosperme ( seme nudo ); ANGIO(dal greco: vaso; ovario)SPERME ( seme
vestito; antofita → magnoliofita ) s'intendono attualmente tutte le piante che hanno gli ovuli chiusi dentro
l'ovario, e conseguentemente i semi, che da essi provengono, contenuti dentro la cavità del frutto;

RIPRODUZIONE ANGIOSPERME: sessuale – vegetale (propaguli) – APOMISSIA (seme in maniera asessuata)


Generazione diploide : SPOROFITO - La DIPLOIDIA è vantaggiosa evolutivamente perché permette l’esistenza
dell’eterosi e la conservazione di variabilità genetica potenziale - ; generazione aploide : GAMETOFITO.

La prima osservazione (1822 - Giovanni Battista Amici ), che portò alla scoperta fondamentale del budello
pollinico.

FUNZIONE RIPRODUTTIVA: Meristema piu’ complesso

CARPELLI : foglie metamorfosate : danno origine all’organo FEMMINILE ( stigma, stilo, ovulo, ovario )

STAMI : danno origine all’organo maschile ( filamenti, antere )

FUNZIONE PROTETTIVA/NUTRITIVA/VESSILLIFERA: cellule molto semplici → diventa meristema florescenza;


sistema floreale; SEPALI E PETALI. → PERIANZIO

SVILUPPO ANDROCEO

Struttura dell’antera: 2 teche 4 sacchi pollinici o microsporangi¸Il tappeto è una struttura molto importante

che circonda le locule ovvero le loggie.

È uno strato unicellulare specializzato a sostenere le fasi dello sviluppo cellulare (binucleari), la quale inizia
con la sporogenesi. Nelle loggie avviene la rispoduzione.
MCP: pollen mother cells ( meiociti) – diploidi → da 4 microspore (meiosi 1 ) DIADI → TETRADE ; callosio :
polisaccaride complesso : si deposita su cellule che vanno in meiosi.

polline binucleato ..130 famiglie + 22 /199 ..entomofile (Solanaceae, Liliaceae, Papilionaceae, Rosaceae)

polline trinucleato .. 47 famiglie + 22 /199 ..anemofile (Poaceae, Brassicaceae, Asteraceae, Helyanthus, Beta)

La deiscenza:

1) Degenerazione del setto e dello stomio 2) Espansione delle cellule dell’endotecio 3) Ispessimento
delle loro pareti cellulari

Il granulo pollinico ha callosio, il tubetto NO!.

L microspora libera si polarizza e va in mitosi ( due nuclei men distinti, solo uno si cellularizza ) ; si forma poi
il nucleo vegetativo che apporta da supporto nelle cellule con polline binucleato. Il nucleo GENERATIVO
invece si divide un’altra volta : due nuclei spermatici ( POLLINE TRINUCLEARE )

Questo non avviene in tutte le specie nello stesso momento .

EXINA: ricopre il polline; sostanza allergenica \ Poli germinativi: dove può uscire il tubetto pollinico

4’ cerchio Sviluppo e funzione del gineceo

1) Monocarpellare (legume, follicolo, cariosside, drupa) 2) Bicarpellare (siliqua, bacca, drupa) 3)


Poli/pluricarpellare (capsula, bacca, esperidio) ; i carpelli possono essere 1 o + ( si fondono, non è
fisso)

Placentazione può essere: apicale assiale parietale basale centrale e marginale; è imp anche a livello tax.
Dove si differenzia l’ovulo ( SOLO 1 MMC – ALLUNGATA - E TANTI OVARI )

MUT FAS: da luogo ai fasciati

Parti epidermici ovulo: tegumento ( 1’ tegumento= primina; 2’ tegumento= secondina ) MICRO’pilo

TENUECELLULATO: 1 STRATO EPIDERMICO


ANCHE BI e TRISPORICO.

CALAZA: POLO OPPOSTO OVULO; NUCELLA: P.TE CONNETTIVO OVULO; FUNICOLO: PEDUNCOLO OVULO

Dopo 2 divisioni meiotiche si ottengono 4 megaspore e solo una funziona

C La megasporafunzionale è la megaspora calazae;


O la 1’ cell del gametofito femm e si sviluppa con 3
F N
divisioni mit e si sviluppa il sacco embrionale.
M

PLACENTA

Cellule antipodali

Si dispongono vicino all’apparato


micropilare = nuclei della cell’centrale;
danno origine all’endosperma; doppia
fecondazione dal secondo gamete M

Sinergidi; nella zona micropilare; 3


nuclei che si cellularizzano

Principali meccanismi di impollinazione 8 nucleato

anemofila entomofila zoofila 7 cellulato

ANEMOFILE

Fiori generalmente piccoli, con componenti del perianzio, se presenti, piccole e verdi. Fiori maschili
generalmente numerosi e aggregati in infiorescenze pendule.

Mai profumati

Stami o numerosi o con grandi antere, o fiori maschili più numerosi di quelli femminili. Grandi quantità di
polline prodotto.

Filamenti spesso lunghi, che si estendono oltre il perianzio, se presente; polline rilasciato con facilità.
Granuli pollinici con superficie liscia, piccoli, asciutti e leggeri; facilmente trasportati in correnti d’aria.

Stigmi ramificati e piumosi, portati su stili lunghi, spesso al di fuori del perianzio.

Fiori anemofili sono tipici di specie arboree, come la quercia e l’olmo, o di piante erbacee come le graminacee,
dove sono portati su lunghi peduncoli al di sopra delle foglie

ENTOMOFILE

Fiori con componenti del perianzio grandi, spesso di colori brillanti, a volte piccoli e aggregati in infiorescenze
compatte per attrarre gli insetti

A volte profumati per attrarre gli insetti

Stami in numero ridotto, di solito con antere piccole. Ridotta quantità di polline di polline prodotto.

Filamenti spesso corti, fissati all’interno dei segmenti del perianzio; antere introrse o estrorse, situate in
modo da venire in contatto con i pronubi.

Granuli pollinici con pareti scolpite, più grandi, strutturati in modo da aderire al corpo degli insett

Stigmi capitati o lobati, di solito su stili corti, che rimangono all’interno dei segminti del perianzio; stigma con
superficie scanalata su cui i granuli aderiscono.

I fiori entomofili spesso hanno meccanismi di impollinazione altamente specializzati, adattati al tipo di insetto
che li visita, insieme a meccanismi che impediscono l’autoimpollinazione e favoriscono l’incrocio.

FENOMENO DI AUTO-INCOMPATIBILITà: SISTEMA CHE è CAPACE DI RIGETTARE IL PROPRIO POLLINE

SISTEMA DI COMPATIBILITà: SISTEMA DI PROTEZIONE SECRETE DALL’OVULO E TUBETTO POLLINICO


PARTICOLARE

Formazione dei tegumenti del seme


Il/i tegumento/i del seme deriva/no dal/i tegumento/i dell’ovulo. Vanno sotto il nome di episperma o
spermoderma

Ovulo bitegmico: primina  TESTA secondina  TEGMEN

Ovulo unitegmico: primina  TESTA Altre componenti: cuticola, ilo, peli, uncini, arillo, etc.
Endosperma: avviene la
poliploidizzazione; il destino e quello di
tex di riserva; assorbito nell’embrione
e stoccato nei cotiledoni

Classificazione dei semi

1) ENDOSPERMICI o ALBUMINOSI 2)
NON-ENDOSPERMICI o ESALBUMINOSI
a) GLUCIDICI b) LIPIDICI i) ORTODOSSI
ii) RECALCITRANTI

A. Simple fruit - formed from a single pistil (pea,


tomato, lily, apple, cucumber)

B. Aggregate fruit - formed from a cluster of


separate pistils borne in a single flower
(strawberry, raspberry)

C. Multiple fruit - formed from the pistils of


several to many flowers consolidated with other
floral or inflorescence parts (pineapple, fig)

Formazione del frutto: allegagione: sviluppo frutto; 3 FASI


Classificazione dei frutti
Cell division Secchi Carnosi

Cell espansion Deiscenti

Ripening ( verde maturo) Indeiscenti

Controllo genetico dello sviluppo riproduttivo


Lo sviluppo può essere di tipo monopodiale o simpodiale (indet o det)

Esempio: Pomodoro: -
Neutrodiurna - Sviluppo
simpodiale (falso monopodio)
- Sviluppo indeterminato -
Poliennale (annuale in
coltura) - Segmento
simpodiale (3 foglie + 1
infiorescenza)
MERISTEMA VEGETATIVO→ Induzione/transizione (geni dell’identità del meristema dell’ infiorescenza)
(MERISTEMA INFIORESCENZA) →(geni dell’identità del meristema fiorale)MERISTEMA FIORALE→(geni
dell’identità degli organi fiorali)ORGANI DEL FIORE: Sepali Petali Stami Carpelli

Il passaggio da sviluppo vegetativo a sviluppo riproduttivo implica un cambiamento di ‘programmazione’ del


meristema

Gene indicates a function (sustained by a polypeptide/protein) | Locus indicates a position (may be a gene or
simply a marker) | Allele indicates a variation (different alleles may have different effects)
Orthologs are genes that originate from a single ancestral gene in the last common ancestor of the species and
are likely to have equivalent functions Paralogs are genes originating from duplication within one organism and
may have more divergent functions.
Phytoene synthase 1 (Psy1) in pomodoro, enzima chiave biosintesi carotenoidi

I fiori sono germogli o segmenti di germogli portanti foglie trasformate che servono alla riproduzione sessuale.
L'accrescimento vegetativo delle piante, sotto il controllo dei cosiddetti meristemi apicali, termina al momento
della induzione fiorale, fenomeno dovuto all'influenza di particolari stimoli interni ed esterni. Quando nella
pianta è avvenuta l’induzione fiorale i meristemi apicali cambiano programma di sviluppo e diventano meristemi
dell’infiorescenza (fase di transizione). Il meristema dell’infiorescenza a sua volta produce, in un ordine ben
definito e variabile da specie a specie, i meristemi fiorali da cui si svilupperanno i fiori con i loro organi. Tutti
questi processi sono controllati geneticamente e, da un punto di vista didattico, possono perciò essere distinti
tre gruppi di geni: 1) geni che controllano l’identità del meristema dell’infiorescenza (inflorescence meristem
identity genes) 2) geni che controllano l’identità del meristema fiorale (flower meristem identity genes) 3) geni
che controllano l’identità degli organi fiorali (floral organ identity genes)
L’INDUZIONE FIORALE → TEMPERATURA ( caldo a freddo, VERNALIZZAZIONE ), FOTOPERIODO, STATUS
NUTRIZIONALE E ORMONALE; inducono la percezione dello stimolo!!!
Che lo stimolo dell’induzione fiorale avvenga al momento giusto relativamente alla stagione e allo sviluppo della
pianta è di fondamentale importanza per il successo riproduttivo e molte specie hanno sviluppato meccanismi
diversi per regolare in maniera ottimale questo processo. Tali meccanismi infatti tengono sotto monitoraggio sia
lo stadio di sviluppo della pianta (incluso lo status nutrizionale e ormonale), sia le condizioni esterne come la
temperatura (termoperiodismo e vernalizzazione) e il fotoperiodo (classificazione delle specie in longidiurne,
brevidiurne e fotoindifferenti). L'induzione fiorale può precedere anche di alcuni mesi la fioritura vera e propria
ed è durante tale periodo che si verifica la gametogenesi ossia l'insieme delle fasi necessarie alla formazione dei
gameti femminili e maschili

GI: gigantea

CO: constas ( mut, non fioriva mai)


–>

Stimola la fioritura

LFY: Il segnale dalla foglia viene


trasferito al gene chiave della
transizione (Leafy) che viene
attivato nel meristema; gene imp
per la fioritura, solo nelle piante in
singola copia; agisce nel meristema;
SCAMBIA/ACCENDE IDENTITà DEL
MERISTEMA

FT: molecola che porta il segnale


dalla foglia all’apice
Sebbene il processo di transizione sia da considerare sotto controllo multigenico e multifattoriale, sono stati
identificati molti mutanti monogenici alterati in momenti specifici della risposta alla fioritura. Tali mutanti
possono essere divisi: in quelli che determinano un ritardo nella fioritura (late-flowering mutants) in cui i geni
corrispondenti promuovono la fioritura e quelli che ne determinano un anticipo (early-flowering mutants) i cui
geni corrispondenti inibiscono l’induzione. A titolo di esempio la mutazione al locus CONSTANS (CO, gene
recentemente clonato) sopprime la capacità della pianta di rispondere al fotoperiodo e le piante mutate co/co
fioriscono più tardi non rispondendo più allo stimolo dei giorni lunghi. Un altro gene è stato recentemente
clonato in Arabidopsis (FRIGIDA); la sua funzionalità corretta determina l’esigenza di vernalizzazione. Simile
funzione ha il gene FLOWERING LOCUS C (FLC). Gli alleli dominanti a questi due loci determinano l’esigenza di
vernalizzazione; invece le piante che portano alleli mutati (con perdita di funzione) hanno un fenotipo “a ciclo
rapido” e nessuna esigenza di vernalizzazione
Le conoscenze acquisite nelle specie modello sono state trasferite nelle specie di interesse agrario.
In frumento sono stati identificati i geni Ppd che sono implicati nella risposta fotoperiodica e dominanti per
l’insensibilità. L’attività dei geni Ppd sembra tuttavia risiedere maggiormente nello sviluppo dell’infiorescenza
che non nello stimolo stesso alla fioritura; geni ortologhi sono stati identificati in altri cereali come segale ed
orzo.
Molti di questi geni sono regolatori trascrizionali, cioè controllano l’espressione di altri geni, e sono, come ci si
può attendere, a loro volta sensibili all’illuminazione e/o alla temperatura e/o ai livelli ormonali. Mutations in
the LEAFY flower meristem identity gene generally cause a partial to complete transformation of flowers into
shoots. The severity of this phenotype varies along the inflorescence such that the basal flowers are completely
transformed into shoots, whereas the apical flowers display only a partial transformation. Il gene FT (Flowering
locus T) agisce in modo ridondante con LFY per attivare la trascrizione di AP1 ; codifica la molecola “florigeno” di
cui per molti anni i fisiologi hanno ipotizzato l’esistenza senza poterla individuare.
LA METIONINA è UN AMMINOACIDO ESSENZIALE TRA ANGIOSPERME E GIMNOSPERME, INFATTI LE
ANGIOSPERME NON HANNO METIONINA AD ECCEZIONE DELLE PIPERACAE.
Leafy - Induces flowering - Control the determination of flower meristem – Control the identity of flower organs
Leafy (Arabidopsis) Floricaula (Antirrhinum, 1990) Falsiflora (tomato, 1999)
Dynamics of inflorescence production
CENTRORADIALIS (Antirrhinum majus) TERMINAL FLOWER1 (TFL1) (Arabidopsis thaliana) SELF PRUNING - Nome
del gene: Self pruning (Sp) scoperto da Burpee intorno al 1923 - (si autopota) se CCT→INDETERMINATO(Sp)
PROLINA , SE SNP CTT→DETERMINATO(sp)LISINA (Solanum lycopersicum) = è UNA FAMIGLIA.
Posizione di mappa: cromosoma 6 (braccio lungo)
Funzione del gene: fattore di trascrizione della famiglia CETS che agisce come regolatore negativo della fioritura
Effetto del gene: la piante con il gene wild type hanno una fioritura regolare con emissione di una infiorescenza
ogni tre foglie (apice indeterminato). Il mutante sp presenta un allele mutato; la proteina è meno efficiente e la
fioritura più rapida (una infiorescenza ogni una/due foglie) finchè la crescita non termina del tutto (habitus
determinato e annuale).
Importanza pratica dei geni che regolano l’alternanza di fase vegetativa – riproduttiva ……. (Svil. Indeterminato /
Svil. Determinato; The recessive sp gene was the single most important genetic trait in the development of
modern agrotechniques for this crop plant, because the ‘determinate’ growth habit facilitates mechanical
harvest
ALTRE MUTAZIONI IMP PER IL SETTORE AGRONOMICO
1) Mutazioni dei fotorecettori per evoluzione da specie brevidiurne a neutrodiurne (es. fagiolo, pomodoro, riso)
2) Geni VRN es in frumento, varietà alternative e non alternative (i geni VRN in frumento non sono ortologhi di
quelli di Arabidopsis)
3) Over expression of LFY or FT
4) Mutazioni a carico di TFL
Geni dell’identità del meristema fiorale: AP1 (apetala 1 , paralogo di CAL ) CAL, FUL
I geni omeotici sono i geni che recano identità all’organo!!! Esempio MADSbox sono geni omeotici umani,
dominio conservato che si lega al DNA, agiscono solo se dimerizzano.
Determinazione del meristema fiorale: Un’altro gruppo di geni controlla la transizione da meristema
dell’infiorescenza a meristema fiorale: geni appartenenti a questa classe sono APETALA1 e CAULIFLOWER (due
geni molto simili in Arabidopsis, famiglia MADS-box): quando sono combinate due mutazioni a questi loci, al
posto dei meristemi fiorali si differenziano altri meristemi dall’infiorescenza dando alla struttura l’aspetto di un
agglomerato di piccole infiorescenze sterili. Il cavolfiore che si consuma come ortaggio è in realtà un mutante
proprio a livello di questi geni. Anche in pomodoro esistono mutazioni ortologhe e sono chiamate anantha (lett.
“senza fiore”) e cauliflower. La conoscenza delle sequenze e del funzionamento dei geni che controllano
l’induzione fiorale e la transizione a meristema fiorale permettono di approfondire la nostra comprensione del
processo di fioritura e offrono le prospettive di modificarlo a vantaggio delle esigenze dell’agricoltura.

Geni dell’identità degli organi


fiorali (geni “omeotici”) Il modello
ABC(DE)

I geni del modello ABC sono: -


fattori trascrizionali -geni
omeotici -di tipo MADS-box

CLASSE A: Apetala1 Apetala2

CLASSE B: Apetala3 Pistillata

CLASSE C: Agamous

Geni dell’identità degli organi fiorali: i mutanti «omeotici»


CARPELLI STAMI STAMI CARPELLI : BC
SEPALI SEPALI CARPELLI CARPELLI : AC
SEPALI PETALI PETALI SEPALI : BA
ABC(D) model is not yet complete

Manca ancora un elemento per dare


identità agli organi, perché
35S::AP1::AP3::PI non fa produrre
foglie petaloidi

1) Vi erano dei MADS espressi nel fiore


in più di due cerchi

2) Mutanti singoli di questi geni non


avevano fenotipo

3) Un mutante triplo per tre di questi


geni produce un fiore con tutti sepali

Il mutante green petal in cetriolo: The green petals (gp) mutant • yellow petals are transformed to green sepals
• stamens are absent in female flowers • caused by deletion in homeotic gene CUM26
Per fare petalo non serve solo funzione A e B ma hanno osservato altri MADS che esprimono altri cerchi
In Thalictrum thalictroides : Fully silenced ThtAG1 flower= FIORE PETALOSO Il numero delle corolle è data dalla
mutazione C, CON MUTAZIONE AGAMUS SI HA UNA SOVRAEXP DI AP2 E QUINDI SEP PET PET SEP
Ruolo dei MADS oltre l’identità degli organi fiorali:
→ 1) MADS gene for pedicel abscission in tomato (Mao 2000) MUTAZIONE DENOMINATA JOINTLESS!!!!!! Tutti
ormai sono cosi!!! Carattere importantissimo
→ 2) Ripening inhibitor (rin= servevole) incompletely recessive
→ 3) SHP1/SHP2 for dehiscence zone
LUCIA COLOMBI: ABLAZIONE DI UN TEX CON PROMOTORE E CITOX ( DISTRUGGE TEX ) IN PARTICOLARE:
BARNASE, BACILLUS E RNASE
Il sistema di unione (mating system): autogamia e allogamia
AUTOGAMA E ALLOGAMA
Stesso fiore: autogamia stesso individuo biologico: stesso ramet: geitonogamia
Due corredi genomici: meccanica o incrociata xenogamia: genet different biologicamente: autofec
1) Autogamia obbligata ….. non esiste ! 2) Autogamia abituale 3) Specie prevalentemente autogame
I Meccanismi atti a favorire l’autogamia 1) Omogamia (maturazione contemporanea) 2) Cleistogamia
(maturazione a fiore chiuso) a) Ecologica (dovuta a stress ambientali) b) Strutturale (base genetica) c)
Effettiva (fecondazione prima dell’antesi; es. frumento). Questo si è evoluto da specie allogame, infatti, lo
stigma all’inizio usciva fuori dalle antere ( pomodoro selvatico) successivamente si è avuta una progressiva
perdita di individualità e lo stigma non è piu uscito dalle antere.
Carattere poligenico→ stigma exterto(w.t.); inserto (mut). Il carattere «stigma exerto» è un carattere
quantitativo, cioè controllato da diversi geni. Prevalgono relazioni di dominanza come è da attendersi perché
lo stigma inserto è il frutto dell’accumulo di mutazioni (recessive) durante la domesticazione e il breeding.
Allogamia obbligata → DOVE? → in specie dioiche (separazione dei due sessi) & specie autoincompatibili (
uno matura prima e laltro dopo ). Si parla di specie ‘prevalentemente’ allogame. La percentuale di allogamia
(tasso di incrocio) non è un fattore assoluto, ma dipende da molti fattori esterni di tipo abiotico e biotico
(presenza di pronubi). ESEMPIO: pomodoro 2-5% ,spinacio 100% dioico, ciliegio 100% autoincompatibile.

Ogni locus, carattere, da det


frequenze alleliche e
genotipiche

Determinazione sperimentale
del modo di riproduzione e del
sistema di unione

Partiamo dall’osservazione della pianta; se sono assenti i propaguli


allora vanno incontro ad una riproduzione sessuata (DIOICA). Se invece ci sono i propaguli allora si procede
con una riproduzione vegetativa (MONOICA).
Se si procede invece con l’osservazione del fiore, se sono rudimentali o sterili, riproduzione
vegetativa(MONOICA), se invece i fiori sono funzionali allora procedono con una riproduzione sessuata (
MONOICA/ERMAFRODITA)
Se il modo di riproduzione è MONOICA O ERMAFRODITA allora si porta ad isolamento la pianta e si osserva
se fa seme e si procede con la depressione o inbreeding ( ALLOGAMA O AUTOGAMA ) ; se non fa depressione
allora si analizza la QUOTA DI ESOINCROCIO; ANALISI DELL’ETEROZIGOSITà. o se non fa seme ( ALLOGAMA
), questo per valutare successivamente la progenie.
QUOTA DI ESOINCROCIO; ANALISI DELL’ETEROZIGOSITà

QUESTO è POSSIBILE
GRAZIE AI MARCATORI
GENETICI IN PARTICOLARE
CON I MARCATORI
MOLECOLARI
ESEMPIO P1 E P2.
SE P1<<<<<<<<P2: E 2 SU 20 SONO COME P2 ALLORA LA QUOTA DELL’IMPOLLINAZIONE è 10%.
ANALISI SU PIANTE MOLTO PICCOLE O ESTRAZIONE DI DNA DAL SEME.
SE P1<<<<<<<<P2 E COME PRIMA 2/20 SONO COME P2 MA IN QUESTO CASO IL P2 NON è OMOZIGOTE PER
L’ALLELE DIVERSO , E QUINDI ETEROZIGORE ( NELLESEMPIO SOPRA ENTRAMBI ERANO OMOZIGOTI PER
L’ALLELE DIVERSO) ALLORA IN QUESTO CASO, LA NUBE POLLINICA CHE CIRCONDA LE PIANTE è FORMATA DA
META ALLELE P1 E ALLELE P2, NOI VEDIAMO SOLO P2 MA DOBBIAMO SUPPORE CHE LA METà NON LA
VEDIAMO, E QUINDI 4/20 E QUINDI 20%.

Questo cosa significa, significa studiare in numero di eterozigoti presenti in una popolazione che si stima con
un parametro ( eterozigosità osservata) con il numero di eterozigoti attesi se la popolazione è in equilibrio
E-W.
Se gli eterozigoti sono di + degli attesi allora siamo di fronte ad un ALLOGAMIA SPINTA ; se invece gli
eterozigoti sono di meno degli attesi allora siamo di fronte ad una spece che prediligie l’AUTOGAMIA

questa se studiata su + loci

Più che l’Ho, la variabilità genetica di una popolazione è molto spesso misurata utilizzando l’eterozigosità
attesa per locus (He nella slide) che corrisponde alla frequenza di eterozigoti attesi nel caso la popolazione
fosse in equilibrio. Infatti molto spesso Ho ≠ He.
Nel caso di un locus con due alleli, He = 2pq come vuole la legge di Hardy-Weinberg.
Considerando una popolazione con incroci casuali (siano rispettate le condizioni dell’equilibrio HW), nella
quale k alleli sono segreganti ad un determinato locus, indicando con pi la frequenza dell’allele i-esimo
nella popolazione (Σpi = 1), He cioè il totale degli eterozigoti si calcola come 1-Σ pi2.
Σ pi2 rappresenta il totale degli omozigoti e viene definita identità genetica o J. (1-J) che corrisponde al
totale degli eterozigoti attesi o He viene definito diversità genetica H. Chiaramente H+J=1. L’He
corrisponde appunto alla diversità genetica (indice di diversità genetica) ed è una delle misure più utilizzate
per stimare il grado di polimorfismo entro una popolazione. Il termine gene diversity non è che la
definizione formale del valore di eterozigosità attesa in una popolazione. Per avere una stima
statisticamente valida, si consiglia di analizzare almeno 30 loci in almeno 20 individui.
L’indice He assume valore 0 in assenza di polimorfismo e si avvicina tanto più ad 1 quanto maggiore è il
grado di variabilità osservabile nel campione per quel determinato locus. È massima quando le frequenze
degli alleli sono bilanciate (es: 0,5 e 0,5 nel caso di due alleli, 0,33, 0,33 e 0,33 nel caso di tre alleli, ecc.) e
in generale aumenta all'aumentare del numero di alleli.
Anche in questo caso, se si
analizzano più loci, l'eterozigosi
attesa media è la media delle
eterozigosi attese per ciascuno
dei vari loci. L'eterozigosi attesa è
una misura molto usata per
valutare la variabilità genetica di
una popolazione. Se estraggo
casualmente due alleli dalla
popolazione, misura la
probabilità di che i due alleli
Sommatoria di tutte quelle frequenze alleliche al quadrato per tutti quegli
alleli che ci sono = ∑ ( identità genetica ) . siano differenti.

Indice di fissazione o coefficiente di inbreeding (Fst) Mette a confronto la


frequenza reale di genotipi eterozigoti con quelli attesi in caso di equilibrio H-W (unioni casuali). Quindi
misura la riduzione di eterozigosi rispetto all’atteso.

He = frequenza attesa di eterozigoti sotto unioni casuali

Ho = frequenza osservata di eterozigoti nella popolazione

F = 0 se la popolazione è in equilibrio H-W. F = 1 se la popolazione è composta da


soli omozigoti (autofecondazione) . F < 0 eccesso di eterozigoti (es. specie
autoincompatibili) allogamia spinta in specie autoincompatibili

La differenza percentuale tra eterozigosità attesa (He) e osservata (Ho) viene stimata dall’indice di
fissazione F (detto anche coefficiente di inbreeding).
F può variare tra 0 e 1. Se la popolazione è in equilibrio He=Ho e allora F=0; se c’è incrocio continuo tra
individui imparentati che porta ad una elevata omozigosi a tutti i loci saggiati (al limite autofecondazione)
allora F tende ad 1. Se Ho > He, cioè si ha un eccesso di eterozigoti (come ad es nel caso di incompatibilità),
allora il valore di F può assumere anche valori negativi.

Ho = 14/31 = 0,45
p = (4*2 + 14)/ 62 = 0,35
q = (13*2 + 14)/ 62 = 0,65
He = 2*0,35*0,65 = 0,46
F = (0,46 – 0,45)/ 0,46 = 0,022

Ho si calcola il numero degli eterozigoti/31 : 14/31: 0,45


He bisogna calcolare le frequenze alleliche di p e q, allele con banda alta e bassa. Calcolare la freq che
quell’allele è presente nella popolazione. In un individuo omo ci saranno due, in un individuo etero, uno. Se
quindi contiamo il numero degli omozigoti per p, banda bassa, moltiplicato per 2 e sommiamo gli
eterorozigoti perche anche li ci sta l’allele p, il totale ci da il totale dell’allele p. lo dobbiamo dividere per il
totale degli alleli della pop , 31→62. Q: 1-p. Appena fatto p e q ,He si calcola usando la formula precedente
P: (13*2)+14/62 : 0,65
Q: (4*2)+14/62 : 0,35
He: 2*0,35*0,65:0,46 F: 0,46-0,45/0,46: 0,022 POICHE F è PRATICAMENTE = 0, la popolazione è in
equilibrio H-W, CIOè UNA POPOLAZIONE CHE SI INTERINCROCIA LIBERAMENTE. ALLOGAMA.

DISTRIBUZIONE DEI SESSI NELLE PIANTE: nelle angiosperme

Tabella 2. Classificazione
delle specie vegetali in
base alla separazione dei
sessi (le parentesi tonde
simboleggiano il fiore, le
quadre la pianta).
A seconda della
suddivisione dei sessi nel
fiore e dei fiori nella
pianta, le specie vegetali
possono possono essere
classificate secondo lo
schema riportato in
tabella 2. Le specie
cosiddette monomorfiche
portano organi maschili e
femminili sulla stessa
pianta (per cui ogni
individuo è capace di
riprodursi) che possono essere sullo stesso fiore (specie ermafrodite) o su fiori diversi (specie monoiche).
A volte, con una nomenclatura leggermente diversa, si distinguono le specie monoiche monoclini
(=ermafrodite) da quelle monoiche diclini (=monoiche, sessi separati sulla stessa pianta). Ulteriormente
possono esistere specie andromonoiche (fiori maschili e ermafroditi sulla stessa pianta), ginomonoiche
(fiori femminili e ermafroditi sulla stessa pianta) e poligame (fiori maschili, femminili e ermafroditi presenti
contemporaneamente sulla stessa pianta).
Le specie polimorfiche portano organi maschili e femminili su piante diverse. Quando la divisione è
completa si parla di specie dioiche, mentre per i casi più complessi le specie polimorfiche presentano la
stessa classificazione delle monomorfiche ad eccezione della combinazione poligama che non è possibile.
Anche in questo caso le piante presentano variabilità maggiori del regno animali.
Ermafroditismo: i due sessi sono portati all’interno dello stesso fiore
Monoiche : caso i cui i due sessi sono portati su fiori diversi della stessa pianta – mais –
Dioiche: I due sessi sono nettamente separati, esistono piante maschili – androiche - e piante femminili –
ginoiche.
Meccanismo che facilita l’unione allogama → monoicismo e diocismo.
I fiori unisessuati che si trovano nelle specie monoiche e dioiche sono considerati un evoluzione dei fiori
ermafroditi. In tutti i fiori si differenziano i 4 cicli fiorai, ma nelle specie dioiche e monoiche, nei fiori femminili
c’è la repressione dello sviluppo degli stami (1), mentre nei fiori maschili c’è la repressione del gineceo (2).
1 2

Quindi l’evoluzione di un fiore


ermafrodita a fiore unisessuato è
un fenomeno che avviene dopo
l’inizziazione dei singoli organi,
quindi avviene a valle del
funzionamento dei geni MADs che
abbiamo visto . L’aborto del sesso
che non si sviluppa può avvenire in
maniera molto veloce → cannabis o
in fase molto avanzate →
vite/fragole
Il diocismo si considera un
fenomeno in circa il 5% nelle
agiosperme, la determinazione dle
sesso in alcune specie è dovuta
dalla presenza dei cromosomi
sessuali, morfologicamente
differenziali e si differiscono dagli autosomi.
3.2. Dioicismo e determinazione del sesso
Il dioicismo è un fenomeno infrequente
nelle piante da fiore e si ritrova in circa il
4-6% delle specie conosciute. E’ più
frequente nelle gimnosperme,
presentandosi circa nel 25% delle specie.
Questa condizione determina allogamia
completa, ma ha lo svantaggio adattativo
che solo metà della popolazione produce
seme. Il dioicismo generalmente si ottiene
attraverso un precoce arresto dello
sviluppo degli organi maschili o femminili
in fiori del sesso opposto. Un individuo
maschile di una specie dioica quindi porta
fiori con la sola funzione maschile (fiori
staminati), mentre un individuo femmina
porta fiori che hanno solo i carpelli
funzionali (fiori carpellati o pistillati).
Per quanto riguarda la determinazione del
sesso e quindi del dioicismo esistono
alcune differenze rispetto alla
determinazione del sesso negli animali. Negli animali la determinazione del sesso è legata esclusivamente
ai cromosomi sessuali che sono eteromorfici, cioè morfologicamente distinguibili dagli autosomi
(cromosomi non sessuali). Nelle piante invece i geni responsabili del sesso possono essere localizzati sia su
cromosomi sessuali (X e Y) che su cromosomi autosomici. Nel caso di determinazione del sesso sulla base
di differenze cromosomiche (presenza di cromosomi eteromorfici), il sesso eterogametico, cioè quello che
produce due tipi di gameti è di solito il maschile.
1) Determinazione del sesso in Bryonia (non differisce da quanto avviene nell’uomo o in Drosophila):
Questa è stata la prima specie vegetale in cui è stato descritto il determinismo genetico del sesso, ad opera
di Correns nel 1906.

Determinazione cromosomica: cromosomi sessuali (eteromorfici) - Determinazione genica: geni sugli


autosomi (cromosomi non sessuali)
In alcune specie, sempre dioiche, non si osservano cromosomi morfologicamente differenziati e quinidi i geni
che controllano la det del sesso sono presenti sugli autosomi. Il sesso eterogametico è il maschile, il maschio
porta i due crom differenziati, e lunione crea il 50% di M E F.
Tra le specie modello delle specie dioiche
→ SILENE DIOICA, attraverso numerosi
studi è stato permesso ipotizzare una
serie di teorie: 1) postula che il che Y sia
il cromosoma “attivo” → CON
ESPERIMENTI DI POLIPLOIDIZZAZIONE,
poiche si vedeva che una pianta che
portava 3 che X e 1 Y, rimaneva una
pianta con caratteristiche maschili. Il
controllo del sesso nelle pianti superiori
è regolato da due geni presenti sui chr
sessuali, il chr Y porta la forma
dominante : 1)→ M (male activator)
stimola lo sviluppo maschile 2)→ SuF
(femalgenie repressor) reprime lo
sviluppo femminile, nel cromosoma X i
due alleli recessivi. Basta la presenza di un singolo Y per avere il maschio; tuttavia questo cromosoma non
può esistere allo stato omozigote. In Silene, spesso i maschi sono ‘incostanti’ cioè esprimono anche organi
femminili perciò si possono autofecondare. È stato poi osservato che autofecondare un individuo incostante
di SILENE, si ottenevano maschi e femmine in proporzione 2 a 1, e questo è stato ipotizzato dovuto al fatto
che l’omozigote YY non è evidentemente vitale.
3) - Tipo Melandrium (= Silene latifolia) white campion THE ACTIVE Y CHROMOSOME SYSTEM
E’ una specie con determinazione del sesso cromosomica, infatti ogni individuo ha 22 autosomi e due
cromosomi sessuali (XX = femmina; XY = maschio). Quindi il sesso eterogametico è quello maschile. La
diversità tra X e Y è stata anche evidenziata citologicamente: il cromosoma Y è più lungo dell’X. Poiché
piante con un cromosoma Y e fino a 3 copie dell’X sono praticamente maschi, in questa specie al
cromosoma Y è associata una forte azione mascolinizzante. Il meccanismo di determinazione del sesso
agisce a valle dei geni omeotici di identità degli organi fiorali; infatti tutti i fiori contengono i primordi dei
due sessi sviluppati normalmente e solo in secondo tempo si ha degenerazione degli stami nei fiori
femminili e del pistillo in quelli maschili. è stata individuata la porzione di cromosoma Y coinvolta nella
determinazione del sesso. In questa porzione sono stati individuati due geni strettamente associati (SuF e
M) i quali agiscono con questi risultati:
A - Inibiscono la formazione di organi femminili (dominanza del gene SuF)
B - Determinano la formazione degli organi maschili. Un meccanismo simile si trova anche in due specie
arboree forestali (Populus e Salix).
Quindi il maschio ha genotipo X(suFm)Y(SuFM) e la femmina X(suFm)X(suFm). Gli alleli dominanti sono
sempre presenti nel cromosoma Y perché non è possibile ricombinazione tra X e Y per mancanza di
omologia e di appaiamento.
La mancanza di maschi YY indica che il cromosoma Y è degenerato e che il genotipo YY non è vitale.
E’ ovvio come l’evoluzione abbia portato ad uno stretto linkage tra i due loci che determinano il sesso,
poiché la ricombinazione tra loro porterebbe sempre individui a sesso intermedio e male adattati. Inoltre
la regione cromosomica che ospita i geni del sesso ha ricombinazione soppressa, ossia esiste appaiamento
e ricombinazione tra X ed Y solo ad una estremità
Specie dioiche in cui l’espressione dei due sessi è incostante, si dicono SUB-DIOICHE→ sub-androiche (le
piante maschili hanno anche fiori ermafroditi) → SESSO INCOSTANTE MASCHILE (Asparagus, le piante
maschili sono preferite) sub-ginoiche (le piante femminili hanno anche fiori ermafroditi)→SESSO
INCOSTANTE FEMMINILE (Cannabis, le piante femminili hanno fibre più pregiate). Il/i gene/i che controlla/no
il sesso sono sul ch. 5 che però non è eteromorfico, ma omomorfico.
Oltre alle specie dioiche esistono anche specie subdioiche
che presentano particolari meccanismi di determinazione
del sesso; in esse per effetto di particolari combinazioni
geniche si verifica la presenza di individui monoici, dioici ed
ermafroditi.
4) - Tipo Asparagus
Nell'asparago non è stata trovata una relazione tra eteromorfismo cromosomico e determinazione del
sesso, cioè non sono evidenziabili eterocromosomi. Essa quindi sembra dovuta ad un singolo gene
(localizzato sul cromosoma 5) con due alleli: M dominante su m che determina il genotipo maschile. Le
ordinarie popolazioni di asparago sono costituite da maschi e femmine nelle proporzioni del 50% come
risulta dallo schema seguente:
Pianta maschile (Mm): Gameti M m
Pianta femminile (mm): Gameti m
Progenie: Mm (50%) mm (50%)
Le piante maschili sono preferite in coltivazione in quanto producono circa il 25% in più delle femminili;
tuttavia il turione femminile è più grosso e di migliore qualità.

Nell’asparago il sesso è det in maniera genica, quindi non cromosomica, e il sesso eterogametico è il sesso
M. Le piante maschili sono preferite in coltivazione, perché danno produzione qualitativamente migliore,
però essendo sempre una specie dioica avremo sempre una composizione di M e F. la presenza di M cosidetti
incostanti, individui sub-androici (come in Silene), ha reso possibile la possibilità di autofecondare individui
maschili e quindi

di ottenere : un 25% di individui omo per


il fattore sessuale maschile→ individui supmaschi, sono utilizzabili come parentali nella costituzione
dell’incrocio con individui femminili e nella costituzione di cultivar che sono state chiamate All male hybrid,
costituiti da individui maschi al 100%. I supermaschi possono essere prodotti anche utilizzando un processo
e percorso biotecnologico che va sotto al nome di produzione DOPPI APLOIDI. Questo significa che con delle
procedure legate a delle culture in vitro si possono mettere in coltivazione delle microspore, cioè dei
gametofiti maschili, con degli shock e fargli assumere un atteggiamento embriogenetico e l’embriogenesi di
queste cellule fa si che si ottengono degli individui aploidi, quando un aploide viene poi raddoppiato nel suo
corredo cromosomico, si ottengono i doppi aploidi omozigodi in tutti i loci. Ovviamente sottoponendo
individui di asparago sotto questo processo , si ottengono mm(F)MM(M) e che sono dei super maschi. Un
altro evento particolare nella riproduzione che avviene nell’asparago, era dovuto al fatto che anche negli
incroci normali tra M e F, molto spesso si ritrovavano in basse percentuali nella progenie, individui sterili ed
individui ermafroditi non attesi.
Come in tutte le specie dioiche, durante i primi stadi di sviluppo tutti i fiori sono ermafroditi ed è
impossibile distinguere i fiori maschili da quelli femminili. Solo in un secondo momento, nelle piante
maschili e in quelle femminili vengono soppressi gli organi del sesso opposto. Gli ovari presenti nei fiori
maschili, anche se di solito abortiscono, possono produrre frutti con semi vitali (comportamento sub-
androico, cioè in cui i maschi possono avere fiori ermafroditi). E’ stato dimostrato che questo
comportamento è controllato geneticamente e quindi proposto un modello più dettagliato per la
determinazione del sesso in asparago. Secondo questo modello, la determinazione del sesso è sotto il
controllo di 2 geni regolatori strettamente associati:
il gene M “male activator” che controlla lo sviluppo dell’androceo
il gene F “female repressor” che reprime lo sviluppo del gineceo.

Questo comportamento è stato


spiegato con la presenza ed il controllo
anche in asparago da parte di due
geni, M E SuF, generalmente sono
vicini e non subiscono ricombinazione,
ma se avviene una ricombinazione a
bassissima freq, si ha la produzione di
due gameti ricombinanti. I gameti
ricombinanti portano un allele
DOMINANTE per il gene M , un gene
RECESIVO SuF, oppure il contrario.
Quando poi vanno ricombinati con m e
e
suF, un gamete femminile, si hanno le
manca la funzione femminile nuove combinazioni.

Di regola la pianta maschile è eterozigote (MF/mf) e quella femminile è


omozigote recessiva (mf/mf). In assenza di ricombinazione gli alleli dominanti rimangono sempre associati.
Tuttavia, con bassa frequenza si può avere ricombinazione tra i due loci il che implica che un maschio possa
produrre gameti Mf e mF. Questi gameti, unendosi a quelli prodotti dalla pianta femmina (mf) danno luogo
a individui Mf/mf (individui ermafroditi per mancanza dell’allele “female suppressor”) e mF/mf (individui
sterili per mancanza di entrambe le funzioni).
Tuttavia sembra possibile avere rare piante andromonoiche (ermafrodite) di asparago con genotipo
MF/mf; queste, autofecondate, danno origine a 25% di piante femminili (mf/mf), 50% di piante maschili
(MF/mf) e 25% di piante maschili denominate “supermaschi” (MF/MF). Le piante femminili si individuano
facilmente; i maschi omozigoti non sono invece distinguibili dagli eterozigoti, ma si possono individuare
mediante prove di progenie. Con questa tecnica le piante maschili vengono isolate con piante femminili e
si fa avvenire la normale impollinazione con insetti. Si raccolgono i semi sulle piante femminili e se la
progenie è tutta maschile significa che il genitore maschile era omozigote (MF/MF), se invece si ha il 50%
di piante maschili significa che l'impollinante era eterozigote (MF/mf).
I maschi omozigoti vengono moltiplicati
per via vegetativa e posti in isolamento
con piante femminili (mf/mf)
permettendo di raccogliere seme al
100% MF/mf (all-male hybrids) che darà
solo piante maschili più produttive.
Un’altra possibilità per ottenere linee
MF/MF da utilizzare per la produzione di
ibridi è quella di ricorrere alla coltura di
antere. Coltivando in vitro le antere di
piante maschili (MF/mf) si ottengono
aploidi MF e mf nel rapporto 1:1. Una
volta raddoppiato il numero
cromosomico, si ottengono aploidi raddoppiati (double haploids) MF/MF e mf/mF.
Per distinguere più facilmente le piante maschili eterozigoti (Mm) da quelle omozigoti (MM) si sono
ricercati marcatori molecolari associati al sesso; sono stati individuati due marcatori RFLP a distanze di
mappa di 7 e 10 cM dal locus M.

Quindi molto imp capire le basi molecolari nel controllo del sesso dell’asparago. Gene candidato MALE
ACTIVATOR = MSE1
Un’altra specie DIOICA che presenta incostanza nei sessi è la Cannabis sativa , ma il sesso femminile è
incostante, sub-ginoica. Il controllo del sesso nella Cannabis è di tipo cromosomico, ossia ci sono una serie di
coppie di autosomi ed una coppia di cromosomi sessuati, anche qui il sesso eterogametico è il sesso maschile.
Chiaramente dal punto di vista produttivo avere piante F o M è molto differenziato. Se uno è interessato al
seme→ F, ma hanno anche delle infiorescenze più ramificate e di taglia piccola, e soprattutto sono quelle
che contengono la maggior parte dei principi attivi. Quindi se per la produzione di fibre tessili, sono sempre
state preferite le varietà dioiche, dove appunto sono costituite da M e F, proporzioni 50%, quando si pensa
alla produzione di principio attivo e quindi di seme, si pensa al sesso F. la specie è sub-ginoica, quindi ci sono
individui con composizione femminile che esprimono anche una funzione M. questi individui possono essere
moltiplicati per la produzione di cultivar, definite come cultivar MONOICHE, proprio perche portano semi M
e F nella stessa pianta.
Le piante di canapa sono sia monoiche (utili per la produzione di semi a uso alimentare) sia dioiche.
I fiori maschili (staminiferi) giallo-verdognolo, sono riuniti in pannocchie terminali
e ciascuno presenta 5 tepali fusi alla base e 5 stami (Foto 3). I fiori maschili si
differenziano dopo almeno sessanta giorni dalla germinazione, e permangono per
circa un mese.
I fiori femminili (pistilliferi) si formano una decina di giorni dopo quelli maschili,
sono riuniti in gruppi di 2-6 alle ascelle di brattee formanti corte spighe (Foto 3);
ognuno mostra un calice membranaceo che avvolge strettamente un ovario supero
ed uniloculare, sormontato da due stili e due stimmi. L’infiorescenza femminile è
molto fogliosa, più compatta e più robusta della maschile. La pianta seminata in
primavera fiorisce in estate inoltrata.
La canapa è pianta anemofila. L’impollinazione può avvenire anche a distanze di
2-3 chilometri, specialmente se non esistono tra le piante femmina e l’impollinante
rilievi naturali, filari di alberi o costruzioni che ostacolino il movimento del polline
(Ranalli, 1998; Bocsa e Karus 1998).
In autunno compaiono i frutti, rappresentati da acheni duri, tondeggianti od ovali,
lisci, ciascuno contenente un seme con un endosperma carnoso ed embrione curvo.
Il colore dei semi è grigio chiaro o marrone chiaro, e spesso sono marmorizzati.
Misurano 2,5-5 mm lunghezza e 2-4 mm di larghezza, ed il loro diametro varia fra i
2 e i 3,5 mm. Il peso di mille semi varia fra 2 e 70 grammi a seconda della varietà, in
quelle da fibra si aggira intorno a 20 g (Foto 4). Il peso dei semi di varietà monoiche
è più basso di quello delle varietà dioiche.
All’interno del pericarpo troviamo due cotiledoni ricchi di sostanze di riserva, con
una radichetta e un endosperma sottile e non sviluppato contenente amido. I
cotiledoni e la radichetta sono ricchi di olio. Il pericarpo contiene principalmente
fibre e clorofilla, che dà all’olio di canapa il suo colore verde
Per la produzione di seme di base la distanza minima tra varietà è di 5000 m

Le piante maschili sono sempre maschi: XY


Alcune piante femminili a volte sono "incostanti", cioè producono anche fiori maschili : XX/XXINC
Le femmine incostanti si dicono genotipi "monoici" - La specie si definisce "sub-ginoica"

Varietà dioiche CARMAGNOLA


CARMAGNOLA SELEZIONATA
FIBRANOVA Da fibra  Molto vigorose,
fino a 6 m di altezza  Ottimo
rapporto tra fibra lunga, fibra corta e
canapulo  Il contenuto in fibra oscilla
tra il 15-20%

Varietà monoiche  Piante poco


vigorose, alte massimo 2-3 m  Ottimo
rapporto tra fiori maschili e femminili
(1:1)  Basso contenuto in THC  Alto
contenuto in CBD (o altri cannabinoidi)
Fibra corta Seme Infiorescenze

MONOICISMO: Hanno sessi separati ma all’interno della stessa pianta,


fenomeno presente circa nel 7% delle angiosperme, una delle piante esempio: mais. Un esempio delle piante
monoiche, si tratta della specie delle Cucumis ( ), grande variabilità sotto questo punto di vista. Nelle
cucuminaceae sono presenti i 4 tipi di distribuzione dei sessi nella pianta:
Monoico: G_A_ [Azione di due loci complementari: Gynoecious (G) Andromonoecious
(A)]
Ginoico o subginoico: ggA_→ tutti i fiori hanno caratteristiche femminili
Andro-monoico: G_aa → i fiori maschili si succedono a fiori ermafroditi
Ermafrodita o sub-ermafrodita: ggaa
Anche questi geni agiscono dopo i geni dell’identità degli organi In melone il gene A = ACS7 (gene coinvolto
nella biosintesi dell’etilene)
Gynoecious→quando mutato da alle linee ginoiche oppure alle linee ermafrodite; imp per lo sviluppo
maschile
Andromonoecious→ deve essere presente quando la linea monoica, o ginoica, la recessività a questo locus
comporta l’andromonoicismo (assenza di fiori completamente femm), o ermafrodidismo (assenza di fiori
femm), imp per lo sviluppo femminile. Di recente si sono identificati i geni ed è stato visto che A =ACS7;
coinvolto nello sviluppo della parte femm e auxina. Etilene è considerato un fattore femminilizzante.
Tante volte pero possono essere anche i fattori ambientali che spostano l’equilibrio in un senso o in un altro,
es ormonali, etilene e auxina→inducono sviluppo femm; gibberelline→imp per lo sviluppo maschile; anche
i patogeni!!
fattori esterni (labile sex expression) 1) Fattori ambientali (fotoperiodo, temperatura, elementi nutritivi) 2)
Fattori ormonali etilene/IAA  fattori femminizzanti GAs  fattori mascolinizzanti 3) Attacchi di patogeni (in
orzo l’attacco di carbone porta femminizzazione del pennacchio). Linee inbred ginoiche di cetriolo (gg A_)
vengono mantenute per autofecondazione dopo aver stimolato lo sviluppo di fiori maschili con applicazioni
di gibberelline. Con alcuni fitoregolatori, ottenere lo sviluppo di una funzione che normalmente non è
presente.
Le piante a volte ricorrono anche a fattori MORFOLOGICI:

La distribuzione dei sessi e


la morfologia fiorale
influiscono notevolmente
sul comportamento
riproduttivo delle piante in
termini di sistema di
unione e quindi di struttura
delle popolazioni. In linea
generale l’ermafroditismo
favorisce
l’autofecondazione,
mentre il dioicismo
favorisce (o obbliga) la
fecondazione incrociata.
Usualmente i fiori sono
aperti al momento della
fecondazione
(casmogamia); in alcune
specie come ad esempio il
frumento i fiori sono chiusi al momento della fecondazione (cleistogamia) favorendo così
l’autoimpollinazione (cfr. 4.1.).
Anche nelle specie ermafrodite esistono meccanismi per favorire l'alloincrocio. Essi sono di due tipi:
1) - Meccanismi morfologici:
Ercogamia: posizione degli stigmi e delle antere che rende impossibile l'autofecondazione. E' frequente nel
genere Orchis.
Eterostilia: diverse dimensioni di stami e stili nella Primula (fiori eteromorfi).
2) - Meccanismi fisiologici e biochimici.
Da un punto di visto fisiologico, la maturazione contemporanea di stami e pistilli (omogamia) favorisce
l’autofecondazione, mentre la maturazione di stami e pistilli dello stesso fiore in tempi diversi (dicogamia)
favorisce l’incrocio. In questo caso una specie si definisce proterandra (o protandra) quando maturano
prima i gameti maschili e proterogina (o protogina) quando maturano prima quelli femminili.
Altri fattori fisiologici che favoriscono l’alloincrocio sono la maschiosterilità (Cap. 5) e l’autoincompatibilità
(Cap. 6). La prima si differenzia dalla seconda per il fatto che il gamete maschile non è funzionale, mentre
nell'autoincompatibilità ambedue i gameti sono funzionali, e l'alloincrocio viene garantito bloccando lo
sviluppo del tubo pollinico dei granuli in caso di autofecondazione.
La maschiosterilità: condizione patologica delle piante che determina la sterilità della funzione
maschile. Imp nel breeding. → molte cultivar vengono sviluppate sottoforma di ibridi F1, cioè il prodotto di
un incrocio tra due parentali A-B. se vogliamo che tutto il seme che si produce venga dall’incrocio bisogna
che il parentale A sia EMASCULATO, ossia sia privato della funzione maschile. La maschiosterilità è un modo
per emasculare geneticamente le piante.
STERILITA’: (incapacità di un individuo di dare progenie vitali)→sito di determinazione; di tipo:
-Gametica (maschile/femminile)
-Zigotica (embrione)
Causa della sterilità
Cromosomica dovuta a poliploidia, aneuploidia, etc.
Genica dovuta alla mancata funzionalità di singoli geni→ quelle che ci interessano di più
Naturale mutazioni spontanee
Indotta mutazioni indotte con agenti mutageni
Artificiale ottenuta per via biotecnologica
Permanente penetranza/espressività stabili→la maschiosterilità è sempre presente
Condizionale penetranza/espressività variabili→quando questi parametri sono variabili
Utilità della maschiosterilità 1) Emasculazione genetica (ibridi F1)→emascularità
2) Evitare fruttificazione (prodotto veget.)
3) Allungare la durata della fioritura→dovuta ad una non fertilità
4) Contenimento transgeni→contenere polline
Lo sviluppo di ibridi F1, è considerato importante principalmente per due fattori; innanzitutto consente di
sfruttare l’eterosi, fenomeno di vigore che nella generazione F1 si presenta fortemente, ed uniformità degli
ibridi F1, e poi è una forma di costituzione varietale che protegge la tecnologia, infatti non può essere
coltivato dal consumatore e quindi per l aziende sementiere è un fatto utile e positivo.
1) Selezione delle piante di base (ecotipi, pop. da sel. ricorrente) 2) Costituzione delle inbred
(introgressione e autofecondazione) 3) Valutazione delle inbred per AGC e ASC 4) Produzione di seme
per il commercio→
1) Emasculazione → meccanica ( ad esempio il mais con falce i pennacchi, in pomodoro si asportano
manualmente le antere), chimica, fisica, genetica (maschiosterilità)
2) 2) Trasferimento
del polline
La sterilità può essere il
risultato di fattori
ambientali, di situazioni
citoplasmatiche, di
incompatibilità fra embrione
ed endosperma, di fattori
squisitamente genetici
segreganti da eterozigoti ed il
cui effetto rilevante è
appunto il condizionamento
della fertilità. La sterilità può
anche derivare da poliploidia
o da aneuploidia ed allora, in
contrasto alla precedente,
detta genica, è invece cromosomica.

La maschiosterilità è caratterizzata da mancata produzione di gameti maschili o da produzione di gameti


maschili non funzionali. Il fenomeno può riguardare anche i gameti femminili, sia pure molto più
raramente. Nelle popolazioni naturali la maschiosterilità, a differenza dell'incompatibilità, non è un
meccanismo comune. Nelle popolazioni autogame ed allogame le piante maschiosterili compaiono solo
sporadicamente, come conseguenza di mutazioni che interessano qualcuno dei molti geni che controllano
i diversi passaggi della microsporogenesi e della microgametogenesi. Questi mutanti sono senz'altro
deleteri per le popolazioni e vengono pertanto eliminati dalla selezione naturale, ma sono interessanti ed
utili per il miglioramento vegetale perché costituiscono dei mezzi per emasculare geneticamente le piante.
L'uso di questo tipo di sterilità consente di semplificare e, in alcuni casi, di rendere possibile la produzione
commerciale del seme ibrido.

La maschiosterilità naturale è controllata da meccanismi di tipo genetico, citoplasmatico, e genetico-


citoplasmatico.

Tratteremo la maschiosterilità in quanto un alterazione della biologia riproduttiva lasciando alcuni dettagli
nel suo uso nel miglioramento genetico a quando discuteremo della costituzione delle varietà ibride.
Maschiosterilità in base al tipo di controllo genetico che la determinano:
Genetica, GMS → mutazione di geni nucleari
Citoplasmatica, CMS → dovuta a fattori citoplasmatici (eredità materna)
Genetico citoplasmatica, G-CMS → dovuta a fattori citoplasmatici, ma superabile con l’attività di geni
nucleari ristoratori.
La maschiosterilità genetica è dovuta a fattori di mutazione di geni nucleari. Le mutazioni in genere sono
mutazioni recessive e qualsiasi mutazione che alteri la funzione di un gene chiave in tutto lo sviluppo maschile
è possibile che crea maschiosterilità. In tutto lo sviluppo maschile si intende dall’inizio dell’identità degli stami
( e quindi modellino ABC) ma anche qualsiasi tipo di mutazione che controlla la microsporogenesi, la
microgametogenesi ed anche la deiscenza delle antere, il rilascio del polline ambiente.
Quando la maschiosterilità è dipesa da: geni che controllano lo sviluppo dello stame (es. geni omeotici,sl-2;
ad esempio di poeseo da geni della classe B) → sterilità STAMINALE; sviluppo dle polline, Microsporogenesi
/ microgametogenesi → sterilità POLLINICA; Deiscenza delle antere (es. ps-2) → sterilità FUNZIONALE
→ sterilità STAMINALE: mutazioni geni MADS-box di classe B
Classe B : Apetala3 Pistillata (pi-2)→in Arabidopsis; Deficiens Globosa → in Antirrhinum; nelle solanaceae
sono rispettivamente duplicati, sono paraloghi tra loro ed ortologhi rispetto ad apetala e pistillata: SlDEF(
stamen less deficiens) TM6 SlGLO1 SlGLO2 (globosa)→ in tomato.
Pi-2: porta petalo sepaloide e stame carpelloide
Ps-2: gene funzionale

5.1. Maschiosterilità genetica


La maschiosterilità genetica dipende da un gene singolo ed è stata trovata in molte specie coltivate. L'allele
per la maschiosterilità è ordinariamente recessivo e le piante maschiosterili (ms ms) si conservano
mediante incrocio con piante maschiofertili eterozigoti (Ms ms). Metà delle progenie risulterà sterile (ms
ms), e metà fertile eterozigote (Ms ms) (Fig. 21a). In Fig. 22 è riportata a titolo di esempio una lista di
mutanti maschiosterili descritti in pomodoro, unitamente al momento dello sviluppo maschile che è
alterato in ciascuno di essi.
L’utilizzo della maschiosterilità genetica per la produzione di seme ibrido è limitato dal fatto che nel campo
di produzione del seme gli individui maschiofertili che risultano dalla segregazione della linea portaseme
devono essere eliminati precocemente. Questo diventa possibile solo quando esiste un marcatore genetico
utile per distinguere gli individui fertili da quelli sterili (cfr esempio girasole in modulo genetica produzione
sementiera) oppure nel caso che l’incrocio venga realizzato manualmente, allorchè si ha modo di
esaminare una per una le piante da usare come portaseme (es. pomodoro).

La maschiosterilità genetica è un sistema ideale nella produzione di seme ibrido F1, perche se voi avete una
linea porta seme maschiosterile, quindi con una mutazione recessiva, msms, ed avete un impollinante, quindi
parentale B, MsMs, che è un genotipo maschiofertile OMOzigote, tutta la progenie è maschiofertile
eterozigote. Tuttavia questo utilizzo presenta delle complicanze ed obbligazioni, perche nel momento si
vuole moltiplicare la linea porta-seme, cioè moltiplicare la linea parentale A, msms, è IMPOSSIBILE FARLO
TRAMITE AUTOFECONDAZIONE PERCHE → la linea è sterile. Allora le possibilità sono quelle di moltiplicarla
vegetativamente, ma se deve essere moltiplicata per seme l’unica possibilità è quella di incrociare il
maschiosterile eterozigote, Msms, che sia quasi isogenico; imp questo aggettivo perche noi non vogliamo
con questo incrocio alterare il genoma della linea maschiosterile che abbiamo selezionato per tanti caratteri
utili ecc, ovviamente essendo però il parentale eterozigote, noi avremo una progenie che al 50% fertile e 50%
sterile, ed in questo bisogna avere un sistema di selezione per eliminare gli individui maschiofertili; basato su
diversi tipi di Marcatori. Difficoltà nella trasmissione della varietà portaseme. Ragion per cui → non è
utilizzato questo approccio con facilità e quindi è stata adottata una soluzione→ mutazione di tipo
CONDIZIONALE: Maschiosterilità genetica “condizionale”. Sono state reperite in alcuni cereali . che significa
condizionale? Che la stabilità non è sempre al 100% ma dipende in qualche modo da alcune condizioni
ambientali [fotoperiodo (P), temperatura (T), intensità luminosa (LI), umidità relativa (RH), fattori edafici,
nutrienti, pH (SF)]. Se si può adottare questa strategia, possono esserci Condizioni restrittive = Alta
penetranza e/o espressività = Sterilità→ seme ibrido oppure Condizioni permissive = Bassa penetranza e/o
espressività = Fertilità → si può autofecondare la linea portaseme.
Penetranza: capacità di un allele (dominante o recessivo) di manifestarsi a livello fenotipico. L’omozigote AA
fenotipo diff da omozigote aa→ completa; in alcuni casi AA presentano un fenotipo simile ad aa→incompleta
Espressività: misura quantitativa dell’espressione di un fenotipo penetrante in base all’amb

nella produzione di produzione di seme ibrido è fondamentale che non ci siano fiori
condizionali e quindi dei semi dovuti ad autofecondazione o a incrocio di individui della linea
A.
Mutante 7B-1 di pomodoro (sterilità condizionale); espressività dipende dal fotoperiodo. Mutante del gene
di classe B.
Penetranza:
La frequenza (in percento) con cui un gene (dominante o omozigote recessivo) o una combinazione di geni
si manifesta nel fenotipo degli individui che la portano. La penetranza (così come l’espressività) dipende
sia dal genotipo (ossia dalla presenza di geni modificatori) che dall’ambiente. Se meno del 100% degli
individui che portano un certo genotipo manifesta il fenotipo caratteristico, allora si dice che la penetranza
è ridotta o incompleta.
Espressività:
Indica l’espressione fenotipica (tipo o grado) di un gene o genotipo che ha penetranza e che può essere
leggera, intermedia o severa. L’espressività può essere descritta in termini qualitativi e quantitativi.
L’espressività (così come la penetranza) dipende sia dal genotipo (ossia dalla presenza di geni modificatori)
che dall’ambiente. Può essere costante o variabile.

La maschiosterilità citoplasmatica: nelle fonti invece di maschiosterilità citoplasmatica, il difetto che


comporta la sterilità maschile→ alleli non funzionali da geni plastidiali (cpDNA) o più spesso, mitocondriali
(mtDNA), presenta tipica trasmissione materna (extracromosomica) e l’interferenza è sulle funzioni del
tappeto. E’ stata individuata in molte (non tutte) specie in interesse agrario. La progenie presenta di fatto il
genotipo della pianta madre, perche sappiamo che il citoplasma è ereditato quasi interamente dalla pianta
madre. Quando utilizziamo una fonte citoplasmatica come la linea MASCHIO STERILE insieme ad un MASCHIO
FERTILE avremo la produzione di seme che pero eredita per la
totalità il citoplasma maschiosterile. La propagazione della linea maschiosterile avviene
con facilità per incrocio con una linea quasi
isogenica maschiofertile (mantainer line)

l’interesse di questo tipo di mutazione è dovuta dalla facilità con cui si moltiplica la linea portaseme.
Basta utilizzare una linea MANTAINER , cioè quasi isogenia, CIOè che ha una costituzione genetica
praticamente identica a quella del porta seme SOLO che è fertile, e quindi ha polline. Impollinando poi questa
con la porta seme avremo una progenie totalmente maschiosterile e uguale alla porta seme.

5.2. Maschiosterilità citoplasmatica


Un secondo tipo di maschiosterilità è legato a fattori citoplasmatici. In questo caso sono maschiosterili le
piante che possiedono un particolare citoplasma. Questo tipo di maschiosterilità è stato utilizzato per la
prima volta per produrre seme ibrido in cipolla. Quando si origina spontaneamente per mutazione, come
in cipolla, la maschiosterilità citoplasmatica viene detta autoplasmica. Si definisce invece alloplasmica
quando è dovuta alla presenza di un citoplasma di una specie diversa (es. Fig. 21bis). Tali piante possono
produrre seme solo in presenza di piante impollinatrici. Il seme dà solo piante maschiosterili perché il
citoplasma viene fornito interamente dalla pianta madre (Fig. 21b).

La maschiosterilità genetico-
citoplasmatica: difatto è una
maschiosterilità citoplasmatica,
sfrutta però la possibilità di
utilizzare dei geni nucleari che
consentono la ristorazione della fertilità. Geni scoperti in diverse specie, per diverse fonti di maschiosterilità
, a partire dagli anni 50’, sistemi come mais ecc… sono geni nucleari a comportamento DOMINANTE. La linea
impollinante, oltre ad avere citoplasma fertile, ha i geni in OMOzigosi gli alleli dei geni ristoratori→ tutto il
seme ibrido, avrà il citoplasma maschiosterile, ma all’interno del nucleo eredita un allele dominante per il
gene ristoratore, e questo determina un recupero della fertilità; quindi in questo modo utilizziamo un
portaseme maschiosterile citoplasmatico, con tutti i vantaggi che ne derivano, ed abbiamo un seme ubrido
maschiofertile con tutti i vantaggi che ne derivano.
5.3. Maschiosterilità genetico-citoplasmatica
Il terzo tipo di maschiosterilità differisce dal secondo solo perché le progenie delle piante maschiosterili
citoplasmatiche non sono necessariamente maschiosterili, ma possono risultare fertili quando vengano
usati particolari impollinatori. I genitori maschili capaci di dare progenie maschiofertili sono dotati di geni
che permettono la produzione di polline fertile su piante con citoplasma maschiosterile. La maschiosterilità
citoplasmatica viene pertanto convertita in maschiosterilità genetico-citoplasmatica con la scoperta di geni
ristoratori (R).
In presenza di citoplasma per la maschiosterilità il genotipo delle piante maschiosterili è rr mentre quello
delle piante con fertilità ristorata sarà RR o Rr. Le progenie di piante maschiosterili citoplasmatiche (rr),
possono essere di tipo differente a seconda degli alleli presenti al locus R del genitore maschile. Tale
genitore può avere costituzione genetica rr se possiede citoplasma normale (N) ma deve essere per forza
Rr o RR in presenza di citoplasma maschiosterile S.

Il primo sistema di maschiosterilità genetico-citoplasmatico che è stato studiato in mais, è stato utilizzato e
poi osservato tutti i geni responsabili ristorat. → CMS: URF13, componente della membrana mitocondriale,
Rf1: alcool deidrogenasi in grado di reprimere l’espressione di URF13 (Schnable e Wise, 1997). L’effetto del
citoplasma T
Completa assenza di antere sul pennacchio: citoplasma T. Molto utilizzato ma
poi si è visto che portava difatto , perche portava a molte suscettibilità di
patologie di tipo funghinee→ epidemie.

Alcuni esempi geni ristoratori

Zea mays – origine spontanea - Rf1, Rf2 (citoplasma T) Rf3 (citoplasma S)


Altri (citoplasma C)

Beta vulgaris – origine Spontanea - X e Z

Triticum aestivum, Rf1-Rf5 ; origine sterilità T. durum T.


Timopheevi e altre specie Aegilops e Secale

Esempio a tre linee→ La linea A, sempre centrale


in tutti gli schemi di produzione di ibridi, s-rf; la
linea impollinante di destra possiede RfRf!!!

La linea A si moltiplica incrociando con La linea B,


quasi ISOGENICA ad A, e non possiede geni
ristoratori, citoplasma fertile. incrociandola non
comportiamo nessun cambiamento genico della
linea A MAAAA→otteniamo la moltiplicazione!

La linea Re B si moltiplicano per


autofecondazione.

SFRUTTAMENTO DELLA TRANSGENESI:


Maschiosterilità ‘artificiale’ biotecnologica. Si sono messi appunto diversi approcci biotecnologici per
ottenere la maschiosterilità. Questi sistemi sono stati adottati in alcune specie quando la maschiosterilità
genetica non era disponibile, ma soprattutto rappresentano un evento storico di transgenesi perche sono
stati dei primi prodotti transgenici di prima generazione che sono stati messi sul mercato ad opera per altro
da studi di una ricercatrice italiana, Celestina Mariani. AVEVA LA SEQUENZA tappeto specifica DI TABACCO,
Promotore tappeto specifico di tabacco, TA29, ovvero quella regione dell’antera che sta strettamente a
contatto con il loculo che contiene il polline, le microspore. La mariani mise appunto un costrutto eterologo,
dove inserì Gene per una citotossina, BARNASE, enzima rnasi, derivato da un batterio. In questo modo le
piante che esprimevano questo costrutto, inducevano l’ablazione e quindi la maschiosterilità. Dopo due anni
, sempre la Mariani, associò a questa fonte di maschiosterilità la possibilità di associare un gene ristoratore,
e questo gene ristoratore è stato fatto utilizzando l’inibitore del BARNASE, isolato sempre dallo stesso
batterio, bacillus amyloliquefaciens. Con un portaseme portatore di BARNESE, quindi maschiosterile, ed un
impollinante portatore di BARSTAR, si ottiene un ibrido F1 che possiede fertilità ristorata e quindi
perfettamente fertile. questo ovviamente richiede due individui transgenici di prima generazione, dove si
utilizzano sequenze di enzimi citotox da organismi di regno molto lontani. Rilevato molto utile nel COLZA.
Recentemente è stato dimostrato che è possibile arrestare la funzionalità delle antere utilizzando geni
artificiali ottenuti con tecniche di biologia molecolare e trasferiti in pianta con tecniche di ingegneria
genetica.
Ad esempio è stato costituito un costrutto genico chimerico contenente un promotore specifico del
tappeto dell’antera, isolato da tabacco, e la sequenza codificante di un enzima ribonucleasi, chiamata
BARNASI perché isolata dal Bacillus amyloliquefaciens (Bacillus amyloliquefaciens + RNAasi) (Fig. 23).
Questo enzima ha la capacità di distruggere l’RNA. Inserito in pianta, il transgene si esprime solo nelle
cellule del tappeto, distruggendone l’RNA e rendendo le piante incapaci di produrre polline vitale
(maschiosterili). Le piante ingegnerizzate, infatti, evidenziano antere con cellule del tappeto distrutte, fatto
che impedisce la formazione del polline. Questo costrutto costituisce quindi un meccanismo che conferisce
maschiosterilità di tipo genetico. Successivamente è stata individuata la sequenza genica codificante la
proteina in grado di inibire tale RNAasi (BARSTAR). Piante che contengono il costrutto con questa sequenza
combinata allo stesso promotore tappeto specifico, quando incrociate con quelle maschiosterili,
proteggono le cellule del tappeto e ristorano così la fertilità. Questo sistema, che a tutti gli effetti può
sostituire una maschiosterilità genetico-citoplasmatica, può teoricamente essere “inserito” e sfruttato in
tutte le specie; fino ad oggi ha avuto molto successo ad esempio in colza e in lattuga.

Esempi: Bucciaglia e Smith, 1994, PMB 24:903 Worral et al 1992. Sempre attraverso il TA29, lo associa ad
un enzima β-1-3-glucanasi (scinde il callosio, polisaccaride che durante la meiosi circonda le cellule meiotiche
e poi le tetradi e poi deve essere idrolizzato ad un certo momento; solitamente avviene in tabacco nello
stadio di 11, 13 millimetri; il costrutto faceva esprimere prima, e quindi quando era nello stadio 8,9
millimetro, e quindi questo evento comportava la maschiosterilità). Approccio CIS-GENICO. Tutte le seq
derivano dalla stessa pianta.
Sennò…….SILENZIAMENTO GENICO! → Bcp1 (Brassica campestris pollen protein 1), is active in both diploid
tapetum and haploid microspores and is required for pollen fertility. Un gene fondamentale nella fase di
microsporogenesi, in colza, colture che aveva bisogno di sterilita, è stato attivato mediante rna-antisenso.
Tramite editing genomico, e quindi CRISPR E TALENs→ TOPPE DEL TOPPE DEO CARO. Con questo si vola alto.
Non lasciano TRANSGENE nella pianta.
FEMMINO-STERILITA. Goldman, Goldberg and Mariani, 1994, EMBO J. 13:2976. Aveva identificato gene
STIGMA SPECIFICO. Specialmente IL tessuto di secrezione dello stigma in tabacco . AL PROMOTORE DI
QUESTO GENE LA Mariani fuse la sequenza della BERNASE, e quello che ottenne, una pianta completamente
normale ma con ablazione dello stigma, ed impediva la germinazione del polline. Nota interessante→
siccome si sa che l’essudato dello stigma normale contiene soprattutto sostanze lipidiche, la Mariani fece una
serie di esperimenti per vedere se il polline germinava con l’aggiunta di olio. Con olio di oliva ottenne la
germinazione del seme. PERCHE???? Allora si osservarono le componenti funzionali dell’olio di oliva;
trigliceridi semplici.
Self-Incompatibility (SI) autoincompatibilità. Meccanismo che
hanno evoluto molte piante al fine di evitare l’autofecondazione. In questo modo ogni pianta produce
ovuli fertili e polline fertile, ma l’autopolline è incapace di autofecondare. Appare evidente che la prima
cosa da fare per verificare se una pianta è autoincompatibile è di tentare delle auto-impollinazioni forzate,
previo isolamento di fiori o infiorescenze così da evitare qualsiasi impollinazione incrociata accidentale. Un
controllo, costituito da fiori trattati allo stesso modo, ma con impollinazione manuale incrociata, su fiore
castrato e su fiore non castrato, dovrebbe sempre accompagnare queste prove per dimostrare l'impossibilità
dell'auto-fecondazione di queste piante e nel contempo la riuscita della fecondazione incrociata.
Se l'incrocio manuale dà dei semi fertili mentre l'autofecondazione non dà niente, si avrà una prima indicazione
su un possibile fenomeno di auto-incompatibilità.
Per escludere tutte le interpretazioni sbagliate, sarà utile fare qualche controllo e, per prima cosa, rilevare la
normale fertilità dei gameti. E' quasi sempre possibile con un rapido test citologico eseguito su polline maturo,
verificare, colorandolo con carminio acetico, che la grande maggioranza dei granelli di polline assuma una
bella colorazione rossa e sia di diametro uniforme, dimostrando che la gametogenesi maschile è normale. Se,
al contrario, questo test mostra che una grande quantità di polline è vuoto, e dunque non si colora col carminio
acetico, o ancora, che i grani di polline sono rossi ma di diametro estremamente variabile, questo rappresenta
un'indicazione di uno sviluppo anormale della gametogenesi maschile che è probabilmente la causa della
sterilità del polline e, di conseguenza, dell'auto-sterilità delle piante o della cultivar.
Un'altra importante caratteristica della specie auto-incompatibile è che le talee, o qualsiasi tipo di propagazione
vegetativa di una pianta auto-incompatibile, moltiplicano lo stesso genotipo in più copie che sono ovviamente
non soltanto autoincompatibili, ma anche incompatibili per incrocio fra di loro. Si spiega così l'incompatibilità
totale di un campo monoclonale di una specie auto-incompatibile che può essere rimossa soltanto
dall'introduzione di qualche pianta impollinatrice della stessa specie di genotipo diverso.
La prima descrizione di sistemi auto-incompatibili fu proprio ad opera di Darwin il quale non conosceva il
meccanismo fisiologico che stava dietro questa cosa, ma noto che in alcune specie esistevano dei fiori con
degli organi fiorali sviluppati in modo diverso. Caso della primula, fiori a spillo→ pistillo lungo, stami
accorciati; fiori a spazzola→ pistillo corto, stami allungati. Aldilà di un meccanismo morfologico che facilita
l’impollinazione da parte degli insetti, era stato evidente che il polline di un fiore a spillo, non riusciva a
fecondare il pistillo dello stesso fiore a spillo, e la stessa situazione avveniva nel fiore a spazzola ma riusciva
a impollinare il pistillo di un fiore diverso. Da allora i fenomeni di auto-incompatibilità sono stati descritti in
molti generi, circa 250. Fenomeno importante nel miglioramento genetico poiché rende impossibile
l’autofecondazione di una pianta. L’autofecondazione è un evento che si basano molti schemi di
miglioramento genetico. L’auto-incompatibilità imp per costituire seme ibrido e produzione sementiera,
poiché mescolando due cloni auto-incompatibili, avremo tutto seme da impollinazione incrociata, ed è imp
nella produzione commerciale, dove il frutto ed il seme è il prodotto commerciale, e quindi è necessario che
ogni varietà produttiva abbia il suo impollinatore.
Importanza: a) Miglioramento genetico (selfing impossibile) b) Produzione sementiera (seme ibrido) c)
Produzione commerciale (produzione e
allegagione) Verifica: 1) Provare
autofecondazioni forzate (controllo
cross) 2) Verificare la fertilità dei gameti
3) Incrociare piante dello stesso clone
(geitonogamia) Conseguenze: a)
allogamia al 100% b) impossibile
autofecondare c) impossibile avere
linee omozigoti d) difficile studiare
eredità dei caratteri
Un numero notevole di specie vegetali
pur formando gameti perfettamente
funzionali sono incapaci di formare dei
semi per auto-impollinazione. Questo
fenomeno, che si riscontra in
approssimativamente 250 generi
diversi, ripartiti fra più di 70 famiglie di angiosperme, è chiamato autoincompatibilità (AI, self-
incompatibility) e può essere meglio definito dicendo che corrisponde “all'incapacità per una pianta con
fiore ermafrodita e fertile, di produrre degli zigoti dopo autoimpollinazione” (De Nettancourt).
E' ovviamente molto importante per la scelta dei metodi più indicati per migliorare una specie coltivata,
conoscere la sua biologia fiorale. A questo scopo è fondamentale sapere se questa pianta può essere
sottoposta ad autofecondazione, o se al contrario è una pianta a stretta allogamia. In questo secondo caso
è necessario accertarsi se questa è auto-incompatibilità o se questa allogamia è dovuta a qualche altro
fenomeno come, per esempio, una maschio sterilità, una protandria, una protoginia o, ancora, a sterilità
per cause di altro tipo, come per esempio la triploidia, l'aneuploidia ecc.
Appare evidente che la prima cosa da fare per verificare se una pianta è autoincompatibile è di tentare
delle auto-impollinazioni forzate, previo isolamento di fiori o infiorescenze così da evitare qualsiasi
impollinazione incrociata accidentale. Un controllo, costituito da fiori trattati allo stesso modo, ma con
impollinazione manuale incrociata, su fiore castrato e su fiore non castrato, dovrebbe sempre
accompagnare queste prove per dimostrare l'impossibilità dell'auto-fecondazione di queste piante e nel
contempo la riuscita della fecondazione incrociata.
Se l'incrocio manuale dà dei semi fertili mentre l'autofecondazione non dà niente, si avrà una prima
indicazione su un possibile fenomeno di auto-incompatibilità.
Per escludere tutte le interpretazioni sbagliate, sarà utile fare qualche controllo e, per prima cosa, rilevare
la normale fertilità dei gameti. E' quasi sempre possibile con un rapido test citologico eseguito su polline
maturo, verificare, colorandolo con carminio acetico, che la grande maggioranza dei granelli di polline
assuma una bella colorazione rossa e sia di diametro uniforme, dimostrando che la gametogenesi maschile
è normale. Se, al contrario, questo test mostra che una grande quantità di polline è vuoto, e dunque non
si colora col carminio acetico, o ancora, che i grani di polline sono rossi ma di diametro estremamente
variabile, questo rappresenta un'indicazione di uno sviluppo anormale della gametogenesi maschile che è
probabilmente la causa della sterilità del polline e, di conseguenza, dell'auto-sterilità delle piante o della
cultivar.
Un'altra importante caratteristica della specie auto-incompatibile è che le talee, o qualsiasi tipo di
propagazione vegetativa di una pianta auto-incompatibile, moltiplicano lo stesso genotipo in più copie che
sono ovviamente non soltanto autoincompatibili, ma anche incompatibili per incrocio fra di loro. Si spiega
così l'incompatibilità totale di un campo monoclonale di una specie auto-incompatibile che può essere
rimossa soltanto dall'introduzione di qualche pianta impollinatrice della stessa specie di genotipo diverso.
FENOMENO CHE HA IMPLICAZIONI SIA NELLO STUDIO CHE MIGLIORAMENTO GENETICO.
Sono stati descritti diversi meccanismi di auto-incompatibilità, si pensa che addirittura esistano diverse
decine di sistemi molecolari non correlati tra di loro, e da un punto di vista di numero di loci che sono coinvolti
nel processo di AI abbiamo sistemi MONO
fattoriali o POLI fattoriali, a seconda se il locus
sia uno o più. In relazione della morfologia
stutturale→a) omomorfico (fiori tutti uguali)
b) eteromorfico (fiori diversi tra loro,
brevistili/longistili). La divisione più imp è
basata sullo stadio di determinazione, ossia
sul momento in cui avviene la determinazione
del fenotipo pollinico→a) AI gametofitica (il
genotipo pollinico determina il fenotipo) b) AI
sporofitica (lo sporofito della pianta
determina il fenotipo).

L'auto-incompatibilità è una caratteristica


specifica ereditaria che impedisce l'unione
fertile dei due gameti attraverso una reazione di riconoscimento fra polline e pistillo dovuta a specifici
prodotti genici o caratteri fenotipici.
Questo meccanismo genetico può essere controllato da un solo gene, chiamato S (per Self-incompatibility)
e sarà dunque monofattoriale, o controllato da pochi geni e qualificato allora come polifattoriale.
L'impossibilità del gamete maschile di raggiungere il gamete femminile si manifesta a diversi stadi dopo
l'impollinazione. La crescita del budello pollinico viene molto spesso arrestata nelle papille stigmatiche o
nello stilo, e l'incompatibilità è qualificata stigmatica o stilare; più raramente la barriera è nell'ovario e si
parla allora di incompatibilità ovarica.
Tuttavia, fra le diverse famiglie delle piante esistono due sistemi completamente differenti nella
determinazione dell'incompatibilità, in relazione al controllo genetico del fenotipo del granello di polline.
In pratica, quando il sistema d'incompatibilità è monofattoriale, è sotto il controllo d'un solo gene S, con
una grande quantità di alleli S1, S2, S3 ...... Sn (serie multiallelica). In questo sistema poliallelico ogni pianta
diploide possiede due alleli S, per esempio S1, S2, mentre i suoi gameti ovviamente ne avranno uno solo e
saranno S1 o S2 (Fig. 26). In questo sistema, il genotipo del grano di polline determina il suo fenotipo, e
dunque, una microspora con l'allele S1 esprimerà soltanto questo S1, e l'incompatibilità è qualificata
gametofitica.
Nel secondo sistema, il comportamento del grano di polline (il suo fenotipo) è determinato dal genotipo
della pianta diploide che l'ha formato, quindi si comporta come se portasse due alleli S, anche se è una
cellula diploide. In pratica, una pianta con un solo gene S ma con due alleli, S dominante e s recessivo,
esprimerà S in tutti i suoi grani di polline indipendentemente dal fatto che questi portino l'allele S oppure
s. L'incompatibilità è detta sporofitica perché il fenotipo dello sporofito diploide determina il
comportamento del gamete aploide.
Infine, la barriera di AI si può manifestare fra fiori perfettamente simili tra loro o, al contrario, come
avviene in Primula, fra fiori che differiscono tra di loro morfologicamente, soprattutto per la lunghezza
dello stilo e dei filamenti staminali. Nel primo caso si qualifica il sistema d'incompatibilità come
omomorfico e nel secondo caso come eteromorfico.
AI gametofitica i sistemi gametofitici quelli più studiati sono di tipo mono-fattoriali, ossia il controllo
genetico di questo comportamento è dovuto da un singolo locus, S. In questo locus ci sono alleli multipli,
avvero la possibilità di avere diverse forme alleliche e ovviamente ogni pianta porta due alleli diversi nel locus
S. Nell’INCOMPATIBILITA GAMETOFITICA una pianta che porta alleli S1 E S2, produce polline che contiene al
50% S1 ed al 50% S2 . Il fenotipo del polline (IMPRONTA MOLECOLARE) è dato dall’allele che porta
(codominanza) . ovviamente se il polline S1 E S2 arriva sul pistillo di una pianta, S1 E S2, è chiaro che non c’è
nessuna possibilità di impollinazione. Se invece il polline è prodotto con un allele S1 ed S3 , ed arriva sul
pistillo S1 ed S2, S3 avrà la possibilità di fecondare. -Può essere totale (primo esempio) , parziale (secondo
esempio, 50%) o nulla (terzo esempio/ 100%) -Riconoscimento e reazione a livello del TT stilare (al momento
di transizione da crescita ‘autotrofa’ a crescita ‘eterotrofa’).

→completa possibilità di fec


La determinazione gametofitica del fenotipo pollinico si spiega dal fatto che le proteine polliniche che stanno
alla base del riconoscimento sono sintetizzate dopo l’avvenuta meiosi, quindi dopo la cellularizzazione delle
microspore. È all’interno del gametofita che si determina se un granulo pollinico possiede le proteine di tipo
adatto. Con esperimenti di genetica formale si è potuto osservare che è determinato da un controllo
monogenico.
Incrociando due piante «fully compatible» e interincrociando tra di loro le piante della progenie si trovano le
seguenti categorie - ¼ of combinations are fully compatible - ¼ are incompatible - 2/4 are partially
compatible.
Nel sistema gametofitico, il controllo genetico dipende dal locus S che è poliallelico. Il meccanismo genetico
è semplice e si basa sul fatto che ogni granello di polline può germinare e compiere la fecondazione a patto
che il particolare allele S di cui è portatore non sia presente nel tessuto diploide del pistillo. In altre parole,
la pianta diploide S1S2 avrà del polline S1 o S2, e sarà auto-incompatibile; mentre un granello di polline S3,
o uno S4, proveniente da una pianta S3S4, germinerà normalmente sullo stigma S1S2 e potrà assicurare la
fecondazione. Un'altra pianta che avesse il fenotipo S1S3, avrebbe soltanto la metà dei suoi granelli di
polline (gli S3) compatibile con il pistillo della pianta S1S2 (Fig. 26).
Il riconoscimento polline-pistillo e la reazione di AI avvengono a livello del tessuto di trasmissione dello
stilo. In caso di incompatibilità il tubo pollinico viene ricoperto da un deposito di callosio maggiore del
normale, che ne arresta la vitalità.
Il meccanismo che è stato studiato nelle solanacee è stato poi ritrovato in alcune rosaceae ma non si
conoscono e non è stato investigato il meccanismo molecolare in altre famiglie. Si sa che è di tipo
gametofitico e basta.

L’unico meccanismo che si conoscono le basi


molecolari, è quello studiato in papavero, oltre a quello
delle solanaceae, nelle papaveraceae hanno una peculiarità molto specifica.
Queste basi sono fondate su enzimi di tipo S-RNASE, cioè sono in grado di idrolizzare rna un po' come la
BERNASE. Visto il meccanismo fisiologico che si basa AI, e visto al fatto che un singolo locus doveva essere
responsabile di questo carattere fu chiaro fin dall’inizio che il locus S doveva essere un locus complesso, cioè
doveva essere un unità di trasmissione ereditaria che però comprendeva diverse sequenze codificanti, perché
è evidente che almeno una proteina doveva essere sintetizzata nel pistillo ed almeno una proteina doveva
essere sintetizzata nel polline. È chiaro che un gene che codifica per una proteina che è capace di creare un
ablazione nel tessuto è ovviamente un buon candidato . più allusivo invece era nella parte sintetizzata nel
polline. Solamente diversi anni dopo gli anni 80’ si riusci a capire qualcosa, combinando esperimenti di tipo
funzionali ma anche sulla sequenza. È stato visto che la proteina responsabile di AI sintetizzata NEL POLLINE,
è una proteina di tipo FBOX. →S-locus F-box protein (SLF) Proteina che è coinvolta nella formazione di un
complesso deputato alla degradazione di altre proteine; e quindi anche in questo caso si sposava bene come
determinante sul polline.
S1 DIFF DA S2 PER UN SITO DI RICONOSCIMENTO. Vengono veicolate in maniera passiva o attiva all’interno
del tubetto pollinico. All’interno del tubetto sono capaci di distruggere l’rna , e quindi potenzialmente
proteine citotox, tutta via all’interno del tubetto pollinico ci sono le proteine prodotte dal polline che sono le
SLF, cioè quelle proteine che vanno a formare un complesso che è capace di portare alla degradazione altre
proteine.

Proteine dello stilo = S-locus Rnases (SRN) [presentano 5 regioni conservate e due ipervariabili (responsabili
della specificità allelica); molte sequenziate (utilissimo per la selezione/genotyping!!!); non hanno specificità
di substrato. Il loro ruolo è stato dimostrato con esperimenti di ‘gain of function’ e di ‘loss of function’.
Proteina(e) del tubetto = cytosolic pollen RNase ‘inhibitor’; SLF (S-locus F-box protein) sono associate
fisicamente al locus S-RNAse (< 30 kb in Prunus); Hanno espressione specifica nel polline; mostrano alti livelli
di diversità allelica); Le proteine F-box sono coinvolte nella degradazione di proteine mediata dall’ubiquitina
Quindi il determinante del polline può essere un dominio della stessa proteina SL.
La proteina SLF è capace di legarsi all’RNAS e di porlarla a degradazione. Se non si lega, → porta alla sua
funzione citotox. La proteina del polline è una sola! Non come nel disegno che sono due. Quando arriva un
polline S3 in un pistillo S1/S2, CHIARAMENTE QUESTO POLLINE s3, POSSIEDE UN SLF che è in grado di legarsi
sia RNASI del S1 sia al RNASE del S2, e quindi l’allopolline è in grado di riconoscere tanti tipi di RNASI e di
degradarli tutti tranne quello identico a lui, quello sul suo stesso allele.
Ai gametofitica: meccanismo in poaceae. È un sistema a 2 loci.
Un controllo bifattoriale con serie polialleliche è noto nelle graminacee. I due loci (S e Z) sono indipendenti
e l'identità fra polline e stilo per uno solo dei due loci non porta ad incompatibilità, mentre se l'identità è
per tutti e due i loci si ha l'incompatibilità. Questo sistema bifattoriale è assai utile dal punto di vista del
miglioramento genetico perché il numero di specificità differenti è più alto in quanto corrisponde al
prodotto del numero di alleli che segregano ad ognuno dei due loci.

AI gametofitica: meccanismo in papavero l’unico sistema gametofitico che è stato


investigato a livello molecolare oltre quello basato sull’RNASI . lidentità dell’elemento dovuto al polline è
stato l’ultimo elemento che è stato identificato.

AI sporofitica ≠ AI gametofitica -il


fenotipo del polline è dato dagli alleli che porta la pianta
madre che l’ha prodotto , e quindi diciamo che nel
gametofitica la madre produceva due tipi di polline, S1 -
S2, nell’incompatibilità sporofitica la madre produce
solo un tipo di polline che avrà si un allele S1 -S2 MAAAA
a livello di proteina possiede entrambe, s1 ed s2.
(dominanza) →Può essere totale ( primo e secondo
caso) o nulla (terzo caso) -Riconoscimento e reazione a
livello tessuto stigmatico ( in gametofitica è stilare) .
una caratteristica della AI- SPOROFITICA è che abbiamo
dominanza di un allele in confronto di un altro, ossia di una funzione allelica rispetto all’altra.
Nel sistema sporofitico, la reazione del polline è determinata dal genoma del tessuto sporofitico diploide
entro il quale è stato formato, ed è dunque controllata da due alleli (Fig. 27). I due alleli possono reagire
indipendentemente o possono interagire fra loro per fenomeni di dominanza. Nella maggior parte delle
specie l'indipendenza degli alleli S è rara, e prevale quindi il rapporto di dominanza.
Per esempio, in una pianta S1S2, se S1, è dominante su S2, l'auto-incompatibilità si spiega perché il polline
avrà un fenotipo S1, qualsiasi sia l'allele presente nei suoi nuclei (S 1 o S2) mentre il polline di una pianta
S2S3, con S2 dominante su S3, non potrà fecondare la pianta S1S2, perché tutto il suo polline avrà un fenotipo
S2.
Nel caso che S2 domini su S1, una pianta S1S2 fa polline con fenotipo tutto S2, quindi in grado di crescere
su uno stilo S1S3.
Il fenomeno della dominanza è stato chiamato in causa anche per spiegare l’incompatibilità descritta in
primula da Darwin, infatti si ritiene che i fiori long styled, posseggono due alleli uguali al sito
dell’incompatibilità, mentre i fiori short- styled (a spazzola) posseggono due alleli diversi, situazione
eterozigote, e quindi hanno polline completamente e fenotipicamente S. in questo modo le combinazioni
sono:
Un esempio chiarificante del controllo gerarchico presente negli alleli S dei sistemi sporofitici è dato dal
nocciolo; in questa specie sono stati identificati 25 alleli diversi, che in base a studi approfonditi hanno
rivelato questa gerarchia di dominanza nel polline: GERARCHIA DEL NOCCIOLO:
3, 8 – 6 - 1, 5, 7, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 24 - 2, 25 – 19 - 9, 11, 22, 26 – 23 – 4
Ciò significa ad esempio che in un pianta S6S19 il polline avrà fenotipo S6, mentre in una S4S19 esso avrà
fenotipo S19.
Ciascun allele poi esprime una reazione indipendente nel pistillo, mostrando dominanza o codominanza.
Nel sistema sporofitico eteromorfico, il meccanismo più semplice è basato sull'eterostilia. Nella Primula,
per esempio, si hanno individui brevistili, con stilo corto e antere portate in alto, ed individui longistili con
stilo lungo e stami bassi (Fig. 28). Il complesso S è costituito da tre unità che controllano le caratteristiche
dello stilo, dell'altezza delle antere e della incompatibilità del polline.
Il gene o i geni (S e M nel caso di specie con tre tipi di stili diversi) impediscono la formazione di semi non
solo per auto-fecondazione, ma anche per fecondazione incrociata fra piante che hanno la stessa
morfologia fiorale (Fig. 28).
Nelle piante omomorfiche con un controllo sporofitico, esistono anche dei sistemi monofattoriali
poliallelici, come in diverse specie di Crucifere.
Citiamo fra i generi coltivati le specie seguenti, controllate con un sistema omomorfico sporofitico:
Brassica, Fagopyrum, Helianthus, Linum, Pyrethrum, Raphanus.

Un controllo bifattoriale con serie polialleliche è noto nelle graminacee. I due loci (S e Z) sono indipendenti
e l'identità fra polline e stilo per uno solo dei due loci non porta ad incompatibilità, mentre se l'identità è per
tutti e due i loci si ha l'incompatibilità. Questo sistema bifattoriale è assai utile dal punto di vista del
miglioramento genetico perché il numero di specificità differenti è più alto in quanto corrisponde al prodotto
del numero di alleli che segregano ad ognuno dei due loci.
Nel sistema sporofitico eteromorfico (nocciolo) , il meccanismo più semplice è basato sull'eterostilia.
Ciò significa ad esempio che in un pianta S6S19 il polline avrà fenotipo S6, mentre in una S4S19 esso avrà
fenotipo S19.
Il prodotto del locus S viene espresso prima della meiosi, il che spiega il sito di determinazione …… Ad
esempio, il determinante del polline SP11-8 è espresso anche nel tappeto dell’antera e quindi il prodotto
genico si trova in tutte le microspore!
il locus S ,che controlla l’AI sporofitica è complesso e tripartito, infattI è costituito da unità codificanti
all’interno dello stesso locus, cioè elemento ereditario che non va incontro a ricombinazione. In particolare
sono due le proteine sintetizzate nel pistillo : 1) SLG: (S-Locus Glycoprotein) locus strutturale che codifica per
una proteina stigmatica coinvolta nella reazionedi AI. 2) SRK: (S-Receptor Kinase) codifica per una proteina
associata alla membrana, che sembra avere una zona extracellulare (simile a SLG) e un dominio
citoplasmatico simile a una protein-chinasi. Si ipotizza che un ligando prodotto dal polline induca l’attività
chinasica.
Questa proteina trans-membrana si ritiene che si posiziona a livello delle papille stigmatiche e che le due
proteine, SLG E SLK interagiscono a formare una regione recettiva esterna ed una regione chinasica interna.
Anche in questo caso l’elemento pollinico è stato l’ultimo ad essere identificato, messo in evidenza, e si è
visto che all’interno del locus S è presente un cene che codifica per una proteina ricca di CYS , e quindi è stata
chiamata : 3) SCR (S locus cysteine rich protein): si esprime nelle antere.

quest’ultima proteina funziona da ligando nella regione trans-membranale pistillare.


Il granulo pollinico portano si alleli diversi ma a livello
fenotipico sono tutti uguali. Caratteristica
dell’incompatibilità sporofitica. Quando c’è riconoscimento
di un granulo pollinico con lo stesso allele nella proteina
trans-membrana vengono attivate una serie di reazioni
chinasiche che a loro volta attivano diverse reazioni
molecolari all’interno della papilla stigmatica che difatto
inibiscono l’idratazione del granulo pollinico e quindi ne
inibiscono la germinazione sullo stigma.
Correlazioni di
valore generale
(esitono infatti
eccezioni) sulle
caratteristiche

dell’autoincompatibilità gametofitica e sporofitica.

* eccezione: le graminacee hanno stigma asciutto


** specie dove la seconda divisione meiotica avviene nel tubetto
L'autoincompatibilità è largamente distribuita in tutte le famiglie di piante coltivate e, a parte le inevitabili
eccezioni, le Leguminose e le Solanacee sono caratterizzate da un sistema gametofitico monofattoriale, le
Graminacee da un sistema gametofitico bifattoriale, mentre le Crucifere e le Composite sono spesso
sporofitiche omomorfiche come le Linacee, Primulacee e molte Rubiacee.
L'auto-incompatibilità è raramente completa nelle piante coltivate e si notano assai spesso dei fenomeni
di pseudo-compatibilità probabilmente dovuti alla pressione antropica che determina un numero molto
limitato di alleli S o ad una forzata autogamia.
E' ovvio che l'auto-incompatibilità crea dei problemi supplementari nei già complicati schemi di
miglioramento delle specie di interesse agrario prevalentemente allogame. Se una pianta è
nell'impossibilità di sopportare l'auto-fecondazione, ci saranno poche possibilità di ottenere un minimo di
omozigosi a livello dei geni importanti per il controllo delle sue qualità agronomiche o del suo rendimento
quantitativo. Anche gli incroci fra consanguinei non potranno essere continuati a lungo perché il numero
degli alleli di incompatibilità si ridurrà progressivamente fino a provocare l'assoluta incompatibilità.
Bisognerà dunque adattare il metodo di miglioramento genetico alla situazione d'allogamia stretta della
specie e cercare di creare delle popolazioni sintetiche di diversi cloni assicurando le qualità e la quantità
ricercate.
Tutto il miglioramento dovrà orientarsi verso la ricerca delle più interessanti combinazioni biclonali, e
dunque essere basato sulle ricerche delle attitudini generali e specifiche alla combinazione.
Se la pianta non può essere moltiplicata vegetativamente le possibilità si complicano ancora di più perché
il miglioramento non potrà farsi che sulla base di una selezione massale positiva o negativa cioè
conservando le migliori piante o eliminando soltanto le peggiori sulla base del loro fenotipo.
Per le piante a moltiplicazione vegetativa, come parecchie specie ornamentali, è ovvio che l'auto-
incompatibilità non causerà grossi inconvenienti, mentre per numerose piante da frutto la produttività
sarà largamente condizionata da una fecondazione ottimale e sarà sempre necessario aggiungere degli
alberi impollinatori. Questi potranno essere anche piante di una specie selvatica vicina, ma scelte per la
loro abbondante produzione di polline che dovrebbe essere altresì distribuita in un periodo di tempo non
troppo ristretto.
Per il miglioramento genetico, l'auto-incompatibilità sarà vantaggiosa soltanto nel caso molto importante
delle produzioni di semi ibridi. Infatti un campo biclonale di una specie auto-incompatibile darà soltanto
semi ibridi, senza nessuna necessità di intervento manuale. Un simile utilizzo dell’AI è stato ipotizzato ad
esempio in erba medica, in cui fino ad oggi non sono state trovate fonti di maschiosterilità genetico-
citoplasmatica.
Queste considerazioni portano alla logica conclusione che se in qualche caso particolare può essere utile
indurre l'auto-incompatibilità, perché la produzione di semi ibridi è la finalità del metodo di miglioramento
utilizzato, sono molto più frequenti i casi in cui l'induzione dell'auto-compatibilità, anche temporanea,
sarebbe molto più utile. Parecchie ricerche sono, state fatte con questo scopo ed hanno portato alla messa
a punto di diverse tecniche che spesso permettono un superamento temporaneo delle barriere di auto-
incompatibilità.

AI and plant breeding: wanted or unwanted??? Dal punto di vista di alcuni schemi di miglioramento
chiaramente ci sono delle differenze.
Unwanted:
- selfing impossible in SI plants (no inbred lines?) rende impossibile AUTOFECONDAZIONE***
- impossible to cross plants with the same S alleles
Wanted: - Avoid inbreeding depression in cultivars of allogamous species – Avoid selfing in hybrid seed
production (when male sterility is not available, eg. Medicago) – Suppress fruit set (species with vegetative
propagation, ornamentals) – Plant producing parthenocarpic seedless fruits
Mezzo per produrre seme ibrido quando vengono messi insieme due cloni, ma puo essere anche un mezzo
per inibire l’allegagione.
***→ Molto interesse da parte dei breeder rispetto a det sistemi che servono per baipassare
temporaneamente l’incompatibilità. Permettono di autofec specie AI. L'auto-incompatibilità è raramente
completa nelle piante coltivate e si notano assai spesso dei fenomeni di pseudo-compatibilità probabilmente
dovuti alla pressione antropica che determina un numero molto limitato di alleli S o ad una forzata
autogamia.
E' ovvio che l'auto-incompatibilità crea dei problemi supplementari nei già complicati schemi di
miglioramento delle specie di interesse agrario prevalentemente allogame. Se una pianta è nell'impossibilità
di sopportare l'auto-fecondazione, ci saranno poche possibilità di ottenere un minimo di omozigosi a livello
dei geni importanti per il controllo delle sue qualità agronomiche o del suo rendimento quantitativo. Anche
gli incroci fra consanguinei non potranno essere continuati a lungo perché il numero degli alleli di
incompatibilità si ridurrà progressivamente fino a provocare l'assoluta incompatibilità. Bisognerà dunque
adattare il metodo di miglioramento genetico alla situazione d'allogamia stretta della specie e cercare di
creare delle popolazioni sintetiche di diversi cloni assicurando le qualità e la quantità ricercate.
Tutto il miglioramento dovrà orientarsi verso la ricerca delle più interessanti combinazioni biclonali, e
dunque essere basato sulle ricerche delle attitudini generali e specifiche alla combinazione.
Se la pianta non può essere moltiplicata vegetativamente le possibilità si complicano ancora di più perché il
miglioramento non potrà farsi che sulla base di una selezione massale positiva o negativa cioè conservando
le migliori piante o eliminando soltanto le peggiori sulla base del loro fenotipo.
Bisogna considerare due finalità diverse a seconda che si cerchi di superare temporaneamente la barriera di
auto-incompatibilità o che si desideri trasformare durevolmente una pianta auto-incompatibile in una pianta
auto-compatibile.

METODI PER EVITARE AI:


Autocompatibilità temporanea (pseudo-self-compatibility)
Diverse tecniche sono state provate con successo ed hanno permesso di ottenere dei semi attraverso un
meccanismo che possiamo chiamare un'autogamia illegittima e temporanea e dalla quale non si otterranno
ovviamente che dei semi che daranno dopo germinazione di nuovo delle piante auto-incompatibili. Tuttavia
queste possibilità possono essere molto utili nella metodologia di miglioramento genetico per ottenere un
minimo di omozigosi che permetterà anche di valutare certe combinazioni di geni recessivi, o di eliminare
delle combinazioni recessive sub-letali, o ancora di indurre successivamente degli ibridi di forte produttività.
1. Impollinazione del bocciolo fiorale (impollinazione precoce)
La tecnica che dà più sovente dei risultati positivi è senz'altro l'impollinazione dei boccioli fiorali qualche
giorno prima dell'apertura del fiore. E' stata applicata con successo sia su piante con un controllo
gametofitico che sporofitico. Il principio si basa sul fatto che lo stilo immaturo non ha ancora ricevuto le
informazioni necessarie al rigetto del suo polline.
Lo stadio ottimale, per questa impollinazione anticipata, sarebbe da 2 a 4 giorni prima dell'antesi. Qualche
volta è stato anche osservato che il deposito di uno strato di essudato stigmatico di uno stigma maturo su
quello immaturo del bocciolo da impollinare, favorisce la riuscita di questa autogamia forzata, non perché
facilita la germinazione del grano di polline, ma perché rinforza la sua adesione sullo stigma non maturo.
Il metodo è molto utilizzato nel miglioramento genetico in Brassica ed è stato anche applicato in Petunia,
Nicotiana e numerosi altri generi. Nel tentativo di applicare la tecnica opposta (impollinazione ritardata),
delle prove sono state tentate senza successo da diversi ricercatori anche se studi di parecchi anni fa su
Brassica e su Lilium avevano mostrato che questo metodo poteva dare buoni risultati.
2. effetto mentore ossia si impollina con auto-polline e allo-polline insieme. La crescita dell’allopolline
consente in qualche modo anche la crescita dell’auto-polline e quindi consente l’autofec, poi bisognerà
successivamente distinguere gli eventi di selfing e impollinazione incrociata
3. Trattamento col calore
L'esposizione dei fiori a temperature moderatamente elevate (variabili secondo le specie fra 32 e 60°C) può
indurre l'auto-compatibilità perché inattiva certi enzimi responsabili delle sintesi necessarie alle reazioni
d'incompatibilità. Il metodo è stato applicato con risultati positivi su diverse specie fra le quali Lycopersicum
peruvianum Mill. ed è molto utilizzato oggi nel miglioramento genetico del pomodoro.
4. ALTRO METODO Trattando il polline su uno stigma con delle soluzioni saliniche e modificando i rapporti
osmotici e favorendo l’idratazione
5. Fecondazione in vitro
6. Effetti delle radiazioni
Bisogna considerare due finalità diverse a seconda che si cerchi di superare temporaneamente la barriera di
auto-incompatibilità o che si desideri trasformare durevolmente una pianta auto-incompatibile in una pianta
auto-compatibile.

6.5.1.1. Autocompatibilità temporanea (pseudo-self-compatibility)

Diverse tecniche sono state provate con successo ed hanno permesso di ottenere dei semi attraverso un
meccanismo che possiamo chiamare un'autogamia illegittima e temporanea e dalla quale non si otterranno
ovviamente che dei semi che daranno dopo germinazione di nuovo delle piante auto-incompatibili. Tuttavia
queste possibilità possono essere molto utili nella metodologia di miglioramento genetico per ottenere un
minimo di omozigosi che permetterà anche di valutare certe combinazioni di geni recessivi, o di eliminare
delle combinazioni recessive sub-letali, o ancora di indurre successivamente degli ibridi di forte produttività.

6.5.1.1.1. Impollinazione del bocciolo fiorale (impollinazione precoce)

La tecnica che dà più sovente dei risultati positivi è senz'altro l'impollinazione dei boccioli fiorali qualche
giorno prima dell'apertura del fiore. E' stata applicata con successo sia su piante con un controllo gametofitico
che sporofitico. Il principio si basa sul fatto che lo stilo immaturo non ha ancora ricevuto le informazioni
necessarie al rigetto del suo polline.

Lo stadio ottimale, per questa impollinazione anticipata, sarebbe da 2 a 4 giorni prima dell'antesi. Qualche
volta è stato anche osservato che il deposito di uno strato di essudato stigmatico di uno stigma maturo su
quello immaturo del bocciolo da impollinare, favorisce la riuscita di questa autogamia forzata, non perché
facilita la germinazione del grano di polline, ma perché rinforza la sua adesione sullo stigma non maturo.

Il metodo è molto utilizzato nel miglioramento genetico in Brassica ed è stato anche applicato in Petunia,
Nicotiana e numerosi altri generi. Nel tentativo di applicare la tecnica opposta (impollinazione ritardata), delle
prove sono state tentate senza successo da diversi ricercatori anche se studi di parecchi anni fa su Brassica e
su Lilium avevano mostrato che questo metodo poteva dare buoni risultati.

6.5.1.1.2. Trattamento col calore

L'esposizione dei fiori a temperature moderatamente elevate (variabili secondo le specie fra 32 e 60°C) può
indurre l'auto-compatibilità perché inattiva certi enzimi responsabili delle sintesi necessarie alle reazioni
d'incompatibilità. Il metodo è stato applicato con risultati positivi su diverse specie fra le quali Lycopersicum
peruvianum Mill. ed è molto utilizzato oggi nel miglioramento genetico del pomodoro.
AC permanente
a) tetraploidizzazione (polyploidization = breakdown of SI) mutazione per autocompatibilità
Con le piante a controllo gametofitico monofattoriale, il passaggio dalla diploidia alla tetraploidia induce quasi
sempre l'auto-compatibilità. Questa differenza era già stata osservata in natura, per esempio nelle diverse specie
diploidi e tetraploidi del genere Coffea. La duplicazione cromosomica può essere abbastanza facilmente indotta
per trattamento con qualche agente amitotico come la colchicina, o per propagazione vegetativa in vivo a partire
da foglia, che spesso rigenera delle piante tetraploidi in mezzo alle diploidi, o infine per rigenerazione in vitro da
tessuto di pianta diploide; in questo caso si può partire dal tessuto differenziato nel quale ci sono già
spontaneamente per endopoliploidia numerosi nuclei tetraploidi (es. ipocotile), o partire da tessuti diploidi
perché il passaggio per la proliferazione in vitro induce quasi sempre della poliploidia. Le piante tetraploidi così
ottenute sono spesso auto-compatibili ed è stato dimostrato che questo cambiamento è dovuto alla perdita
dell'inibizione di crescita del budello pollinico proveniente da granuli di polline eteroallelici (S1S2 )). Gli incroci
reciproci fra piante tetraploidi e diploidi dimostrano che al contrario i tessuti degli stili non hanno perso la loro
capacità di rigetto. Cioè i tessuti S1S2 , e S1S1S2S2 , rigettano tutto il polline S1 , S2 , S1S1 e S2S2 , ma non i tubi
pollinici S1S2 . E' necessario prendere in considerazione l'influenza del genotipo della pianta tetraploide perché
questo può giocare un ruolo importante nella risposta all'auto-impollinazione. Diverse linee tetraploidi con gli
stessi alleli S possono dimostrare infatti delle grandi variazioni di auto-compatibilità. Infine è importante notare
che le monocotiledoni che hanno un controllo gametofitico dell'auto-incompatibilità non diventano compatibili
per tetraploidizzazione. Il migliore esempio è stato riportato per Tradescantia paludosa, ma è stato anche
osservato nelle Liliacee e nelle Graminacee. Le implicazioni e le possibili spiegazioni di questa scoperta non sono
note.
b) Mutazione per autocompatibilità (duplicazione locus S, mutazione locus S)
La mutazione di compatibilità sarà abbastanza facile da identificare se possiamo cercarla fra una grande
popolazione di granuli di polline. Infatti appare evidente che, nel caso del controllo gametofitico, il tessuto stilare
fungerà da filtro automatico dopo un'auto-impollinazione, e che soltanto i granuli mutati per compatibilità
passeranno ed andranno a fecondare gli ovuli. C'è da tenere in considerazione il fatto che la crescita del budello
pollinico è sotto il controllo del nucleo vegetativo del granulo di polline e per avere una mutazione trasmissibile
alla progenie successiva bisognerà indurla prima della separazione dei nuclei vegetativo e generativo del polline.
Nelle specie a controllo sporofitico non sarà possibile agire allo stesso modo perché la mutazione dovrebbe
interessare tutta la pianta o almeno un suo settore per poter dare della compatibilità; sarebbe dunque
necessario effettuare la ricerca del mutanti fra numerose piante e non fra numerosissimi granuli di polline.
In pratica quattro categorie di mutazioni sono state identificate nel sistema gametofitico monofattoriale:
a) La compatibilità del polline può essere associata alla presenza di un frammento centrico libero di
cromosoma. Se il polline porta oltre al suo allele S normale un frammento cromosomico sul quale è presente
un altro allele S, il budello pollinico attraverserà lo stilo perché ci sarà un effetto di competizione o di
complementazione allelica che, come abbiamo già visto, esiste nelle specie auto-tetraploidi.
b) Il polline compatibile può anche non essere associato ad un frammento centrico libero, ma alla presenza
di una duplicazione comprendente l'allele S. D'altra parte si può anche pensare che questi tipi di mutazioni
siano dovute ad una delezione della parte del locus S che controlla l'attività del polline.
c) La mutazione può anche portare al non funzionamento della parte del locus S che controlla l'attività dello
stilo, ma questa possibilità sembra molto più rara.
d) Infine, sono stati identificati dei mutanti che combinano la compatibilità nel polline e nello stilo, ma non è
mai stato stabilito se questi mutanti siano il risultato di due mutazioni indipendenti sulle parti d'attività
polline e stilo del locus S o, al contrario, dei mutanti risultati dalla perdita del segmento di specificità S.
Queste mutazioni non corrispondono mai al vero cambiamento della specificità del locus S e appare evidente
che finora tutti i lavori di ricerca sugli effetti di vari mutageni, come le radiazioni ionizzanti o i mutageni
chimici, non hanno mai permesso di osservare, per esempio, il cambiamento di un allele S1, in un allele S2.
L'assenza di questo tipo di mutazione, che sarebbe la sola e vera mutazione costruttiva, è tanto più strano se
si pensa che nelle piante a controllo gametofitico monofattoriale la quantità di alleli S differenti in una
popolazione di piante è sempre molto grande, raggiungendo spesso il numero di parecchie centinaia, e che
questo incredibile polimorfismo ad un solo locus è ovviamente il risultato di un meccanismo naturale che ha
operato con una estrema efficacia.
c) trasferimento dell’AC (Chrysanthemum)
Pochissime informazioni sono disponibili a questo proposito. Un caso di trasferimento dell'auto-compatibilità
verso delle varietà coltivate auto-incompatibili è stato osservato in Chrysanthemum e ha mostrato che l'auto-
compatibilità era dominante, ma rimaneva allo stato eterozigote nel clone auto-compatibile.

6.5.1.2.2. Mutazione per autocompatibilità


La mutazione di compatibilità sarà abbastanza facile da identificare se possiamo cercarla fra una grande
popolazione di granuli di polline. Infatti appare evidente che, nel caso del controllo gametofitico, il tessuto
stilare fungerà da filtro automatico dopo un'auto-impollinazione, e che soltanto i granuli mutati per
compatibilità passeranno ed andranno a fecondare gli ovuli. C'è da tenere in considerazione il fatto che la
crescita del budello pollinico è sotto il controllo del nucleo vegetativo del granulo di polline e per avere
una mutazione trasmissibile alla progenie successiva bisognerà indurla prima della separazione dei nuclei
vegetativo e generativo del polline.
Nelle specie a controllo sporofitico non sarà possibile agire allo stesso modo perché la mutazione dovrebbe
interessare tutta la pianta o almeno un suo settore per poter dare della compatibilità; sarebbe dunque
necessario effettuare la ricerca del mutanti fra numerose piante e non fra numerosissimi granuli di polline.
In pratica quattro categorie di mutazioni sono state identificate nel sistema gametofitico monofattoriale:
a) La compatibilità del polline può essere associata alla presenza di un frammento centrico libero di
cromosoma. Se il polline porta oltre al suo allele S normale un frammento cromosomico sul quale è
presente un altro allele S, il budello pollinico attraverserà lo stilo perché ci sarà un effetto di competizione
o di complementazione allelica che, come abbiamo già visto, esiste nelle specie auto-tetraploidi.
b) Il polline compatibile può anche non essere associato ad un frammento centrico libero, ma alla presenza
di una duplicazione comprendente l'allele S. D'altra parte si può anche pensare che questi tipi di mutazioni
siano dovute ad una delezione della parte del locus S che controlla l'attività del polline.
c) La mutazione può anche portare al non funzionamento della parte del locus S che controlla l'attività
dello stilo, ma questa possibilità sembra molto più rara.
d) Infine, sono stati identificati dei mutanti che combinano la compatibilità nel polline e nello stilo, ma non
è mai stato stabilito se questi mutanti siano il risultato di due mutazioni indipendenti sulle parti d'attività
polline e stilo del locus S o, al contrario, dei mutanti risultati dalla perdita del segmento di specificità S.
Queste mutazioni non corrispondono mai al vero cambiamento della specificità del locus S e appare
evidente che finora tutti i lavori di ricerca sugli effetti di vari mutageni, come le radiazioni ionizzanti o i
mutageni chimici, non hanno mai permesso di osservare, per esempio, il cambiamento di un allele S 1, in
un allele S2. L'assenza di questo tipo di mutazione, che sarebbe la sola e vera mutazione costruttiva, è tanto
più strano se si pensa che nelle piante a controllo gametofitico monofattoriale la quantità di alleli S
differenti in una popolazione di piante è sempre molto grande, raggiungendo spesso il numero di parecchie
centinaia, e che questo incredibile polimorfismo ad un solo locus è ovviamente il risultato di un
meccanismo naturale che ha operato con una estrema efficacia.

6.5.1.3. Trasferimento dell’autocompatibilità


Pochissime informazioni sono disponibili a questo proposito. Un caso di trasferimento dell'auto-
compatibilità verso delle varietà coltivate auto-incompatibili è stato osservato in Chrysanthemum e ha
mostrato che l'auto-compatibilità era dominante, ma rimaneva allo stato eterozigote nel clone auto-
compatibile.
L’apomissia: è una modificazione del sistema riproduttivo delle angiosperme che consente
la riproduzione via seme ma in maniera asessuata, viene anche detta agamospermia.
L’interesse verso questo fenomeno è dovuto al fatto che combina i vantaggi della propagazione vegetativa
attraverso il seme (modo più comodo e semplice).

È stata descritta per la prima volta nel 1841 in quanto osservando una pianta di una specie dioica femminile
che continuava a produrre seme nonostante l’assenza di un parentale maschile. Di fatto si capiva che c’era
un modo di produrre seme in maniera agamica.

L’apomissia è stata anche oggetto di un romanzo giallo dove lo scopritore dell’apomissia va incontro a una
serie di avventure dato che aveva fatto quest’importante scoperta.

Apomixis dal greco significa un fenomeno che bypassa la missia (unione dei gameti) e si contrappone al
termine anfimissia che vuol dire unione di due gameti.

Lo sviluppo dell’embrione in maniera autonoma (PARTENOGENESI), senza fecondazione quindi, fa parte


dell’apomissia.

Negli ultimi decenni l'interesse verso


l'utilizzazione del comportamento riproduttivo
delle specie apomittiche nel miglioramento
genetico delle piante coltivate ha subito un
costante incremento in Europa ed in altre parti del
mondo. Infatti la manipolazione dell'espressione
di tale carattere può permettere l'ottenimento a
basso costo di varietà uniformi, combinando i
vantaggi propri della propagazione vegetativa
(clonazione del genotipo) con quelli dell'anfimissia
(propagazione per seme). Sarebbero così superati gli inconvenienti che si registrano quando si vogliono
propagare individui altamente eterozigoti mantenendo uniforme il genotipo nel tempo.

La prospettiva dello sfruttamento dell'apomissia permetterebbe persino di superare l'ipotesi di produzione


del cosiddetto "seme sintetico" (cfr. modulo Genetica della Produzione Sementiera), in quanto la pianta
apomittica può moltiplicarsi, senza alterare il genotipo, attraverso il mezzo di propagazione più comodo e
naturale: il seme.

Nonostante la confusione terminologica che ha caratterizzato questa materia fino a pochi anni fa, oggi
sembra comunemente accettato di considerare sotto l'accezione del termine "apomissia" tutti i fenomeni
agamospermici, cioè di produzione asessuata del seme. Tali fenomeni sono stati riscontrati in oltre 300
specie appartenenti a 35 famiglie di Angiosperme.

[materiali di approfondimento sul moodle: niente sesso siamo apomittiche! E Apomixis. Se hai tempo
guardale]

I PERCORSI DEL FENOMENO APOMITTICO NELLE PIANTE: l’apomissia si colloca tra l’anfimissia (riproduzione
sessuata per seme) e la propagazione vegetativa (riproduzione asessuata per parti vegetative). L’apomissia
può avvenire in 2 modi:
- Embrionia avventizia: l’embrione si forma direttamente dall’ovulo. O dai tegumenti → tegumentale
o dalla nucella → nucellare
- Apomissia gametofica: più importante. Viene prodotto un gametofito femmine ma senza la riduzione
meiotica, quindi un sacco embrionale non ridotto. Questo dà luogo ad un ovocellula 2n che per
partenogenesi dà luogo ad un nuovo individuo. Il sacco embrionale non ridotto può formarsi in due
modi diversi: 1) aposporia: il sacco embrionale si forma da una cellula somatica dell’ovulo. 2)
diplosporia: si forma dalla cellula madre delle megaspore per meiosi modificata.

La riproduzione apomittica si realizza


tramite lo sviluppo embriogenetico di
una cellula con numero cromosomico
non ridotto: se l'embriogenesi prende
origine direttamente da una cellula
somatica il fenomeno viene definito
embrionia avventizia; se invece
l'embrione si sviluppa a partire da una
cellula uovo differenziatasi in un
macrogametofito non ridotto il processo
si definisce apomissia gametofitica (Fig.
32).

Nel caso dell'apomissia gametofitica, il


sacco embrionale non ridotto può essere
formato da una cellula somatica che
acquisisce le funzioni di macrospora (aposporia) oppure dalla cellula madre delle megaspore (CMM) dopo
soppressione o modificazione della meiosi (diplosporia). Nell'ambito di questi processi fondamentali,
definiti globalmente con il termine di apomeiosi, sono stati individuati in natura differenti modelli di
sviluppo del macrogametofito (Fig. 33).

L'aposporia e la diplosporia mitotica (assenza totale di meiosi da parte della CMM, tipo Antennaria)
garantiscono teoricamente sempre l'identità genetica tra l'ovocellula 2n e la pianta madre.
Differentemente, nel caso della diplosporia restituzionale (aneusporia, tipo Taraxacum e tipo Ixeris), in cui
si formano nuclei di restituzione in prima divisione (nuclei FDR), tale identità è garantita solo nel caso in
cui vi sia completa assenza di appaiamento alla profase 1 (asinapsi) e quindi di scambi tra cromatidi di
cromosomi omologhi.
EMBRIONIA AVVENTIZIA: ha luogo quando una cellula somatica dell’ovulo
prende il programma di sviluppo di uno zigote e dà origine a un embrione
avventizio. Da un punto di vista genetico sarà uguale alla pianta che lo
produce. Lo sviluppo di embrioni nucellari non impedisce lo sviluppo di
embrioni zigotici. Infatti una regola è avere dei semi poli-embrionici, da cui
possono nascere diversi germinelli dovuti all’esistenza di più embrioni.

È molto diffusa nel genere citrus: se mettessimo a germinare semi di arancio


mandarino etc... sarebbe probabile avere più germinelli da un solo seme. Il
record dovrebbe essere 23-24 embrioni in un seme. In citrus viene usata per la moltiplicazione di alcuni
genotipi che fungono da portainnesti.

Embrione di mango che è il prodotto di una


giustapposizione di diversi embrioni avventizi.

Seme di un mango (Mangifera indica L. var.


Kensington Pride).
Gli embrioni avventizi sono derivati dal tessuto
sporofitico dell’ovulo.
L’embrionia avventizia da luogo per definizione a poliembrionia,
come in questo caso in cui si contano 11 embrioni in un unico seme.

L’APOMISSIA GAMETOFITICA: è la forma


più diffusa di apomissia. Il nuovo individuo
prende origine da una cellula uovo non
ridotta che si forma da un gametofito non
ridotto. In figura si rappresenta in modo
schematico il ciclo ontogenetico che porta
alla meiosi e quindi al gametofito sulla
destra e il ciclo che porta tramite
apomeiosi (taglia fuori la meiosi) alla
formazione di un sacco embrionale non
ridotto che porta a un’ovocellula non
ridotta e che da origine per partenogenesi
a uno zigote, identico alla pianta madre.

In tutti i processi apomeiotici (aposporia e diplosporia) il sacco


embrionale non ridotto maturo è morfologicamente identico al sacco
embrionale di origine meiotica: polarizzato, 8-nucleato e altamente
differenziato nei nuclei che lo compongono. Solo nel caso dell'aposporia
"tipo Panicum", diffusa in un notevole numero di Graminacee
appartenenti alle tribù delle Paniceae e delle Andropogoneae, il sacco
embrionale aposporico risulta non polarizzato e 4-nucleato
(un'ovocellula, due sinergidi ed un nucleo polare).

Quindi, nella maggior parte delle specie, la distinzione tra un sacco


embrionale apomeiotico ed uno ridotto può avvenire solamente in virtù di un'analisi citologica ad un ben
determinato stadio di sviluppo: è di fondamentale importanza perciò stabilire il momento fenologico
ottimale per eseguire sperimentalmente questa osservazione.
APOSPORIA IN POA PRATENSIS: una parte della tesi di Mazzu. Poa pratensis è importante come specie da
tappeto erboso. In alto a sinistra vedi una tetratede con la cellula più a sinistra che inizia ad ingrandirsi ed è
una megasporta funzionale. Nella foto a destra in alto vediamo come questa megaspora funzionale possa
venire disturbata da un’iniziale aposporica. In basso a sinistra vedi un ovulo con due sacchi embrionali perché
anche nell’aposporia non è esclusa la presenza di due o più linee riproduttive (si possono sviluppare o due
aposporiche o un’aposporica e una sessuale legittima). In Poa pratensis il 5-6% di semi sono poliembrionici.

DIPLOSPORIA: non vi è una cellula somatica dell’ovulo che interviene ma è la stessa cellula madre delle
macrospore che subisce delle alterazioni. Praticamente questa va incontro alla duplicazione del materiale
genetico ma non entra in meiosi o comunque entra in meiosi restituzionale, cioè che non va a buon fine. A
un certo punto questa cellula prende un programma di sviluppo di una megaspora funzionale. Si può quindi
sviluppare un sacco embrionale perfettamente simile a quello sessuale ma senza che sia avvenuta riduzione
meiotica. Esistono diversi tipi di diplosporia dove la meiosi viene intaccata in modo più o meno pesante. Il
modo più semplice è quello tipo antennaria: diplosporia mitotica → la mitosi non viene seguita per nulla.

DIPLOSPORIA MITOTICA IN ELYMUS diplosporico


RECTISETUS: queste foto sono sezioni di
Sessuale
un ovulo o di diversi ovuli di una specie
affine al frumento coltivato che va sotto
il nome di elymus rectisetus. In questa
specie esistono sottospecie con
comportamento sessuale e altre con
comportamento diplosporico. In alto
vedi un ovulo di una pianta sessuale e di
una diplosporica e all’interno di questo
ovulo si può vedere la cellula madre
delle macrospore. Nella foto + a destra
c’è un sacco embrionale binucleato di
origine diplosporica. Si capisce perché
mancano le megaspore degenerate ed è
anche già a contato con lo strato epidermico. Nella diplosporia mitotica è stata notata una correlazione
dovuta all’assenza di callosio nelle cellule diplosporiche. Infatti nella cellula sessuale nella foto di sotto vedi
una fluorescenza che è callosio, nella foto centrale invece il callosio è assente. Il callosio viene depositato
anche per isolare le cellule meiotiche e quindi potrebbe essere una causa o un effetto della diplosporia stessa.
APOMISSIA GAMETOFITICA: l’alternanza di generazione si basa su meiosi e fecondazione. Nell’anfimissia ci
sono meiosi e fecondazione. Nell’apomissia non avviene la meiosi e non avviene la fecondazione (l’ovocellula
si sviluppa in maniera partenogenetica e produce una progenie materna (geneticamente identica alla pianta
madre). Questi due fenomeni però possono anche interincrociarsi e dare luogo ai fenomeni di apomissia non
ricorrente: se avviene la meiosi avrai il sacco embrionale ma non avviene la fecondazione → aploide (con
dimezzamento del corredo cromosomico). Può avvenire anche che non hai meiosi, quindi avviene la
fecondazione su un ovulo apomeiotico. Un’ovocellula 2n viene fecondata e avremo un individue 2n+n →
individuo triploide (o ibrido B3). Non possono essere modi di riproduzione sistematici ma avvengono sia nella
piante apomittiche e in quelle sessuali.

Nello studio dei sistemi riproduttivi delle piante si


deve sempre considerare come il processo che
porta alla formazione del seme, sia esso gamico o
agamico, sia costituito da due fasi distinte (fig. 34):
la formazione del macrogametofito e quindi della
cellula uovo (macrogametogenesi) ed il suo
sviluppo in embrione (embriogenesi). La prima
fase, nell'apomissia gametofitica, comprende quei
fenomeni che sono stati definiti "apomeiotici" e
portano alla formazione di un sacco embrionale
non ridotto e quindi di un gamete 2n. La seconda
implica lo sviluppo partenogenetico
(partenogenesi diploide) dell'ovocellula non
ridotta, cioè senza che il nucleo spermatico giunga
ad operare la fecondazione; tale sviluppo può
avvenire in assenza di stimoli pollinici (sviluppo autonomo) o può richiedere in qualche modo lo stimolo
dell'impollinazione, tramite la crescita del tubetto pollinico, la penetrazione citoplasmatica o la
fecondazione dei nuclei polari (sviluppo pseudogamo).

La combinazione stabile di queste due fasi può essere definita (apomissia ricorrente), in quanto è stata
fissata geneticamente in un gran numero di specie e permette di perpetuare stabilmente il genotipo, senza
variazioni nel numero cromosomico (Fig. 34).

Di contro, vengono riportati come "apomissia non ricorrente" quei fenomeni per cui si sviluppa una
progenie genomicamente instabile, come lo sviluppo autonomo di un gamete ridotto (partenogenesi
aploide) o lo sviluppo indipendente del gamete maschile e femminile (semigamia o emigamia) a formare
un embrione aploide chimerico.

Esiste anche la possibilità che un'ovocellula non ridotta venga fecondata da un gamete maschile ridotto:
in tal caso si ottiene una progenie 2n + n che, per evitare l'uso del termine restrittivo di "triploide", è stata
definita, "BIII hybrid", distinguendola cosi dagli ibridi n + n ("BII hybrid"). Raro, ma non impossibile, è anche
l'ottenimento di un ibrido 2n + 2n.

I fenomeni di apomissia non ricorrente, così come la formazione di ibridi B III, non possono essere ritenuti
di diretta utilità al fine del miglioramento genetico, ma sono sicuramente di grande importanza
nell'evoluzione dei complessi poliploidi (aploidizzazione e poliploidizzazione) ed ai fini dello studio
fisiologico e genetico del fenomeno.
APOMISSIA RICORRENTE E NON RICORRENTE: in
Hieracium, una specie apomittica obbligata cioè si
riproduce x apomissia ad un’elevata frequenza, la
progenie è composta al 97% da individui materni
(2n+0). Per l’1% abbiamo poliaploidi (n+0), 2% individui
che derivano da riproduzione sessuata (n+n) e 0.1%
individui che derivano da ovocellule 2n, cioè ibridi B3.

Figure 3. Progeny Types Formed in Crossed Hieracium


Species Facultative for Aposporous Plus Autonomous
Apomixis. Most of the progeny are maternal (2n+0),
because there is no genomic contribution from a male
gametophyte. Nonmaternal seedlings form a smaller
subset that can be subdivided into a number of types.
Seedlings also are derived from the use of a reduced
egg that undergoes autonomous embryogenesis (n+0);
alternatively, the egg can be fertilized with a sperm cell
from self (s) or nonself (ns) pollen to give rise to
hybrids that arise from sexual reproduction (n+ns or
n+nns, respectively). Unreduced egg cells also can be
fertilized with sperm cells from self or nonself pollen to give rise to hybrid progeny (2n+ns or 2n+nns,
respectively) that have increased ploidy relative to the maternal parent. D3 ovules appear to be strictly
self-incompatible, whereas in A3.4, progeny arising from self-pollination are evident (data are from
Bicknell et al., 2003 ).

FORMAZIONE DELL’ENDOSPERMA: Come si forma l’endosperma? Vi sono specie in cui anche l’endosperma,
come lo zigote, è autonomo ossia si forma senza fecondazione (quindi sarà 2n+2n, quindi formato dai nuclei
polari). In altre specie, come la Poa pratensis, l’endosperma per svilupparsi necessita l’impollinazione quindi
non è svincolato dalla fecondazione. Nelle specie pseudogame l’endosperma che si forma sarà formato da 2
nuclei polari 2n + 1 nucleo spermatico, per un totale di 5n. nelle specie pseudogame è stato visto che
l’embrione spesso si sviluppa in modo anticipato rispetto alla fecondazione necessaria per l’endosperma. In
foto vedi il sacco embrionale prelevato da mano da Poa (lui lo ha fatto, da quello che dice è molto difficile
perché parliamo di cose piccole). Poi è stata colorata con un
colorante fluorescente che si lega al dna. Nella parte di destra vedi
lo sviluppo dell’embrione globulare, a sinistra le cellule grosse
sono le cellule antipodali proliferate e i due nuclei polari sono in
questa parte meno evidente e ancora non sono stati fecondati.
Questo fenomeno si chiama proembrionia: l’embrione si sviluppa
prima rispetto alla fecondazione necessaria per lo sviluppo
dell’endosperma.

DISTRIBUZIONE DELL’APOMISSIA NELLE ANGIOSPERME: l’apomissia è stata ritrovata soprattutto in alcune


famiglie. Principalmente Poaceae (dove prevale l’aposporia), poi Asteraceae (dove prevale la diplosporia) e
poi rosaceae, liliaceae, rutaceae…

All’interno delle poaceae l’aposporia si trova principalmente nelle panicoideae (specie macroterme come
mais, riso…), nelle microderme invece è più presente la diplosporia
In questa tabella vi riporto una tabella in cui è stata
descritta l’apomissia e quale tipo di apomissia. Le specie
apomittiche di solito sono associate a specie allogame,
sono erbacee, caratteristiche di habitat disturbati e in cui ci
sia evidenza di derivazione da poliploidia (quindi allo o
autopoliploidia) perché derivano anche da ibridazione
interspecifica.

La riproduzione apomittica, e in particolare l'apomissia


gametofitica, si verifica soprattutto in individui poliploidi.
Tuttavia, i rapporti casuali tra i due fenomeni, apomissia
e poliploidia, nonostante le numerose ipotesi formulate,
non sono ancora ben chiari.

Se da una parte è evidente che un sistema riproduttivo


quale l'apomissia, che prescinde dall'equilibrio genomico
richiesto dalla gametogenesi meiotica, può costituire
l'unico modo di propagazione di individui geneticamente
"sbilanciati", dall'altra a volte è l'apomissia che necessita
per mantenersi di biotipi in condizione poliploide. Ad
esempio in Ranunculus auricomus W. Koch l'evidenza sperimentale ha fatto ipotizzare che gameti ridotti
portanti l'allele per l'apomissia A- o gameti 2n omozigoti per esso non siano vitali; in tal caso la
trasmissione del carattere per via sessuale può avvenire solo per mezzo di gameti non ridotti eterozigoti
(A+/A-).

Le possibilità di riproduzione apomittica combinate con quelle di poliploidizzazione sessuale e di


aploidizzazione per partenogesi (aploide) hanno dato origine alla formazione di complessi agamici con
origine comune che presentano un gran numero di tipi morfologici. In questi casi, frequenti soprattutto
nelle Composite, (Crepis, Taraxacum, Antennaria) e Bothriochloa, Capillipedium, Panicum), ma anche in
altre famiglie (Potentilia, Rubus, Ranunculus), il concetto tradizionale di specie biologica non può più essere
applicato.

Le capacità evoluzionistiche insite in tali complessi sono enormi: le diverse forme biologiche possono infatti
beneficiare alternativamente dei vantaggi specifici della riproduzione apomittica (produzione di seme
indipendentemente dalle turbe meiotiche dovute alla ploidia o alla lontananza tassonomica, indipendenza
dal polline nelle specie autonome, fissazione dell'eterozigosi per assenza di ricombinazione genica) e di
quelli caratteristici dell'anfimissia (segregazione e ricombinazione quale capacità di adattamento nel
medio periodo, poliploidizzazione ed aploidizzazione ai fini dello scambio genico tra biotipi a livelli di
ploidia differenti).
STIMA APOMEIOSI: negli studi dell’apomissia è fondamentale la possibilità di
monitorare il fenomeno ovvero capire se una pianta si riproduce in maniera
anfimittica o apomittica, e se è apomittica con che frequenza la progenie che si
ottiene è di origine apomittica → stimare il grado di apomissia

Poiché l’apomissia è data dall’unione di apomeiosi e partenogenesi, possiamo


studiare il grado di apomissia a 3 livelli:

- Stimare l’apomeiosi: studiare in un certo numero di ovuli, allo stadio


giusto, in quanti di essi si ha evidenza di comportamenti apomittici.
Questa è sempre la foto di Poa pratensis, nella foto sopra vediamo una
bella tetrade normale mentre in quella sotto quello cerchiato un inizio di
apomissia. Si può vedere anche con il contrasto di fase.
- Stima dei sacchi embrionali: oppure è la stessa cosa di stimar
l’apomeiosi?boh
- Stimare la partenogenesi: stimare l’apomeiosi è molto difficile soprattutto su larga scala. Un metodo
più veloce si basa sull’esecuzione del test dell’auxina: la pianta viene trattata con una soluzione
auxinica, ad un certo stadio, ottenendo così uno sviluppo partenocarpico delle cariossidi. Queste
saranno vuote per assenza di endosperma. Dove c’è una capacità apomittica si forma un embrione
sviluppato mentre dove non c’è una capacità partenogenetica non si ottiene nessun embrione.
- Stima dell’apomissia realizzata: andare a vedere nella progenie della pianta quanti sono identici alla
pianta madre e quanti diversi (quindi fonte probabilmente di riproduzione sessuata o di apomissia
non ricorrente). Può essere fatto usando o caratteristiche morfologiche o con marcatori molecolari.
- Citometria di flusso in specie
aposporiche pseudogame: è il
sistema più veloce! Usi il
citoflorimetro. Una sospensione di
nuclei viene colorata con un
fluorocromo e fatti passare in un
capillare in cui viene misurata la
fluorescenza, che ovviamente è
direttamente proporzionale al
contenuto di acido nucleico. In alcuni
casi l’apomissia comporta delle
alterazioni nel numero cromosomico,
non tanto nell’embrione, ma
nell’endosperma (livello di ploidia
5n). Se sottoponiamo un campione di
seme ad un’analisi citoflorimetrica,
nel caso di specie sessuale avremo un
picco dovuto ai nuclei 2n che sono i nuclei dell’embrione e un picco dovuto ai nuclei dell’endosperma.
Se la pianta è un’apomittica facoltativa avrete un istogramma a 3 picchi: il picco 2n dovuto ai nuclei
triploidi, il picco triploide dei semi sessuali e il picco dovuto all’endosperma dei semi di origine
apomittica. Infine un’apomittica obbligata avrai il picco 2n dell’embrione e poi il picco
dell’endosperma a 5n.
CONTROLLO GENETICO DELL’APOMISSIA: apomissia e sessualità

Il controllo genetico dell’apomissia richiede di puntualizzare che ci sono specie in cui l’apomissia si
esprime in maniera obbligata, cioè la progenie è in grande percentuale di origine apomittica (ovviamente
non esiste apomissia al 100% perché sarebbe un vicolo cieco dell’evoluzione). Le specie apomittiche
obbligate quindi presentano sempre dei mutanti sessuati. Poi ci sono le apomittiche facoltative: di regola
si possono trovare livelli di apomissia diverse: prevalentemente apomittiche o prevalentemente sessuali
o metà e metà etc… La situazione perfetta per studi genetica è l’apomittica obbligata con un mutante
sessuale, e si possono fare incroci tra questo mutante sessuale usato come femmina e una pianta
apomittica obbligata come maschio impollinante.

8.3. Controllo genetico dell’apomissia

Riproduzione apomittica e
riproduzione sessuale sono due
processi distinti che tuttavia possono
verificarsi parallelamente anche
all'interno dello stesso individuo.

Si definisce apomittica "obbligata" la


pianta che produce solo seme di
natura apomittica. Tale requisito, se
dipende da un controllo genetico
stretto, si trasmette ovviamente a
tutta la popolazione ed, eventualmente, alla specie. Tuttavia, in molte specie ritenute apomittiche
obbligate, come ad esempio in Cenchrus ciliaris L., sono stati reperiti mutanti totalmente sessuali e, a
volte, anche individui facoltativi. Perciò parlare di "apomissia obbligata" a livello di specie sembra
perlomeno inesatto.

Le specie in cui, di regola, riproduzione sessuata ed apomittica coesistono all'interno dello stesso
individuo sono definite apomittiche "facoltative". Nelle piante aposporiche sacchi embrionali sessuali
possono svilupparsi, competere e talvolta prevalere su quelli apomittici; nelle diplosporiche i disturbi
meiotici possono verificarsi o meno. ed a diversi livelli di intensità, determinando ora la presenza di
progenie apomittiche ora quella di progenie da incrocio. Il "grado di apomissia", soprattutto nelle
specie facoltative, può essere quindi influenzato da diversi fattori:

1) Genitore materno: il genotipo materno influenza, spesso in maniera alquanto stretta, sia il grado di
apomeiosi che la tendenza partenogenetica della cellula uovo.

2) Genitore pollinico: il genotipo ed il grado di ploidia del polline può influenzare, nelle specie
pseudogame, lo sviluppo partenogenetico o la fecondazione della cellula uovo n o 2n. Noack,
autofecondando l'autotetraploide Hypericum perforatum L. trovava che la percentuale di ovocellule
non ridotte fecondate (ibridi BIII) era del 27%, mentre, usando come genitore pollinico il diploide H.
quadrangulum L., tale valore saliva al 68%.

3) Fattori ambientali: i fattori ambientali che possono influenzare il grado di apomissia sono diversi.
Sparvoli cita le condizioni di coltivazione in genere in Eupatorium riparium Reg., mentre l'influenza
specifica del fotoperiodo è stata studiata in varie specie con risultati diversi.
FATTORI CHE INFLUENZANO IL GRADO DI APOMISSIA:

il genotipo materno è fondamentale ma non mancano le influenze ambientali etc…

lo studio del controllo genetico si fa incrociando un sessuale x un apomittico e andando a studiare la


segregazione della progenie.

4) Fattori sperimentali: le radiazioni


ionizzanti non hanno avuto alcuna
influenza sul grado di apomissia in
Taraxacum vulgare Wigg, Paspalum
dilatatum Poir. e Potentilla spp.
Viceversa, in Pennisetum typhoides
trattamenti mutageni hanno
provocato un aumento della
apomissia, mentre in Poa pratensis
L. numerosi esperimenti di
mutagenesi hanno sempre
determinato un aumento delle
progenie sessuali. Il
raddoppiamento cromosomico ha
aumentato la tendenza alla
sessualità in Potentilla argentea L.
ed in Paspalum longifolium, ha
incrementato le progenie
apomittiche in Paspalum
hexastachyum Parodi e non ha
avuto influenza in Paspalum commersonii Lam..

L'influenza dei regolatori di crescita sul processo apomittico è stata finora poco studiata, tuttavia si può
ritenere che riguardi essenzialmente lo sviluppo partenogenetico più che la formazione dei
macrogametofiti non ridotti. Recenti esperimenti sono stati condotti, peraltro senza chiari risultati, su C.
ciliaris e su P. pratensis.

Diversi Autori hanno dimostrato lo stretto controllo genetico dei caratteri che determinano l'apomissia in
numerose specie; almeno per quanto riguarda i fenomeni aposporici tale controllo sembra essere di tipo
semplice, dovuto ad uno o pochi geni al massimo.

Il fenomeno apomittico dovrebbe essere considerato in funzione dei processi che lo compongono: si pensa
infatti che la produzione di gameti 2n e lo sviluppo partenogenetico dell'ovocellula siano processi
controllati da due sistemi genici indipendenti. Sotto questo punto di vista la quota di apomissia presente
in un genotipo dovrebbe essere calcolata:

grado di apomeiosi x grado di partenogenesi = grado di apomissia

Purtroppo questa distinzione non è stata finora tenuta in grande considerazione dai Ricercatori.

Lo studio del controllo genetico del carattere risulta di fondamentale importanza ai fini dell'utilizzo
dell'apomissia nel miglioramento genetico e viene effettuato analizzando il comportamento riproduttivo
delle progenie da autofecondazione (S1, S2, etc.), da incrocio (F1, F2, etc.) e da reincrocio (BC1, etc.) di piante
madri sessuali (possibilmente al 100%) e di genitori pollinici apomittici (possibilmente al 100%). Nel caso
di apomissia facoltativa le cose si complicano notevolmente: sarà ovviamente indispensabile conoscere in
maniera precisa il grado di apomissia e sessualità dei materiali che si utilizzano. Inoltre, si dovrà tener
presente l'entità dell'effetto dose (dovuto alla poliploidia), il background genetico (fenomeni epistatici),
gli effetti citoplasmatici, pollinici ed ambientali.

Il primo ad eseguire un incrocio sex x apo fu lo stesso mendel, il quale oltre al lavoro sul pisello svolse anche
molte ricerche su altre specie come Hieracium (specie apomittica). Mendel rimane stupito perché vedeva in
Hieracium una situazione opposta al pisello dove incrociava due linee fisse e otteneva un F1 sempre uguale
e una F2 che segregava, in Hiracium incrociava due linee fisse e in F1 già otteneva segregazione! Però in F2
tornava l’uniformità dei caratteri dovuti alla segregazione dell’apomissia. Mendel ovviamente non era scemo
e aveva capito che questi fenomeni erano eccezioni mentre quelli del pisello erano la regola.

La stima del grado di apomeiosi richiede soprattutto un'attenta analisi citologica, avendo campionato i
macrogametofiti nel momento fenologico più adatto alla distinzione morfologica dei sacchi embrionali.

Per grado di apomissia (ricorrente) si deve intendere la quota percentuale della progenie che presenta
identità genotipica con la pianta madre: analisi morfologiche accurate, coadiuvate da metodi statistici
multivariati, possono fornire una stima abbastanza accurata di tale valore. Tuttavia, tecniche direttamente
dipendenti dal genotipo, come l'analisi isoenzimatica o quella degli RFLP (Restriction fragment length
polymorphism), forniscono risultati senz'altro più attendibili. La migliore valutazione sarà comunque quella
che scaturisce dalla comparazione dei risultati rilevati parallelamente con metodi diversi. L'analisi
cariologica della pianta madre e della progenie, potrà fornire un'indicazione sulla presenza e sull'entità di
fenomeni di apomissia non ricorrente, cioè di partenogenesi aploide e di formazione di ibridi BIII.

Esistono pochi studi sui determinismo genetico della partenogenesi, sia nelle piante apomittiche che in
quelle sessuali. Probabilmente i due processi, partenogenesi diploide e partenogenesi aploide, sono
strutturalmente simili e controllati geneticamente in maniera simile. Per diversi Autori il controllo di
questo carattere è più complesso di quello dell'apomeiosi, probabilmente poligenico, e maggiormente
influenzato dall'ambiente e dal genotipo pollinico. Perciò, sembra che la variabilità del comportamento
apomittico che si riscontra in molte specie facoltative, sia dovuta maggiormente alle capacità
partenogenetiche che non a quelle apomeiotiche.

In questa immagine ripresa da uno dei lavori di mendel su


Hieracium si vede proprio come lui incrociava una pianta
di Hieracium sessuale x una apomittica e otteneva in F1
varietà di forme e di colore (l’opposto dell’unità degli
ibridi di due linee omozigoti).

Esperimenti più recenti fatti su diverse specie hanno portato ad alcune considerazioni generali:

- Il controllo genetico sull’apomissia è di tipo semplice, cioè dovuto all’effetto di uno o pochi geni.
Molto si è dibattuto sul gene unico o sui due geni che controllano il processo di apomeiosi o di
partenogenesi. In molte specie è stato appurato un controllo monogenico e quindi si è ipotizzato che
l’apomissia sia dovuta al controllo di un solo gene complesse dove ci siano una sequenza codificante
responsabile di apomeiosi e una responsabile di partenogenesi. Ovviamente queste 2 sequenze
stanno sempre insieme tranne in una ricombinazione di bassa frequenza che darebbe origine agli
eventi di apomissia non ricorrente. In altre specie invece è stato dimostrato un controllo digenico ed
è stato controllato con esperimenti di mappatura che ci sono 2 geni indipendenti e non associati.

Due esempi molto sintetici:

1- Esperimenti di una 40 di anni fa su Panicum maximum e rappresenta un incrocio sex x apo in cui si
ha una segregazione 1:1 di apomissia e di sessualità → l’apomissia è dovuta a un singolo allele
dominante che segregava 1:1 nella progenie (controllo monogenico)
2- In Hieracium sono state studiate da ricercatori australiano e sono stati messi in evidenza 2 loci non
associati. Uno con funziona apomeiotica e uno partenogenica. Non si sa quale geni ci siano dietro

SLIDE 7

Una teoria alternativa sul controllo genetico dell’apomissia è nota come “teoria della collisione dei genomi”
ed è operta dell’americano Savidan. Si basa sull’osservazione che la maggior parte delle specie apomittiche
mostrano evidenza di derivazione da ibridazione interspecifica e il processo riproduttivo e le sue
modificazioni (come l’apomissia) sono dovute ad un’alternanza di fasi e di sviluppo ben definiti. Ipotizzo che
l’apomissia non fosse dovuta a geni particolari ma pensò che la collisione di due genomi che avviene in un
incrocio interspecifico porta all’espressione non sincrona di geni che sono alla base di eventi di sviluppo
(chiamata da lui eterocronicità) e anche a un’espressione sbagliata del punto di vista spaziale (eterototicità).
Questa teoria è stata poi verificata a livello sperimentale.

Recentemente Savidan ha formulato


una teoria che applicherebbe il
controllo monogenico rilevato in P.
maximum, in R. auricomus ed in Beta
lomatogona F. a tutti i casi di
apomissia gametofitica. Secondo
tale ipotesi, un unico evento
induttivo premeiotico, codificato
dall'allele "A", sarebbe responsabile
dell'innesco di una serie di eventi
che, dalla produzione del sacco
embrionale non ridotto (aposporia o
diplosporia), conducono alla
partenogenesi dell'ovocellula ed alla
pseudogamia (Fig. 36).

La figura 36 rappresenta come la


teoria di Savidan si basi
essenzialmente su considerazioni di sviluppo temporale. Nel caso ad esempio dell'aposporia, il sacco
embrionale non ridotto possiede un notevole vantaggio temporale rispetto allo sviluppo di quello sessuale,
per cui generalmente prevale nella competizione intraovulare. Tale vantaggio gli è conferito
essenzialmente dal fatto di non dover subire la meiosi. Poiché però il momento dell'impollinazione è
sincronizzato con la maturazione dell'ovocellula meiotica, il tubetto pollinico, trova il gamete non ridotto
che ha già completato la sintesi della parete cellulare e risulta impenetrabile allo spermio; solo la
fecondazione secondaria può allora aver luogo e l'embriogenesi risulta partenogenetica. Che
l'impollinazione ritardata sia un fattore scatenante per la partenogenesi è d'altronde noto anche in
numerose specie sessuali. Secondo l'ipotesi di Savidan l'eventuale verificarsi dell'impollinazione nei
momenti rappresentati in figura come (a) e (b), determinerebbe rispettivamente la produzione di un ibrido
BIII (2n + n) o la partenogenesi di un'ovocellula ridotta. Nel caso di diplosporia, l'evento induttivo
avverrebbe più tardivamente, quando ormai le cellule nucellari non possono essere stimolate allo sviluppo
gametofitico; tuttavia ne risulterebbe alterato il normale sviluppo meiotico, in senso mitotico (tipo
Antennaria) o restituzionale (tipo Taraxacum). Savidan ipotizza anche quale potrebbe essere l'evento
chiave del processo, sulla base delle osservazioni effettuate da Carman e Wang nel complesso agamico di
Elymus scabrus.

Alcuni studi recenti hanno potuto suffragare la teoria di Carman. Uno di questi è su Boechera che è molto
simile ad Arabidopsis dal punto di vista tassonomico e quindi anche come genoma, poi in questa specie
abbiamo l’espressione dell’apomissia a livello diploide quindi c’è la possibilità di fare studi genetici più
approfonditi. È stato fatto uno studio molecolare di espressione genica a livello di ovuli di una specie
apomittica e di una sessuale, è stato visto che esiste effettivamente un’espressione asincrona di una serie di
geni.

RIASSUMENDO: lo stato dell’arte (ma l’ha detto sul serio o è colpa dei soliti problemi di dizione) sul controllo
genetico dell’apomissia gametofitica prevede il controllo monogenico e quindi il linkat per l’apomissia, in
altre specie abbiamo evidenza di un controllo digenico: 2 geni non associati, uno per l’apomeiosi e uno per
la partenogenesi. E poi la teoria della collisione dei genomi dove chiaramente non sono geni specifici a
determinare il fenomeno ma l’asincronia: cioè alcuni geni che derivano da una specie e alcuni da un’altra
specie. Questo determina uno sfasamento nella precisione dell’espressione di questi geni che determinano i
fenomeni che conosciamo come apomissia. Se hai interesse nell’approfondire questo argomento sei la
benvenuta e puoi usarlo come argomento a piacere da portare all’esame!

Controllo genetico dell’apomissia gametofitica: riassumendo


1) Controllo monogenico: linkat per l’apomissia, 1 singolo locus che mostra ricombinazione
soppressa (es. Panicum)
2) Controllo digenico: due loci non associati, uno controlla l’apomeiosi e uno controlla la
partenogenesi (es. Hieracium)
3) Collisione dei genomi: nessun locus specifico, ma la variazione nel tempo (eterocronicità) e nello
spazio (eterototicità) di geni chiave dovuta all’origine interspecifica, provoca il fenomeno apomissia
(es. Boechera)
APOMISSIA E MIGLIORAMENTO GENETICO: sicuramente ci sono diverse specie apomittiche che sono
oggetto di coltivazione e quindi dobbiamo occuparci di miglioramento genetico delle specie apomittiche e di
quelle obbligate. Interessante è introdurre il carattere di apomissia nelle specie sessuate perché avere per
esempio un mais apomittico potrebbe essere propagato in modo indefinito o comunque autonomo anche
dagli agricoltori.

Il fenomeno dell'apomissia è stato inizialmente studiato


soprattutto da botanici e genetisti; i breeder vedevano il
comportamento riproduttivo delle specie apomittiche
unicamente come un ostacolo all'ibridizzazione e, di
conseguenza, alla ricombinazione genica. Il rinnovato interesse
per questa modificazione del sistema anfimittico si basa sulla
convinzione che lo studio dei meccanismi fisiologici e del
controllo genetico delle componenti che lo costituiscono
fornisce notevoli prospettive, sia nel miglioramento delle specie
usualmente apomittiche (obbligate o facoltative) sia in quello
delle specie sessuali

Il miglioramento genetico delle apomittiche ricorda quello delle vegetative. Se abbiamo un’apomittica
obbligata possiamo selezionare tra ecotipi ed entro ecotipi per genotipi che siano agronomicamente
interessanti. Qualsiasi pianta andiamo a selezionare è potenzialmente apomittica e quindi darà origine ad
una varietà uniforme. Se abbiamo variabilità sufficiente possiamo cercare di fare incroci intraspecifici se
abbiamo quei mutanti per la sessualità che abbiamo descritto e visto parlando del controllo genetico.
Possiamo fare degli incroci o delle autofecondazioni o degli incroci interspecifici.
Una volta sfruttata la
variabilità genetica libera
presente nelle popolazioni
naturali, ogni ulteriore
programma di
miglioramento necessita
della possibilità di ottenere
ibridi. Dal momento che le
specie apomittiche
(soprattutto quelle
pseudogame) producono
normalmente polline, possono essere utilizzate come genitore maschile, qualora sia stato possibile
individuare linee mutanti a riproduzione sessuata, come è accaduto in C. ciliaris, Paspalum notatum Flugge,
P. maximum ed Eragrostis curvula Nees. In mancanza di individui sessuali della stessa specie, si può tentare
la via dell'ibridazione interspecifica con specie sessuali affini o l'induzione di sessualità mediante
irraggiamento.

Lo schema di selezione riportato in figura 37, proposto per il C. ciliaris può essere valido in generale per
tutte le specie apomittiche obbligate. Le piante apomittiche delle progenie segreganti S1 e F1 possono
costituire direttamente materiale di selezione per nuove cultivar. Gli alleli dominanti, ad alta ereditabilità,
vengono espressi direttamente nella F1; per recuperare caratteri dovuti all'espressione di alleli recessivi le
progenie sessuali possono essere autofecondate, interincrociate o reincrociate con il genitore pollinico, al
fine di ottenere generazioni segreganti con nuovi genotipi apomittici su cui selezionare.

Il rilascio della cultivar di C. ciliaris "Higgins" conferma la validità teorica e pratica di questo schema; tale
varietà deriva infatti da un'unica pianta selezionata tra la progenie S 1 del clone sessuale TAM-CRD B-1s,
che è eterozigote per il modo di riproduzione.
SCHEMA DI BASHAW PER Cenchrus ciliaris: Questo è uno schema che è stato proposto anni fa per una specie
apomittica obbligata che si chiama Cenchrus ciliaris e fa parte delle graminaceae panicoidee, sono specie
importanti perché si usano come foraggio in ambienti sub-tropicali per esempio brasile, argentina… In
cenchrus è stato scoperto un mutante sessuale che poteva segregare gli apomittici sia se autofecondato sia
se incrociato con una pianta apomittica. Il succo di questo schema è che ogni nuova pianta che presenti
caratteristiche adatte può essere riprodotta e registrata come nuova varietà.

La prima specie in cui è stato


possibile studiare con successo il
controllo genetico dell'apomissia è il
C. ciliaris (2n = 4x = 36), foraggera
tropicale che presenta aposporia
obbligatoria, benché siano state
scoperte linee totalmente sessuali.
Taliaferro e Bashaw ottennero,
autofecondando la linea sessuale,
un rapporto di segregazione nel
sistema riproduttivo della progenie
pari a 13:3 (sessuali:apomittiche).
L'incrocio con una linea totalmente
apomittica produceva invece un
rapporto di segregazione non
significativamente diverso da 5:3
(sessuali:apomittiche).

Tali risultati sono stati spiegati ipotizzando un controllo da parte di due geni, A e B, con epistasia di B su A.
La presenza di un allele B è sufficiente a garantire la sessualità, mentre quella di A provoca apomissia se il
locus B è omozigote recessivo. Il doppio omozigote recessivo "aabb" risulta sessuale per la mancanza di A.
In tal caso, i risultati suddetti si spiegano ipotizzando che il genotipo della linea sessuale fosse stato "AaBb",
mentre quello della linea apomittica "Aabb"; i rapporti di segregazione nel caso dell'autofecondazione e
dell'incrocio risultano quindi come schematizzato in tabella 7 e Fig. 35.

Questo è uno schema che è stato proposto anni fa per una specie apomittica obbligata che si chiama
Cenchrus ciliaris e fa parte delle graminaceae panicoidee, sono specie importanti perché si usano come
foraggio in ambienti sub-tropicali per esempio brasile, argentina… In cenchrus è stato scoperto un mutante
sessuale che poteva segregare gli apomittici sia se autofecondato sia se incrociato con una pianta apomittica.
Il succo di questo schema è che ogni nuova pianta che presenti caratteristiche adatte può essere riprodotta
e registrata come nuova varietà.

BRACHIARA DECUMBENS: utilizzata in un prato estentsivo di allevamento di brasile.

.2) BREEDING DELLE SPECIE APOMITTICHE FACOLTATIVE: il miglioramento


delle apomittiche facoltative è simile a quello delle obbligate. Il vantaggio è
che non serve avere una pianta mutante sessuale per avere la riproduzione
sessuata, perché nelle facoltative c’è una quota elevata di riproduzione
sessuale in molti individui. Questo è un vantaggio se vogliamo fare gli
incroci, ma è uno svantaggio se dobbiamo recuperare un’alta percentuale
di apomissia. Per avere una cultivar che sia propagata per apomissia questa
deve avere dei livelli di espressione elevati. Il primo sistema può essere quello di selezionare tra-ecotipi ed
entro-ecotipi: per esempio la cultivar MERION viene da selezione su una singola pianta, fatta in un golf club
nel 1936. Era una pianta con caratteristiche particolarmente vantaggiose. Poi la Poa pratensis è anche
rizomatosa quindi tende a chiudere le fallanze: uno stesso genotipo si allarga e si distribuisce su una parte di
terreno più ampia. Bene questa pianta fu prelevata e selezione e fortunatamente aveva un elevato livello di
apomissia e la cultivar MERION è diventata una delle più utilizzate in tutti i tappeti erbosi negli stati uniti. La
Poa è molto importante anche nei campi da calcio

Il problema in questo caso è di più difficile soluzione: ogni genotipo selezionato produrrà sempre una quota
parte della progenie per anfimissia, che sarà genotipicamente eterogenea e morfologicamente aberrante.
D'altra parte, l'esecuzione degli incroci può risultare facilitata in quanto ogni pianta facoltativa può essere
utilizzata anche come genitore femminile, purché si riesca (anche con l'ausilio di geni marcatori) a
riconoscere in F1 la progenie di origine materna da quella ibrida.

Nel momento di costituire una nuova varietà si dovrà cercare di contenere la quota di anfimissia entro
limiti accettabili; tali standard, nel caso di specie foraggere o da tappeto erboso, potranno essere anche
più permissivi rispetto a quelli adottati per altre colture. L'incrocio o il reincrocio con parentali ad elevato
grado di apomissia permetterà di aumentare le capacità apomittiche dei genotipi interessanti, ma la
stabilizzazione di questo carattere nelle generazioni successive dovrà comunque essere accertata. Nella
produzione commerciale del seme sarà necessario l'isolamento spaziale delle produzioni, per evitare lo
scambio pollinico tra linee diverse.

Quando si deve invece effettuare un incrocio si può utilizzare sia un individuo sessuale che uno apomittico
facoltativo per un apomittico perché gli apomittici producono polline come tutte le piante. La selezione e la
valutazione deve essere fatta in maniera parallela per selezionare i caratteri agronomici interessati sia per
recuperare l’apomissia. Questo schema riguarda la cultivar di Poa ma rappresenta bene l’utilizzo dell’incrocio
nelle apomittiche facoltative.

In P. pratensis, la specie
apomittica di maggiore interesse
agrario in Italia, esistono genotipi
altamente apomittici (> 95%),
altri con percentuali minori, altri
totalmente sessuali. Nei paesi
dove è più vitale il miglioramento
genetico di questa specie, come
gli Stati Uniti e l'Olanda, le
cultivar che vengono registrate
garantiscono in genere
percentuali di apomissia superiori
all'80%.

La collezione e la valutazione
degli ecotipi è il primo passo nella
ricerca di nuove cultivar; in
seguito l'ibridizzazione intra ed
interspecifica può fornire nuove
combinazioni entro cui
selezionare. Molte delle ultime
iscrizioni varietali di P. pratensis negli USA sono state ottenute tramite incrocio intraspecifico: ad esempio,
la cultivar "ABLE I" deriva da una pianta altamente apomittica selezionata tra la progenie liberamente
impollinata di una pianta sessuale che era un promettente ibrido F1 selezionato dall'incrocio WARREN'S
A25 x NUGGET. Il genitore femminile (WARREN'S A25) è una linea a prevalente riproduzione sessuale,
mentre NUGGET è una varietà selezionata altamente apomittica (Fig 38).
Anche l'incrocio interspecifico fornisce buone prospettive al fine di indirizzare il comportamento
riproduttivo di una specie facoltativa verso una maggiore quota di sessualità o di apomissia o al fine di
effettuare l'introgressione di caratteri desiderabili. Le grandi possibilità di ibridizzazione nel genere Poa
sono state confermate già da molto tempo grazie all'ottenimento dell'ibrido a 4 vie [P. scabrella (Thurb.)
Bentham x P. pratensis] x [P. ampla Merr. x P. pratensis L. var. alpigena (Fr.) Lindm.]. I parentali di tale
ibrido sono adattati ad ambienti molto contrastanti; la progenie presentava individui apomittici e sessuali,
tutti riferibili tassonomicamente a P. pratensis, sebbene dimostrassero introgressione dalle altre specie.

Nonostante le grandi possibilità di incrocio esistenti nei complessi agamici poliploidi, il maggior problema
rimane quello di combinare nella progenie segregante l'espressione delle migliori caratteristiche
agronomiche con un grado di apomissia alto e stabile. A questo proposito sarebbe altamente auspicabile
poter prevedere la segregazione del carattere "apomissia", per evitare la dipendenza dal verificarsi di
combinazioni casuali tra caratteri agronomici e modo di riproduzione.
Uno dei motivi più importante dell’interesse nei confronti dell’apomissia è il suo auspicato trasferimento alle
specie a riproduzione sessuata. Il vantaggio maggiore sarebbe clonare via seme un genotipo. Sono stati
avanzati due dubbi a questa ipotesi:

1) Conseguenze ecologiche: cosa succederebbe se una specie particolarmente invasiva e apomittica


venisse messa in natura e prendesse il sopravvento → cosa che è stata discussa e valutata ma in
realtà è vero che le caratteristiche che rendono adatta una cultivar per la coltivazione sono le stesse
che non ne rendono elevata la fitness in condizioni spontanee
2) Come si può pensare che l’apomissia sia di interesse se poi rende l’agricoltore indipendente dalle
ditte sementiere? → le ditte sementiere dovrebbero ostacolare e non apprezzare. Pero in alcune
condizioni di agricoltura intensiva l’agricoltore potrebbe preferire il seme della ditta sementiera
perché questa garantisce delle sicurezze anche a livello sanitario del seme, delle germinazione etc…
e non solo genetico. In situazione di colture estensive e di sussistenza sarebbe una buona cosa
lasciare all’agricoltore la possibilità di fare la rimonta del seme.

8.4.3. Miglioramento genetico di


specie sessuali attraverso
l’apomissia

L'induzione e la manipolazione
dell'apomissia nelle specie sessuali
può essere tentata attraverso
diverse vie:

1) ricerca di individui che


presentino mutazioni naturali o
indotte classificabili come
"elementi di apomissia"
(apomeiosi e/o partenogenesi),
che possano essere manipolate
geneticamente;

2) ibridazione remota, per cui si


ottiene una sorta di apomissia
indotta;

3) ibridazione con specie apomittiche affini e introgressione del carattere "apomissia" nella specie
sessuale;

4) trasferimento in vitro dei geni per l'apomissia con tecniche di ingegneria genetica.
Le possibilità di trasferire l’apomissia
da specie apomittiche a sessuali è
stata effettuata attraverso 3
tecnologie: introgressione da specie
affini, elementi di apomissia in specie
sessuali e ibridazione remota. Oggi ci
si avvale di tecnologie avanzate e
quindi dello studio del controllo
genico in specie apomittiche e
sessuali.

.1) L’introgressione di apomissia da specie affini si basa sulla constatazione che per molte specie importanti
completamente sessuali esistono delle specie affini compatibili a livello di incrocio che presentano
apomissia. Abbiamo fatto già l’esempio di Elymus rectisetus che è un’affine del frumento e vi voglio citare il
Tripsacum dattiloides che è un’affine del mais, è simile al teosinte.

Quando si fanno questi incroci cercando di trasferire l’apomissia ad una specie sessuale, si deve tener conto
di alcuni problemi:

- Diverso numero cromosomico


- Presenza di diversa ploidia
- Espressione del carattere apomissia nel nuovo background genetico

Il successo dei programmi di introgressione genetica da specie selvatiche a specie coltivate per altri
caratteri, ha fatto ritenere interessante la prospettiva di introdurre l'apomissia nelle specie sessuali
mediante l'incrocio con specie apomittiche tassonomicamente affini. Benché non siano stati ancora
raggiunti risultati definitivi ed applicazioni pratiche, la gran quantità di ricerche condotte fa ritenere questa
una delle strade più promettenti.

Le problematiche maggiori che si riscontrano in questo caso sono quelle caratteristiche dell'incrocio
interspecifico, cioè la considerazione delle relazioni filogeniche e genomiche, la presenza di diversi livelli
di ploidia e il diverso background genico. La tabella 10 riporta alcuni esempi di specie sessuali in cui è stata
studiata la possibilità di incrocio con specie affini apomittiche.

Nel frumento, è stata ipotizzata l'introduzione dell'apomissia tramite l'incrocio con l'apomittico Agropyron
scabrum che presenta diplosporia restituzionale, tuttavia non è accertato il valore pratico di questa
possibilità. L'incrocio intergenerico, sebbene difficile, è anche possibile con la diplosporica E. rectisetus:
Carman e Wang riportano di aver trasferito l'intero corredo genomico di questa specie in alcune piante di
frumento, Benché l'espressione dei geni per l'apomissia nel nuovo background genetico non sia ancora
stata valutata.
Nel genere Beta le specie poliploidi della sezione Corollinae si riproducono apomitticamente. Diplosporia,
aposporia ed embrionia nucellare sono state riscontrate in diverse specie, di cui le tetraploidi B.
lomatogona e B. intermedia Bunge (2n = 4x = 36) e l'esaploide B. trigina W. et K. (2n = 6x = 54) sono le più
promettenti.

L'incrocio interspecifico di B. lomatogona con B. vulgaris L. (2n = 2x = 18), ha prodotto individui triploidi
con riproduzione apomittica, dimostrando in tal modo che il carattere era stato introgresso. Inoltre sembra
che il carattere apomissia venga trasmesso in maniera semplice e sia dominante rispetto alla sessualità.

Queste slide rappresentano gli esperimenti che


sono stati fatti per il trasferimento della
diplosporia da Tripsacum a mais: nel passato
c’erano 3 progretti, di fatto tutti quanti hanno
incrociato mais con tripsacum perché il mais è
un diploide 2n=20 mentre in tripsacum gli
apomittici hanno livelli di ploidia 3x, 4x, 6x…
quindi se incroci 2n=20 e 2n=72 ottieni un F1
con 10 cromosomi di mais e 36 di tripsacum.
Questo è il punto di partenza. In tutti questi
progetti per anni e decenni hanno fatto sempre
backcross con il mais per cercare di recuperare
le caratteristiche della specie coltivata. Questo
è stato un po’ frustrante perché tutte le volte
che ci si avvicinava alle caratteristiche del mais coltivato si perdevano quelle di apomissia, e viceversa.

Problema dell’espressione parziale, ma soprattutto instabile del carattere apomissia negli ibridi Mais X
tripsacum (v. Petrov, 1973).

Savidan e coll. Sono arrivati alla BC4, ma l’ottenimento di una pianta diplosporica con 20 cromosomi di
mais rimane un obiettivo non raggiunto. Allora è importante tutto il background, oppure il controllo
genetico è più complesso di quanto si pensasse

Un problema maggiore rimane il bilanciamento dell’endsperma, un problema sottovalutatoin passato …

Il Tripsacum dactyloides L. è la specie affine al mais più promettente ai fini della manipolazione
dell'apomissia. Tale specie presenta diplosporia mitotica e pseudogamia nelle sue forme triploidi,
tetraploidi ed esaploidi (rispettivamente 2n = 3x = 54, 2n = 4x = 72 e 2n = 6x = 108), mentre le forme diploidi
(2n = 2x = 36) si riproducono sessualmente. L'introgressione genetica da Tripsacum a Zea è già stata
realizzata per alcuni caratteri di resistenza. Il trasferimento della diplosporia al mais è stato effettuato a
livello sperimentale, anche se il processo rimane difficile per la diversità di numero cromosomico, e
l'espressione del carattere nel background genetico del mais risulta incompleta e soprattutto instabile.

La specie foraggera in cui le possibilità di introgressione dell'apomissia sono state studiate più a fondo è il
Pennisetum glaucum (L.) (2n = 2x = 14). Dujardin e Hanna riportano 7 specie poliploidi affini a riproduzione
apomittica. Tra queste le specie più facilmente incrociabili e più promettenti per il trasferimento del
carattere sono P. orientale L.C. Rich. (2n = 4x = 36), P. setaceum (Forssk.) Chiov. (2n = 3x = 27) e P.
squamulatum Fresen (2n = 6x = 54). In particolare, gli ibridi ed i reincroci prodotti con quest'ultimo
presentano vari gradi di fertilità e riproduzione sessuale, facoltativa e totalmente apomittica. Le possibilità
offerte da P. squamulatum comprendono anche il fatto che le diversità a livello cromosomico e genomico
non sembrano costituire un notevole ostacolo nell'esecuzione dei programmi di incrocio.
MAIS APOMITTICO: sono state costituite alcune linee avanzate e materiali utili. Sono stati fatti molti patent
annunciando questo mais apomittico ma in realtà sono solo materiali di transizione e da ricerca perché se è
apomittico non è mais e se è mais non è apomittico.

.2) Elementi di apomissia in specie sessuali: è la seconda strategia. In molte specie sessuali sono state
descritte mutazioni assimilabili all’apomissia: quindi apomeiosi, cioè produzione di gameti non ridotti, e
anche partenogenesi, cioè sviluppo autonomo della cellula uovo. Si pensava che combinando un mutante
apomeiotico con uno partenogenetico si sarebbe ottenuta una nuova specie apomittiche: le prospettive e la
semplicità delle idee non sono state seguite da grandi risultati perché spesso queste caratteristiche si
presentano nelle specie sessuali come mutazioni e quindi eventi che accadono a frequenza bassa e che sono
influenzati da fattori ambientali e di cui è difficile aumentare la frequenza.

Tabella incompleta e solo esemplificativa di come nelle sp sessuali si ritrovino latenti tutti gli elementi
dell’apomissia (ovocellule 2n, partenogenesi aploide/diploide). Matromorfia è la apomissia nelle sessuali
(partenogenesi diploide irregolare). Tuttavia:

1) Non si ritrovano esempi di


aposporia o diplosporia mitotica
che sono i più garanti
dell’identità del genotipo. Esiste
sempre ‘tendenza meiotica’

2) Molti mutanti desinaptici, ma


pochi asinaptici. I desinaptici
presentano un numero limitato
di chiasmi alla profase I.

3) Nellamacrosporogenesi prevale
SDR, che significa omozigosi

4) Comparsa in certi genotipi, ma


ad una frequenza molto bassa.

5) Influenza dei fattori esterni.


.3) Ibridazione remota: la terza strategia che è stata perseguita in passato. È sulla base dei presupposti della
teoria di Carman. L’incrocio tra individui di specie simili ma tassonomicamente lontane spesso scatenano
eventi assimilabili ad apomissia. Il più frequente è l’ottenimento della partenogenesi aploide ossia lo stimolo
allo sviluppo dell’ovocellula o in assenza di fecondazione o con fecondazione e conseguente eliminazione dei
cromosomi della specie impollinante. Ottimo sistema per ottenere gli aploidi ma dal punto di vista della
stimolazione dell’apomissia ha ben presto rivelato scarso interesse pratico.

L’incrocio tra individui tassonomicamente


lontani conduce talvolta all’espressione di
alcuni caratteri apomittici.

La riproduzione anfimittica è bloccata.

L’apomissia che si presenta è ‘indotta’: dipende


essenzialmente da cause esterne (gen.
Pollinico) e non può essere definita apomissia
facoltativa.

Perciò il metodo ha scarso interesse pratico,


semmai può servire ad evidenziare genotipi con
particolare tendenza a manifestare elementi di
apomissia.

Con l’avvento delle


biotecnologie sono state
impiegate diverse tecniche. Ci
sono molti esempi di ricerche in
questi ambiti. I più attuali sono
quelli di genomica e di
genomica funzionale che sono
rivolti o sulle specie
apomittiche o su quelle
sessuali.

Gli studi sulle specie apomittiche hanno in primis previsto dei progetti di mappatura: facendo incroci sex x
apo e avere segregazione del carattere apomissia e seguendolo con marcatori molecolari si possono mappare
i geni e avvicinarsi mediante il positional cloning. Per questi progetti di mappatura i sistemi tradizionali erano
un po’ difficoltosi quindi sono stati sviluppati e portati avanti sistemi più semplici come Hieracium o le specie
di Becera che hanno uno scarso livello di ploidia.

Una caratteristica fondamentale vista nelle mappe delle panicoidee è che la regione in cui si trova il gene
dell’apomissia è una regione con scarsissima ricombinazione, quindi i marcatori genici che normalmente
ricombinano e quindi possono essere mappati ma nell’apomittico questi marcatori finiscono tutti nello stesso
punto e quindi non c’è ricombinazione. Questo va in linea con l’idea di un gene complesso formato da più
sequenze codificanti.

I processi di mappatura comunque hanno portato a delle informazioni più avanzati e all’identificazione di
alcuni geni candidati: geni che si sa che sono legati alla gametogenesi e allo sviluppo dello zigote e che
mappavano in qualche modo nelle stesse regioni dove mappava il gene dell’apomissia. Questi candidati
quindi sono oggetto di ricerca per capire chi è coinvolto.

Studiare l’apomissia in specie sessuali significa studiare i geni che sono alla base del processo sessuale.
Questa slide fa vedere come si comincino a conoscere i geni che funzionano nei singoli step. La conoscenza
di questi geni potrebbe nel futuro dare imput per capire quali mutazioni, se di mutazioni si tratta, potrebbero
dare un comportamento apomittico.

Con le moderne tecniche basate ad esempio


sula microdissezione si possono fare
campionamenti anche delle singole cellule
che compongono un gametofito femminile
e studiarne il cDNA, ossia i geni espressi. In
questa figura vedete che è stato fatto uno
studio analitico su geni specifici della
singergidi in F della cellula uovo in G e della
cellula centrale in E. questo produce elenchi
smisurati di geni dal nome apparentemente
insignificante ma piano piano può
consentire di capirne il funzionamento.

L’APOMISSIA IDEALE: una rifressione sul


sistema apomittico ideale. Sarebbe un sistema in cui si
potesse passare dalla sessualità all’apomissia a discrezione
dell’utente, quindi magari un sistema inducibile così da
poter stimolare la sessualità per studi di miglioramento
genetico e apomissia quando si vuole propagare il seme. La
forma apomittica più interessante potrebbe essere una
diplosporia mitotica autonoma dove non c’è bisogno di
fecondazione neanche per l’endosperma, non c’è pericolo
di poliembrionia e di rimescolamento del materiale
genetico. La produzione del seme potrebbe essere fatta per
via apomittica e dalla cultivar si potrebbe riavere apomissia
per la rimonta del seme o sessualità se si vuole mantenere
la protezione tencologica. Ovviamente è un ragionamento
ipotetico.
Avendo iniziato la lezione con una citazione letteraria, la finisco con una citazione letteraria con una poesia
di Pohl (mazzu non sa chi sia, manco io). È l’ode ad una specie apomittica che è il dandelion, cioè il tarassaco
o soffiose.
9a – FRUIT SET, DEVELOPMENT AND PARTHENOCARPY

Allegagione e lo sviluppo del frutto. Lo sviluppo del frutto è l’ultima parte della riproduzione delle piante
quindi questa è l’ultima lezione sull’approfondimento sulla biologia riproduttiva.

In questa slide vedete schematizzata la riproduzione sessuale delle piante partendo dall’induzione fiorale
fino alla formazione del fiore in tutte le sue parti e questa è la riproduzione in senso stretto, se volgiamo
parlarne in senso lato dobbiamo aggiungere che il fiore viene poi impollinato e fecondato e da esso ha origine
lo sviluppo del seme e del frutto. Ovviamente lo sviluppo del frutto e del seme sono eventi di importanza
fondamentale perché sono alla base sia della produzione commerciale che della moltiplicazione di molte
specie coltivate.

Normalmente, l'allegagione del frutto è in


relazione al completo successo
dell'impollinazione e della fecondazione. La
fecondazione richiede la germinazione del
polline e la penetrazione e l'accrescimento
del tubo pollinico nel tessuto stilare verso
l'ovulo e dentro il sacco embrionale per la
fusione con la cellula uovo. La crescita dei
tubi pollinici nel pistillo e in seguito la
presenza di ovuli fecondati scatenano lo
sviluppo dell'ovario in frutto. In assenza di
tali stimoli generalmente l’ovario va
incontro a senescenza e, dopo pochi giorni,
ad abscissione. Una fruttificazione ottimale,
di grande importanza per molte colture,
dipende quindi dall’esistenza di condizioni
ottimali per lo svolgimento del processo
riproduttivo. Queste condizioni comprendono lo stato nutrizionale della pianta, il soddisfacimento del
fabbisogno idrico, nonché le condizioni ambientali. Diversi processi connessi con la riproduzione, come la
microsporogenesi, la deiscenza delle antere e la crescita del tubetto pollinico, sono molto sensibili alle
temperature.

In pomodoro ad esempio le cultivar moderne allegano bene entro un intervallo di temperatura molto
stretto: 15-21°C di notte e 30-35°C di giorno. Al di fuori di questi intervalli di temperatura generalmente
l'allegagione è difficoltosa perchè non viene prodotta una quantità sufficiente di polline fertile e si ha
difficoltà nella deiscenza delle antere, nell'impollinazione e nella fecondazione. Piante di pomodoro
allevate con basse temperature, bassa intensità luminosa e corto fotoperiodo, generalmente presentano
un basso numero di fiori fecondati ed una scarsa percentuale di allegagione. Tali condizioni sono frequenti
nelle serre e nei tunnel freddi, e in pieno campo con colture precoci; in questo modo temperature basse e
umidità eccessiva riducono la produzione di polline e, se prodotto, la deiscenza delle antere e la
germinazione del polline. Al fine di superare gli inconvenienti a cui vanno incontro le colture precoci di
pomodoro, la procedura normalmente adottata dagli agricoltori prevede l'impiego di prodotti ormonali
alleganti. La stessa pratica viene applicata anche per molte altre colture (cfr. 7.2.2.).

Nella maggior parte delle angiosperme lo sviluppo del frutto può essere suddiviso schematicamente in
quattro fasi: la prima comprende lo sviluppo dell'ovario all'interno del fiore fino all'antesi e la decisione se
entrare in senescenza e abortire o procedere con l'allegagione (fruit set) e la formazione del frutto; la
seconda comprende principalmente la crescita dovuta a divisione cellulare; nella terza la divisione cellulare
termina e il frutto continua ad accrescersi per espansione cellulare, fino a quando il non ha raggiunto le
dimensioni finali. L’ultima fase consiste nei processi fisiologici che portano alla maturazione (fruit
ripening). Frutti di specie diverse mostrano delle variazioni da questo generale modello di sviluppo. Per
esempio, in alcuni casi, come in avocado, la divisione cellulare nel pericarpo continua fino a poco prima
della maturazione.

Scusate la slide sfocata ma sintetizza bene la suddivisione dello sviluppo del frutto che può essere divisa in 3
fasi.

Quando il fiore viene impollinato inizia una fase di attiva divisione dell’ovario (quando parliamo dello sviluppo
del frutto parliamo in primis dello sviluppo dell’ovario). Questa fase di divisione cellulare attiva non dura
moltissimo perché ben presto viene a spegnersi lentamente per lasciare il posto ad una fase di maggiore
espansione cellulare che porta il frutto a raggiungere le sue dimensioni definitive ad uno stadio che viene
chiamato anche di verde maturo. Alla fine del’espansione cellulare inizia la fase di maturazione (ripening) che
consiste nelle trasformazioni che portano un frutto verde ad essere un frutto pigmentato e maturo in tutte
le sue parti. L’inizio della fase di ripening va sotto il nome di Breaker e Turning che è quella fase in cui il colore
comincia a cambiare da verde e poi si arriva alla fase di maturazione completa.

È fondamentale l’apporto di tutti i principali ormoni delle piante durante lo sviluppo del frutto:

- Auxine e gibberelline sono fondamentali nel fruit set e poi insieme alle citochinine per la fase di
divisione
- Gibberelline importanti anche durante l’espansione
- La fase di maturazione è caratterizzata dall’etilene ma anche le auxine sono molto attive.

Nella prima fase, di cui si è già parlato, dalla fusione e dalla crescita dei carpelli, gli organi che si
differenziano nel cerchio più interno del meristema fiorale, si forma il pistillo, composto da ovario, stilo e
stigma. Quando il fiore è maturo, i tessuti del pistillo hanno raggiunto un'elevata differenziazione e l'ovario
è composto da un rivestimento esterno (pericarpo) e da un tessuto parenchimatico interno (placenta) che
porta inseriti gli ovuli. All'interno degli ovuli sono maturi i gametofiti femminili (sacchi embrionali) nei quali
si sono differenziati i gameti (cellule uovo). In questo momento, l'attività della divisione cellulare
nell'ovario è temporaneamente ridotta fino a quando non è terminata la fecondazione.

La decisione di procedere con lo sviluppo del frutto (allegagione) dipende da uno o più segnali positivi di
crescita generati durante e/o dopo l'impollinazione, e infine con la fecondazione. Gli stimoli positivi di
crescita sono prodotti durante la germinazione del polline, la crescita del tubetto pollinico e dopo la fusione
dei gameti: tali fattori includono principalmente auxine e gibberelline. Le gibberelline stimolano la
germinazione del polline e la crescita del tubo pollinico; infatti l'applicazione esogena di gibberelline ai fiori
può consentire l'allegagione in assenza di impollinazione (partenocarpia artificiale). In seguito un forte
apporto di GA si ha da parte dell’embrione; in particolare la regione del sospensore è il luogo di maggiore
sintesi di questi ormoni. Sembra che le gibberelline agiscano indirettamente nel processo di allegagione,
stimolando la produzione di auxina; infatti l'utilizzo di gibberelline in fiori non impollinati causa un
incremento del livello di auxina nell'ovario. Le gibberelline prodotte dal polline, quindi, possono essere
responsabili dell'incremento di produzione di auxina nell'ovario, che a sua volta può agire come un segnale
(o può amplificare un segnale) per l'allegagione e la successiva divisione cellulare. Studi più recenti hanno
però avvalorato l’ipotesi contraria, in quanto è stato visto che l’auxina stimola la trascrizione di geni che
codificano enzimi chiave della biosintesi delle GA e in un certo senso ne controlla i livelli. Quello che
comunque è certo è che il rapporto funzionale tra queste due classi di ormoni in questa fase dello sviluppo
è molto stretto e non è ancora stato ben compreso.

Lo sviluppo del frutto determina la trasformazione dell’ovario in una struttura molto più espansa e con una
pigmentazione differente e conformazione differente. Ci sono una serie di tessuti importanti che vanno dal
pericarpo (comprende esocarpo e mesocarpo) e di solito rappresenta la parte edule, poi la parte interna è
l’endocarpo e contiene di solito i semi.

Di nuovo una slide che rappresenta l’andamento dello sviluppo del frutto, ma da un lavoro molto più recente.
Non sono però diminuiti i punti interrogativi perché su questi argomenti ci sono molti studi ma ancora non è
stato definito il ruolo dei vari ormoni. È anche definito come nello sviluppo del frutto gli ormoni siano di fatto
importanti sia per la qualità che per la quantità del frutto. L’assenza o la presenza di seme può essere un
fatto qualitativo, l’espansione quantitativa ma anche lo sviluppo di forme diverse. E poi durante il ripening si
stabilisce la produzione e tutte le caratteristiche qualitative del frutto maturo.

Alcuni dettagli sulla fase fondamentale dell’allegagione o detta fruit set li daremo in seguito parlando di
partenocarpia. Ora vi parlo delle fasi successive.

Lo sviluppo del frutto avviene in primis per divisione cellulare. Il controllo e la divisione cellulare sono
importanti per le dimensioni del frutto finale e sono sotto il controllo di molti geni.

Nel frutto di pomodoro è stato identificato sul braccio lungo del cromosoma 2 il QTL fw2, è stato
recentemente clonato (tipo inizio anni 2000). È stato il primo QTL di cui sia stato clonato il gene (primo gene
di carattere quantitativo)

4.3 Clonaggio di geni per caratteri quantitativi (QTL cloning)

Così come appena visto per geni che controllano caratteri qualitativi (monogenici), spinta alle più
dettagliate conseguenze l’analisi QTL può consentire di clonare (identificare) i geni veri e propri che
rappresentano i QTL. Con difficoltà maggiori ma con essenzialmente le stesse procedure descritte prima è
possibile arrivare a scoprire quale sia la sequenza codificante responsabile (di una parte) del fenotipo, cioè
il gene e quindi la proteina che influenza il carattere in esame.

Ad esempio il gene rappresentante il QTL per le dimensioni della bacca denominato fw2.2, localizzato sul
braccio lungo del cromosoma 2 di pomodoro è stato identificato nel 2000 dal gruppo di S. Tanksley.

Questa slide rappresenta come l’espressione di fw2.2 sia coincidente con la fase di divisione cellulare e
avviene prima che avvenga un’importante espansione delle cellule e quando l’indice mitotico è al massimo.

Il gene che rappresenta il QTL fw2.2 è stato dimostrato essere un regolatore negativo della mitosi nell’ovario
prima della fioritura, la sua similarità ad un oncogene umano ne giustifica la funzione. Una mutazione di
questo genere ha portato ad un abbassamento della sua espressione nel pomodoro coltivato, era invece alta
nelle specie selvatiche. Nelle varietà a frutto grande manca l’espressione del gene. Quindi la mutazione di
questo gene ha determinato un aumento di dimensioni del frutto. È una mutazione fissata nel pomodoro
coltivato. Gli ortologhi di questo gene hanno funzioni simili anche in altre specie. È possibile estendere questa
conoscenza anche a specie simili.

In questa immagine si vede l’analisi di espressione di fw2.2 in fiori della linea di pomodoro coltivato a bacca
grande (coltivato, a sinistra) e in quello della linea a bacca piccola (selvatico, a destra). L’analisi è fatta
tramite RT-PCR. I numeri romani rappresentano tre diversi stadi I: bocciolo fiorale di 3-5-mm, II: fiori da 5
mm all’antesi, III: fiori all’antesi. I numeri arabi indicano diversi organi del fiore 1, sepali; 2, petali; 3, stami;
4, carpelli (=ovario); L, foglie.

Si veda l’espressione del gene nell’ovario soprattutto agli stadi di pre-antesi: nel genotipo a bacca grande
(cerchi rossi) il gene si esprime molto meno che nell’ovario del genotipo a bacca piccola (cerchi neri).

Verrà poi dimostrato che la mutazione responsabile di questa ridotta espressione del gene riguarda il
promotore del gene stesso.

La fase di espansione cellulare determina l’accrescimento dimensionale del frutto e a volte ne determina
anche il conseguimento di forme differenti. È una cosa parzialmente vera perché in pomodoro per esempio
la forma del frutto è già determinata durante lo sviluppo del fiore. La variabilità genetica che si riscontra nelle
forme di frutti è dovuta a mutazioni che oggi si vengono a conoscere.

Dopo la fecondazione nell’ovario ha inizio la divisione cellulare (in pomodoro ad es. dura circa 7-10 giorni).
Nel monento in cui termina la divisione cellulare le singole cellule incominciano ad allargarsi per le
successive 6-7 settimane fino a formare il frutto maturo. Prima della fase della distensione cellulare, cioè
quando le cellule sono in divisione, esse sono
piccole, strettamente compresse, e ricche in
sostanze citoplasmatiche e con piccoli vacuoli.
Quando le cellule si allargano la parete cellulare
primaria e la membrana citoplasmatica diventano
relativamente più tese e i vacuoli occupano una
maggiore porzione del volume cellulare. Nella fase
di divisione, l'attività mitotica è generalmente
maggiore nel pericarpo e nei tessuti placentali.
Nello sviluppo normale del frutto, l'embrione o il
seme in formazione controllano il tasso della
divisione cellulare nel tessuto che li circonda.
Questo punto di vista è consistente con le
osservazioni che il numero di ovuli fecondati (futuri
semi) generalmente determina l'iniziale tasso di
crescita dell'ovario, cioè il tasso di divisione
cellulare. Se gli ovuli non si sviluppano in una parte del frutto, si formano frutti asimmetrici, in cui lo
sviluppo normale o ritardato dell'organo coincide proprio con la presenza o l'assenza di semi. Esiste anche
una correlazione positiva tra il numero di semi e la crescita in dimensioni del frutto.

Dopo la divisione cellulare, la crescita del frutto è dovuta essenzialmente alla distensione cellulare. Nella
maggior parte delle specie l'aumento del volume cellulare può dare il maggior contributo alle dimensioni
finali del frutto. Nella bacca di pomodoro, il volume delle cellule nella placenta, nel tessuto loculare e nel
mesocarpo può aumentare più di 10 volte, mentre le cellule che fanno parte dell'eso- e dell'endocarpo,
che continuano a dividersi, si espandono molto meno. Questa espansione cellulare nei tessuti del frutto
non è parallela ai processi di sviluppo del seme, il quale non mostra un simile aumento di dimensioni.
Durante il periodo di espansione cellulare rapida del frutto, l'embrione si trasforma da struttura globulare
in un embrione bilaterale che mostra i cotiledoni ben sviluppati e un asse apico-radicale già stabilito. E'
accertato che l'auxina ha un ruolo fondamentale nell'espansione cellulare nei tessuti del frutto; l’auxina
molto probabilmente causa un incremento nell'estensibilità delle pareti cellulari e induce l'assorbimento
di acqua e di soluti.

Anche la forma del frutto è un carattere quantitativo (controllato da più loci). Oggi in pomodoro si conosce
che di questi loci solo pochi hanno un effetto maggiore e questi pochi si conoscono tutti. Il pomodoro wt è
piccolo, tondo e generalmente con due logge (con 2 soli carpelli). Delle mutazioni che hanno inciso sullo
sviluppo di un numero maggiore di carpelli troviamo il LC (locule number) e il gene FAS (fasciated) e hanno
aumentato il numero di carpelli nella bacca e quindi l’aumento di dimensoni e formazione a volte di frutti
appiattiti.

Parallelamente ci sono state mutazioni che hanno determinato la forma allungata del frutto: il fattore di
trascrizione OVATE.

Altre forme come il pomodoro a cuore, a corno ed altri sono dovuti ad ulteriori mutazioni avvenute dopo il
trasferimento del pomodoro in Europa, sono quindi molto recenti e riguardo gli ultimi secoli.

La fase del Ripening o della maturazione è una fase fisiologica in cui il frutto immaturo si sviluppa in frutto
maturo. È un fenomeno molto specifico e peculiare delle angiosperme perché è caratteristico del frutto. I
processi fisiologici che avvengono possono essere schematizzati. Avviene il softening (ammorbidimento dei
tessuti del frutto cosicché diventi appetibile per i disseminatori), avviene la sintesi di molecole e sostanze che
aumentano il profumo, l’aroma e l’attrattività del frutto, avviene la perdita di clorofilla e l’accumulo di
pigmenti che sono utili per incrementare l’appetibilità del frutto stesso. Con tutto questo aumenta anche la
suscettibilità al patogeno perché i tessuti diventano più aggredibili.

(softening, aroma e sapore, nutrizione, perdita di clorofilla, accumulo di pigmenti, suscettibilità ai patogeni).

In questo grafico espresso in giorno


post antesi possiamo vedere i
fenomeni di cui abbiamo parlato:

la divisione cellulare termina entro i


primi 10 giorni, poi entro i 35 termina
l’espansione con il raggiungimento
del mature green, il picco di etilene
che nei frutti climaterici da origine
alla maturazione ora da origine alla
softening e alla sintesi dei
carotenoidi.

Ovviamente nello sviluppo del frutto sono fondamentali tutti i processi che portano alla sintesi e all’uccumulo
delle sostanze con valore nutrizionale e salutistico. Per esempio la classe dei pigmenti che non solo
rappresentano la possibilità di differenziazione estetica ma rappresentato anche molecole bioattive con
attività benefica sulla salute. Nel pomodoro esistono molte varianti che rendono diversificato il contenuto
dei pigmenti e quindi il colore e vengono chiamati geni del colore.

Un’altra categoria di varianti importanti sono quelle mutazioni che ritardano la maturazione. Quando
abbiamo parlato dei geni mad box vi ho citato il gene rin (?) che rallenta la maturazione. Sono importanti
perché aumentano la shelf life del prodotto.

MODIFICAZIONI DEL FRUIT SET:

LA PARTENOCARPIA: è una modificazione del fenomeno dell’allegagione. In tutte le specie non avviene
allegagione del frutto se non c’è fecondazione. In molti casi ci possono essere sia delle varianti genetiche che
dei trattamenti artificiali che possono bypassare impollinazione, fecondazione e sviluppo del seme e però
stimolare lo sviluppo del frutto che diventa un frutto senza seme. Questi fenomeni vanno sotto il nome di
partenocarpia e sono importanti perché ci consentono di capire i meccanismi dell’allegagione e sono anche
un metodo per migliorare la qualità dei frutti (i frutti senza semi piacciono) e sono un metodo per aumentare
o stabilizzare la produzione in quei casi in cui ci siano condizioni sfavorevoli alla produzione del polline ed
aumentare quindi la produzione. Un’altra cosa positiva è proteggere la tecnologia perché la pianta che
produce quel seme è sterile (tutti i soldi ai vivaistiiiiiiiiiii. Michela dixit)
In realtà i fenomeni che portano alla formazione del frutto senza semi dovrebbero essere indicati dalla parola
APIRENIA (frutto senza seme) che è un fenomeno più generale. In questo fenomeno possiamo comprendere
la partenocarpia (sviluppo dell’ovario totalmente indipendente dalla fecondazione e impollinazione) e la
stenospermocarpia (avviene impollinazione e fecondazione e iniziale sviluppo dell’embrione ma viene
abortito per problemi genetici → frutto senza
semi ben formati ma spesso con abbozzi di
semi).

La partenocarpia può essere suddivisa in:


partenocarpia naturale di natura o genetica
(obbligatoria o facoltativa a seconda
dell’espressione del gene) o ambientale
(accidentale). La partenocarpia può essere
ottenuta in modo artificiale intendendo
l’induzione con somministrazione di ormoni.
Per via biotecnologica si intende con
modificazioni genetiche sul fenomeno
dell’allegagione.

VANTAGGI DELLA PARTENOCARPIA:

l’assenza del seme è spesso apprezzata dal consumatore o da


chi effettua trasformazioni tecnologiche. Lo svincolo
nell’impollinazione è importante dal punto di vista produttivo
(in tempi dei cambiamenti climatici è importante avere piante
che producano anche in assenza di pronubi o polline. Ele i
pronubi sono gli insetti impollinatori). Inoltre permette la
fruttificazione di genotipi sterili come i triploidi e altri
poliploidi.

Può rappresentare anche una produzione della tecnologia.

Alcuni esempi di specie partenocarpiche come varietà di citrus, banane, alcuni cetrioli. Fico d’india, ananas,
pomodoro, pepino (solaneacea che origini sud americane di cui ne è stata proposta l’introduzione in europa
senza grandi successi).

La partenocarpia naturale è dovuta a predisposizione genetica e può essere distinta in obbligatoria


(totalmente di origine genetica), facoltativa e accidentale, (in questi due ultimi casi essa è dovuta
all'influenza delle condizioni ambientali e di conseguenza la sua origine è indeterminata) (Tab. 4). Nel caso
più frequente di partenocarpia facoltativa si ha la produzione di frutti con semi o senza semi in relazione
alle condizioni ambientali. Le condizioni ambientali agiscono sui tessuti del gametofito o dello sporofito
inducendo la formazione di frutti apireni. Si ha partenocarpia accidentale quando la formazione di frutti
apireni è poco frequente. In questo caso i fattori ambientali, quali la temperatura (alta o bassa), l'intensità
luminosa, il fotoperiodo, le concimazioni, l'umidità, ecc., predominano su quelli genetici, impedendo
l'impollinazione e la fecondazione. Nella partenocarpia naturale facoltativa, invece, la formazione di
bacche prive di semi è relativamente frequente, raggiungendo anche il 100% dei frutti formatisi. In questo
caso i fattori genetici agiscono in maniera prevalente su quelli ambientali. Si pensa che i mutanti
partenocarpici presentino alterati equilibri ormonali che fanno raggiungere nell’ovario livelli auxinici (o
gibberellinici) capaci di stimolare l’allegagione anche in assenza di fecondazione. Per esempio i livelli
endogeni di auxine e gibberelline prima della fecondazione sono più alti negli ovari di linee di pomodoro
partenocarpiche che in quelle normali (che producono semi).

In alcune specie di interesse agrario (banana, ananas, fico, melone, cetriolo, uva, agrumi, dattero) esistono
varietà con capacità partenocarpiche più o meno spiccate che vengono ampiamente sfruttate nella
produzione commerciale. Ad esempio, tutte le varietà di banana sono partenocarpiche, permettendo di
evitare la presenza dei semi nel frutto (Fig. 31) e di
sfruttare la coltivazione di genotipi triploidi che sono
A B C
commercialmente molto più validi dei diploidi, ma
sessualmente completamente sterili.

Altri esempi di specie partenocarpiche sono la pastinaca, la D E F


palma da olio, annona squamosa, kiwi, cetriolo, citrus,
banana,pomodoro (l’effetto del gene pat2. Bacca con
diverse logge e semi a sx mentre a dx stesse dimensioni e G H I
logge ma completa assenza di seme. In pomodoro queste
non hanno trovato sviluppo sul mercato ma solo per studi
di base sul fenomeno).

Carrellata di specie partenocarpiche: (se volete approfondire questo non è molto aggiornato eh)

- Banana (musa spp.): le cultivar commerciali sono tutte triploidi quindi propagate vegetativamente e
sono sterili. Quindi la possibilità di avere un frutto è legato essenzialmente alla partenocarpia.

- Il Fico (Ficus carica L.) ha fiori di tre tipi: femminili a stilo lungo (numerosi nelle cultivar eduli),
femminili a stilo corto (ospitano la Blastophaga) e maschili. Gli ultimi due tipi sono numerosi nel fico
selvatico (caprifico). Il siconio può formarsi per fecondazione o per partenocarpia. Il fico
normalmente richiede impollinazione incrociata per dare frutti, per mezzo del complesso ciclo della
Blastophaga, tuttavia la maggior parte dei fichi coltivati (common type) allega senza impollinazione
(partenocarpici) e sono coltivati senza maschi.

- La diffusione del pepino (Solanum muricatum) al di fuori delle Ande è stata limitata a causa delle
difficoltà di allegagione al di fuori del suo ambiente di origine. Questo è dovuto alla bassa fertilità del
polline e alla difettosa deiscenza delle antere soprattutto alle alte temperature. Inoltre alte
temperature producono l’allungamento dello stilo (stigma exertion) che riduce l’impollinazione.
Tuttavia anche basse temperature (<10°C) hanno effetti negativi sul fruit set. Esistono cloni
partenocarpici, noti sin dal 1891 (Bailey), sia di tipo obbligato (maschiosterili) sia facoltativi: questi
cloni sono più produttivi sotto condizioni subottimali. Prohens e coll. identificano la partenocarpia
come controllata geneticamente da un solo gene dominante (P), ma l’efficienza della partenocarpia
e il grado di partenocarpia facoltativa sono caratteri molto più complessi.

- Le banane e plantains (Musa spp.) hanno genomi aploidi definiti A o B a seconda che derivino da
Musa acuminata o da Musa balbisiana. Plantain sono le banane da cuocere (la maggiore quantità di
amido viene dal genoma di M. balbisiana) hanno genomi AAB o ABB. Diversamente, le banane da
mangiare crude sono solo del gruppo AAA. Tutte sono praticamente sterili (2n=3x=33) e producono
frutti partenocarpici. La partenocarpia ha una base genetica: il carattere è controllato da almeno tre
geni dominanti indipendenti (P1, P2, P3). Quindi le banane commerciali sono triploidi partenocarpici
(I diploidi non sono adatti per il ridotto sviluppo del frutto il basso vigore e la presenza dei semi) che
vengono propagati vegetativamente. Il miglioramento genetico si basa sull’uso di triploidi che
producano gameti non ridotti (eg. Gros Michel) da incrociare con buoni diploidi. Solo la varietà Gros
Michel ha presentato questa caratteristica, mentre tutti gli altri cloni triploidi non hanno mai
prodotto un solo seme.

- Agrumi (citrus spp.): la partenocarpia è molto gradita dai consumatori e da chi effettua la
trasformazione in succo. Permette di sfruttare la triploidia e soprattutto gli ibridi interspecifici.

- Anguria (citrullus lanatus): anche qui è evidente il vantaggio. Qui non abbiamo un fenomeno
partenocarpico ma di stenospermocarpia. Quei cosetti bianchi e vuoti sono gli abbozzi dei semi. Il
carattere è molto ambito dai sementieri.

- Cetriolo (cucumis sativus): consente di sfruttare cultivar ginoiche cioè con solo fiori femminili →
massima produzione

- Uva da tavola: si dice o si calcola che una % molto alta dell’uva bianca in commercio sia senza semi.
Nella vite esistono 2 forme di apirenia: una partenocarpia in senso stretto e una spermostenocarpia
(+ diffusa)

- Pomodoro: mutazione pat e pat -2 (parthenocarpic frut). la pat è stata la prima descritta dal vecchio
prof di mazzu.

Geni naturali di partenocarpia: In pomodoro, sono stati identificati e descritti diversi mutanti che
presentano espressione di partenocarpia (Tab. 6); tra questi l'attenzione dei ricercatori si è
concentrata, per ragioni diverse, soprattutto sulla mutazione parthenocarpic fruit-2 (pat-2). In
questa specie, lo sfruttamento della partenocarpia genetica permetterebbe, soprattutto in colture
protette, di evitare trattamenti con sostanze chimiche di natura auxinica, garantendo
un'allegagione soddisfacente ed un miglioramento delle caratteristiche merceologiche ed
organolettiche della bacca. Tuttavia, nonostante l'esistenza di interessanti geni per la
partenocarpia e gli sforzi profusi dai genetisti e dai breeder, a tutt'oggi in pomodoro non sono state
costituite varietà partenocarpiche di successo, a causa dell'incompleta penetranza ed espressività
del carattere, delle manifestazioni pleiotropiche negative e dell'assenza di marcatori genetici di
ausilio alla selezione.

Ad oggi sono state descritte altre mutazioni oltre pat e pat 2. Alcune sono dovute a fattori mono e di
genici. In alcune sono stati isolati i geni, tra cui il gene pat prodotto nel nostro laboratorio. Oltre pat
che è stata ottenuta con EMS, le altre sono tutte dovute ad incroci tra coltivato e specie affini
selvatiche. Ragionando su questa cosa si può fare un parallelismo con la teoria dei collisione dei
genomi che abbiamo richiamato parlando di apomissia. La concomitanza di questo fenomeno con
l’ibridazione interspecifica potrebbe far pensare che più che a un gene mutato, la partenocarpia sia
dovuta ad una mancata sincronia tra geni che controllano lo stesso processo ( è una supposizione di
mazzu, non ha dati sperimentali).

Qualche anno fa nel nostro lab abbiamo fatto una ricerca: abbiamo detto come la partenocarpia sia
in grado di sfruttare situazioni di poliploidi, in realtà è stato visto essere una condizione vantaggiosa
per diversi vegetali e al tempo stesso di essere una condizione sterile. In questa ricerca abbiamo
ottenuto dei triploidi incrociando diploide e tetraploide. Abbiamo trovato il triploide partenocarpico
e questi frutti sono completamente privi di seme. Il mutante triploide partenocarpico è ovviamente
sterile. È stata una prova di concetto che la partenocarpia può consentire lo sfruttamento della
triploidia (erano anche più produttivi dei normali).

L’uso di varianti genetiche di partenocarpia può andare incontro ad alcuni effetti non voluti come effetti
pleiotropici legati all’espressione del fenomeno, il controllo multigenico che ne rende difficile a volte
maneggiarle a livello genetico e la facoltatività (molto speso le mutazioni di partenocarpia sono facoltative:
a volte producono poco seme e a volte di più).

Dato che l’allegagione dipende da oromi come auxine e gibberelline è stato dimostato che si può indurre la
partenocarpia con trattamenti ormonali. Nelle condizioni di controstagione che si applicano in sicilia in
inverno ci sono le condizioni per coltivare per esempio cucurbitaceae ma le temperature notturne non
permettono l’allegagione quindi si effettuano trattamenti alleganti.

La partenocarpia artificiale si ottiene mediante trattamento dei fiori con mezzi artificiali, come per esempio
stimolazioni meccaniche, polline devitalizzato, polline di specie e generi differenti, estratto di polline,
polline irradiato, sostanze di crescita di tipo auxinico (acido indol-propionico, fenossiacetico, indolacetico
e indol-butirrico), ma anche di altro tipo come gibberelline, citochinine ed etilene. Gustafson è stato il
primo ad ottenere lo sviluppo di frutti di pomodoro partenocarpici di dimensioni adeguate, utilizzando
sostanze chimiche (IAA, IBA e penicilline). Successivamente Nitsch ha dimostrato che numerose sostanze
di crescita sintetiche e naturali inducono lo sviluppo di frutti apireni in varie specie, ma nella maggior parte
dei casi i frutti ottenuti risultano di dimensioni, forma e struttura interna diversi da quelli naturali.

Oggi tuttavia sono disponibili composti ormonali e protocolli di applicazione di notevole efficacia in un
certo numero di specie che vengono frequentemente utilizzati per garantire un’ottimale allegagione (Tab
5).

I problemi connessi con la stimolazione artificiale di partenocapia riguardano i costi, la somministrazione


di sostanze di sintesi (benchè teoricamente innocue per il consumatore), i cambiamenti che a volte si
verificano sulla pezzatura, forma e struttura del frutto, nonché a volte i danni alla pianta stessa.

CHE GENI STANNO DIETRO LE MUTAZIONI DI


PARTENOCARPIA?

In questa slide è riassunto il concetto dell’importanza


fondamentale di IAA e GA nell’allegagione per il segnale
positivo che viene dato all’ovario. Non si sa chi agisca
prima.

Fino agli anni 2000 non si conosceva niente dei geni che controllavano questa fase dello sviluppo riproduttivo.
Questo articolo descrive il primo gene di partenocarpia pubblicato e descritto in melo. Si conoscevano alcune
cultivar partenocarpiche e si era capito che si esisteva un singolo gene che aveva l’effetto pleiotropico di
mancare dei meli (gene APE). Questi ricercatori si sono accorti che parallelamente alla mancanza di petali vi
erano anche dei difetti a carico degli stami. Quel fenotipo fiorale sembrava molto simile al modello b
(pistillata e apetala 3 di arabidopsis).

In melo (Malus domestica) esistono alcuni mutanti (Spencer Seedless, Wellington Bloomless, Rae Ime) che
sono partenocarpici ed hanno in comune l’effetto pleiotropico di produrre fiori privi di petali e/o stami e
con due cerchi di sepali e di carpelli. Questi effetti pleiotropici hanno fatto pensare ad una mutazione in
uno dei geni omeotici di classe B (cfr. Cap. 2). Per verificare questa ipotesi sono stati clonati in melo i geni
omologhi di PISTILLATA ed APETALA3 di Arabidopsis (Yao et al., 2001). Gli stessi autori hanno verificato
che nelle tre cultivar sopra citate il fenotipo fiorale a la partenocarpia sono dovuti ad una attivazione per
inserzione di un retrotrasposone in introni del gene MdPI, l’omologo in melo di PISTILLATA.
Moltissime cvs di vite hanno tendenze alla partenocarpia con varia intensità, alcune anche con
documentati difetti dello sviluppo ovulare o del sacco embrionale. Sembra che il meccanismo più comune
in questa specie sia in realtà la stenospermocarpia, per cui in realtà la fecondazione avviene, ma c’è un
aborto precoce del seme lasciando dei residui di pseudosemi. La fonte di partenocarpia più comune in vite
è la cv. Sultanina (chiamata anche Thompson seedless): si ritiene che la stenospermocarpia in questa specie
sia dovuta all’azione di tre geni recessivi a1, a2 e a3 complementari e indipendenti e regolati da un gene
dominante I. Quindi il controllo del carattere deve considerarsi quantitativo. Nel miglioramento genetico
è possibile incrociare cultivar partenocarpiche tra loro e poi recuperare tramite tecniche in vitro l’embrione
che sarebbe destinato all’aborto.

Questi ricercatori hanno quindi sequenziato i geni di classe b nei mutanti partenocarpici di melo e hanno
notato delle mutazioni proprio a carico del gene ortologo di pistillata e lo hanno chiamato MdPI (malus
domesticus pistillata). È sembrato strano che un gene responsabile dell’identità degli organi fosse
responsabile anche dello sviluppo autonomo dell’ovario. Oggi si è visto che vi sono rapporti stretti tra organi
adiacenti nel verticillo fiorale e quindi l’anomalia di un organo può provocare l’anomalia di un organo
adiacente. In particolare i geni di classe b sono anche espressi nei carpelli e qui effettuano una sorta di ruolo
di repressori dello sviluppo dell’ovario, quindi una loro mutazione poteva giustificare la partenocarpia del
melo.

Oggi si conoscono diversi altri esempi di geni e mutazioni di partenocarpia che sono state clonate. Alcune
sono coinvolte nella risposta all’auxina, alcune nell’identità dell’ovulo, alcune sono altri fattori trascrizionali.
Il gene pat è una mutazione di un fattore trascrizionale coinvolto anche nello sviluppo dell’ovulo quindi
questo fenotipo determina l’evento partenocarpico.

Moltissime conoscenze si sono anche andate sviluppando negli ultimi 15 anni grazie ad un approccio di
genetica inversa mediante silenziamento genico. Sono stati fatti tantissimi studi in pomodoro con queste
tecniche, molto recentemente anche su vite e su citrus. Il quadro che ne emerge è che ci sia un controllo da
parte dell’ovulo che produce dei repressori dell’ovario e solitamente sono rimossi dall’impollinazione e dalla
fecondazione.

Un esempio di geni coinvolti nel controllo dello sviluppo dell’ovario e direttamente coinvolti anche nella
risposta all’auxina sono dei fattori di trascrizione chiamati Aux/IAA. In pomodoro in particolare si è visto che
aux/iaa 9 funziona da repressore della trascrizione di alcuni geni che vengono indotti dall’auxina perché
l’auxina determina una modificazione molecolare della proteina aux iaa 9 e la indirizza verso la degradazione
a carico del proteasoma. Di fatto finché c’è il repressore questi geni non vengono trascritti mentre quando
arriva l’auxina vengono trascritti. Silenziando questo gene in pomodoro si aveva partenocarpia.

In una ricerca che ho portato avanti personalmente con dei colleghi di un istituto della basilicata abbiamo
cercato un mutante proprio per questo gene Aux/IAA9. Siamo andati a cercare col tilling delle piante che
avessero subito questa mutazione e ne abbiamo trovate 3. Due di queste erano 2 mutazioni non sinonime
che però non avevano un grosso effetto sulla proteina e nessun effetto fenotipico. La 3 invece era una
mutazione che provocava la delezione di una base quindi una mutazione non senso che provoca la rottura
del frame di lettura e quindi una proteina tronca. Il mutante per questa mutazione è capaci di produrre una
bacca come quella del wild type ma completamente priva di seme.

Quindi la conoscenza del controllo genetico del fenomeno dell’allegagione si va facendo più chiara e rimane
il fatto che esistono dei repressori dell’ovario che bloccano i geni dell’iniziazione del frutto e sono in genere
ostacolati dall’impollinazione. Il controllo di questi repressori è dovuto a geni responsabili dello sviluppo degli
stami e dell’ovulo. Tutto questo porta a una funzione repressiva degli ormoni di auxine e gibberelline e se
silenziati si ha lo sviluppo autonomo del frutto.
È chiaro che la partenocarpia biotecnologica può essere ottenuta tramite il knock out di uno dei tanti geni
coinvolti come repressori nel controllo dello sviluppo dell’ovario. A livello storico vi racconto una ricerca fatta
in italia in cui si è cercato di aumentare la sintesi di auxine nell’ovario ingegnerizzando la via triptofano-
dipendente. Questa via è basata sull’enzima IaaM che sarebbe la triptofano monossigenasi che trasforma
triptofano in indol-3-acetamide che poi viene idrolizzato dalla IAM idrolasi in acido indolaceatico (IAA).

Questa ricerca è nata dalla collaborazione di gruppi di ricerca tedeschi e uno italiano di un prof di verona.
Questi ricercatori volevano creare un costrutto chimerico con un promotore specifico della placenta
dell’oculo e hanno legato diversi geni coinvolti nella biosintesi auxinica tra cui anche il gene IAA
monossigenasi di un batterio (pseudomonas syringae). L’espressione ovulo specifica ha determinato un
effetto di partenocarpia molto forte in melanzana.

A causa delle minori conoscenze acquisite, sono pochi gli esempi di applicazioni biotecnologiche che
modificano le prime fasi di sviluppo del frutto. Tuttavia recentemente, sulla scorta delle osservazioni sul
controllo ormonale che agisce alla base dell'allegagione e delle fasi di divisione, sono stati costituiti
costrutti transgenici capaci di aumentare artificialmente il contenuto auxinico dell'ovario nel fiore maturo,
in modo da indurre allegagione e crescita anche in assenza di impollinazione e fecondazione. Tale
partenocarpia geneticamente ingegnerizzata è stata ottenuta in tabacco, melanzana e pomodoro con un
costrutto chimerico contenente un promotore ovulo-specifico di Antirrinhum majus (DefH9) e la regione
codificante del gene iaaM di Pseudomonas syringae pv. Savastanoi, l’espressione del quale determina un
aumento del contenuto auxinico dell’ovario. Lo stesso risultato è stato ottenuto in pomodoro utilizzando
il promotore ovario-specifico del gene TPRP-F1, associato al gene batterico iaaH.

Questa slide rappresenta l’effetto del transgene in melanzana su fiori emasculati e non impollinati. Il
promotore defH9 è un gene di antirrinum che corrisponde a un gene di classe D di antirrinum (ortologo).

PROBLEMI: anche questa proposta di partenocarpia biotecnologica comportava una serie di problematiche.
Il costrutto è comunque stato brevettato e utilizzato in alcuni paese dove sono ammessi in coltivazione gli
ogm.

Una cosa importante anche come prova di concetto è che una volta identificata una possibilità biotecnologica
in una specie modello si può trasferirla su altre specie. Il costrutto defH9 è stato trasferito anche in
pomodoro, fragola e uva. A questo approccio sono seguiti tanti altri brevetti che si basano sia su approcci
transgenici di prima generazione ma anche su silenziamento genico. Oggi col genome editing è diventato
particolarmente semplice ottenere un effetto partenocarpico silenziando uno dei tanti geni che si conoscono
nel sistema.
VARIABILITA’ ESISTENTE-RISORSE GENETICHE

Un miglioramento genetico è costituito da fasi


importanti: si identifica il problema da risolvere,
si scelgono i materiali e i metodi da usare, poi si
ha la fase esecutiva in cui si preparano i materiali
e si effettuano gli incroci se sono necessari, poi
si esegue lo schema con cui viene effettuata la
selezione delle tipologie effettuate. Poi c’è la
fase di finalizzazione composta da screening
delle popolazioni, poi si sceglie la varietà da
registrare e produrre e si arriva al rilascio della
varietà.

- IDENTIFICAZIONE DEL PROBLEMA: è un’attività di tipo programmatico che incide su consocenze


anche diverse dalla genetica. Ci sono problemi che si possono risolvere allelicamente e altri che sono
troppo impegnativi a livello economico. In pratica serve a capire se iniziare o meno il programma di
miglioramento genetico per la nostra varietà;
- SCELTA DEI MATERIALI: i materiali che poi sono costituiti dalla variabilità genetica sono la materia
prima su cui si esplica il lavoro di miglioramento. La variabilità genetica può essere di origine naturale
(se già esistente naturalmente) oppure indotta (per esempio tramite incrocio ma anche tramite
mutagenesi chimica, fisica, somaclonale etc…). un nuovo tipo di variabilità si può ottenere tramite la
transgenesi o tramite editing genomico. Il problema delle risorse genetiche è dovuto al fatto che la
variabilità naturale negli anni passati è stata oggetto di un depauperamente progressivo (detto
erosione genetica).
Quando si parla di perdita di variabilità ci si riferisce alla biodiversità. Il 2010 è stato l’anno della
biodiversità. La biodiversità è la diversità genetica che comprende tutte le forme animali, vegetali e
microbiche presenti negli agroecosistemi. Se si parla di agricoltura si tratta di agro-biodiversità
(relativa alla specie coltivate o allevate in campo agricolo) e se vogliamo anche alla biodiversità degli
agro-ecosistemi (diversità microbica dei sistemi agricoli). Altri termini che si utilizzano per indicare
questo tipo di variabilità sono: germoplasma (materiale ereditario di una singola specie) e risorse
genetiche vegetali o agrarie.
Un concetto utile per classicare la diversità genetica importante in ogni singola specie agraria è stato
proposto nel 1972 da Harlan e De Wet formulando il concetto di gene pool. Facendo riferimento ad
ogni specie si possono individuare 4 livelli di germoplasma utili al miglioramento genetico di questa
specie. Nel livello primario (il gene pool primario) c’è tutto il materiale che presenta completa
compatibilità sessuale con la specie coltivata. Nel secondario c’è una parziale compatibilità sessuale
quindi possono essere incrociati con la specie coltivata ma comportano difficoltà nelle generazioni
successive. Il terziario è l’ultimo gene
pool con cui esista
compatibilità sessuale: specie
che hanno una possibilità di
essere incrociata ma
possono dare una
progenie fertile solo con
l’intervento dell’uomo
come l’embryo rescue
(salvataggio degli ormoni
in vitro). Nel quaternario
invece non hanno
compatibilità sessuale quindi il
miglioramento genetico è possibile tramite
trasformazione genetica o ibridazione somatica.

La diversità genetica poiché è soggetta a fenomeni di depauperamento è stata oggetto negli ultimi
decenni di vari sforzi di conservazione. Esistono oggi infatti numerose banche del germoplasma. Per
esempio i diversi gene pool di pomodoro si trovano negli stati uniti, a taiwan e in russia. L’italia non
brilla per la conservazione del pomodoro, la migliore è probabilmente la nostra. (mazzu sbom).

Il pomodoro è una specie molto adatta per esemplificare il concetto di gene pool.
Nel primario troviamo: varietà commerciali e varietà obsolete, ecotipi o landrace e qualsiasi altro
materiale come stock genetici, collezioni di mutanti, linee di introgressione e sostituzione etc… Poi
ci sono forme spontanee della specie coltivata: nel caso di pomodoro troviamo la varietà cerasiforme
(bacca piccola e tonda che si è evoluta in centro america e ancora coltivata). In fine nel gene pool
primario troviamo anche le specie ancestrali ed affini sessualmente compatibili (Solanum
pimpinellifolium, ancestrale del pomodoro).
(È consentito per legge usare varietà brevettate da altri se vogliamo farci breeding)
Una fonte intestimabile laddove si è mantenuta di variabilità genetica nel gene pool primario sono le
varietà locali o landrace o ecotipi, per quello che riguarda il pomodoro ci sono in italia tantissime
varietà locali ma soprattutto anche in virtù della variabilità climatica ed edafica. Queste varietà locali
si sono evolute nel corso dei secoli, non sono scomparse e sono una parte inestimabile del gene pool
primario.

Qualche anno fa abbiamo partecipato ad un progetto europeo votato allo studio delle varietà locali di
pomodoro in europa. Abbiamo studiato più di 1500 varietà provenienti dai paesi come la spagna, francia,
italia e grecia. Questi materiali sono stati studiati a livello fenotipico, genotipico, biochimico.

C’è una grande attenzione per questi materiali ed esiste oggi un’attività sia a livello regionale che nazionale
per fare catologhi. Mazzu è nel comitato scientifico di questo progetto, nato da una legge del 2015. In questa
slide vi presento 2 varietà locali del lazio.
Scatolone di bolsena e spagnogella di formia e gaeta. Sono 2 piatti costoluti ma con caratteristiche
organolettiche e strutturali molto diverse. Ad oggi sono solamente conservate da istituti pubblici e coltivate
in pochissimi ettari e riconosciuti solo nella legge regionale.

Gli stock genetici comprendono mutanti, breeding lines (ancora non sono cultivar ma sono usabili
nel miglioramento genetico).

Nel gene pool secondario troviamo specie dello stesso genere o famiglia ma con compatibilità sessuale
parziale, cioè si va in f1 f2 f3 etc ma le segregazioni non sono molto precise. Ricordiamo solanum habrochaites
usato per inserire resistenze e solanum pennellii usato per le mappature.

Nel gene pool terziario abbiamo detto limitatissima compatibilità sessuale, solo mediante coltura di embrioni
o altre tecniche si riesce ad ottenere f1. Troviamo molte specie a frutto verde.

Nel quaterario ci sono tutti gli altri donatori di geni, trasferibili per via biotecnologica.

In questa slide vedete un dendrogramma ottenuto sulla base di marcatori molecolari che vi fa vedere le
relazioni filogenetiche tra le diverse specie nei diversi gene pool. Le specie a bacca rossa sono tutte del gene
pool primario. Poi vi sono specie dove comincia ad essere presente l’incompatibilità. (non ti metto il grafico.
Comunque slide 15).

L’importanza di questi materiali è anche molto nella presenza di resistenze a patogeni e che si possono
introdurre nelle varietà coltivate.

Nei sistemi agricoli moderni è stato riscontrato un problema


relativo alla perdita di agro-biodiversità e questo problema è
nato con la nascita dell’agricoltura. Oggi si dice che 30 spcie
assicurino il 90% del fabbisogno alimentare della popolazione
mondiale e poche specie copropno da soli il 75% delle necessità.
Per esempio riso frumento e mais sono rappresentano il 75%
dei cereali coltivati.

La progressiva perdita di diversità genetica è anche entro le


specie, quindi non sono diminuite solo le specie coltivate ma
anche le cultivar delle diverse specie. Quindi di tanti alleli
presenti nelle specie spontanee è rimasto molto poco. Il
miglioramento genetico moderno ha ulteriormente contribuito alla diminuzione della variabilità genetica.

La domesticazione delle specie vegetali è stato quindi un processo che si è verificato quando sono state
adottate alcune forme per la coltivazione. Anche darwin ha usato la domesticazione come prova
dell’evoluzione. In specie diverse si sono avuti cambiamenti più o meno paralleli → sindrome della
domesticazione. Uno di questi cambiamenti è il gigantismo: sono state selezionate varianti genetiche che
portano alla dimensione delle bacche maggiore.

Un aspetto fondamentale della sindrome di domesticazione è relativo alla dispersione dei semi: le piante
spontanee hanno dei meccanismi che garantiscano la disseminazione mentre l’uomo ha selezionato
organismi che non tendono a disperdere il seme. Evidente nelle leguminosae dove quelle spontanee hanno
il baccello che si apre a maturità mentre quelle coltivate no.

Sempre relativamente alla domesticazione e alla dispersione del seme ci sono state le mutazioni che
comportano il rachide che non dissemina nei cereali. Molti dei geni dietro queste mutazioni spesso sono
mendeliani o sono major gene di caratteri poligenici. Questi geni sono stati in gran parte identificati.
Un altro elemento fondamentale nella domesticzione riguarda la struttura della pianta: forme coltivate più
monocaule e prive di ramificazioni laterali o di accestimenti. Per esempio il carattere monostelo del mais.

Anche la perdita di dormienza è un carattere che si consiera fondamentale. Molto piante spontanee
presentano la dormienza dei semi mentre in quelle coltivate hanno perduto questo carattere.

In diverse specie coltivate dopo la domesticazione anche la diffusione ha comportato perdita di variabilità
genetica. L’esempio tipico sono le colture originarie dell’america latina che sono state portate in europa e
poi diffuse in tutto il mondo: il pomodoro ha avuto una pre domesticazione nelle ande e poi una
domesticazione definitiva in messico e da lì è stato introdotto in spagna e in italia e in europa. Facile pensare
che questa comportato una perdita di diversità perché solo poche varietà sono state portate.

L’ultimo effetto importante nella perdita di diversità è dovuto al miglioramento genetico moderno: si sono
andati a perdere gli ecotipi per utilizzare le colture migliorate. Da un certo punto di vista aumenta le
produzioni ma dal punto di vista della diversità genetica è stata una perdita.

Detto ciò, nel 900 si è capita l’importanza strategica di raccogliere e conservare il germoplasma. Nikolai
Vavilov era un genetista russo che studiò le zone in cui c’era zone di maggiore diversità e coincidevano con
le zone di origine delle specie. Individuò 8 centri di origine o diversità: uno in meso america, uno in sud
america, uno mediterraneo, uno caucasico etc…

Nel centro meso americano ha origine mais, pomodoro e cotone. In quello andino arachide fagiolo e patata.
In quello mediterraneo l’orzo, l’olivo. La vite e i frumenti nella mesopotamia…

Fu fondata una rete di centri di ricerca internazionale finanziata dai paesi più ricchi che andavano a formare
questi centri di recerca nelle varie zone di origine. L’organismo consultivo che se ne occupa è l’ IARC. Il SIMMIT
per esempio è un centro di ricerca per mais e frumento e si trova a città del messi, poi in colombia c’è il centro
della patata etc…

In italia c’è l’istituto BIOVERSITY cioè un centro di ricerca che si occupa delle risorse genetiche. Questi centri
sono stati in alcuni casi alla base della rivoluzione verde, cioè l’applicazione del miglioramento genetico
scientifico che ha comportato l’uso di ogm anche in paesi di sviluppo (aumentare produzioni e benessere per
le popolazioni. Non tutti sono d’accordo perché questi paesi poi sono assoggettati ad altri ricchi.)
CONSERVAZIONE DELL’AGRO-BIODIVERSITA’:

La conservazione in situ di specie spontanee è basata sulla conservazione dell’habitat e quindi parchi, riserve
etc…

Quando la conservazione in situ riguarda delle varietà coltivate allora si può parlare di conservazione on farm,
quindi direttamente da parte delle aziende che producono il prodotto (a volte ci sono anche incentivi per
queste coltivazioni).

Nei confronti delle varietà tradizionali molte azioni di tutela sono fatte da leggi regionali (nel lazio se ne
occupa anche l’arsial). Dal 2015 infatti c’è un tentativo di portare questo al sistema nazionale. Queste leggi
favoriscono la coltivazione in situ con supporti a questi agricoltori o allevatori custodi.

La conservazione ex situ viene fatta quando la risorsa genetica viene portata in un luogo diverso da quello in
cui si trova e si è evoluta. Quindi può essere conservata in vivo nei campi catalogo (soprattutto di piante da
frutto).

La conservazione ex situ in vivo è molto impegnativa a livello di spazi e di manodopera. Un’opzione migliore
è la coltivazione in vitro quindi in celle climatiche per mezzo di germogli tenuti in tubo e su substrato apposito.
Però c’è biogno di tanta manodopera perché ogni tot devi subcolturarle. Si usano infatti condizioni di crescita
che la rallentino.

Tra i metodi di conservazione in vitro, la crioconservazione rappresenta un valido strumento per la


conservazione a lungo termine del germoplasma di specie a propagazione gamica, caratterizzate da semi
sub- o non-ortodossi. La crioconservazione permette di conservare il materiale vegetale in condizioni di
temperatura ultra-bassa per tempi illimitati. La conservazione viene effettuata con organi e tessuti vegetali
immersi in azoto liquido, cioè alla temperatura di -196°C, oppure mantenuti nei suoi vapori, a circa -160°C.
A queste temperatura non si ha alcuna attività biochimica cellulare e, di conseguenza, è bloccata la crescita
biologica e lo sviluppo degli organi o tessuti in azoto liquido, senza che ne sia compromessa la sopravvivenza.
I semi, prima dell'immersione in azoto liquido, devono essere opportunamente ridotti nel loro contenuto in
acqua a valori, in genere, inferiori al 20%. La disidratazione viene condotta mediante esposizione dei semi
per tempi definiti sotto il flusso d'aria sterile di una cappa a flusso laminare, oppure in contenitori
ermeticamente chiusi, contenenti gel di silice o una soluzione acquosa satura di un sale potassico (acetato,
idrossido o carbonato di potassio). Dopo il recupero dall'azoto liquido e lo scongelamento in bagno
termostatato, i semi sono posti a germinare in vitro, su substrato nutritivo gelificato o, più semplicemente,
su ovatta umida.
E' da rilevare che la crioconservazione dei semi si presta, oltre alla conservazione di specie a propagazione
gamica, anche alla conservazione clonale di specie da frutto caratterizzate dalla contemporanea presenza
nel seme dell'embrione zigotico e di embrioni nucellari. E' questo il caso del genere Citrus, all'interno del
quale si annoverano molte specie poliembrioniche.

Una interessante applicazione della crioconservazione agli agrumi è la salvaguardia di una antica collezione
Medicea di agrumi, condotta dal CNR-IVALSA di Sesto Fiorentino (Firenze), in collaborazione con la
Soprintendenza Speciale per il Patrimonio Storico, Artistico ed Etnoantropologico e per il Polo Museale
della città di Firenze. E' stata sviluppata un'idonea procedura di crioconservazione per numerose accessioni
della collezione di Citrus della Villa Medicea di Castello in Firenze. La collezione, iniziata da Cosimo I° de'
Medici nel XVI° secolo, comprende oltre 600 accessioni di elevato valore storico, la maggior parte delle quali
mantenute in grandi conche di terracotta. Il progetto, sviluppato grazie anche ad un finanziamento dell'Ente
Cassa di Risparmio di Firenze, si basa sulla determinazione, per ogni accessione, del contenuto in acqua del
seme più appropriato a garantirne il mantenimento della germinabilità durante l'immersione diretta e la
conservazione in azoto liquido. Ad oggi, 14 antiche accessioni, provenienti da 9 specie di Citrus e da un ibrido,
sono state oggetto di campionamento del seme e sviluppo del protocollo di disidratazione e immersione
diretta in azoto liquido; per 11 di queste è stata ottenuta una germinabilità superiore al 75% dopo recupero
dall'azoto liquido. Obiettivo primario del progetto è la duplicazione in criobanca della collezione di agrumi
Medicea, primo esempio applicativo in Italia di crioconservazione di semi. Oltre al genere Citrus, presso il
CNR-IVALSA sono stati recentemente oggetto di indagine sistemi di conservazione del seme di Pistacia spp.
e di embrioni escissi di arachide (Arachis hypogaea). La principale criobanca del seme è oggi presso il
National Center for Genetic Resources Preservation (NCGRP) of Fort Collins, Colorado, ove sono conservate
a -18°C e in crioconservazione semi di oltre 750.000 specie vegetali.
Per maggiori dettagli ed informazioni sulla crioconservazione di organi e tessuti vegetali si può consultare:
Lambardi M. e De Carlo A. 2009. Tecniche ed applicazioni della criogenia alla conservazione ed al
risanamento di germoplasma vegetale. Italus Hortus, 16 (1): 79-98.

I semi delle specie vegetali vengono tradizionalmente conservati in banche del seme, in camere fredde
mantenute alla temperatura, in genere, di -18°C. In conservazione, la longevità del seme dipende da fattori
intrinseci ed estrinseci e, inoltre, da meccanismi di protezione e riparazione dai danni eventualmente prodotti
dalle basse temperature. A secondo del comportamento dei semi sottoposti a disidratazione vengono distinti
tre gruppi: semi tolleranti alla disidratazione (semi ortodossi), semi intermedi (semi sub-ortodossi) e semi
sensibili alla disidratazione (non ortodossi o recalcitranti). I semi ortodossi, che vanno incontro ad una
naturale riduzione del contenuto in acqua già sulla pianta madre, possono essere disidratati fino ad avere un
contenuto in acqua anche inferiore al 10%, senza che ne venga compromessa la vitalità e la germinabilità. La
conservazione a bassa temperatura di questi semi, opportunamente disidratati, può quindi essere protratta
per tempi molto lunghi (anche per vari decenni). I semi non ortodossi o recalcitranti non entrano in
dormienza e sono metabolicamente pronti a geminare quando ancora sulla pianta madre; quindi, a
differenza dei semi ortodossi, non vanno incontro ad una naturale disidratazione prima della maturazione. Il
contenuto in acqua dei semi considerati recalcitranti oscilla fra valori del 35% e del 90%. Appena i semi
vengono raccolti è necessario conservarli in condizioni idonee per non comprometterne la capacità
germinativa o provocare uno sviluppo anomalo del semenzale. I tempi di conservazione sono comunque
sempre molto limitati, in quanto tali semi sono molto sensibili alla disidratazione e perdono facilmente la
loro vitalità già quando il contenuto in acqua scende sotto il 30%, oppure quando mantenuti a temperatura
inferiore ai 16°C. I semi non ortodossi, inoltre, devono essere raccolti ad un ben preciso stadio di maturità,
spesso di breve o brevissima durata.

Il metodo migliore di conservazione ex situ è quello sotto forma di semi e si distinguono collezioni di semi
seed bank con conservazione a breve, medio e lungo termine in base alla capacità di sopravvivenza dei
materiali. Quelli a lungo termine vengono congelati. Prima di congelarlo bisogna diminuire l’umidità nel
seme. Una banca importantissima è nelle isole svalbard in norvegia.

Si stima che nel mondo ci siano quasi 2000 banche di seme per un totale di più di 7 milioni di accessioni. Deve
avere delle specifiche.

È importante la conservazione in situazione adeguata, la loro sicurezza dal punto di vista del mantenimento
della germinabilità e quando vengono rigenerate bisogna stare attenti che l’accessione non venga
contaminata. Le specie autogame possono essere lasciate all’autofecondazione mentre nel caso delle
allogame no e bisogna fare molta attenzione. Per accessione si intende il frutto di una raccolta o campione
di seme o di individui che sono stati prelevati in una certa situazione in un certo ambiente e popolazione.
Un’accessione può essere costituita da un individuo o da una popolazione.

Semi ortodossi: semi che possono essere disidratati e conservati in condizioni di lunga conservazione

Semi recalcitranti: non si prestano a queste condizioni e spesso sono tropicali. O fai conservazione a breve
termine o in vivo.

Ci sono tanti database e progetti internazionali che cercano di catalogare le informazioni sulle risorse
genetiche e anche a utilizzare gli stessi passport data, cioè con le stesse annotazioni (nome, dove è stata
raccolta, situazioni edafiche etc…), perché la ricchezza vera delle collezioni di seme sono le annotazioni. Il
programma Eurisco (finanziato dalla comunità europea) ha cercato di dare delle notazioni comuni alle
raccolte di germoplasma collezionate in europa.

Genesys è un altro databse proposto da un progetto del gruppo consultivo per la ricerca agricola internazione
che fa da cappello all’attività dei centri internazionali di ricerca.

Anche in italia c’è stata un’attività fervida sulla conservazione della biodiversità agraria e oltre la legge del
2015 sono state fatte anche altre iniziative precedentemente. Sono state stese delel linee guida per la
conservazione vegertale, animale e microbica.

Al di là della descrizione con i passport data è importante anche la valutazione morfologica delel collezioni.
Le collezioni infatti devono essere caratterizzate anche per essere utili ai breeder.

La valutazione delle accessione e delle collezioni è una fase preliminare anche ai programmi di miglioramento
genetico.

Un altro esempio di uso delle collezioni di risorse genetiche è l’utilizzo per contrastare nuovi patogeni. Con
l’introduzione del pepino in europa è stato introdotto anche il virus del mosaico che è ha attaccato anche
pomodoro e altre solanaceae. I ricercatori spagnoli hanno cercato delle fonti di tolleranza o resistenza al
pepino mosaic virus in delle specie selvatiche affini al pomodoro e hanno trovato diverse fonti di resistenza
in diverse specie. Poi questo carattere di resistenza non è stato utilizzato per il breeding ma se fosse stato
necessario ci sarebbero stati ottimi punti di partenza.

Il solanum sitiens è presente nel deserto atacama in cile ed è una delle regioni più aride del pianeta. È stato
oggetto di attenzione per la ricerca di alleli che conferissero resistenza a situazioni siccitose.
NUOVA VARIABILITA GENETICA:
A volte è necessario creare nuove forme alleliche.

Relativamente all’esecuzione di incroci intraspecifico di solito


eseguiamo delle esercitazione e a livello teorico c’è poco da dire in
quanto non ci sono problemi di compatibilità e conguruità.
L’importante è avere una fioritura sincronizzata e la
panta madre femmina deve essere messa in condizioni
da NON essere autoimpollinata quindi deve essere
emasculata e protetta e poi viene a contatto con la
pianta impollinante.

Una cosa importante da tenere in considerazione quando si effettua


un incrocio è sapere bene a che stadio sono i fiori perché
l’emasculazione deve avvenire prima che le antere vado in deiscenza.
Invece il parentale pollinico deve essere utilizzato per la raccolta del
polline quando questo è in antesi perché è il momento di massima
vitalità del polline.

Quando si opera a livello sperimentare di solito basta eseguire poche decine di incroci quindi può anche
essere una tecnica laboriosa. Se invece vuoi fare incrocio manuale x produzione di seme commerciale devi
trovare metodiche il più veloci possibiile e deve essere economicamente conveniente.

Questa slide è a dimostrazione che ogni specie ha le sue metodi e difficoltà:


nello zucchino le dimensioni dei fiori e il monoicismo rendono
l’impollinazione manuale una cosa molto semplice.

(Nell’immagine a sinistra puoi vedere un operatore (probabilmente un


ricercatore plurilaureato) intento nella masturbazione assistita di una
zucchina. In data odierna 13/5 ho cercato di convincere chiara, la mia
agronoma di fiduia, ad aprire una pagina chiamata “agri porn”. Secondo me
sarebbe un’idea redditizia)

Diverse sono le considerazioni da fare quando l’impollinazione riguarda


specie diverse e quindi tassonomicamente separate. In primis c’è da dire che l’ibridazione INTER specifica ha
dato origine a specie che di fatto sono coltivate (caffè, fragola…)

Una maggior esemplificazione del ruolo dell’ibridazione inter specifica è dato dalla filogenesi del genere citrus
e rappresenta come tutte le specie del genere citrus siano derivate da 5 specie ancestrali. Tra queste 5 specie
riscontriamo il mandarino, il pomelo, il limone, il kumquat e la patrena.

L’interesse principale dell’ibridazione interspecifica nel miglioramento genetico è che dalle specie vicini o
affini sono stati reperiti molti geni utili come resistenze a stress, tolleranza a stress abiotici etc…
Mentre l’ibridazione intraspecifica non ha problemi fisiologici, quella inter specifica sì per la presenza di
barriere biologiche nei confronti dell’incrocio che possono essere pre zigotiche o post zigotiche (che
avvengono prima o dopo la fecondazione).

A - Barriere tra le specie parentali 1. Isolamento geografico Barriere esterne


(o pre-mating)
PREZIGOTICHE 2. Isolamento ecologico
3. Isolamento stagionale
4. Isolamento meccanico
5. Incompatibilità interspecifica Barriere interne
B - Barriere negli ibridi 1) Non vitalità e scarsa vigoria degli
POSTZIGOTICHE ibridi INCONGRUITA’
2. Sterilità degli ibridi
3) Non vitalità e scarsa vigoria della
generazione F2

Tra quelle prezigotiche abbiamo una serie di problematiche dette barriere esterne o di pre-mating e sono
limitazioni dovute a isolamento delle due specie da un punto di vista geografico, ecologico, stagionale o
meccanico (arcogamia). Quando invece le barriere prezigotiche sono dovute a fenomeni fisiologici si parla di
incompatibilità interspecifica e sono relative alla crescita del tubetto, feconazione dell’ovulo etc… problemi
nella fase progamica.

Tra le barriere post zigotiche troviamo tutte interne e vengono chiamate incongruità. L’ibrido può essere non
vitale, vigoroso ma sterile, vigoroso e fertile ma soggetto a depressione e minore vigoria nelle generazioni
successive.

Ci sono delle tecniche basate sulle colture in vitro che sono utili nell’esecuzione di incroci inter specifici. Nel
caso di barriere pre zigotiche (interazione polline-pistillo) si può ricorrere alla fecondazione in vitro, cioè una
tecnica per cui si possono mettere in vitro sia pezzi di placenta con ovuli maturi sia granuli pollinici.

Quando siamo di fronte a barriere post-zigotiche dovute alla non vitalità degli ibridi si può utilizzare la tecnica
dell’embryo rescue o coltura di embrioni in vitro: consiste nel sezionare l’embrione dal seme in sviluppo
prima che inizino i processi degenerativi. Questo embrione ovviamente viene dissezionato in condizioni
asettiche e viene messo a crescere su substrato artificiale e asettico e può andare incontro ad uno sviluppo
di successo. Questo perché spesso l’incompatibilità è tra embrione ed endosperma quindi togliere l’embrione
dall’endosperma può essere una tecnica vincente. (si bello, fino a che non passi tre settimane della tua vita
sotto cappa a dissezionare embrioni di pesco e ti senti un’ostetrica che cresce i suoi bambini. Michela dixit)

Un esempio dell’uso di embryo rescue per l’ibridazione inter specifica è quello dell’incrocio per arrivare al
triticale: una specie che prima non esisteva e che è stata oggetto dell’incrocio frumento duro x segale. Questo
perché volevano combinare la resistenza della segale con la produttività del frumento duro. Il frumento duro
è tetraploide mentre la segale è diploide quindi l’incrocio non va incontro a barriere pre zigotiche ma a
problemi di vitalità dell’ibrido con 21 cromosomi. Questo embrione viene quindi allevato in vitro e questa
piantina è sterile ma con il raddoppiamento del numero cromosomico possiamo ottenere una pianta
esaploide auto fertile.

Nel miglioramento genetico del pomodoro è stato fondamentale l’uso dell’embryo rescue perché ha
permesso di usare solanum peruvianu e s. chilense che si sono rivelate molto importanti per le resistenze.

I parametri da mettere appunto per il successo sono: - il momento ottimale per l’excisione (embrione maturo
ma prima della degenerazione) e – mezzo di coltura da utilizzare.
A volte l’embryo rescue viene utilizzata anche in incroci perfettamente compatibili per velocizzare il processo.
Infatti già dopo 15 giorni dalla fecondazione puoi prelevare l’embrione dal seme e metterlo a germogliare su
un substrato così si risparmiano diverse settimane.

Le altre due problematiche relative alle barriere post zigotiche sono di risoluzione semplice: se l’ibrido è
sterile è possibile puntare al raddoppiamento cromosomico. Se l’ibrido è sterile lo puoi propagare
vegetativamente e portarlo a frutto se ha partenocarpia.

Se si ha scarsa vigoria nella generazione successiva si può rincrociare col parentale coltivato.

Sempre parlando delle specie affini del pomodoro: se nel passato queste specie sono state guardate come
serbatori di geni di resistenza per stress biotici, oggi si usano anche per stress abiotici. Diverse specie del
genere solanum presentano degli adattamenti estremamente differenziati tra di loro.

Un fenomeno che succede in questo complesso di specie (pomodoro ovviamente) ma anche in altri casi è
che molto spesso le relazioni di compatibilità non sono completamente
reciproche cioè la compatibilità sessuale o meno dipende da quale
specie si utilizza come portaseme. Il genitore femminile deve essere
auto compatibile per poter essere inseminato con specie auto
incompatibili. Questo probabilmente è dovuto al fatto che il genitore
auto compatibile ha perduto i meccanismi di incompatibilità, questi
meccanismi di auto incompatibilità interspecifica e intraspecifica si
crede siano basati sugli stessi geni.

Un’ultima possibilità per avere un incrocio interspercifico tra specie non


compatibili è quello di usare specie ponte. Se a x b non è compatibile fai
a x c e poi l’ibrido a x c può diventare compatibile con la specie b.

In alcune specie la compatibilità di un incrocio inter specifico e la vitalità dell’incrocio non è dovuta tanto al
numero di cromosomi dei parentali ma a un valore che è specie specifico e va a identificare l’endosperma. Si
chiama endosperm balance number: se due specie hanno lo stesso EBN sono compatibili.

Ovviamente puoi ricorrere ad alcuni stratagemmi come diploidizzare. Se hai un tetraploide con ebn = 4,
diploidizzi e ti si dimezza anche ebn.

MUTAGENESI: è stata un’attività di creazione di variabilità genetica in maniera random e molto applicata nel
passato.

Le mutazioni sono un argomento che dovrebbe essere stato trattato nell’esame di genetica ma sappiamo che
la mutazione è uno degli elementi con cui aumenta la variabilità anche in natura ma si può aumentare il tasso
di mutagenesi mediante agenti chimici o fisici.

Ci sono mutazioni genomiche, cromosomiche e geniche. Possono essere utili quelle genomiche per rendere
fertile un ibrido sterile ma quelle veramente utili al migliroamento genetico sono quelle geniche.

Gli effetti delle mutazioni possono essere: loss of function o gain of function (mutazione spesso dominante).
Solitamente la generazione che viene sottoposta all’agente mutageno viene chiamata M0. La generazione
M1 è quella subito dopo e possiamo trovare piante senza mutazioni o con mutazioni chimeriche o con
mutazioni non chimeriche. Se vai in autofecondazione e arrivi in M2 già riesci a vedere le mutazioni recessive
(quelle dominanti le vedi anche in M1)

Variabilità somaclonale: è basato sulla coltura in vitro con l’uso massiccio di ormoni nei substrati e nella
organogenesi indiretta, cioè da callo. Un metodo di elezione è basato sull’uso di colture di cellule passando
quindi dallo stadio di callo a quello di cellule in sospensione che già di per ha attitudine alla mutazione può
essere spinta dall’uso di ormoni. Se poi aggiungi un agente selettivo come la tossina di un patogeno o un
erbicida o altro si ipotizza di favorire lo sviluppo delle cellule che hanno subito mutazioni che le rendono più
resistenti nei confronti dell’agente selettivo. Quindi si selezionano in vitro le mutazioni che possono aver
riguardato un gene utile in quella direzione. La coltura di cellule in sospensione viene poi indotta
all’embriogenesi somatica o diretta o indiretta (cioè passando nuovamente da callo.

La variabilità somaclonale ha luogo soprattutto a causa degli eventi di DEDIFFERENZIAZIONE che si hanno
con la morfogenesi

Eventi di morfogenesi INDIRETTA (con passaggio per fase di CALLO) sono quelli che danno la maggiore
frequenza di mutazioni somaclonali

La frequenza di mutazioni dipende da:

Metodo di coltura e tipo di espianto (anche specie e genotipo)

Uso di ormoni (auxine e citochinine)

Numero di sub-colture

Quindi la mutagenesi si è rivelata nel tempo uno strumento molto potente per creare variabilità anche se in
modo random. Infatti poi nel materiale mutagenizzato dobbiamo cercare le varianti utili.

La mutagenesi è stata molto usata negli anni 50-60. Negli ultimi anni invece è possibile seguire le mutazioni
se le cerchiamo su uno specifico gene con la tecnica del TILLING (ricorda che zia ermelinda ti vede, cara ele).
Serve per cercare la pianta mutata nella popolazione mutagenizzata. Estrai il dna dalle piante madri, fai dei
pool e li amplifichi con primer specifici del gene target (PCR). Se in un pool è presente una pianta mutata in
quella regione alla fine dell’amplificazione avremo alcuni frammenti che presentano un mismatch
(appaiamento tra allele wt e allele mutato). Si usano enzimi come il cel1 per tagliare sul mismatch e su gel
vedi la banda del frammento intero + 2 bande leggere dei frammenti tagliati. Questo serve a capire che in un
certo pool è presente la pianta con mutazione e poi vai a cercare nel pool.

Un’ultima opportunità di variabilità genetica è data dalle tecniche biotecnologiche che si basano sulla
transgenesi. Già con la transgenesi è accessibile il gene pool quaternario. Negli ultimi anni si è usato il cis
genico cioè usando dna della stessa specie. La frontiera oggi è quella del genome editing cioè una tencologia
che permette di ottenere una lesione in un gene target conosciuto ma il sistema che opera non è associato
al gene quindi può essere eliminato tramite segregazione. Praticamente alla fine hai il mutante ma senza
sequenze esogene. Non è nostro interesse entrare in dettaglio perché noi parliamo di mg convenzionato ma
sul materiale supplementare del corso c’è il libretto “plant breeding techniques in a new era”.

LA SCELTA DEL METODO

La scelta dei metodi sono quelle valutazioni che devono essere fatte dopo aver individuato il problema e
scelto i materiali.

Bisogna valutare:

- Materiale di partenza da cui si parte (specie selvatica, ecotipi etc…)


- Struttura delle popolazioni (dipende dal sistema di unione della specie)
- Controllo genetico del carattere (se il carattere è monogenico o poligenico)

Materiale di partenza: quando si lavora con il germoplasma coltivato si va incontro ad incroci più facili e il
background genetico è più favorevole (siamo nel 1 gene pool). Quando si deve operare con germoplasma
selvatico le difficoltà di incrocio sono di diverso tipo (si pensi alle barriere pre e post zigotiche) e poi c’è il
rischio dell’introgressione di materiali non desiderati, quindi si deve stare attento agli schemi di
miglioramento.

Struttura delle popolazioni: dipende dalle caratteristiche riproduttive delle specie, cioè modo di riproduzione
e sistema di unione. Quando il modo di riproduzione è asessuato si va a costituire una popolazione clonale
(popolazione di individui geneticamente identici ottenuti per via apomittica o per propagazione vegetativa).
Se parliamo di specie che si riproducono sessualmente abbiamo il caso dell’autogamia in cui avremo delle
popolazione costituite da individui tutti omozigoti (linea pura o linea fissa, una linea tutta omozigote); se si
parla di allogamia allora si hanno le popolazioni in equilibrio.

A volte si vuole effettuare un’allogamia controllata, cioè


un seme ottenuto da due parentali controllati e in questo
caso avremo una popolazione F1, uniforme se
si parte da materiali omozigoti ma che
segregherà nella generazione successiva.
Ramet = individuo fisiologico

Genet = individuo genetico

Sembra che l'ermafroditismo sia stata la condizione originale delle piante e tuttora la grande maggioranza
delle specie è ermafrodita. Perciò, diversamente dagli animali unisessuati, molte Angiosperme hanno la
possibilità di operare l’autofecondazione (selfing). L’impollinazione tra fiori della stessa pianta o tra fiori
di piante con lo stesso genotipo (es. piante della stessa linea o clone) da un punto di vista genetico non
comporta differenze con l’autogamia, sebbene sia stata indicata con il termine “gneitonogamia”
(gneitonogamy). Malgrado molti fiori possano evitare l'autofecondazione con l'autoincompatibilità o con
altri meccanismi come il dioicismo, circa il 40% delle specie vegetali possono talvolta autofecondarsi,
mentre il 20% lo fanno abitualmente. L'autofecondazione é sconosciuta negli animali superiori come i
vertebrati e in molti artropodi, anche se normalmente avviene in altri gruppi come i molluschi. E' possibile
che le piante tollerino l'autofecondazione meglio degli animali perché molti geni recessivi che
porterebbero alla depressione da inbreeding possono essere stati eliminati quando sono stati esposti alla
selezione allo stadio di gametofito aploide.

Come l’autofecondazione ripetuta porti all’omozigosi totale l’abbiamo vista con lo schema di unione.
Riprendendo questo schema si vede che
partendo da F1 completamente
eterozigoti, se autofecondiamo
otteniamo segregazione
mendeliana, quindi 1,1 e 2 su 4. In
F2 quindi la percentuale di
eterozigoti è dimezzata mentre
omozigosi è raddoppiata. In f3 le
piante fissate daranno piante
fissate mentre le eterozigoti
segregheranno. In F4 in ogni
generazione la percentuale degli
eterozigoti è dimezzata. La
percentuale di eterozigoti è ½ di
ogni generazione segregante. Se gli
eterozigoti sono pari a 1/2^m

Sembra che la maggioranza delle piante abbia un sistema di unione misto, in cui coesistono l'incrocio e
l'autofecondazione. Solo poche specie sono diventate abitualmente autogame e l'autogamia obbligata é
quasi sconosciuta (infatti l’autogamia obbligata sarebbe un vicolo cieco dal punto di vista
adattivo/evolutivo, in quanto non permetterebbe l’insorgenza di nuove combinazioni geniche).
Comunque, anche l'autogamia abituale dal punto di vista adattativo sembra portare alcuni problemi, fra
cui i seguenti:

1) Alti livelli di omozigosi per cui geni letali recessivi ed altri geni sfavorevoli, che si possono accumulare
nelle specie allogame, si esprimono fenotipicamente e portano a depressione da inbreeding. L'autogamia
ripetuta può epurare una linea di una parte del suo carico genetico, ma una linea completamente
omozigote potrebbe contenere per caso alcuni alleli sfavorevoli fissati.

2) Gli effetti di superdominanza, dovuti a geni che mostrano superiorità in condizione eterozigote,
sarebbero persi. Questa seconda sorgente di depressione da inbreeding però non scompare con
l'autofecondazione ripetuta ed é la probabile ragione per cui alcuni loci talvolta rimangono in condizione
eterozigote dopo molte generazioni di autofecondazione (eterosi single locus).

3) L'omozigosi porta anche a perdita di variabilità nelle segregazioni e ricombinazioni fra i gameti per cui,
se in una popolazione si perde variabilità fra individui, quasi tutti gli zigoti prodotti dalla popolazione
saranno geneticamente uniformi. I danni che ne derivano sono simili a quelli causati dalla riproduzione
agamica.

In F5 gli omozigoti sono già il 98-99%.

Quando si considera più di un locus l’effetto è un pochino più lento


ma rimane identico, quindi ragionando sull’intero genoma si può dire
che l’autofecondazione ripetuta porta all’omozigosi su tutti i loci.

Considerando due loci A e B in eterozigosi in F1, in F2 avremo 16


combinazioni riassunti in 9 genotipi: solo 4 sono omozigoti ad

entrambi i loci su 16 quindi il 25%, gli eterozigoti sono il 75%. Se


autofecondo F2 avremo. In F3 gli omozigoti saranno il 56.25%. Come
si calcola?

La formula x l’omozigosi considerando + loci è

Le popolazioni naturali e artificiali di specie prevalentemente autogame sono costituite da un miscuglio di


individui omozigoti ed ogni omozigote rappresenta una linea pura o fissa.

Sappiamo che la variabilità genetica entro linea è molto bassa ed è data dalla componente ambientale. La
variabilità genetica però è alta tra linee diverse.

Le specie autogame hanno sempre una possibilità di allogamia e non sono fisse al 100% perché c’è sempre
la possibilità di una mutazione spontanea con un tasso molto basso e solitamente sono mutazioni recessive.
Nelle specie autogame le mutazioni vengono mantenute solo se favorevoli o neutrali, altrimenti vengono
eliminate per selezione naturale dato che vengono messe in omozigosi e tendono a scomparire.
Un’altra fonte di variabilità di una linea pura è una piccola quota di incrocio che comunque permane. Per
quanto la frequenza possa essere bassa, esiste. Spesso quando avviene un incrocio l’individuo ibrido
eterozigote che si forma possiede una fitness (capacità riproduttiva) più elevata perché si mettono in
evidenza degli effetti di eterosi (vantaggio selettivo) che danno una maggiore vigoria all’individuo ibrido.

Il miglioramento di linee pure porta a


varietà massale e varietà multilinee (sotto
controllo dell’allevatore). Nelle autogame
si ricorre comunque anche alla

costituzione di varietà basate sull’incrocio


di linee pure perché l’incrocio F1 può
sfruttare l’eterosi ed essere molto
uniforme.

Le specie che hanno un sistema di


riproduzione allogamo sono costituite
individui che si interincrociano liberamente e
si dice che condividono un pool genico
comune. Se sussistono i presupposti della
legge di Hardy-Weinberg (teorici ma
importanti) allora se la popolazione ha una frequenza allelica P di un allele e una frequenza allelica Q di un
secondo allele, all’equilibrio si avrà che la frequenza genotipica dell’individuo omozigote per l’allele P sarà
pari a P^2, la frequenza allelica per l’omozigote allele Q sarà Q^2, mentre l’eterozigote sarà 2PQ. Se
permangono i presupposti di questa legge, queste frequenze alleliche non cambiano nel tempo e la
popolazione rimane IN EQUILIBRIO!

Nelle popolazioni di specie allogame la variabilità genetica sussiste tra popolazioni. Popolazioni differenziate
per adattamenti a diversi ambienti sono chiamate Razze climatiche o ecotipi.

La variazione clinale è una variazione continua nello spazio, a seconda delle condizioni ambientali.

Nelle specie allogame la variabilità entro popolazione è elevata perché ogni individuo è diverso dall’altro e
quindi sono gli stessi individui a presentare variabilità. Questa variabilità è detta libera, se dovuta alle
condizioni genetiche esistenti, invece è potenziale quella dovuta agli individui eterozigoti della popolazione
che quindi sul momento non manifestano ma nella segregazione possono dare luogo a omozigoti con fenotipi
più estremi.
Quindi x le specie allogame: le popolazioni mantengono elevata eterozigosi, ogni individuo è diverso dall’altro
e non tollerano l’inbreeding (o autofecondazione forzata) perché nei fenotipi recessivi ci sono spesso geni
non conveniente (?).

I tipi varietali delle specie allogame


sono: popolazioni in equilibrio,
varietà sintetiche (ottenute
dall’interincrocio da un numero
limitato di genitori) e l’ibrido F1
costituito solo dall’incrocio di due
genitori specifici.

Per quanto riguarda le specie che si propagano per via vegetativa costituiscono le popolazioni di cloni sono
geneticamente uguali ma altamente eterozigoti di solito. Se costituiti da un solo genotipo sono popolazioni
monoclonali mentre se sono presenti genotipi tra individui uguali abbiamo una popolazione policlonale.

Il terzo aspetto importante nella scelta del metodo è il controllo genetico del carattere: monogenico o
poligenico (effetto combinato di più loci).

Monogenici → a eredità semplice – mendeliani – a variabilità discontinua (3 genotipi con solo 2 fenotipi
visibili o 3 ma comunque classi distinte) – categorici – QUALITATIVI

Poligenici → a eredità complessa – non mendeliani – a variabilità continua – QUANTITATIVI (i fenotipi non
sono classificabili in poche classi ma su tutta una scala di valori e la frequenza è rappresentata da una curva
gaussiana)
I caratteri utilizzati da mendel sono un esempio tipico di caratteri con eredità semplice. Nel caso di caratteri
non presi in considerazione da lui ma molto importanti per il miglioramento genetico: le resistenze verticali
→ sono resistenze molto forti e specifiche e sono solitamente monogeniche.

Nei caratteri mendeliani la relazione fenotipo- genotipo è relativamente semplice e dipende dalle interazioni
intra locus e in misura meno frequente da relazione tra loci diversi e con l’ambiente.

Intra locus: nel caso di un locus singolo con 2 alleli abbiamo 3 genotipi possibili. In caso di eterozigote con
dominanza e quindi uguale ad un omozigote abbiamo solo 2 fenotipi. Se la dominanza è incompleta quindi
l’eterozigote è fenotipicamente molto simile ad un omozigote ma non ne raggiunge il livello. Se la dominanza
è additiva l’eterozigote è in posizione intermedia tra i due diversi omozigoti. Manca la casistica della
sovradominanza: l’eterozigote ha un valore fenotipo più elevato degli omozigoti relativi.

Inter loci: l’espressione dipende sia dallo stato allelico del locus stesso che di un altro locus → epistasia. Sono
fenomeni frequenti ma non troppo.

Tra loci e ambiente: ci sono loci minori che hanno un piccolo effetto epistatico oppure l’ambiente ha un
effetto sulla penetranza e sull’espressività delle varianti alleliche. Penetranza: esprime un concetto
qualitativo relativo al fatto che a uno stato genotipico corrisponda un determinato stato fenotipico. La
presenza di alleli dominanti porta a un fenotipo forte mentre quelli recessivi a uno più contenuto. Se la
penetranza è il 100% tutte le piante con un certo corredo allelico hanno il fenotipo atteso, se è incompleta
pur avendo la corretta composizione allelica non abbiamo il fenotipo perfettamente corrispondente.

Penetranza:

La frequenza (in percento) con cui un gene (dominante o omozigote recessivo) o una combinazione di geni
si manifesta nel fenotipo degli individui che la portano. La penetranza (così come l’espressività) dipende
sia dal genotipo (ossia dalla presenza di geni modificatori) che dall’ambiente. Se meno del 100% degli
individui che portano un certo genotipo manifesta il fenotipo caratteristico, allora si dice che la penetranza
è ridotta o incompleta.

L’espressività è un concetto quantitativo ossia in questi individui la penetranza dell’allele A è completa ma


l’espressività o valore fenotipico è variabile.

Espressività:

Indica l’espressione fenotipica (tipo o grado) di un gene o genotipo che ha penetranza e che può essere
leggera, intermedia o severa. L’espressività può essere descritta in termini qualitativi e quantitativi.
L’espressività (così come la penetranza) dipende sia dal genotipo (ossia dalla presenza di geni modificatori)
che dall’ambiente. Può essere costante o variabile.
La teoria della selezione per caratteri monogenici: è semplice. Se siamo in assenza di dominanza, sia l’allele
dominante che recessivo possono essere fissati con un unico ciclo di selezione, perché un fenotipo è diverso
dagli altri due quindi se seleziono le piante col allele A ho già fissato e idem per allele a. → basta un ciclo di
selezione

Se invece c’è dominanza 2 genotipi


hanno lo stesso fenotipo mentre il
recessivo resta distinto. Se voglio il
recessivo mi basta un ciclo di selezione.
Se voglio fissare il dominante mi
servono 2 cicli. Per distinguere omo ed
etero ho bisogno di una nuova
autofecondazione e quindi le piante
che erano omo daranno progenie omo
mentre quelle etero daranno progenie
variabile.

Nel caso dei caratteri poligenici o quantitativi a variabilità continua le cose si complicano molto perché è
difficile stabilire una corrispondenza fenotipo genotipo. Di fatto il fenotipo che vediamo è dovuto all’effetto
di diversi geni a diversi loci che si sommano l’uno con l’altro.
Nei caratteri poligenici c’è anche un forte effetto ambientale
quindi in una popolazione con variabilità genetica per un
carattere poligenico gli individui si distribuiscono in una curva
di tipo gaussiano cioè in cui gli individui con valori intermedi
sono quelli a frequenza più elevata mentre gli individui più
estremi (coda di destra e di sinistra) hanno la frequenza meno
elevata. Molti caratteri agronomici importanti sono poligenici:
i caratteri dimensionali del frutto, produttività, tolleranze a
stress biotici e resistenze orizzontali (non ad altissimo livello
ma con efficacia ad ampio spettro)

L’azione di ciascun gene si somma a quella degli altri (additività) e l’effetto fenotipico del singolo è troppo
piccolo per poter essere seguito.

Esempio di un carattere quantitativo controllato da 5 loci diversi. I loci che controllano i caratteri quantitativi
sono anche chiamati QTL (quantitative trait loci). In tutti questi loci ci sono alleli plus e alleli minus (varianti
che danno un incremento o una diminuzione del carattere). Nell’esempio sono usate le lettere maiuscola e
minuscola ma non indicano dominanza ma solo A plus e a minus. Nell’esempio questi alleli sono considerati
additivi, quindi il loro contributo fenotipico si somma per dare quello finale. L’individuo 1 ha un certo valore
fenotipico, l’individuo 2 ha lo stesso valore fenotipico ma la composizione allelica è molto diversa. Poi ci
possono essere individui che manifestano un fenotipo non di interesse come l’individuo 3 ma se il breeder
avesse la lente di ingrandimento potrebbe venere che ci sono gli alleli plus in C che non ci sono altrove. Con
il breeding convenzionale non è possibile la scomposizione degli alleli ma con sistemi basati sui marcatori
molecolari è possibile identificare i qtl e la posizione genomica, individuare gli alleli plus e minus e anche
identificare il contributo allelico di ciascun locus. Volevo anche sottolineare che ci sono dei loci che hanno
effetto maggiore e effetto minore → vuol dire che la sostituzione allelica di un A con un a ha un effetto molto
maggiore della sostituzione di un B con b, ecco perché un locus come A o come D si chiamano major gene
(geni ad effetto maggiore). Invece loci come B ed E si chiamano minor genes!

Individuazione ed analisi dei geni che codificano per caratteri quantitativi (QTL)

Non tutti i caratteri si comportano in


maniera mendeliana e possono essere
seguiti con precisione nelle popolazioni
segreganti (es. F2 da un incrocio tra
resistente 'RR' e suscettibile 'rr' che
segrega 3:1).

Moltissimi caratteri di interesse


economico (produzione, precocità,
qualità, resistenze orizzontali, tolleranze
a stress) sono controllati da una pluralità
di loci, in cui gli alleli hanno effetti
additivi (cioè che si sommano) per dare
l'espressione fenotipica, ed effetti
troppo piccoli e troppo influenzati
dall'ambiente per essere seguiti
singolarmente. La differenza tra
caratteri qualitativi e quantitativi risiede
quindi nella grandezza relativa degli
effetti della sostituzione allelica a un determinato locus. Se l'effetto è grande relativamente alla varianza
fenotipica totale il carattere è qualitativo, se l'effetto è piccolo è quantitativo. Nella figura si rappresenta
un carattere controllato da cinque geni dove per ciascuno di essi è possibile la presenza di alleli che
incrementano il carattere (alleli plus, in maiuscolo, impropriamente) o alleli che lo diminuiscono (alleli
minus). Inoltre l’effetto della presenza di un allele o di un altro non è simile per tutti i loci; in alcuni può
avere un effetto maggiore (es. locus A e D) e vengono detti major genes, in altri ha un effetto minore (es B
e E) e vengono detti minor genes.
il fatto che l’azione combinata dell’effetto di più loci porti ad
una distribuzione continua e quindi ad un gaussiana è un
effetto combinato dovuto sia al numero dei loci in
segregazione e sia all’effetto della componente ambientale. A
destra si vede come passando da un singolo locus in assenza
di dominanza avete per esempio 3 classi fenotipiche in F2. Se
passate a 2 loci avete 5 classi fenotipiche e ogni volta le classi
fenotipiche aumentano e la distribuzione diventa sempre più
gaussiana.

A sinistra c’è un solo locus in assenza di dominanza e in


presenza e con i 3 fenotipi in F2 e all’inizio si considera che la
penetranza sia al 100% e che l’espressività sia costante e
quindi non ci sia effetto ambientale, quindi le 3 classi sono
perfettamente distinguibili.

Se ipotizziamo un effetto ambientale queste tre colonne diventano un grafico con overlap (sovrapposizione)
e più aumenti l’effetto ambientale più la sovrapposizione aumenta fino alla formazione di una curva!

Altro esempio teorico dimostra che i tanti loci portino ad una forma gaussiana. Se fai un incrocio che porta a
un tri-ibrido quindi ibrido per 3 loci eterozigoti, voi avete 8x8 64 caselle composte da 27 (9^3) genotipi
possibili. Tuttavia questi genotipi se consideriamo ipoteticamente che la presenza di ogni allele plus
conferisca un aumento al valore fenotipico abbiamo di fatto 7 possibilità, tutto secondo il quadrato di Punnet.
Se guardi F2 già si dispongono secondo curva gaussiana.

Come si può quindi effettuare la selezione nel caso di caratteri


poligenici?

Se ho una specie autogama posso riconoscere gli individui con le


migliori condizioni già fissate → gli individui agli estremi della curva
saranno quelli per gli alleli minus e plus e volendoli selezionale
opereremo una fissazione di questi genotipi.

In una specie allogama la selezione per un carattere qualitativo può


solo cercare di aumentare la frequenza degli alleli
favorevoli e se noi abbiamo una popolazione con una
media x=0 e siamo interessati ad incrementare il valore
di questo carattere nella popolazione allora possiamo
selezionare tutti quegli individui che ne hanno una
espressione elevata. Per esempio quelli in rosso sulla
curva, sia Xs la media della popolazione selezionata. Il
differenziale di selezione è la differenza tra le medie
della popolazione selezionata e popolazione originale.
Se noi selezioniamo questi individui con il carattere più
elevato e li interincrociamo tra di loro otterremo una
progenie con una media intermedia cioe X1. Si definisce
la risposta alla selezione la differenza che si è ottenuta di spostamento della media da quella originale a quella
ottenuta ed è data da x1-x0 e di norma è inferiore di S
REGRESSIONE: Il fenomeno per cui la media della progenie della popolazione selezionata è più bassa della
media della popolazione selezionata stessa. Questo fenomeno si spiega con il fatto che non tutta la variabilità
fenotipica selezionata è di fatto ereditabile. Magari una pianta è + alta perché per motivi ambientali aveva
un’esposizione ottimale, questo ovviamente non viene trasmesso in progenie. La scomposizione della
varianza nelle sue
componenti è molto
importante. La varianza
fenotipica che si indica
con sigma^2p è dovuta a
2 componenti principali:
varianza genetica e
varianza ambientale. La
componente genetica
può essere scomposta
anche in altre
sottocomponenti tra cui
si distinguono le
variazioni dovute ad
effetti additivi, quelle
dovute a dominanza e
quelle dovute ad effetti
epistatici. È
fondamentale stimare la
componente genetica di cui quella additiva si fissa con più efficienza, quindi è la + importante da stimare. Il
rapporto di queste componenti con la varianza totale viene definito con una variabile chiamata
EREDITABILITA’ … in senso largo → (varianza genetica/ varianza fenotipica) … in senso stretto →
(componente additiva / varianza fenotipica).

Allora il fenomeno della regressione è dovuto ed è legato proprio a questo valore dell’ereditabilità. Più è alta
e minore sarà la regressione.

In questa immagine tratta dal libro sono disegnati due


casi estremi che non si realizzano mai. In A
considerano ereditabilità= 0 quindi anche se abbiamo
un differenziale di selezione, la media della progenie
della popolazione selezionata sarà uguale a quella
selezionata e questo perché? Perch abbiamo
selezionato un carattere che non è legato per niente
alla genetica. Nel caso B l’ereditabilità è pari a 1 quindi
ogni effetto selezionato sarebbe di tipo genetico,
anche questo non succede mai.

SCOMPOSIZIONE DELLA VARIANZA FENOTIPICA IN VARIANZA GENETICA E COMPONENTE AMBIENTALE: è


facile se puoi confrontare due popolazioni della stessa specie: una monogenotipo e un’altra invece variabilie.
Se prendiamo una specie autogama e abbiamo una linea fissa costituita da un unico genotipo e poi una
popolazione F2 segregante.

Un altro caso è se abbiamo un’allogama, abbiamo metti un clone ottenuto per via vegetativa e a fianco una
popolazione ottenuta da inter incrocio o libera impollinazione. Quando possiamo valutare in modo parallelo
una monogenotipo e una poligenotipo possiamo stabilirne la varianza perché la linea fissa ha una varianza
solo ambientale. Differentemente quella di interincrocio ha la varianza di tipo fenotipico cioè è dovuta sia
alla componente ambientale che quella genetica. Se stimiamo che quella ambientale sia uguale in entrambi
i casi, si può ottenere quella genetica per sottrazione.

Esempio: hai due popolazioni di erba medica, una da


inter incrocio e una clonare e vuoi considerare il
carattere dell’altezza. Devi avere stesso numero di
individui. Vediamo che la media è simile ma
dobbiamo trovare la varianza. La varianza della pop
da interincrocio può essere una stima di varianza
totale mentre la stima della pop clonale può essere la
stima della varianza genetica. La varianza fenotipica è
la differenza tra le due e il rapporto tra la varianza
genetica e quella totale ci da una stima
dell’ereditabilità in senso largo.

I casi più reali sono quelli in cui l’ereditabilità è


compresa tra 0 e 1, anche se ci sono caratteri con ereditabilità molto alta e altre molto bassa.

Conoscendo quindi una stima dell’ereditabilità possiamo calcolare il guadagno conseguibile con la selezione
che è dato quindi dal prodotto del differenziale di selezione S x l’ereditabilità. A posteriori dopo la selezione
possiamo calcolare la risposta di selezione che è dovuta al differenziale di selezione sempre moltiplicato per
l’ereditabilità. Questo consente quindi di calcolare un valore di ereditabilità realizzata dovuta al rapporto tra
la risposta alla selezione e il differenziale.

Sapendo che la componente additiva è quella più fissabile, è chiaro che l’ereditabilità realizzata sia una buona
stima dell’ereditabilità in senso stretto.
TIPOLOGIA DI RISPOSTA ALLA
SELEZIONE

Nel caso dei caratteri qualitativi la


selezione ha l’effetto molto efficiente
di consentire la fissazione degli alleli
favorevoli. In assenza di dominanza si
possono fissare sia allele dominante
che recessivo. In presenza di
dominanza si ottiene lo stesso effetto
ma in tempi leggermente più lunghi,
per il recessivo basta una
generazione mentre per il dominante
sono necessari 2 cicli di selezione.

Nel caso dei caratteri quantitativi è


molto diverso, in pratica la selezione
punta ad aumentare la frequenza dei
caratteri favorevoli. Nelle popolazioni che vengono selezionate per i caratteri quantitativi si ha la perdita
dell’equilibrio di ardvaigher (non ho capito che cazzo ha detto ma dovrebbe essere un nome che ha già detto
nelle lezioni precedenti) perché vengono cambiate le frequenze geniche e genotipiche, inoltre comporta la
presenza di nuovi genotipi perché l’interincrocio favorisce nuove combinazioni geniche e poi per
segregazione. Inoltre comporta un cambiamento della varianza perché selezionando individui con un
fenotipo più estremo escluderemo tutta una serie di individui differenti e quindi abbiamo una varianza più
bassa.

La risposta alla selezione che si ottiene può essere categorizzata in 6 categorie:

1) Risposta rapida seguita da una risposta più lenta → si ottiene quando il carattere è controllato da
major gener e l’aumento della frequenza di questi alleli nei loci con effetto maggiore comporta la
crescita rapida. La crescita lenta successiva è dovuta a loci con effetto minore.
2) Risposta lenta e continua data da tanti loci con effetto simile ma piccolo
3) Risposta lenta seguita da un plateau perché a una certa la popolazione non risponde più e non si può
andare oltre un certo livello, spiegabile perché ci sono dei limiti fisiologici (si pensi alla dimensione
del frutto).
4) Risposta limitata o nulla. È il caso che si presenta quando l’ereditabilità di un certo carattere è molto
bassa quindi per quanto si selezioni non si ottiene un guadagno dal punto di vista genetico oppure
sono sbagliate le metodologie di selezione
5) Una selezione rapida seguita da un plateau che dopo alcune generazioni si ha di nuovo un aumento
e un nuovo pleateau e così via. Questo può essere spiegato dal fatto che la risposta rapita è data dai
major genes mentre ad un certo punto si esaurisce la varietà libera su cui selezionare, però dopo
alcune generazioni di interincrocio, senza guadagno selettivo, si può ottenere segregazione e
ricombinazione per cui si formano nuove combinazioni geniche che possono essere oggetto di
selezione e dare origine ad una nuova risposta
6) Risposte asimettriche: si verifica quando si fa selezione divergente, ovvero si selezionano per i due
estremi di un carattere che a volte pur essendo lo stesso andando nelle due direzioni si hanno
risposte diverse perché l’ereditabilità può essere diversa (per esempio major genes che aumentano
il carattere e minus che lo diminuiscono → risposta asimmetrica).
SELEZIONE PER PIU’ AMBIENTI: se uno sperimentatore ha ottenuto diverse linee selezionate e durante lo
screening vuole capire come si comportano queste varietà in luoghi diversi. Quindi eseguendo l’analisi della
varianza non hai più un solo fattore ma 2 (ambiente) quindi diventa un’analisi a 2 vie. Le fonti di variabilità
sono quindi i fattori principali e la loro interazione (genotipo, ambiente e interazione genotipo-ambiente).

se l’interazione è altamente significativa non si devono fare confronti sulle medie ma bisognerebbe fare delle
anova singole, quindi analizzare ogni singolo genotipo in ogni ambiente.

Si valuta mediante grafico crossover e i genotipi devono incrociarsi. Se l’incrocio tra le linee non è altissimo il
grafico si chiama non crossover. Come agire? O in ogni località portiamo il genotipo con le maggiori
performance, oppure selezioniamo un unico genotipo ma che sia il migliore come stabilità e come
performance combinata nelle 2 località.

La selezione del genotipo meglio adattato può essere guardato un po’ come l’adattamento degli ecotipi
avvenuto per secoli → interpretazione positiva (può essere considerato anche nel campo del miglioramento
genetico partecipativo)

Selezione del genotipo “migliore compromesso” → interpretazione negativa (avvenuto molto durante la
rivoluzione verde)

METODI PER SPECIE AUTOGAME

Iniziamo a parlare degli schemi di selezione! Il miglioramento genetico come scienza inizia con la riscoperta
delle leggi di mendel all’inizio del 20 secolo. Prima si coltivavano gli ecotipi, cioè varietà locali adattate alla
coltivazione in modo empirica e nate dalla libera impollinazione. Gli schemi di miglioramento genetico hanno
permesso un incremento di rese, resistenze, qualità etc…

Le varietà liberamente impollinate avevano una resa costante mentre con l’avvento del mg queste produzioni
sono aumentate in maniera vertiginosa (anche 4-500%).

Quasi tutti i tesi di mg parlando di schemi di selezione fanno riferimento a una distinzione in metodi per
specie prevalentemente autogame e per specie prevalentemente allogame, distinguono anche i metodi per
specie propagate vegetativamente. Questa distinzione è un po’ fittizie perché ci sono dei metodi applicati ad
entrambe le categorie.
Selezione massale:

quando si parla di metodi per specie autogame si


fa come esempio la selezione dei cereali autunno
vernini e quindi si portano delle specifiche in
termini di numero di piante e modalità di
allevamento che fanno riferimento a queste
specie. Se parliamo di altre specie ovviamente
cambiano i termini.

Per quanto riguarda la selezione massale si


allevano un certo numero di piante come
popolazione iniziale (da 3000 a 10000) e queste
piante devono essere selezionate in base al
fenotipo quindi devono essere ispezionabili
singolarmente. Quando si parla di cereali autunno
vernini si dice che la semina debba essere fatta a piante spaziate quindi ogni pianta viene separata dalle altre
in modo che sia visibile in maniera individuale. Se parliamo di pomodoro la comune densità di semina e
allevamento già consente la visualizzazione di ogni singola pianta quindi non serve dire di allevarlo a semina
spaziata. Viene quindi fatta una selezione fenotipica degli individui che rappresentano l’ideotipo. Può essere
una selezione positiva o negativa a seconda che si scelgano le piante migliori da tenere o quelle da scartare.
Il seme viene raccolto e riunito e sarà il seme di base della nuova varietà (costituita da diversi genotipi ma
comunque abbastanza simili. La popolazione avrà quindi una variabilità più bassa di quella iniziale).

Questa immagine rappresenta bene che si selezionano per l’ideotipo ma quindi individui che appartengono
a diverse linee pure anche se i genotipi delle varie linee e sono diversi! È un metodo molto primitivo ed è il
primo metodo che si adotta quando si vuole fare miglioramento su specie autogama. Chiaramente il fatto
che produca una popolazione eterogenea non la rende adeguata alla produzione di cultivar secondo il
concetto moderno. Può però essere interessante per migliorare gli ecotipi locali!

Selezione per linea pura:

si alleva una popolazione iniziale a piante spaziate e con


lo stesso numero di genotipi della massale, ma il seme
delle piante selezionato viene poi raccolto e seminato in
una fase 2 in parcelle pianta-fila: ogni fila rappresenta la
progenie di una singola pianta. Le file sono state
rappresentate in maniera omogenea perché se la
popolazione è prevalentemente autogama ci si deve
aspettare un alto livello di omozigosità e quindi di
fissazione. Di fatto in fase 2 si allevano parallelamente
una serie di linee pure.

Effettuando la selezione per linea pura puoi selezionare


piante altamente omozigoti ma potresti anche
selezionare piante non completamente fisse e
quindi il breeder deve portare alla fissazione.
L’adozione sistematica del metodo per linea
pura viene massimizzato in italia dalla
selezione genetica del frumento da genetisti
come Todaro, Passerini e Avanzi. Le varietà
che selezionarono sono conosciute come Rieti
11, Frassineto 405 etc… che sono fatti da
varietà locali e il numero rappresenta la
selezione fatta all’interno della varietà.

L’effetto immediato di queste operazioni di


miglioramento genetico fu quello di esaurire la
variabilità presente perché la migliore
performance indiscussa delle varietà
selezionate faceva sì che prendessero piede e avessero una coltivazione aumentata mentre le altre linee
andavano a sparire piano piano.

Creazione di nuove combinazioni (incrocio):


quando la variabilità genetica disponibile nelle
popolazioni esistenti è stata selezionata ed
esaurita, un modo per creare nuove varianti
alleliche è quella di effettuare un incrocio tra
individui diversi, portanti ognuno delle
caratteristiche che si vogliono mettere insieme
nella progenie. In questo caso abbiamo la
produzione di una generazione F1 che essendo
autogame saranno tutte uguali. In F2 si ha la
massima segregazione e minima omozigosi e
dopo ad ogni generazione di autofecondazione
l’eterozigosi viene dimezzata quindi in F5 o F6 hai
progenie quasi completamente omozigoti e con la
minima segregazione. Si seleziona a partire dalla
F2 fino alla F6 per ottenere linee pure che
combinino di caratteri desiderati nei 2 parentali dell’incrocio.

L’utilizzo dell’incrocio per ottenere nuova varabilità genetica fu adottata dopo la massale ma siamo nel
periodo tra le 2 guerre mondiali. Fu utilizzata da nazareno strampelli, l’autore di una serie di selezione nei
frumenti in italia e che hanno avuto importanza a livello mondiale). (ps. Messaggio da michela: Leggiti Contro
Natura di Dario Bressanini, parla anche un botto del glutine posso prestartelo)
Questa slide riporta uno degli incroci più fortunati di strampelli: si
era preposto di combinare alcune caratteristiche di adattamento
come la resistenza alla ruggine presenti in varietà RIETI che però era
poco produttiva con delle caratteristiche di alta resa di una varietà
olandese. Quindi riusci ad introdurre un terzo parentale, cioè una
linea giapponese molto resistente ad allettamento e alla stretta da
caldo. Da questo incrocio sono state selezionate varietà
importantissime per la granicoltura italiana e che sono poi
diventate i genitori di varietà molto più moderne. Quello che non è
spiegato è il come si passa dal prodotto di un incrocio ad una
selezione per linea pura. Questi sono proprio i metodi che
consentono di selezionare durante la segregazione.

Il metodo per eccellenza con cui si può effettuare


la selezione partendo da un incrocio per arrivare
ad una F6 va sotto il nome di Pedigree o selezione
genealogica: si esegue l’incrocio → F1
(generazione uniforme x il 1 principio di mendel,
non si può selezionare qui perché c’è solo la
variabilità ambientale) e si mette in semina fitta
→ F2 viene seminata in semina spaziata con una
numerosità di piante (x i cereali autunno vernini si
parla di 10/20.000 piante) e si esegue la selezione
su pianta singola su base fenotipica → il seme
raccolto su F2 viene seminato in pianta fila → F3,
ricordiamo che c’è ancora variabilità entro fila
quindi la selezione si basa sul fenotipo della
pianta singola → F4 in pianta fila (una per ogni
pianta selezionata perché anche le F3 sono un po
eterozigoti) → F5 si può basare la scelta su un
valore medio della parcella piuttosto che sulla
pianta singola perché le differenze tra le piante
saranno dovute molto all’ambiente → F6
parcella, anzi si può fare selezione come se fosse
una linea pura: una parte va in fase di screening
(condizioni agronomiche diverse, vari ambienti,
vari anni, confronto con varietà su mercato) e una
parte nel campo sperimentale per controllarne la
stabilità

Il metodo viene chiamato pedigree perché il breeder è


portato a mantenere le note pedigree, ovvero a
mantenere di tutte le selezioni che effettua delle note.
Perché c’è il pericolo di portare avanti troppi materiali,
mantenendo le note pedigree il breeder può
massimizzare la diversità genetica delle selezioni che
porta avanti (se in F4 ci sono 4 selezioni che vengono
dalla stessa pianta F2 magari ne sceglie solo 2 da portare avanti).

Il metodo pedigree è il metodo più completo e preciso ed efficiente ma anche impegnativo a livello di tempo,
spesa e lavoro. Accanto ai vantaggi del metodo pedigree bisogna annotare alcuni svantaggi:

- Problemi tecnici-logistici: impegno di tempo e lavoro e la spesa. Il metodo implica che in ogni anno
sia fatta selezione e questo significa che la progenie che si porta avanti deve essere messa in una
situazione selezionabile (se devi selezionare in pieno campo non puoi selezionare in serra per
sbrigarti oppure usare due stagioni diverse ma devi aspettare un anno)
- Problemi genetici: il metodo è efficiente se essendo basato sulla valutazione fenotipica si parla di
caratteri qualitativi o comunque con alta ereditabilità. Questi caratteri devono anche essere espressi
bene su piante spaziate e però non sono le stesse che la pianta ha in semina fitta cioè nella condizioni
di allevamento. La prima selezione che è anche quella più importante viene fatta in F2 cioè in uno
stadio in cui le singole piante sono ad un livello elevato di eterozigosi e quindi potrebbero essere
selezionate molte piante che appaiono buone in F2 ma daranno progenie molto scadenti, oppure
saranno scartata progenie non ideali ma che avrebbero potuto dare progenie di valore. Cioè
selezionare in F2 con alto livello di eterozigosità e su base fenotipica ha efficienza limitata.

Un altro metodo per la selezione è il metodo per


popolazione riunita o Balk selection: incrocio → F1 in
semina fitta perché non si fa selezione dato che è
uniforme → F2 – F6 si continuano a seminare senza
effettuare nessuna selezione specifica ma portando
avanti le piante in modo tale che si arrivi in F6 con
elevato livello di omozigosi → in F6 la popolazione viene
semina in maniera spaziata e queste piante sono piante
ormai diverse tra di loro ma comunque fisse quindi con
elevato livello di omozigosi → F7 seminata a semina
spaziata viene sottoposta a selezione sulla base della
singola pianta → da ogni pianta selezioanta in F7
si fa una F8 seminato in pianta-fila (un po’ come
nello schema per linea pura) → selezione delle
piante migliori → screening facendo in F10-F12
testando le selezioni in più anni e in più ambienti
e in confronto con le varietà affermate sul
mercato e si esce dal campo sperimentale del
breeder e si va direttamente nelle aziende per
andare a testare le piante nelle condizioni di
allevamento effettive. Nella stazione
sperimentale si continua a sperimentare per
costituire anche i nuclei di semi.

Il metodo per popolazione riunita di fatto


risponde in qualche modo alla forte selezione in
F2 che deve essere fatta col metodo pedigree.
Non si effettua selezione ad ogni generazione
quindi puoi svolgere più generazioni in un anno e
si accorciano i tempi.
Svantaggi del metodo? Te piacerebbe che fosse tutto easy, ma non lo è. Durante le generazioni di
popolazione riunita opera la selezione naturale che potrebbe non andare nella direzione che il breeder
desidera. Per esempio la selezione naturale in una popolazione riunita avvantaggia le piante di taglia alta ma
magari tu vuoi le piante basse. Nel corso delle generazioni di popolazione riunita il breeder deve comunque
imprimere una selezione positiva nel senso da lui voluto (per esempio eliminare le piante più alte. Se invece
stesse cercando una resistenza biotica si potrebbero allevare le piante con il patogeno in campo).

Un esempio relativo all’effetto della selezione naturale dovuta alle popolazioni riunite è sullo studio delle
composite (popolazione creata mescolando in parti uguali il seme di 4 varietà diverse). Il più famoso è quello
di orzo: un ricercatore ha portato avanti una composita per tanti anni. Nel 1933 è iniziata la coltivazione di
questa composità con il 25% del seme di ognuna di queste 4 varietà. Questa popolazione è stata portata
avanti per tanti anni e ogni anno si andava a vedere quanti individui di ciascuna varietà iniziale erano presenti
nella popolazione. Ogni anno c’è una crescita continua da parte di una varietà, si mantiene quasi costante
un’altra varietà, mentre un terza dopo 15 anni è scomparsa del tutto: nella selezione naturale rimangono le
varietà con una fitness più elevata delle alte popolazioni. Quindi lo studio di una composita ci dice cosa più
accadere all’interno di una popolazione riunita e ci dice come sia opportuno che il breeder imponga un
minimo di selezione positiva nel senso in cui lui vuole che vada la selezione.

Vantaggi e svantaggi: + semplice e conveniente, - laborioso e – costoso…

La filosofia su cui si basano molte concezioni del miglioramento genetico partecipativo (materiale adattato
ad ambienti specifici e programmi di miglioramento con i contadini, trasformatori etc…) sono questi
ragionamenti: lasciare che in una popolazione si affermino gli individui maggiormente adattati. Questo
funziona e si favoriscono gli individui più adattati. La filosofia del mg partecipativo è quella di continuare
queste popolazioni favorendo il rimescolamento delle popolazioni e quindi mantenendo eterozigosi e
diversità. Nel concetto tradizionale del mg questo metodo invece viene legato
alla produzione di linee fisse e monogenotipo.

Metodo SSD (single seed descent): per passare da etero a omo senza fare
speciali selezioni e per contrastare l’effetto della selezione naturale. Si parte
da un incrocio → F1 → F2 come piante spaziate perché vai in F3 con un singolo
seme da ogni pianta F2 → F3 sempre prendendo un singolo seme da pianta→
F4 sempre prendendo un singolo seme da pianta→ F5 sempre prendendo un
singolo seme da pianta→ F5 o F6 quando siamo in omozigosi si spaziano di più
le piante e si fa la selezione → F6 in piante fila → selezione su linea pura →
screening

Questo metodo è forse un pochino più impegnativo del precedente perché


richiede ogni anno di prendere un seme da ogni singola pianta ma anche qui
si possono usare ambienti controllati e più stagioni, non ci sono note
pedigree…
Metodo degli aploidi raddoppiati: si basa sull’uso di una tecnica
biotecnologica che permette l’ottenimento di aploidi. Il metodo è
sempre inserito nell’ambito di un incrocio → F1 in semina fitta →
ottenimento degli aploidi in vitro dalla rigenerazione di microspore
o di granuli pollinici e sono generalmente molto deboli e poco vitali
ma se il corredo cromosomico viene raddoppiato con alcaloidi
come colchicina risulta omozigote a tutti i loci → DH o doppio
aploidi o aploidi raddoppiati → selezione per linea pura e
screening

Questo metodo nelle specie autogame può essere adottato per ottenere linee pure che siano esse stesse
delle varietà oppure linee pure per poi fare ibridi F1. Anche nelle allogame in molti casi si vogliono costituire
linee omozigoti non per allevarle ma per costituire gli ibridi F1 e si può fare velocemente con gli aploidi
raddoppiati.

Come si procede? Ci sono diversi metodi x ottenere gli aploidi:


partire da cellule aploide e rigenerarle in vitro. Quindi o da
gamete o da gametofito, per esempio microspore che possono
essere isolate dai tessuti diploidi che li contengono
(normalmente vanno incontro alla gametogenesi) ma se
vengono isolate e collocate in vitro su substrato specifico con
ormoni specifici e vengono sottoposti a shock termico o
osmotico o chimico si può ottenere l’embriogenesi somatica,
cioè la riprogrammazione quindi dedifferenziazione e
ridifferenziazione in strutture embriogenetiche, cioè embrioni
somatici aploidi perché derivano da cellule aploidi. Gli embrioni
possono essere prelevati dal substrato e posti a rigenerare
(germogliare) e si possono sviluppare le piantine aploidi che
vengono sottoposte a trattamenti o a eventi spontanei che le
riportano ad essere dei doppi aploidi (DH). È un processo a cui
alcune specie rispondono bene e altre male. Per alcune specie
non ci sono protocolli. Per esempio la coltura di antere è facile
in peperone ma in pomodoro non si ottiene androgenesi.

Una delle cose importanti è lo stadio della microspora e lo shock e poi lo stadio di prelievo che generalmente
si colloca quando la microspora è uninucleata. Esistono anche specie in cui non c’è un buon protocollo da
gametofiti maschili ma da femminili (CIPOLLA) anche se è più facile partire da microspore ma vabbe meglio
di niente.

Il vantaggio di tutta sta pippa è che ci metti molto meno tempo degli altri metodi.

Anche nel caso delle autogame spesso si usano gli omozigoti per gli ibridi F1 per tanti vantaggi.
Schema del reincrocio o backcross o BC: tratta la selezione di una popolazione segregante dopo aver eseguito
un incrocio. Mentre negli schemi precedenti effettuavamo l’incrocio per unire le caratteristiche dei due
parentali, nel reincrocio generalmente si vuole trasferire un’unica caratteristica dal genitore donatore al
genitore ricevente o ricorrente. Lo scopo è quello di trasferire solo un allele e recuperare tutto il genoma del
genitore ricorrente. Vengono infatti eseguiti reincroci con il genitore ricorrente. (ARGOMENTO
FONDAMENTALE E DEVI IMPARARE ANCHE IL DISEGNO). Facciamo riferimento a
caratteri monogenici ma può essere riadattato a specie allogame e a caratteri poligenici.

In questa slide è rappresentato il meccanismo di funzionamento del programma di


reincrocio: il donatore è a sinistra e il ricorrente è a destra. Uno ha i cromosomi neri e
uno bianco. Si fanno reincroci tenendo sempre d’occhio l’allele di interesse. Si deve
ottenere una linea quasi isogenica: cioè la linea del parentale ricorrente con la porzione
che contiene l’allele del donatore. Le linee quasi isogeniche (NILs) che otteniamo
costituiscono il punto finale di un programma di reincrocio. L’idealizzazione è il
trasferimento di un gene di resistenze da una specie selvatica a un coltivato.

In questa slide è rappresentato lo schema di un programma del reincrocio.

Ce ne sono due leggermente diversi a seconda che si debba trasferire un allele dominante o uno recessivo.

Trasferimento di un allele dominante: la


generazione parentale prevede l’incrocio tra un
genitore donatore e uno ricorrente. Il donatore ha
l’allele dominante, il ricorrente ha quelli recessivi. Se
possibile è bene usare il ricorrente come femmina
dell’incrocio per mantenerne anche il citoplasma.
Quando si scrivono gli incroci è d’uso mettere
sempre a sinistra il femminile e poi il dominante.
Quindi P1 omozigote recessivo e P2 omozigote
dominante. Si ottiene F1 (eterozigote x il locus di
interesse + percentuale del genoma del ricorrente
50%)→ BC1 F1 backcross 1 o F1 → segregazione al
50 % allele recessivo in omozigosi e il 50%
eterozigoti → selezione su BC1 F1 perché noi
vogliamo andare avanti solo con gli individui che
hanno l’allele che ci interessa. Ora il abbiamo
recuperato il 75% del ricorrente perché si dimezza
quella del donatore→ BC2 F2 (secondo
backcross) anche qui si va a scegliere l’etero.
Percentuale di genoma del ricorrente 87,5% →
BC3 F3 → selezione etc… → BC5 o BC6
raggiungiamo il 98-99% del genoma del
ricorrente!

Neanche in BC6 siamo in presenza di una linea


quasi isogenica perché l’allele che ci interessa è in
condizione eterozigotica. Servono quindi 2 cicli di selezione: autofecondazione → BC6F2 → segregazione
1:2:1 omo rec, etero, omo dom → ¾ degli individui hanno allele dominante e dobbiamo andare in una
seconda generazione di selfing → BC6F3 in cui gli etero segregano mentre gli omo progenie fissa → abbiamo
individuato gli individui fissi per l’allele che ci interessa.

E’ necessario fare screening dopo un programma di backcross? Si e no. No perché se abbiamo ottenuto una
linea quasi isogenica a quella di partenza, teoricamente noi abbiamo recuperato in toto le caratteristiche di
adattamento ma è opportuno controllare perché non abbiamo trasferito un solo gene o un solo allele ma un
piccolo segmento allelico ( più o meno piccolo) quindi ci possono essere in associazione degli alleli sfavorevoli
o che comunque cambiano le caratteristiche del risultato finale, quindi + che screening servirebbe un
controllo che le caratteristiche siano rimaste di fatto le stesse.

Da un punto di vista matematico il recupero del patrimonio del ricorrente il meccanismo è molto simile al
recupero dell’omozigosi dopo generazioni segreganti. Infatti il genoma del donatore si dimezza ad ogni
reincrocio. Il genoma del donatore è= P= 1/2m+1 mentre del ricorrente è P= 1 – ½ m+1

L’andamento grafico è asintotico e non ha senso andare oltre BC6 perché il guadagno sarebbe troppo piccolo.

Oltre che il carattere voluto si può anche fare selezione positiva o negativa di altre caratteristiche,
prediligendo le piante che dimostrano + consistentemente le caratteristiche del ricorrente → background
selection (x accelerare lo schema di backcross)

Di fatto il backcross è anche un programma che si basa su una riproduzione tra consanguinei perché non si
fa altro che reincrociare continuamente con lo stesso genotipo → comporta un aumento dell’omozigosi.

Quindi vale ancora questa fantastica


formula

Trasferimento di un allele recessivo:

lo schema è lo stesso ma con qualche modifica. Molte mutazioni utili sono recessive.

A sinistra c’è la femmina e a destra il maschio (omozigote recessivo).

F1 etero → BCF1 → da un punto di vista fenotipico dobbiamo prendere gli alleli recessivi ma se c’è dominanza
completa sono tutti uguali quindi facciamo
autofecondazione → BC1F2 o BC1S2 dove non si
guadagna niente in termini di recupero del
genoma ma riusciamo a mettere allo scoperto gli
omo recessivi → (spesso fa la domanda “ma con
quale frequenza vengono fuori questi omo
recessivi. La risposta è: se consideriamo che le
piante di BC1F1 sono x metà dominanti e x metà
etero avremo ½ che segregano. Poi nella
segregazione di un etero gli omo recessivi sono ¼
quindi in totale saranno ¼ di ½ cioè 1/8) → BC2F1
completamente etero quindi anche se non
vediamo il recessivo sappiamo che c’è → BC3F1 in
cui segregano etero dom e omo dom → BC3S2 →
BC6F1 → fissi subito il recessivo e fai un solo ciclo di selezione

Qui vedi che è un po’ più lungo, non si fanno BC a ogni generazione ma alternati. Per esempio 3 BC e anche
2 self, 6 BC e 5 self etc…

Nella realtà dei fatti i breeder hanno alcuni trucchi o


possibilità di fare scorciatoie e avere una selezione +
veloce. Una scorciatoia che si può fare può essere
quella di fare il self in BC1F1 andando in BC1F2 ma le
stesse piante le facciamo anche andare in BC, in
questo modo nella generazione successiva possiamo
allevare parallelamente il prodotto dei self e capire
quali erano omo e quali etero. Possiamo recuperare i
bc fatti con le etero che sono quelli che contengono
l’allele recessivo. I bc fatti con le dominanti saranno
buttati via.

Sia se parliamo di allogame che di caratteri poligenici


serve operare con un numero maggiore di piante.
Conviene comunque usarlo x monogenici.

Aspetti positivi e negativi li abbiamo già menzionati


tutti. La problematica del “linkage drag”, cioè avere un
pezzo del genoma del donatore in associazione con
l’allele trasferito e la possibilità che ci potrebbero essere
dei geni non graditi.

Se alla fine ti trovi anche un altro allele puoi sperare in


una ricombinazione (difficile se i loci sono vicinissimi).
La linea con i caratteri dominanti deve essere incrociata
di nuovo col ricorrente e si deve sperare che ricombinino in meiosi in cui si ottengano due gameti
ricombinanti con uno che porta l’allele favorevole senza l’allele di cui volevamo liberarci.

Il problema del linkage drag può essere stato sottovalutato per molto tempo perché con tutti i BC che ti pare
potresti non aver avuto ricombinazione vicino al locus di interesse. Nel progetto di risequenziamento di più
di 300 genomi di pomodoro ci sono linee moderne che possiedono abbondanti pezzi di selvatico laddove
siano stati inseriti alleli di resistenza da un selvatico. Ci sono infatti molte tracce di solanum chilense e
solanum peruvianum. Questo succede anche perchp se inserisci dal selvatico la ricombinzione non è facile
perché non c’è molta omologia. (vedi questi programmi convenzionali sui cui prodotti non vengono fatti
controlli comportano delle belle introgressioni di selvatico di cui non sappiamo nulla. Col mg moderno puoi
inserire solo quel fottuto pezzetto di gene).

Per finire sulla trattazione dei metodi delle autogame la selezione genetica porta alla costituzione di varietà
basate sulla linea pura. La possibilità di fare introgressioni di geni per esempio di resistenza creando linee
quasi isogeniche ha dato la possibilità di ideare le varietà multilinee, cioè varietà in cui vengono mescolate
linee quasi isogeniche che differiscono per la resistenza a diversi patogeni o ceppi dello stesso patogeno. Era
un modo di dare un po di variabilità tipo immunità di gregge in cui alcuni individui sono resistenti a una cosa
e altri a un’altra → non ha avuto molto successo a causa dei costi perché fare varietà multilinee e avere
parecchi isogeniche non è molto economico.
Una cosa che viene adottata invece è il gene pyramiding (piramidizzazione): vengono inseriti tramite BC
diversi geni di resistenza nella stessa linea. Questo si fa anche in pomodoro

SELEZIONE ASSISTITA DAI MARCATORI (MAS):

argomento che vale sia per le piante autogame che allogame. L’uso di queste metodiche ormai è di routine
nella selezione ma non solo nelle aziende gradi con laboratori e centri di ricerca ma anche nelle aziende
medio-piccole in cui o si allestiscono piccoli laboratori o si rivolgono a lab esterni.

La selezione assistita è quando si basa la selezione sul fenotipo dell’allele di interesse ma sul fenotipo di un
marcatore associato (i due loci sono vicini fisicamente quindi automaticamente selezioni l’allele giusto).

I livelli di selezione possono essere diversi. Fin’ora abbiamo parlato di selezione fenotipica ma può essere
fatta anche selezione su base genotipica (basata sul fenotipo della progenie), selezione assistita (cerchi l’allele
utili tramite l’associazione con uno o più marcatori), selezione genomica (basata su molti marcatori). La
selezione genomica è un po’ il futuro mentre quella assistita è attuale e utilizzata.

La selezione assistita da marcatori si applica in quei casi in cui è più conveniente seguire la segregazione del
marcatore rispetto al carattere di interesse, perché se quest’ultimo è di facile rivelazione è inutile usare i
marcatori. Nei caratteri di complesso rivelamento c’è questo vantaggio. Un esempio esplicativo è quello di
un carattere di resistenza a stress biotici, per fare selezione bisogna sottoporre le piante a pressione selettiva
e quindi allevarle col patogeno nelle giuste condizioni e
con le giuste modalità e se il patogeno non c’è deve
essere inoculato → ovviamente costa una cifra! In
questi casi avere un marcatore associato è utile. Nella
slide si fa riferimento a caratteri che vengono espressi
tardi nel ciclo vitale della pianta e che il miglioratore
può avere interesse a selezionare prima, questo può
essere caratteristico delle specie arboree dove la
giovanilità postpone l’espressione di caratteri come
fioritura, fruttificazione etc…

La mas può essere utile anche nei caratteri difficili da


selezionare x motivi genetici (carattere recessivo che in
eterozigosi non si vede a livello fenotipico, oppure x i
caratteri quantitativi).

L’uso dei marcatori genetici è un uso molto antico però ha preso una importanza rilevante da quado è arrivata
la possibilità di sviluppare i marcatori molecolari (analisi dei polimorfismi del dna: il dna di individui della
stessa specie è ricco di variazioni per esempio di una singola base SNP oppure piccole delezioni, inversioni
etc… con opportune tecniche molecolari è possibile mettere in evidenza queste modifiche e servono per
avere un marcatore che può essere usato nell’analisi genetica). I marcatori sono veramente tanti e con una
singola reazione possiamo fare il genotipo in migliaia e migliaia di posizioni del genoma e questo ha un costo
relativamente basso.
come funziona la mas nella selezione? Si fa l’esempio di un gene di resistenza (Rdg2a) che è molto vicino (0.2
centi morgan, quindi due ricombinazioni ogni 1000) a un marcatore polimorfico (cioè se amplifichi con PCR
in un parentale ottieni una banda leggera e
nell’altro una più pesante). In F2 il marcatore
segrega in maniera mendeliana quindi trovi gli
omozigoti e gli etero. Se non c’è ricombinazione
tra due loci questo marcatore e il locus di
interesse segregano come se fossero un unico
locus. L’allele dominante per il locus di interesse si
accompagna sempre con l’allele leggero per il
marcatore mentre l’allele recessivo si
accompagna a quello pesante. Quindi con un gel
voi avete una lettura precisa di quello che succede
al locus utile che vuoi selezionare.

Il concetto di base della selezione assistita da marcatori (marker-assisted selection) consiste nella
possibilità di sfruttare la cosegregazione tra un allele di un locus marcatore ed un allele di un locus di
interesse. Qualora la rilevazione del marcatore sia più rapida e/o economica rispetto alla rilevazione del
carattere stesso, nei programmi di miglioramento genetico è possibile effettuare la selezione basandosi
sul fenotipo del marcatore invece che su quello del carattere di interesse. Questa situazione si realizza
spesso, soprattutto con caratteri per i quali necessitano, durante la selezione, manipolazioni artificiali
dell'ambiente (resistenze a stress biotici e abiotici), analisi chimiche (caratteri che influenzano la qualità
del prodotto), etc. Il vantaggio di basare la selezione su caratteri marcatori è anche evidente in tutti i casi
di caratteri espressi su pianta adulta, soprattutto in specie a ciclo lungo, come ad esempio. le specie
arboree.

Le fasi di un programma di selezione assistita: si prelevano i campioni (piccoli pezzetti di tessuto o di seme),
si estrae dna, pcr, visione gel e sulla base del gel si selezionano le piante. La cosa importante è che queste
analisi si possono fare su piante piccolissime, questo ovviamente è un vantaggio notevolissimo.

Perché un marcatore possa essere utilizzato in un programma di mas bisogna che sia stato prima identificato
il marcatore associato al locus. Quindi la mas prevede una fase di studio iniziale in cui si cerca il marcatore
associato al locus e che viene poi pubblicato in lavori scientifici dove poi i risultati sono a disposizione di tutti.
Nelle grandi ditte sementiere come la Pioneer a volte la ricerca viene fatta dalle companies stesse e ne sono
proprietarie. Quando il marcatore è stato identificato e si è visto che la ricombinazione è bassa, questo può
essere usato per la selezione.

Il concetto di base della selezione assistita consiste nella possibilità di sfruttare la cosegregazione tra un
allele di un locus marcatore ed un allele di un locus di interesse. Qualora la rilevazione del marcatore sia
più rapida e/o economica rispetto alla rilevazione del carattere stesso, nei programmi di miglioramento
genetico è possibile effettuare la selezione basandosi sul fenotipo del marcatore invece che su quello del
carattere di interesse. Questa situazione si realizza spesso, soprattutto con caratteri per i quali necessitano,
durante la selezione, manipolazioni artificiali dell'ambiente (resistenze a stress biotici e abiotici), analisi
chimiche (caratteri che influenzano la qualità del prodotto), etc. Il vantaggio di basare la selezione su
caratteri marcatori è anche evidente in tutti i casi di caratteri espressi su pianta adulta in specie a ciclo
lungo (es. le arboree).

Si deve tenere presente che, prima di poter utilizzare un marcatore molecolare nella selezione assistita, è
necessario individuare un locus polimorfico associato al carattere, cioè si distinguono due fasi:
1) Fase di studio: identificazione di un marcatore molecolare associato al gene di interesse, verifica
dell'associazione, stima della distanza genetica, pubblicazione e divulgazione dei risultati (questi lavori
vengono effettuati soprattutto, ma non solo, da Università, Centri di Ricerca, etc.).

2) Fase di applicazione: utilizzo del marcatore molecolare nella selezione assistita (questa fase viene
effettuata prevalentemente, ma non solo, presso ditte sementiere, breeders, etc.).

Per semplificazione si descrivono le tecniche facendo riferimento a caratteri di tipo qualitativo.

Identificazione di marcatori associati a caratteri di interesse: i metodi sono basati sullo sviluppo di una
popolazione sperimentale o di mappa che segreghi sia per il gene di interesse che per marcatori molecolari
sparsi nel genoma → i due parentali devono essere anche polimorfici!

Se facciamo l’esempio di un locus di interesse A possiamo costituire un backcross BC1. Si parte


da due parentali contrastanti, si ottiene F1 etero e si reincrocia col parentale recessivo e si
ottiene la segregazione del locus A.

Nella popolazione che abbiamo sviluppato


prendiamo in considerazione un certo numero di
individui statisticamente valido. Il locus A segrega
50 e 50 se considerato da solo ma se consideriamo
un locus molecolare indicato con m → la F1 sarà un
di-ibrido e produce da 2 loci indipendente 4 tipi di
gameti in proporzioni uguali. Se abbiamo loci
associati (quindi m associato ad a) succederà che i
gameti parentali saranno prodotti in maniera
maggiore del 50% e quindi le classe derivate dai
parentali saranno ciascuna maggiore del 25%. Se
troviamo una frequenza relativa e complessiva delle
classi ricombinanti=10% si può dire che sono
distanti 10 centi morgan tra di loro. Quindi il
metodo si svolge sottoponendo la popolazione di
mappa ad un’analisi con tanti marcatori molecolari finchè non se ne trova uno vicino al locus di interesse.

Nell’esempio che abbiamo visto prima la distanza stimata era di 10cM ma è troppo ampia x usare un
marcatore nella selezione assistita perché vorrebbe dire che il 10% delle volte si ha una ricombinazione e si
sbaglia la selezione. La distanza utile si considera sotto i 5 cM ma oggi si arriva tranquillamente anche molto
al di sotto di 1. Se la distanza è di 5 cM le due classi di ricombinanti saranno del 2,5% ciascuna quindi il 95%
delle volte facciamo una selezione corretta anche dell’allele al locus A mentre il 5% facciamo uno sbaglio. Nel
primo caso della classe ricombinante (Aamm) siamo in presenza di un falso negativo perché non troviamo m
grande ma c’è A grande, quindi non vedi il marker anche se l’allele c’è). Nel secondo caso sempre 2,5% siamo
nel falso positivo ovvero è presente il marker ma non l’allele (aaMm).

Applichiamo questo conetto ad uno schema di reincrocio: nel backcross x trasferire un allele dominante
bisogna selezionare ad ogni generazione.

Dopo quanto premesso ed anticipato, poco rimane da spiegare per quanto riguarda l'utilizzo dei marcatori
associati nella selezione assistita. Nella figura seguente è riportato l’esempio di introduzione di un allele di
resistenza ‘R’ in una linea suscettibile ‘rr’. Con il metodo tradizionale dopo ogni reincrocio si devono
selezionare i genotipi ‘Rr’ che devono essere reincrociati ancora mediante prove con inoculi artificiali. Con
la selezione assistita, potendo disporre di un marcatore molecolare strettamente associato, si può basare
la selezione su analisi molecolari e scegliere gli individui che presentano l’allele ‘M’ che è associato ad ‘R’
(notare che nello schema si è esclusa la ricombinazione, cioè si è ipotizzato che il locus R e il locus M siano
associati in maniera molto stretta. Si considerano utili ai fini della selezione assistita quei marcatori che
sono associati a circa 5 cM o meno (o a ca. 20 cM se si usano due marcatori da lati opposti del gene). Questo
grado di saturazione, se difficilmente ottenibile con marcatori morfologici o biochimici, lo è invece con
marcatori molecolari.

Con i metodi sopra descritti sono stati identificati marcatori molecolari associati a molti loci che
controllano caratteri ad eredità semplice (es. resistenze). Solo per citare alcuni esempi, in pomodoro un
allele raro delle fosfatasi acide (quindi un marcatore isoenzimatico), strettamente associato con un allele
per la resistenza ai nematodi, è stato molto sfruttato nel breeding. Molte ricerche sono state fatte per
marcatori RAPD in mais in linkage con un gene per la resistenza a Pseudomonas. Altri marcatori biochimici
sono stati importanti per questi scopi: importanti associazioni tra isoenzimi e resistenza a un erbicida in
Avena fatua.

Di particolare utilità possono essere i marcatori molecolari nel particolare lavoro di recupero del genoma
del genitore ricorrente ricorrente nel reincrocio. Utilizzando marcatori RFLP è possibile minimizzare le
generazioni di reincrocio per recuperare il genoma del genitore ricorrente: il 'monitoraggio' del locus
introgresso con marcatori RFLP strettamente associati aumenta l'efficienza di selezione di un fattore 50
(Young e Tanksley, 1989). Si può inoltre ridurre al minimo il frammento introgresso e utilizzare meglio il
pool genetico delle specie selvatiche.

I vantaggi della selezione assistita sono perciò riassumibili come:

• selezione più accurata


• selezione più semplice
• selezione più precoce (allo stadio di plantula)
• identificazione segreganti con fenotipo simile
• identificazione segreganti con max genotipo ricorrente
• limitazione linkage drag
• non è necessario eseguire inoculi artificiali.

Al locus dell’allele utile è stato ipotizzato molto vicino un


locus di un marcatore associato. Il marcatore è costituito
da un frammento di dna + corto per l’allele m piccolo e più
lungo per M. in F1 l’etero ha 2 bande e facendo il
reincrocio con il doppio recessivo avremo segregazione
sia del marcatore che del locus utile (avremo individui con
doppia banda e individui con banda bassa). Se c’è la banda
alta lì c’è associato l’allele R che è quello che stiamo
trasferendo. Ovviamente alla fine un programma di
reincrocio con mas si portano avanti più piante x ovviare
falsi positivi e negativi e poi alla fine si fa sempre un test
in vivo. In questo caso il marcatore molecolare evidenzia
sia i due stati omozigoti sia quello eterozigote (marker
codominante: puoi vedere tutti gli stati allelici) → ti
risparmi i cicli di selfing.
Un altro esempio di applicazione di selezione assistita:
gene di resistenza x il tomato spotted wilted virus che
è un virus che è diventato epidemico da un po di anni
e quindi i breeder hanno cercato sia la fonte di
resistenza che il marcatore associato. Questo
marcatore si trova a circa 1 cM dal gene utile ed è un
marcatore dominante (gli individui che portano il
marcatore hanno un bel amplificato per la banda bassa
mentre quelli che non hanno il gene di resistenza on
hanno neanche l’allele utile e Sono stati aggiunti una
coppia di primer che fungesse da controllo e sono le 6
piante a destra col primer di controllo). Nei gel sotto il
primer di controllo fa vedere che l’amplificato avviene
su tutte ma la segregazione della banda del marcatore
c’è e le piante interessanti sono quelle che portano il
gene utiile e quindi il marcatore. È molto più facile fare
una piccola amplificazione così su piante piccole che aspettare che crescano e sottoporle ad un inoculo.

Un altro esempio di recente applicazione. Il virus Tomato Spotted Wilted Virus (TSWV) è diventato
recentemente un problema epidemico nella coltura del pomodoro. Tutte le varietà maggiormente
coltivate fino a 10 anni fa erano suscettibili al virus. Ciò ha creato enormi danni alla coltura. Sono stati
reperiti diversi geni di resistenza nelle specie selvatiche affini a pomodoro; il più stabile e promettente è
stato l’allele SW5 proveniente da Solanum peruvianum. Con un approccio di BSA sono stati identificati dei
prodotti di PCR RAPD associati al locus Sw5. Lo studio di questi prodotti ha portato allo sviluppo di uno
SCAR a una distanza di 1 cM. Purtroppo questo marcatore è risultato dominante (presenza/assenza) ma
tuttavia è stato molto adottato nella MAS. Nelle foto in basso, lo screening di una popolazione segregante
in cui in ogni reazione sono stati inclusi i primer per un amplificato di controllo. Le piante che hanno
ereditato un allele Sw5 sono indicate chiaramente dalla presenza dell’amplificato a minor peso molecolare.

in questa slide sono riassunti i vantaggi della selezione assistita.

L’uso dei marcatori e della mas ci permette di selezionare a


volte per i loci che controllano i caratteri quantitativi, cioè i loci
QTL

Se l’uso dei marcatori molecolari x i caratteri qualitativi


consente di fare selezione, nel caso dei quantitativi consente in
generale un avanzamento più ampio di quanto sia possibile
sapere con le tecniche convenzionali. Infatti il breeding
convenzionale considera il carattere nel suo complesso e non
se ci sono alleli plus o minus o geni major etc…

Con l’analisi molecolare è stato possibile dissezionare il


carattere poligenico nelle sue componenti mendeliane (mendelizzazione di un carattere poligenico).
Come si fa? Qui parliamo della dimensione della bacca
di pomodoro. Questo è un carattere poligenico e di
fatto si opera come abbiamo descritto prima per
trovare i marcatori x un singolo locus, quindi incrociamo
i due parentali (individuo bacca piccola x bacca grande),
si ottiene una popolazione segregante (+ di 100
indivdui) e di questa popolazione da una parte si misura
il fenotipo e si fa anche la genotipizzazione (analizzati a
tanti marcatori molecolari). Esistono poi delle analisi
statistiche come la regressione o altri più complessi che
danno la possibilità di mettere in evidenza quei
marcatori che sono legati ai loci e della manifestazione
del carattere. Così praticamente scansionando il
genoma in modo statistico si ottengono dei picchi e
dove sono i picchi c’è un qtl di interesse.

Le fasi essenziali dell'analisi QTL sono:

1) Costituzione di una popolazione segregante proveniente da parentali differenti per il carattere


quantitativo, che può essere F2, BC1 o linee inbred ricombinanti (RIL).

2) Caratterizzazione (phenotyping) di tutti gli individui (o linee RIL) per il carattere quantitativo in studio,
cioè misurazione del carattere. Una tolleranza può essere ‘misurata’ ad es. con un indice fisiologico basato
su una o più misurazioni. Poiché nei caratteri quantitativi gioca un ruolo importante l’ambiente è
importante fenotipizzare le piante in prove ripetute nel tempo e/o nello spazio. Da questo punto di vista
sono preziose le popolazioni segreganti «immortalizzate» come le RIL che permettono di essere replicate
a piacimento tramite seme.

3) Scelta di un set di marcatori molecolari su cui lavorare. Per esempio si scelgono 100 marcatori RFLP
(supponiamo di lavorare in una specie per cui esiste una mappa con inseriti molti marcatori RFLP: li
scegliamo in modo da coprire uniformemente tutto il genoma).

4) Caratterizzazione di tutti gli individui per il tipo di allele molecolare presente a tutti i loci scelti
(genotyping)

5) Analisi statistica: esistono molti metodi più o meno complessi e software specifici. Vedremo in questa
sede uno dei metodi più semplici basato sul calcolo della retta di regressione con il metodo dei minimi
quadrati.
In questa slide è esemplificato quello che vi ho detto a
parole. Come vedete sono disegnati 2 marcatori e un
qtl nel parentale 1 e 2. Il primo marcatore è lontano dal
qtl quindi segrega in modo indipendente e che ci sia
una situazione allelica o l’altra il fenotipo è uguale
praticamente. Nel caso 2 dove il marcatore è vicino al
gene importante e quindi non segrega facilmente con
questo, quindi in un caso avremo fenotipo=20 e
uno=77! I geni maggiori daranno o più marcatori
associati.

Consideriamo per esemplificare lo studio di una


tolleranza generica (es. tolleranza alle alte
temperature) utilizzando una popolazione segregante
BC di cui si riportano solo 12 individui. Chiamiamo I
l’indice che misura la tolleranza nell’esempio. I due
parentali sono contrastanti per I (5 vs 95), mentre
l’ibrido F1 presenta valori intermedi (50), come lecito
attendersi nel caso di un carattere quantitativo

Nell’esempio è riportato il genotipo per due marcatori molecolari, uno indipendente (marker 1) ed uno
strettamente associato (marker 2) ad un QTL che controlla il carattere. Questa situazione si vede
chiaramente considerando ciascuna combinazione marker/tolleranza. Per marker 1 la media dei valori di
tolleranza degli individui omozigoti (A) è molto simile alla media degli individui eterozigoti che portano un
allele di B (H). I valori sono 52,5 e 44,8.

Facendo lo stesso calcolo per il marker 2 la situazione è molto diversa: la media degli individui A è molto
inferiore alla media degli H, indicando la vicinanza tra il locus molecolaree un QTL importante per il
carattere. L’associazione è chiara anche se è avvenuta probabilmente qualche ricombinazione (es. il primo
individuo presenta A al marcatore ma ha un livello elevato di tolleranza; anche il sesto individuo è
probabilmente un ricombinante).

Benchè la significatività di questa associazione possa essere saggiata con un test chi-quadrato o con altre
semplici statistiche non parametriche, esistono metodi di analisi più precisi quale appunto quello della
regressione.

Se esiste una buona mappa genetica della specie in studio, i marcatori possono essere scelti in modo tale
da coprire uniformemente tutte le regioni del genoma; diversamente si faranno marcatori multilocus
casuali, o comunque non mappati in misura tale da avere, probabilisticamente, una buona copertura.
Questa è il risultato di un analisi QTL, sono
disegnati 2 cromosomi di pomodoro e le
stanghette di lato sono le regioni in cui sono
stati trovati QTL con il peso della bacca o
con la forma della bacca. Parliamo di prima
del 2000. Con un’analisi così si può capire
quanti sono più o meno i loci che
controllano un carattere quantitativo, quali
hanno un effetto maggiore, dove stanno e
quali sono gli alleli del marcatore associati a
un allele del gene importante che aumenta
o che diminuisce il carattere → puoi fare
selezione assistita su ogni singolo locus del
carattere poligenico.

Questo ha permesso di sviluppare il concetto di selezione assistita basata sui QTL e quindi sui diversi loci del
genoma, mettendo in pratica quello che è stato definito BREEDING BY DESIGN, cioè si conoscono i diversi loci
importanti e su 6 individui ciascuno porta alleli plus per un locus e si possono mettere insieme e arrivare ad
un individuo che riassume tutti gli alleli plus.

Conoscere la posizione, l’effetto e marcatori associati a QTL importanti consente oggi di fare MAS su QTL
per migliorare caratteri quantitativi – cosa non possibile prima – ed arrivare al concetto di «breeding by
design» ossia alla possibilità di selezionare con le analisi molecolari gli alleli favorevoli in tutti i loci
importanti per un certo carattere e magari anche per più caratteri contemporaneamente. Nell’esempio sei
linee diverse portano un allele favorevole (in rosso) ad un locus QTL diverso. Il breeding tradizionale non
può far altro che cercare di aumentare la frequenza degli alleli favolrevoli nei materiali selezionati; si potrà
ad esempio arrivare ad un individuo che raccolga 3 alleli favorevoli. Con la MAS su ciascun singolo QTL si
può invece riunire in un solo individuo tutti e sei gli alleli desiderati con uno schema di selezione
relativamente semplice.

Questa applicazione sarà uno dei punti di forza del miglioramento genetico delle piante (ma anche degli
animali) nel prossimo futuro.

Questo concetto oggi si estende ancora oltre perché diventa relativamente facile e fattibile analizzare diversi
individui di una popolazione segregante per tanti marcatori e questo consente non di andare a vedere un
marcatore singolo o una decina di posizioni (mas e breeding by desing) ma arrivare a centinaia di loci che ci
mostrano un certo fenotipo. Quindi sappiamo che selezioniamo la pianta con la situazione genetica più vicina
possibile al modello stabilito in precedente e quando lo applchiamo possiamo con un’analisi basata su
centinaia di marcatori capire qual è il genotipo più rispondente al modello e quindi il fenotipo a cui arrivare.
Viene chiamata selezione genomica e costituisce la frontiera nelle tecnologie avanzate.

Genomic Selection

Le strategie di MAS descritte sinora richiedono l’identificazione di marcatori associati a caratteri di


interesse. Ciò rappresenta una delle debolezze degli approcci di MAS tradizionali. Tuttavia la MAS può
anche essere applicata evitando questo passaggio, usando un approccio conosciuto come selezione
genomica (o genome-wide) (Fig. 1). Il metodo è stato decritto per la prima volta nel 2001, come un
tentativo di sfruttare le informazioni generale dalle emergenti tecnologie di genotyping ad alta efficienza.
La selezione genomica si basa sulla stima simultanea degli effetti sul fenotipo di tutti i loci marcatori
disponibili. La differenza con altri metodi di MAS sta nel fatto che non viene stabilita alcuna scelta a priori
di quali marcatori abbiano effetto sul fenotipo. La slide mostra uno sche di selezione genomica dove
l’informazione su fenotipo e genotipo rilevati in una popolazione di riferimento permette di stimare i
parametri del modello. Il modello «spiega» il fenotipo sulla base di tutti i marker disponibili. Il modello
predice il fenotipo di piante in popolazioni in selezione (su cui si sta effettuando uno schema di
miglioramento genetico) sulla base dei loro valori genotipici. Questo è il cosiddetto “valore di breeding
stimato a livello genomico (genomic estimated breeding value, GEBV), e viene usato per selezionare gli
individui con i fenotipi desiderati.

MIGLIORAMENTO GENETICO DI SPECIE PREVALENTEMENTE ALLOGAME:

sempre tenendo in considerazione che questa suddivisione tra mg x autogame e allogame è abbastanza
didattica e questi metodi spesso si
interscambiano.

Nel miglioramento x le allogame si può fissare


un allele solo tramite riproduzione asessuata
quindi riproduzione vegetativa o apomissia.
Esiste un’altra opportunità ed è quella di creare
ibridi F1 partendo la linee omozigoti (line
inbred) e possono essere ottenute in molte
specie ma non in tutte perché in alcune specie
l’autofecondazione comporta problemi che non
consentono di raggiungere un elevato livello di
omozigosi.

Bisogna pensare quindi alla produzione di


popolazioni in equilibrio, cioè pop caratterizzate
da frequenze alleliche e geniche definite.

Nel lavoro di selezione delle allogame bisogna


tener conto di 2 fenomeni genetici che
vengono messi in evidenza durante l’attività
di mg:

- Inbreeding: nelle specie allogame


quando si adopera un sistema di
unione che porta all’aumento di
omozigosi si ha un calo di vigore della
pianta nella progenie (depressione da inbreeding). Questo è dovuto al fatto che nelle allogame
permangono alleli recessivi deleteri, questo fenomeno si indica col nome di carica genetica. Inoltre il
risultato sarà una popolazione piccola perché gli individui che si incrocia sono pochi ed è facile che
siano imparentati tra loro. Si chiama LINEA INBRED una linea molto omozigote ottenuta per
autofecondazione forzata di una pianta prevalentemente allogama. Gli effetti e la possibilità di
eseguire autofecondazione forzata dipende dalle specie: in mais per esempio è possibile ma in altre
specie non si riesce ad andare oltre 2-3 generazioni di autofecondazione, per esempio l’erba medica.
- Eterosi: è un fenomeno opposto a quello della depressione da inbreeding ed è quel fenomeno x cui
quando si incrociano 2 individui differenti ne deriva un ibrido con elevata vigoria. Questo è vero
quando si incrociano 2 eterozigoti ma è ancora meglio se si incrociano 2 individui che vedo da
inbreeding quindi 2 linee inbred, spesso la loro progenie presenta un elevato vigore eterotico. Il
motivo genetico dell’eterosi è spiegato con diverse teorie. La teoria della dominanza postula che se
nelle 2 inbred ci sono dei loci che hanno raggiunto l’omozigosi per alleli diversi avremo un ibrido con
un allele dominante in tutti e 5 i loci. Se questo allele dominante fosse portatore in un vigore
maggiore del recessivo allora l’ibrido sicuramente sarebbe più vigoroso dei parentali. Secondo questa
teoria però dovrebbe essere possibile ottenere una linea con tutti gli alleli dominanti favorevoli ma
fissa quindi omozigote ma questo non succede perché i geni coinvolti nel vigore ibrido sono tanti e
non si riescono a portare tutti in omozigosi per la presenza di loci e alleli sfavorevoli. È impensabile
nelle allogame avere una inbred che fissi il vigore. Una parte della spiegazione dell’eterosi è dovuta
a motivazioni di sovradominanza: in alcuni casi il fenotipo della pianta eterozigote è comunque
maggiore di quello di entrambi gli omozigoti. Un esempio è: mettiamo che in un locus ci siano due
alleli che codificano per due forme diverse di un enzima: un enzima migliore ad alte temperature e
uno a temperature basse. Ma l’individuo che le porta entrambe ha un’attività elevata in qualsiasi
condizione.

Possiamo distinguere i metodi per le piante allogame


in metodi basati su selezione fenotipica e selezione
genotipica. La fenotipica si basa sull’espressione del
carattere sull’individuo, quella genotipica invece si
basa sulle prove di progenie cioè la selezione di un
individuo viene definita sul valore della progenie. La
selezione è un po’ come dire che giudichiamo i padri
dal fenotipo dei figli.

La selezione fenotipica è adatta per caratteri


qualitativi oppure per quantitativi ad alta
ereditabilità e quindi forte componente additiva.

La selezione genotipica è idonea quando il carattere da selezionare presente ereditabilità con un basso livello.

In questa slide sono riassunti alcuni schemi di selezione basati su queste due modalità.
Selezione tra ecotipi e varietà locali: metodo su selezione fenotipica. Avendo a disposizione un certo numero
di ecotipi questi vengono valutati in uno schema spermentale e dalle osservazioni fenotipiche si sceglie
l’ecotipo più idoneo a quella zona di coltivazione o a quelle saggiate contemporaneamente. Se questi ecotipi
sono già adattati all’areale in cui si seleziona possono essere selezionati direttamente. Se parliamo di
prendere ecotipi da un areale e portarli in uno nuovo bisogna fare la valutazione in un tempo più ampio di
un anno anche per consentire agli ecotipi di adattarsi al nuovo ambiente. Gli ecotipi sono delle popolazioni
plastiche geneticamente e dopo alcune generazioni si adattano a eventuali nuove condizioni di coltivazione.
Quando parliamo di specie allogame bisogna sempre tener conto del loro isolamento spaziale se vogliamo
raccogliere il seme, a causa della possibilità di inter incrocio.

Selezione massale (o per via


materna): avendo scelto una
popolazione di partenza questa
viene allevata per piante
spaziate in modo tale da poter
agire su pianta singola, il seme
che viene raccolto serve per dare
origine a nuove varietà. La
selezione è puramente
fenotipica ma la cosa importante
è che se il seme viene raccolto
sulle singole piante allora sarà
stato prodotto anche da polline
che proveniva da piante non
selezionate. Viene detta “per via
materna” perché si può
controllare solo la pianta
portaseme da cui deriva il
gamete femminile. è una
selezione utile x caratteri ad alta ereditabilità e per selezionare varietà con un’ampia base genetica adatte a
situazioni di coltivazione non intensiva.
Selezione fenotipica ( o massale per via materna e
paterna): si opera come la selezione per via massale ma si
vuole portare nella costituzione della nuova varietà anche
il contributo pollinico unicamente delle piante
selezionate. Questo può essere fatto in 2 modi: la fase di
semina spaziata e di selezione avviene su base fenotipica,
poi le piante devono essere selezionate prima della
fioritura e o si eliminano quelle non selezionate oppure si
tolgono le piante selezionate e si spostano e si portano in
un campo isolato di polincrocio che avviene solo tra
piante oggetto della selezione. Il seme quini costituisce il
seme della nuova varietà con tutti i pro e i contro che
abbiamo selezionato prima ma l’efficienza della seleziona
sarà più elevata.

Selezione ricorrente semplice (o fenotipica ricorrente): quando si parla di specie allogame, sia che si parli di
selezione fenotipica che genotipica,
sono usati spesso gli schemi di
selezione ricorrente. Sono schemi
ciclici in cui la selezione avviene in
modo ciclico in un processo
indefinito in cui a determinati punti
il breeder può sempre estrapolare
materiali utili per la selezione
varietale.

Il più semplice è per la selezione


ricorrente semplice. Funziona che
come nella selezione massale per
via materna e paterna si effettua
selezione da una popolazione di
partenza e le piante selezionate
vengono interincrociate per
costituire una nuova popolazione
su cui verrà effettuato un nuovo
ciclo di selezione. È come se fosse
una selezione fenotipica per via materna e paterna ma fatta in modo ciclico. Qui vediamo tre cicli ma se ne
possono fare anche molti altri. Ogni tanto si possono inserire nuove forme di variabilità. La cosa importante
è che in uno schema di selezione ricorrnte, ad ogni step il breeder deve estrapolare alcuni materiali che siano
adatti ad originare una nuova varietà. Si ipotizza che nelle 100 piante selezionate, le 10-15 migliori vengono
clonate e interincrrociate per dare origine ad una nuova varietà. Qui è riportato anche il reincrocio di
allogame che concettualmente si esplica come per le autogame, con la differenza che nelle autogame è
sufficiente portare avanti pochi individui, nelle allogame un programma di reincrocio deve usare molti
genotipi per evitare la deriva genica.
Selezione genotipica: questi si fondano sul
concetto per cui il fenotipo di un individuo
viene valutato in base alla valutazione della
progenie di questo individuo. Con questo
concetto si definisce la base della selezione che
permette di valutare l’attitudine alla
combinazione (capacità di un genotipo di dare
una certa progenie quando viene incrociato
con determinati parentali). Quando si vuole
valutare l’attitudine di un genotipo a dare una
certa progenie qualunque sia il genotipo con
cui viene incrociato, si parla di valutazione
dell’attitudine generale alla combinazione
(AGC). Quandi si valuta la performance di un
individuo in una combinazione specifica, allora
si parla di attitudine specifica alla
combinazione (ASC). Questo concetto è
rappresentato in modo semplice nella tabella nella slide in cui 4 linee di una specie vengono incrociate con
altre 4 linee in tutte le combinazioni, e la valutazione generale è data dalla valutazione dei comportamenti
medi. In questo caso le linee migliori per la AGC sono la 3 (15) e la A (14). Viceversa quando parliamo di ASC
ci riferiamo alla performance di un incrocio specifico, in questo caso il migliore è Ax3. In questo esempio ASC
è data dall’incrocio delle 2 linee che hanno anche AGC più elevata ma non è sempre così.

Prove di progenie: quindi la selezione genotipica si effettua tramite le prove di progenie. Possiamo avere
diversi tipi di prove di progenie a seconda dell’obiettivo da perseguire.

- Prove di progenie da autofecondazione: i genotipi da valutare si autofecondano e può essere utile


per costituire linee inbred che però devono fungere da porta seme e quindi bisogna selezionarle non
solo per i caratteri selezionati ma devono anche avere vigoria e produzione di seme;
- Progenie liberamente impollinate: valutazioni delle piante madri che si ottengono valutando la
progenie ottenuta per libera impollinazione. Le piante madri sono distanziate per rendere possibile
la raccolta di seme. Poi il seme va disposto in parcelle e la valutazione delle parcelle ci da la possibilità
di valutare il genitore che le ha prodotte. Non si controlla il genitore pollinico e questa valutazione
tiene conto dell’attitudine generale alla combinazione;
- Progenie liena x varietà (top cross): si controlla il genitore pollinico. Le piante da selezionare vengono
emasculate e impollinate unicamente da un individuo che funge da tester. In questo caso sulle piante
impollinate viene raccolto il teme e viene valutato in parcelle. Ciò che si valuta dipende da qual è il
tester. Se il tester è una popolazione con una base genetica larga, valuteremo l’attitudine alla
combinazione. Se il tester è una popolazione con base genetica stretta (linea inbred o clone) la prova
valuta l’attitudine specifica con quel genotipo.
- Progenie da policrocio (polycross): controlli sia la madre che il padre. Le piante che si vogliono testare
si clonano e si portano in un campo isolato così il polline che le impollinerà deriverà solo da individui
selezionati. Il clonaggio serve per avere + individui. Dall’individuo selezionato e impollinato nel
campo isolato si raccoglie il seme e si alleva a parcella e sulla base del fenotipo delle parcelle sono
selezionati gli individui parentali. Stima l’attitudine generale alla combinazione.

- Progenie da incrocio semplice (single cross): ciascun individuo da selezionare viene incrociato con un
individuo specifico e quindi la casistica in cui abbiamo linee selezionate e vogliamo indidivuare la
combinazione di incrocio migliore possibile. Su 5 linee per esempio fai tutti gli incroci possibili e senza
atuofecondazione. Si chiama anche incrocio di allelico, cioè incrocio senza autofecondazione e senza
reciproci (oltre a x b non c’è b x a). così si valuta l’incrocio migliore. È sempre bene operare in una
progressione a collo di bottiglia quindi si cerca di selezionare prima con delle stime di attitudine
generali gli individui migliori per poi arrivare all’incrocio semplice
Gli schemi per la costituzione di varietà sintetiche e ibridi F1 adottano le prove di progenie per effettuare la
selezione degli individui da utilizzare nella selezione varietale. Utile nel caso di ereditabilità non elevata e
controllo poligenico. Le varietà sintetiche sono popolazioni in equilibrio che si ottengono dall’interincrocio di
un numero limitato di genotipi selezionati per avere un’elevate attitudine generale alla combinazione. E sono
il tipo varietale più sofisticato che si possa ottenere laddove non si possono ottenere sementi ibride. La
varietà sintetica si ottiene effettuando una prova di progenie di polycross. Quindi partendo da una
popolazione di partenza, poi semina spaziata e selezione degli individui che vogliamo sottoporre a prova di
progenie. Vengono portate in un campo isolato in modo tale che i gameti maschili e femminili siano
controllati. Ovviamente avviene la clonazione perché gli individui devono essere rappresentati più volte per
evitare le influenze ambientali e quindi avere falso positivo o negativo.

Il seme prodotto da ciascun genotipo nel campo di polycross si raccoglie e si fa con tutti i genotipi saggiati e
si fa una prova di progenie (semina su parcelle). Gli individui che in questa prova di progenie daranno il
risultato migliore con la più alta AGC vengono usati come parentali di una nuova varietà che si ottiene per
interincrocio di questi parentali e viene chiamata varietà sintetica. Gli individui parentali vengono denominati
anche Syn=0 che produce il seme Syn=1 cioè il seme del costitutore. Dal seme del costitutore come in tutte
le filiere di produzione del seme viene prodotto il seme di base Syn=2, da cui viene prodotto il seme
commerciale di prima riproduzione syn=3 da cui viene prodotto per libera impollinazione il seme di seconda
riproduzione Syn=4. Non è consentito andare oltre la syn=4 perché si andrebbe incontro ad ecotipizzazione
della popolazione. Ecco perché la produzione del seme in una sintetica deve sempre partire in modo ciclico
dalla Syn=0.

STUDIA I METODI DI SELEZIONE RIDISEGNANDO GLI SCHEMI

Costituzione di ibridi F1:

è un approccio che ha avuto un enorme successo ed oggi è in auge sia nel campo delle allogame che delle
autogame. Il motivo di questo successo è dovuto a una serie di fattori:

1) Sfruttamento dell’eterosi: popolazioni che manifestano un elevato vigore che si trasmette in una
potenzialità produttiva più elevata e in una tipologia varietale più desiderabile.
2) Uniformità elevata: Se si usano parentali omozigoti, l’ibrido ha un’elevata omogeneità! Anche se per
le allogame è difficile anche se usi linee inbred. Comunque l’ibrido deve essere selezionato perché ci
sia uniformità ma questa non è così elevata nel caso delle allogame.
3) Protezione della tecnologia: l’ibrido f1 consente il copyright sulla tecnologia con cui è stato ottenuto.
Questo perché se usi il seme dell’ibrido F1 segrega quindi non te lo porti avanti da solo. Se l’ibrido di
per sé è protetto il costitutore deve occuparsi di proteggere le linee parentali, e il copyright dei
parentali è un bel problema. Recentemente si è verificato il problema del “taleaggio”, cioè dei gruppi
acquistano poca semente ibrida e la propagano per taleaggio (in modo illecito).

Chiaro che l’utilizzo di una varietà F1 ha senso se questo ibrido può essere moltiplicato in modo economico:
o in modo vegetativo o dall’incrocio di due parentali.

L’ibrido semplice è un ibrido a 2 vie: un parentale portaseme A x un impollinante B = seme


AxB e il seme viene raccolto solo su A (deve essere emasculata). In questo caso la
produzione dell’ibrido richiede 3 campi al produttore di seme (2 x moltiplicare i parentali
e 1 x incrocio e produzione di seme). Nel mais ci si è confrontati subito con una
problematica. La linea A portaseme è inbred può essere poco vigorosa e poco produttiva
→ poco seme → costo elevato del seme.

L’ibrido doppio o a 4 vie: le linee parentali sono 4: 2 portaseme per costituire un ibrido
semplice e vengono impollinate da B e D. i due ibridi semplici AB e CD vengono fatti
incrociare e si ottiene l’ibrido a 4 vie. Il produttore di seme è un ibrido semplice, non
una linea inbred, ma l’uniformità dell’ibrido viene inficiata ed è per questo che il valore
eterotico è più basso di un ibrido semplice ma il costo è più alto. Sono necessari 7
campi: 4 x i parentali, 2 x produrre ibridi semplici, 1 x ibrido finale.

Una soluzione è l’ibrido a 3 vie: si costituisce un ibrido semplice AxB come portaseme e viene
incrociato con una linea inbred C. i campi sono 5 e il risultato in termini economici e produttivi
è intermedio tra quelli prima.

L’ibrido semplice modificato o “ibrido per sister lines” si colloca in posizione


intermedia tra ibrido doppio e semplice come vantaggi e svantaggi. Le linee che
danno origine agli ibridi semplici sono due linee imparentate tra di loro, cioè sono
simili ma non uguali → otteniamo ibridi semplici con vigore ibrido ma in quantità
limitata. La massima estrinsecazione del valore ibrido si avrà nell’ibrido doppio. Lo
schema è quello di un ibrido doppio e servono sempre 7 campi ma le linee sono
imparentate a coppia

La procedura per l’ottenimento di varietà ibride: (una delle parti più importanti)
Quando dobbiamo costituire un ibrido vogliamo selezionare 2 linee parentali con alta attitudine specifica alla
combinazione (ASC), nel campo delle allogame il
materiale di partenza sarà eterozigote. La fase più
importante sarà la costituzione delle inbred, che
viene fatta con autofecondazione e prove di
progenie e poi bisogna inserire tutti i caratteri
necessari (per esempio caratteri di resistenza).
Durante la costituzione delle inbred, oltre alla
progenie e all’autofecondazione, bisogna valutare
l’attitudine alla combinazione e prendere quelle alta
con progenie di tipo topcross o polycross o single
cross. Poi bisogna tenere conto che il porta seme
deve essere emasculata e il polline deve essere
trasferito dal maschio alla femmina.
L’emasculazione può essere meccanica, chimica, fisica o genetica.

Uno schema molto articolato ed efficiente per la selezione di inbred con ASC elevata va sotto il nome di
“selezione ricorrente reciproca”: si chiama così perché è uno schema di selezione ricorrente dove a ogni ciclo
si usa una popolazione per fare da tester alla popolazione “cugina” (?) quindi si fa una stima dell’attitudine
generale alla combinazione. Le due popolazioni quindi diventano un serbatoio di linee, di genotipi e di linee
inbred che potenzialmente presentano un’aumentata attitudine alla combinazione verso la popolazione
opposta. Nello schema vedete la popolazione A che viene selezionata fenotipiamente e vengono scelte 300
piante, vengono autofecondate per avere 300 lotti di seme e il polline di queste 300 piante serve per
impollinare la popolazione B così da avere 300 lotti di seme di incrocio BxA. Contemporaneamente in B si fa
la stessa cosa, 300 autofecondate, lottizzate e incociate AxB. Poi ci saranno i test di progenie sugli incroci e
sulla base dei risultati (selezione genotipica) si scelgono un 10% di A e di B che si fanno interincrociare in
modo da avere una popolazione da interincrocio che può essere inserita in un altro momento dello schema
ricorrente. Procedendo così si incrementa l’omozigosi e l’attitudine generale alla combinazione ma sempre
con riferimento alle linee dell’altra popolazione.
Questa slide riassume quello che abbiamo detto
prima. Ricordando che si può fare una selezione
fenotipica per eliminare le linee peggiori o per
selezionare i caratteri più facili, ma sicuramente
si deve ricorrere alle prove di progenie per
selezionare linee con una buona AGC e poi
capire qual è la possibilità di incrocio più valida.

Se il numero di ibridi semplici che si possono


ottenere con un numero x di linee sono molto
elevati, 45 con 10 linee! ( n x n-1 /2). Gli ibridi
doppi che si possono ottene sono molti molti di
più, con 10 linee si possono effettuare 630 ibridi
doppi. Ecco perché si usa una previsione su base
genetica tra le linee. La produzione di ibrido
doppio può essere stmata con la media degli
ibridi semplici non parentali.

Qui abbiamo fatto un esempio con 10 linee. Se ne avessimo 4 e volessimo fare un di-allelico avremmo 6
ibridi semplici e 3 ibridi doppi. Con 20 linee sarebbero 120 semplici e 14535 doppi → numeri impossibili per
qualsiasi ditta sementiera.

La produttività di un ibrido doppio può essere stimata con la media degli ibridi semplici non parentali.

Cerchiamo di dare una spiegazione a queste relazione evidenziata in maniera empirica. Pensiamo a due
coppie di linee sorelle selezionate con la selezione ricorrente reciproca. Da A abbiamo estrapolato A e A’ e
da B abbiamo B e B’. sono possibili 6 combinazioni di ibridi semplici e 3 di doppi. Le 6 di semplici saranno
tutte tranne 2 ottenute dall’incrocio di linee di popolazioni diverse (tranne AxA’ e BxB’ che saranno meno
produttivi). L’ibrido doppio più produttivo sulla carta? Dato che l’eterosi si manifesta tanto + i parentali sono
diversi, allora l’ibrido migliore è quello di parentali + diversi. Quindi l’ibrido doppio più produttivo sarà quello
ottenuto dagli ibridi semplici che incrociano linee della spessa popolazione.

È ovvio come in tutte le costituzioni varietali che il breeder non effettua e non sceglie una sola combinazione
ibrida ma ne seleziona un certo numero e sarà solo la fase di screening a dire quale si adatta meglio all’areale
di coltivazione. (screening significa mettere a confronto le varietà in sperimentazione in ambienta reali di
coltivazione, in più anni e in più condizioni e magari anche a confronto con le migliori varietà in commercio).

La produzione di seme ibrido è complessa perché è necessaria l’emasculazione della pianta porta seme e che
il piante dell’impollinante sia portato sul portaseme. L’emasculazione e l’impollinazione può essere fatta
anche con mezzi manuali, per esempio in pomodoro si sceglie un fiore non ancora aperto, si elimina il cono
delle antere e i petali. Una volta il pistillo si porta il polline dalla pianta impollinante sullo stigma. Ovviamente
a livello di incrocio commerciale non è possibile per tutte le specie. Nel pomodoro ancora si fa manualmente
perché con una sola impollinazione si ottiene un numero di semi elevato e il costo singolo del seme è elevato.
Inoltre le ditte sementiere si rivolgono a paesi dove la manodopera costa poco per fare questo lavoro.
L’uso della sterilità genetica negli schemi di
produzione di seme ibrido:

si distinguono 3 sistemi di maschio sterilità


(genetica, citoplasmatica e genetico-
citoplasmatica). Bisogna tenere a mente 3
problematiche distinte:

1) Uso di un tipo di maschiosterilità nello schema di produzione del seme


2) Mantenimento della linea maschiosterile: deve essere moltiplicata ma ovviamente non può farlo per
autofecondazione
3) Trasferimento della maschiosterilità nella linea porta seme

La maschiosterilità genetica è data da mutazioni di geni nucleari che agiscono allo stato recessivo. Quando
abbiamo un portaseme maschiosterile e utilizzando come impollinante un omozigote dominante avremo un
ibrido 100% maschio fertile perché porterà l’eterozigosi al locus della maschiosterilità. Questo rende l’uso
molto semplice ed efficiente. Se l’ibrido F1 venisse autofecondato ci sarebbe anche segregazione mendeliana
di questo carattere. Il problema è il mantenimento della linea porta seme che non potendosi autofecondare
difficile da propagare. Il trasferimento di una fonte di maschiosterilità a un portaseme ricevente (mutazione
recessiva) è uno schema di incrocio che può prevedere il reincrocio per recuperare un allele recessivo. L’unica
differenza è che il genitore donatore di solito si usa come maschio ma trattandosi di un maschiosterile
dobbiamo usarlo come femmina e portarci dietro il citoplasma della donatrice. Trattandosi di un incrocio di
un recessivo sono utili tutte quelle tecniche come la MAS.

Il problema fondamentale per l’uso della maschiosterilità genetica è quello di moltiplicare la linea porta seme.

Una prima soluzione può essere la propagazione vegetativa in vivo o in vitro e va bene per tutti quei casi in
cui non servono tante piante e dove non ci sono alternative. Il sistema più classico è incrociare un individuo
della linea portaseme con dei maschio fertili e quasi isogenici alla linea stessa, così si riesce ad avere una
segregazione e un 50% di progenie maschio sterile. I maschio fertili vengono eliminati o in fioritura per vedere
il fenotipo fiorale oppure precocemente se c’è un marcatore morfologico o molecolare che ci può indicare
quali siano fertili e quali sterili. Gli individui con cui si effettuano gli incroci dei maschiosterili devono essere
quasi isogenici per evitare cambiamenti. Si possono anche usare mutazioni condizionali: in certe condizioni
ambientali permettano un recupero parziale della maschio fertilità e consentano l’autofecondazione alla
linea maschio sterile.

Un esempio di marcatore genetico usato in passato per selezionare le piantine maschio sterili in girasole e
praticamente esisteva vicino al locus della maschio sterilità (circa 1 cM) un locus per le antocianine. Se erano
assenti le antocianine nell’ipocotile allora era maschiosterile, se invece vedevi il rossiccio allora era fertile. È
un carattere espresso precocemente sulla pianta veniva usato per eliminare i maschiofertili nel portaseme.
Poi si è scoperta la maschiosterilità genetico-citoplasmatica in girasole.

L’uso di fonti di maschio sterilità condizionale (EGMS) nella semente ibrida: la condizionalità permette alla
linea portaseme di essere autofecondata e di essere riprodotta efficacemente. L’importante è che ci siano
delle distinzioni ben precise tra le condizioni permissive e quelle restrittive (cioè devi sapere in quali
condizioni è fertile e in quale è sterile → un po per evitare l’inquinamento del seme ibrido e poi
determinerebbe l’uscita dei genotipi della linea parentale ed è quanto di più prezioso la ditta sementiera
abbia). La condizionalità può dipendere da temperatura, fotoperiodo, fertilità del suolo e intensità della luce.

Questa analisi riprende dal lavoro che vedete riportato. Come sono stati studiati nei diversi mesi dell’anno 3
fonti di maschio sterilità e in due annate diverse ed è stato visto come le linee presentassero caratteristiche
di fertilità e di sterilità in determinate stagioni dell’anno.
Se vuoi approfondire a slide 18 del pacchetto 14-2 consiglia di scaricare un manuale.

Mutante di pomodoro 7B-1: sembra che la restrittività sia dovuta al fotoperiodo. In fotoperiodo lungo c’è
maschiosterilità mentre in corto si recupera la fertilità. Nel fiore 7B-1 sono è stato eliminato il perianzio. Le
antere risultano molto corte. È interessante perché le antere oltre a non avere polline però rimane lo stigma
molto visibile quindi questi fiori possono essere impollinati senza togliere le antere. In condizioni di giorno
corto lo stigma rimane inserto e le antere contengono un po di polline anche se non è proprio come un fiore
totalmente fertile tantè che se lo vuoi impollinare devi dargli un aiuto con gli insetti pronubi o scuotendo il
fiore.

Anche in campo qui a viterbo abbiamo fatto una tesi su FB-1. Si vede che si ottengono un pochino di semi
tramite l’agitazione e anche in impollinazione normale però sul giorno corto. Quindi la condizionalità di 7B-1
anche nel nostro ambiente ha una sua validità.

La maschiosterilità citoplasmatica:

i problemi relativi alla propagazione relativi alla maschiosterilità genetica vengono superati con l’uso di
mutazioni di maschiosterilità citoplasmatiche. Sono state ritrovate mutazioni non a carico di geni nucleari ma
di organelli contenuti nel citoplasma. L’eredità di questi organelli è di tipo materno. Se usiamo una fonte di
maschiosterilità citoplasmatica per l’uso di seme ibrido possiamo usare lo schema che vedete. Quindi un
portaseme maschio sterile e un impollinante con alta ASC che funge da impollinatore. Gli individui che
otteniamo ereditano il citoplasma materno quindi saranno al 100% maschio sterili. Questo è inutile quando
il prodotto commerciale è il frutto ma funziona quando il prodotto è dello sviluppo dello vegetativo come un
fittone (carota) o foglia x gli ortaggi da foglia. Quindi l’uso della maschiosterilità citplasmatica ha
mantenimento e trasferimento + facile

5.2. Maschiosterilità citoplasmatica

Un secondo tipo di maschiosterilità è legato a fattori


citoplasmatici. In questo caso sono maschiosterili le
piante che possiedono un particolare citoplasma. Questo
tipo di maschiosterilità è stato utilizzato per la prima
volta per produrre seme ibrido in cipolla. Quando si
origina spontaneamente per mutazione, come in cipolla,
la maschiosterilità citoplasmatica viene detta
autoplasmica. Si definisce invece alloplasmica quando è
dovuta alla presenza di un citoplasma di una specie
diversa (es. Fig. 21bis). Tali piante possono produrre
seme solo in presenza di piante impollinatrici. Il seme dà solo piante maschiosterili perché il citoplasma
viene fornito interamente dalla pianta madre (Fig. 21b).

Il mantenimento di una linea maschiosterile citoplasmatica viene


fatto incrociando con una maschio fertile quasi isogenica (viene
definita manteiner). Questo incrocio da tutti maschiosterili. Il
mantenimento e la moltiplicazione è estremamente semplice.
Ultimo dei problemi quando dobbiamo trasferire una fonte di
maschiosterilità citoplasmatica da un donatore a una linea
ricevente fertile ma che vogliamo far diventare maschio sterile
dobbiamo fare un reincrocio perché il carattere viene
immediatamente trasferito dal primo incrocio (incrocio femmina
+ linea che deve ricevere sterilità = già in F1 ho la sterilità). Il genoma di questo incrocio conterrà per il 50%
il genoma del donatore e si recupera incrociando sempre con la linea del ricevente.

Questo è un esempio che mostra come si può


usare una fonte di maschiosterilità citoplasmatica
per un ibrido a 4 vie. Nel primo incrocio semplice
e nell’esecuzone dell’incrocio tra i 2 ibridi semplici
non c’è bisogno di emasculare. Invece nel
secondo incrocio semplice a destra è necessario
emasculare. Anche qui però l’ibrido risulta sterile.

Quando si è iniziato ad usare le fonti di


maschiosterilità citoplasmatica ci si è accorti che
in alcuni casi esistevano dei loci per recuperare la
fertilità attraverso i “geni ristoratori” ma anche
per loro c’è polimorfismo quindi ci sono alleli
funzionali e alleli non funzionali. Ecco che se in
uno schema di maschiosterilità citoplasmatica
inseriamo i geni ristoratori parliamo di
maschiosterilità genetico-citoplasmatica.
Consente di usare un maschiosterile senza geni
ristoratori con un impollinante con geni
ristoratori avremo un ibrido 100% maschiosterile
di citoplasma ma fertile grazie al locus della
ristoriazione. L’esempio sotto sono altri casi ma non sono casi che si rifanno alla pratica. Viene rappresentato
l’impollinante eterozigote e quindi ci sarebbe segregazione per l’allele ristoratore ma avere un impollinante
eterozigote non è molto comune.

5.3. Maschiosterilità genetico-citoplasmatica

Il terzo tipo di maschiosterilità differisce dal secondo solo perché le progenie delle piante maschiosterili
citoplasmatiche non sono necessariamente maschiosterili, ma possono risultare fertili quando vengano
usati particolari impollinatori. I genitori maschili capaci di dare progenie maschiofertili sono dotati di geni
che permettono la produzione di polline fertile su piante con citoplasma maschiosterile. La maschiosterilità
citoplasmatica viene pertanto convertita in maschiosterilità genetico-citoplasmatica con la scoperta di geni
ristoratori (R).

In presenza di citoplasma per la maschiosterilità il genotipo delle piante maschiosterili è rr mentre quello
delle piante con fertilità ristorata sarà RR o Rr. Le progenie di piante maschiosterili citoplasmatiche (rr),
possono essere di tipo differente a seconda degli alleli presenti al locus R del genitore maschile. Tale
genitore può avere costituzione genetica rr se possiede citoplasma normale (N) ma deve essere per forza
Rr o RR in presenza di citoplasma maschiosterile S.
nei libri sono riportati questi schemi più
complessi ma l’importante è che voi
capiate il meccanismo + semplice.

Questo schema è un ibrido doppio con l’uso


di una fonte di maschiosterilità
citoplasmatica e due linee che formano
l’ibrido semplice di destra sono fornite di
geni ristoratori. Questo incrocio semplice
deve essere emasculati ma gli altri no. Il
seme ibrido finale è maschiofertile.

In quest’altro schema è rappresentata una casistica in cui si riesce ad


eliminare completamente l’emasculazione meccanica usando due portaseme
con la maschiosterilità e due linee impollinanti con i geni ristoratori. L’utilizzo
dell’ibrido doppio è stato molto in auge in tempi passati ma anche nel mais
di fatto si predilige la costituzione di ibridi semplici, sia perché si riescono a
selezionare inbred abbastanza vigorose sia perché il costo del seme ripaga
anche la scarsa produttività dei portaseme.

USO DELLE FONTI G-CMS:

Questo è uno schema complessivo dell’utilizzo di una


fonte di maschiosterilità genetico-citoplasmatica. Vi
consiglio di studiare facendo schemi così: portaseme
al centro in questo caso A (sterile per citoplasma
sterile e assenza di geni ristoratori), a destra
l’impollinante. L’ibrido è fertile al 100%. Come si
mantiene? Con il manteiner, linea B (disegnare a
sinistra) che è QUASI ISOGENICA (imparatelo perché
ci tiene). Come si moltiplica il manteiner? Si
autofeconda. Come si moltiplica l’impollinante? Si
autofeconda.
L’ultimo problema è favorire il movimento del polline. Facile in specie allogame ma per le autogame può
essere difficile, si usano addirittura gli elicotteri per smuovere le piante.

Anche nel caso della maschiosterilità genetico citoplasmatica può essere utile usare fonti di maschiosterilità
condizionale per eliminare l’uso della linea manteiner e trasformare il sistema da un sistema a 3 linee a uno
a 2 linee.

Genetica molecolare della maschiosterilità: può essere utile la selezione assistita nel caso del trasferimento
della maschiosterilità. La MAS può essere molto utile per il trasferimento di alleli recessivi (maschiosterilità
genetica), per schemi di maschiosterilità condizionale e anche per il breeding dei geni ristoratori (a volte
vengono trasferiti da un impollinante all’altro), perché anche se sono dominanti il fenotipo si vede solo se è
capace quell’individuo di dare fertilità ad un maschiosterile citoplasmatico (richiederebbe tipo la prova di
progenie).

Oggi queste tecnologie si usano anche in specie molto più difficili come il carciofo. Il carciofo è una di quelle
specie in cui esiste maschiosterilità genetica e le piante portaseme vengono propagate in modo vegetativo e
dove si utilizzano dei portaseme e degli impollinanti che non sono proprio inbred ma abbastanza eterozigosi.

Anche nel radicchio è stato studiato e si sono usate sempre varietà liberamente impollinate ma da poco
tempo si riescono a fare varietà ibride. Alcuni hanno usato due cloni incompatibili e lasciando la libera
impollinazioni, altri hanno usato la maschiosterilità genetica e quindi utilizzando anche delle linee omozigoti
perché il radicchio anche se autoincompatibile si riesce ad autofecondare con i sistemi di pseudo self
compatibility. Nel radicchio uno degli obiettivi principali nella produzione di ibridi è l’uniformità molto
elevata.

Le varietà ibride di pomodoro sono quasi l’80% delle linee.

Le ultime due slide sui pomodori non le ho messe perché sono le 21 e 30 e sto morendo di fame.

PRODUZIONE SEME E LEGISLAZIONE SEMENTIERA

Quando hai costituito la varietà devi portarla in commercio e quindi seguire una serie di iter burocratici e poi
inizi la produzione di seme e commercializzazione. Di fatto fino a qualche decennio fa gli agricoltori si sono
sempre riprodotti il seme in autonomia, ma poi con le scoperte genetiche e tecnologiche si è capito che si
potevano costituire varietà migliorate seguendo gli schemi scientifici e dall’altra che si poteva avere un seme
tecnologicamente più avanzato anche in termini di germinabilità, sanità, purezza varietale e specifica…

La produzione del seme con il miglioramento genetico diventano una professione che non è più svolta
dall’agricoltore ma che svolgono dei professionisti esterni da cui si approvvigiona l’agricoltore. Il passaggio
dalla coltivazione di ecotipi che venivano propagati col seme prodotto in azienda alla varietà di seme
costituito da ditte specializzate viene definito “il fenomeno varietale”. È chiaro che col fenomeno varietale si
vuole incrementare produttività delle colture e performance della semente, ma in tutto questo gli ecotipi
vengono via via abbandonati e c’è tutto un problema di perdita di diversità genetica (biodiversità) e di
dipendenza dall’industria sementiera. Il fenomeno varietale in italia è avvenuto in tempi diversi per le varie
colture (frumento anni 20, mais anni 50, orzo 70, foraggere ancora atteso). Tutto questo è stato governato
dal prezzo del seme rispetto al prezzo del prodotto qualsiasi. Non tutte le colture hanno una differenza
uguale. Il seme di frumento costa il doppio del frumento da granella.
6.5. La produzione sementiera
e gli ambienti di produzione
del seme in Italia

L’individuazione di ambienti
idonei per la produzione
sementiera nel nostro paese è
più frutto di conoscenze
empiriche che non di precise
indagini sui microclimi ed
ambienti pedologici più
indicati per le diverse specie e, meglio ancora, per le diverse varietà. Non si deve poi dimenticare che
queste scelte sono fortemente condizionate da diversi importanti fattori: quelli relativi all’”ambiente”
umano, che deve operare con serietà, capacità tecnica, sensibilità, e scrupolosa precisione, e quelli relativi
al tipo di organizzazione e dimensione aziendale, che deve garantire coordinamento di esecuzione tecnica
e sufficiente isolamento delle colture. Si è venuta così a creare nel nostro paese una concentrazione delle
colture da seme, soprattutto di quelle orticole e bieticole, in zone particolari di determinate regioni, nelle
quali ad un periodo autunno-primaverile piovoso fa seguito un’estate asciutta e calda (es. zone litoranee,
pedecollinari e collinari delle Marche, Romagna e Campania). Tale concentrazione comporta però
frequenti inconvenienti circa il mantenimento di un alto grado di purezza genetica, per la difficoltà di
rispettare le distanze minime di isolamento delle colture, e di un elevato stato sanitario del seme per il
ripetersi troppo frequentemente delle stresse colture nei medesimi terreni.

Nelle figure 19-24 sono riportate alcune statistiche riguardanti il comparto sementiero italiano ed
indicazioni sulle principali zone di produzione del seme per alcune specie di importanza agraria in Italia.

Prima di parlare di elementi della legislazione


sementiera vi ricordo quali sono le tipologie
varietali più diffuse. Nell’ambito delle autogame
possiamo trovare ecotipi, linee pure, varietà
multilinee, ibridi F1 e cloni. Nelle allogame
abbiamo ecotipi, varietà sintetiche, ibridi F1 e
cloni. Nelle specie a propagazione vegetativa
troviamo ecotipi e cloni.

L’effetto del fenomeno varietale in ogni specie ha avuto una sua


evoluzione ed è stato un aspetto del tutto dinamico: le varietà che sono
state adottate all’inizio non sono rimasti gli stessi e si sono evoluti. Il
fenomeno varietale in pomodoro è iniziato verso la metà del 20 secolo e
nel 72 si aveva già un elenco di quasi 400 varietà e un 15% era ancora
costituito da ecotipi, il 72% erano varietà basate su linea pura e un 13%
sugli ibridi F1. Nel 2014 si annoverano 464 varietà di pomdoro (non
molte di più del 72) ma gli ecotipi si sono ridotti a meno del 5%, 10% varietà su linea pura e 85% di ibridi!
Se il fenomeno varietale è iniziato nel XX secolo, è evidente che si è sentita ben presto la necessità di avere
delle leggi che garantissero il sistema sementiero: bisognava inserire una tutela sulla purezza genetica. Alla
fine del 900 uscirono 3 leggi ad hoc. Sono leggi fondamentali che nonostante le molte modifiche rimangono
lo zoccolo della produzione di seme in italia. La legge quadro sulle sementi è la legge numero 1096 del 1971
“disciplina dell’attività sementiera” (ricordatela, è importante). Nel 1973 uscì il decreto di attuazione, quindi
si sono date delle specifiche tecniche. Nel 1976 uscì un’altra legge (195) importante perché si occupa in
particolare delle colture ortive.

Alcuni degli articoli fondamentali dei principi su cui si basa la legge 1096. Nell’articolo 1 viene definito
l’ambito di cui si occupa, escludendo forestali e piante officinali. All’articolo 6 distingue le sementi per colture
da pieno campo, ortive ornamentali e da fiore, arboree e arbustive, i materiali di moltiplicazione come i tuberi
etc, e la commercializzazione dei miscugli.

L’articolo 7 definisce le categorie delle sementi:


quelle di base che derivano dal seme del
costitutore, quelle di 2 categoria e poi quelle di 3
che sono quelle commerciali.

Le sementi di base vengono usate per produrre


le sementi di 2 categoria che vengono certificate
e quelle di 3 vengono dette commerciali.

L’articolo 9 definisce il costitutore e il 10 la


possibilità di vendere miscugli solo per foraggere
che per tappeti erbosi.

L’articolo 12 definisce che le sementi di prima e


seconda categoria possono essere
commercializzate solo di varietà iscritte al
registro.

10.1. Iscrizione al Registro e protezione delle novità vegetali.

Il commercio di una varietà comporta in via preliminare la sua iscrizione al Registro Nazionale delle varietà
vegetali. L'iscrizione al Registro Nazionale delle varietà viene promossa dal costitutore. La pratica inizia con
una domanda di iscrizione in carta legale da inoltrare al Ministero dell'Agricoltura e delle Foreste, Direzione
Generale della Produzione Agricola, Servizio Registri delle varietà, Roma, insieme con una scheda
descrittiva e l'indicazione dei caratteri peculiari della varietà. Contemporaneamente, va spedito anche un
certo quantitativo di semi o di piante, diverso da specie a specie, che servirà per l'accertamento dei
requisiti richiesti per l'iscrizione. Le prove di accertamento sono effettuate dallo stesso Ministero presso i
suoi Istituti Sperimentali; le spese per l'effettuazione di queste prove verranno pagate da colui che chiede
l'iscrizione, mediante versamento di una quota in denaro variabile con la specie. Le prove ufficiali durano
in genere due o tre anni al termine dei quali le varietà, che si sono dimostrate conformi ai requisiti richiesti,
verranno incluse nel Registro Nazionale. La decisione relativa all'iscrizione viene adottata da una speciale
Commissione, istituita presso il Ministero dell'Agricoltura e delle Foreste; questa Commissione deciderà,
in base ai risultati delle prove ufficiali, se la nuova varietà può entrare nel circuito commerciale. L'iscrizione
di nuove varietà, la conservazione o la cancellazione di varietà già iscritte sono pubblicate dal Ministero
dell'Agricoltura e delle Foreste sulla Gazzetta Ufficiale della Repubblica. Secondo le norme vigenti le nuove
costituzioni, per essere iscritte al Registro Nazionale delle Varietà, debbono possedere le caratteristiche
stabilite in sede C.E.E., U.P.O.V. e dalla legislazione italiana (Legge 25/11/71,n.1096 e dalla Legge 20/4/76
n.195). Queste caratteristiche sono: distinguibilità, stabilità, omogeneità e valore agronomico.
La legge è molto complessa e qui vi ho fatto una
sintesi estrema. Ad esempio l’articolo 14 demanda
molte specifiche genetiche e tecnologiche al
regolamento di esecuzione. Poi ci sono articoli che
parlano di importazione di sementi che vengono
dall’estero. Molto importante è l’articolo 19 che
istituisce i registri varietali e quindi queste liste
ottenute dal ministero nelle quali vengono iscritte
le varietà delle differenti specie agrarie. Definisce
anche i requisiti DUS (distinguibilità, uniformità e
stabilità) che servono per iscrivere una varietà al
registro.

Distinguibilità significa che la varietà deve essere


distinguibile dalle varietà già iscritte sulla base di
alcuni caratteri morfologici previsti come distintori tra quella specie.

Uniformità significa che la varietà deve essere uniforme. È un concetto relativo perché alcune tipologie
varietali come la linea pura sono costituite da un solo genotipo. Per ogni specie ovviamente c’è una soglia di
tolleranza di fuori tipo.

Per le popolazioni costituiti da genotipi diversi come gli ecotipi etc l’uniformità non è genetica ma morfologica
per alcuni caratteri.

La stabilità significa che la varietà deve essere stabile quando viene moltiplicata secondo le direttive date dal
costitutore. Una linea pura che mantiene un po’ di loci eterozigoti che segregano fenotipi strano non è stabile.
La stabilità per esempio in un ibrido F1 deve intendersi non come stabilità della semente commerciale stessa
(F1 segrega) ma deve intendersi che quando viene moltiplicato secondo i dettami del costitutore viene fuori
sempre lo stesso prodotto (A x B deve darmi sempre quell’ibrido F1).

La legge definisce anche il valore agronomico, un requisito che deve essere anche dimostrato e sostenuto,
cioè la nuova varietà deve avere qualcosa in più o di diverso rispetto alle varietà già presenti. Gli articoli
successivi definiscono gli organismi che si fanno carico di gestire tutto il sistema di controlli, certificazioni,
registri etc…

Nella legge viene istituire l’ENSE (ente nazionali sementi elette), è stato abolito e rimaneggiato ed oggi è
parte del CREA.

10.1.1. Distinguibilità.

La nuova varietà deve possedere una o più caratteristiche importanti che permettano di distinguerla da
qualsiasi altra varietà della stessa specie iscritta al Registro Nazionale o al Catalogo comune europeo delle
varietà. Queste caratteristiche possono essere di natura morfologica (es.: presenza o assenza di reste,
mucroni, peli, pigmenti, ecc.) o fisiologica (es.: data di spigatura o fioritura, resistenza ad avversità
specifiche, ricchezza particolare in principi nutritivi, ecc.) e debbono essere nettamente riconoscibili.

10.1.2. Stabilità.

Una varietà è stabile se dopo successive riproduzioni o alla fine di ogni ciclo, qualora il costitutore abbia
definito per la varietà stessa un ciclo particolare di riproduzione, essa resta conforme alla definizione dei
suoi caratteri distintivi che devono rimanere stabili anche sotto ambienti diversi. La definizione dei
caratteri da parte del costitutore deve pertanto risultare chiara nella scheda descrittiva presentata al
momento della richiesta di iscrizione al Registro, altrimenti il controllo della stabilità diventa impossibile.

10.1.3. Omogeneità.

Una varietà è sufficientemente omogenea se le piante che la compongono sono, tenuto conto del
particolare sistema di riproduzione della specie, geneticamente identiche o simili per l'insieme delle
caratteristiche considerate. Evidentemente occorre stabilire entro quali limiti una varietà che presenta
qualche fuori tipo viene ritenuta omogenea, in genere la percentuale di piante fuori tipo presenti nella
varietà standard di confronto fornisce un buon elemento di giudizio. La nuova varietà potrà essere
giudicata in possesso di detto requisito se presenta le stesse caratteristiche di omogeneità della varietà
prescelta come termine di paragone.

10.1.4. Valore agronomico.

Una varietà possiede un soddisfacente valore agronomico o di utilizzazione se, visto l'insieme delle sue
caratteristiche, risulta nettamente superiore alle varietà esistenti almeno in una determinata regione
agricola. L'eventuale deficienza di talune caratteristiche può essere compensata dalla presenza di altre
caratteristiche pregevoli. Il valore agronomico è un carattere di difficile definizione e la sua obbligatorietà
per la iscrizione al Registro è venuta dopo un certo periodo di discussione. Comunque è evidente che non
poteva essere trascurato un carattere così importante. L'esame del valore agronomico non è necessario
per l'iscrizione di:

a) varietà di graminacee foraggere destinate alla semina di tappeti erbosi;

b) varietà destinate alla commercializzazione in un altro Stato;

c) varietà di piante da orto.

Per esemplificare il concetto di uniformità e stabilità vi faccio vedere due foto di campi di girasole (uau). Nella
foto in alto c’è la semente F1 ottenuta dalla ditta sementiera x incrocio dei parentali e l’uniformità è elevata.
Nella foto sotto vedete il fenotipo di una popolazione F2 riseminata da un F1 che ovvimanete non mantiene
uniformità e stabilità.

L’ultima cosa importante della legge 1096 è l’elenco di specie riportato nell’allegato 1 dove si elencano le
colture che non possono essere commercializzate se non rispondono a certe caratteristiche. Di fatto la legge
sancisce che in queste specie possono essere commercializzate solo sementi certificate. Ovviamente è
un’imposizione fatta in buona fede per spingere il miglioramento genetico e l’adozione di semente di qualità
quindi a beneficio di produttività e redditività delle colture. Però si opera un taglio con il passato perché tutti
gli ecotipi o le varietà locali che non possono essere registrate diventano illegali cioè non possono essere
commercializzati.
REGOLAMENTO DI ESECUZIONE DEL 1973: sono
riportate molte info tecniche come tolleranza, cartellini,
purezza, germinabilità etc…

Sono molto importanti gli allegati perché sono tabelle in


cui si danno le specifiche. Non so quante siano ancora
valide però il nocciolo è ancora valido. Addirittura se fai
coltura da seme per una specie se hai due varietà
diverse devi metterle distanziate.

Si parla anche di produzione di seme di cannabis sativa


e la distanza minima deve essere di 5 km da una varietà
e l’altra di cannabis. Per la produzione di sementi
certificate la distanza minima è di 1 km

Questi sono i cartellini tipici delle diverse categorie di sementi definite dalla legge 1091.

Le sementi di base (moltiplicate direttamente dal seme del costitutore) hanno il cartellino bianco. Le sementi
di pre base hanno il cartellino bianco con barra viola. Quelle di 1 riproduzione cartellino azzurro e di 2
cartellino rosso, cartellino verde x i miscugli e marrone per le sementi commerciali.

La legge 195 del 1976 è dedicata specificamente alle sementi di orticole e di fatto alcune definizioni sulle
ortive ci sono già nella legge 1091. In questa nuova la cosa più importante è che nel caso delle ortive le
tipologie varietali sono molto più abbondanti di quanto non avvenga per le colture da pieno campo quindi il
legislatore ha definito l’impossibilità di effettuare controlli in campo per tutte le orticole. Quindi viene
definita la categoria standard: sementi certificate secondo legge 1091 ma non subiscono la certificazione in
campo.

Ricapitolando il sistema legislativo messo in piedi con le leggi quadro tende alla certificazione della semente
per la qualità agronomica e per la qualità genetica. Gli elementi fondanti sono l’iscrizione al registro e il
rispetto dei requisiti DUS.

La legge nazionale istituisce l’ente nazionali sementi elette e oggi è parte del crea.

Questa è una nota del 2012 presa da un sito di informazione sementiera (assosementi) in cui si parlava della
soppressione dell’ense come ente autonomo.

Questa slide riassume un po quelle che sono le attività della mission dell’ense: la certificazione della varietà
in campo e in laboratorio.

In questa slide c’è una statistica che porta il numero di aziende che producono semente certificata. I numeri
non sono eccessivi. Nel lazio sono solo 11 ma ci sono regioni come emilia romagna e sicilia e puglia che
superano le 40 aziende. Molto attivi sono anche veneto e marche.

Vi ho citato che quello che viene implementato a livello nazionale ormai è lo specchio di quello che viene
implementato a livello della comunità europea. CPVO è l’ente europeo che se e occupa e poi ci sono molti
istituti che se ne occupano a livello internazionale. Le regole di base sono abbastanza comuni e l’ente
deputato va sotto il nome di UPOV.
Una volta che la varietà è stata registrata inizia di fatto la produzione del seme commericale, in realtà questa
produzione e la sua vendita può avvenire nel momento in cui viene richiesta l’iscrizione al registro. Quindi
anche mentre è in fase di registrazione può essere commercializzata me se poi non passa la certificazione
viene ritirata dal commercio.

Non è detto che il produttore del seme sia il costitutore, in ogni caso il costitutore deve continuare la
selezione conservatrice e quindi fornire continuamente questo seme al produttore. È un processo a cicli che
consente di passare dal seme del costitutore che esce dalla ricerca e la produzione delle categorie di seme
certificata (semente di base e di 1 e 2 riproduzione).

Nella produzione del seme di base (da semina del seme del costitutore) e qui entra in gioco la richiesta di
certificazione. Vengono fatti i controlli di campo e di laboratorio e vengono concessi i cartellini. Il seme di
base viene utilizzato per costituire il seme di 1 riproduzione e poi di seconda riproduzione. Ovviamente sarà
più costoso ma qualitativamente migliore quello di prima riproduzione.

La legge non consente di andare oltre la seconda riproduzione perché con le continue moltiplicazioni si perde
purezza genetica della varietà.

Le diverse categorie di sementi che abbiamo visto nel caso di una varietà basa sulla linea pura come può
essere un cereale variano a seconda della tipologia varietale. Nel caso degli ibridi il seme del costitutore è il
seme delle linee parentali che sono deputate a formare l’ibrido. Il seme di base nel caso dell’ibrido semplice
è costituito dalle linee parentali. Nel caso degli altri ibridi il seme di base aumenta sempre, cioè tipo nell’ibrido
a 3 vie avremo 3 semi del costitutore.

La selezione conservatrice: la legge non consente di superare un certo numero di moltiplicazioni della
semente. Nel caso delle autogame quali sono le cause che portano alla degenerazione? La mutazione
spontanea, l’incrocio occasionale. Anche la microsegregazione (ricombinazione di loci con effetto minore)
che nelle prime generazioni di moltiplicazione non da effetto fenotipico ma andando avanti con le
generazioni sì. Anche le linee pure o linee inbred selezionate come parentali possono degenerare allo stesso
modo. Anche le popolazioni di equilibrio per: mutazione e incrocio accidentale e per l’ecotipizzazione (una
popolazione in equilibrio se viene riprodotta in un ambiente diverso da quello in cui si è evoluta può cambiare
le frequenze alleliche ed evolvere verso un ecotipo diverso.

È emblematico l’esempio di ditte sementiere dei paesi del nord europa che avevano selezionato varietà di
foraggere ma che per la produzione del seme si indirizzavano a paesi più caldi ma nel giro di un paio di
moltiplicazioni cambiavano tantissimo.
10.3.1. Selezione conservatrice e
produzione di seme nelle varietà
prevalentemente autogame.

In teoria l'applicazione di una


attenta selezione conservatrice,
nelle varietà di specie autogame,
non dovrebbe porre dei problemi
particolari dato che la loro struttura
genetica è basata sulla linea pura.

In pratica, anche per le varietà


basate sulla linea pura, il costitutore
deve effettuare una rigida selezione
conservatrice per lo standard
varietale al fine di evitare che la
varietà "degeneri" per un insieme di motivi (mutazione, esoincrocio, microsegregazione), alcuni dei quali
non del tutto conosciuti. Sicuramente l'omozigosi viene raggiunta più facilmente per i caratteri qualitativi,
molti del quali vengono spesso utilizzati per l'identificazione varietale, mentre è più difficile da raggiungere
nei caratteri quantitativi che sono alla base delle più importanti caratteristiche fisiologiche quali data di
spigatura, produzione di sostanza secca, ecc.. Questi caratteri sono spesso controllati da numerosi geni e
quindi raggiungono l'omozigosi soltanto dopo moltissime generazioni, di conseguenza, anche dopo che la
varietà è iscritta al Registro ed è in coltivazione, è possibile che si verifichi una "microsegregazione" che,
sotto la pressione della selezione naturale, può portare ad una certa ecotipizzazione della varietà.

Il cambiamento dello standard varietale è favorito inoltre dagli incroci tra linee della stessa varietà e tra
varietà contigue e dall'inquinamento di semi appartenenti ad altre cultivars. E' evidente che in questo
contesto alcuni accorgimenti tecnici come la scelta dell'appezzamento destinato alla moltiplicazione del
seme, la pulizia dei locali di conservazione del seme e un'attenta cernita meccanica hanno un peso
rilevante ai fini della conservazione in purezza della varietà. Per alcune piante autogame caratterizzate da
semi molto piccoli, come il tabacco, la varietà può essere conservata in purezza dopo aver prodotto una
notevole quantità di seme del costitutore. Questo seme, conservato sotto condizioni ambientali
controllate, verrà utilizzato negli anni successivi a seconda delle richieste. Tale metodo non è attuabile per
i cereali e per tutte quelle specie che richiederebbero grossi volumi di seme, soprattutto se si tiene conto
dell'impossibilità di prevedere il successo o meno della nuova varietà e quindi la quantità di seme da
accumulare. La conservazione di una varietà
avviene quindi normalmente attraverso
l'impiego della selezione conservatrice che è
spesso parte integrante della catena di
produzione del seme che porta alla
commercializzazione della varietà.

Quindi il costitutore deve garantire un nucelo


di semente che sia selezionato costantemente
per la corrispondenza al tipo. E va sotto il nome
di selezione conservatrice.

Come vedete il costitutore parte da 400 spighe


con uniformità e conformità totale. Le spighe
vengono trebbiate separatamente e la semina
viene fatta per spiga-fila. Si esaminano con
cura le file e tutte le file conformi al tipo vengono mantenute e tutte quelle che hanno all’interno degli off
type vengono scartate, anzi tutta la fila viene scartata. Alla raccolta vengono selezionate 400 spighe con
totale uniformità e dall’altra parte si raccoglie il seme per dare di nuovo il seme del costitutore.

La selezione conservatrice che di solito viene impiegata nei cereali autogami ricalca, talvolta con qualche
modifica, lo schema proposto da Hanson nel 1973 (Fig. 43). Tenendo presente lo standard varietale, il
costitutore sceglie annualmente circa 400 spighe che vengono seminate l'anno successivo in spiga-fila, da
ognuna delle quali viene prelevata una spiga per la conservazione della varietà. Nelle 400 spighe-fila
allevate a piante spaziate, viene fatta una rigida selezione per scartare tutte quelle spighe che non sono
conformi al tipo varietale (selezione negativa). Il seme raccolto sulle 400 spighe-file (selezione positiva)
verrà impiegato per la semina di alcuni ettari che produrranno così il seme del costitutore. E' evidente che
è la quantità del seme del costitutore che condiziona la produzione di seme di base e di seme certificato di
I e II moltiplicazione. Di conseguenza se la varietà ha un grosso successo commerciale il costitutore può
incrementare la produzione del seme di base o aumentando il numero di spighe selezionate per la
conservazione della varietà o effettuando un'ulteriore generazione di moltiplicazione. In quest'ultimo caso
vengono distinte quindi, due generazioni, una di pre-base ed una di base. Tuttavia al fine di evitare quei
cambiamenti a cui va incontro la varietà nel corso delle generazioni di moltiplicazione è preferibile
aumentare il numero di spighe che servono per la conservazione dello standard varietale piuttosto che
aumentare il numero di generazioni di moltiplicazione.

Quanto sopra esposto vale anche per le varietà multilinee (varietà costituite da più linee isogeniche) dove
però il costitutore deve attuare la selezione conservatrice in maniera indipendente per tutte le linee che
entrano nella costituzione della varietà. E' chiaro che in quest'ultimo caso il costitutore deve sopportare
un maggior lavoro che si traduce in un maggiore costo della semente.

Per quello che riguarda le popolazioni in equilibrio di specie allogame bisogna evitare l’ecotipizzazione e
questo si evita facendo sempre riproduzione di seme del costitutore. Per evitare l’incrocio occasionale
bisogna rispettare le distanze minime. C’è anche da dire che oltre al problema dell’inquinamento pollinico
c’è anche il problema dell’inquinamento fisico che dipende dalla pulizia delle trebbie e dei magazzini.

Distinguibilità, omogeneità e stabilità sono i requisiti che si realizzano con relativa facilità nelle varietà
fondate su singole linee omozigoti (varietà di piante autogame) o su singoli genotipi (ibridi semplici), negli
ibridi a 3 o 4 vie, l'omeostasi e l'eterosi tendono a mascherare la diversità genetica tra gli individui
facilitando cosi il compito del costitutore. E' evidente che nel caso degli ibridi la selezione conservatrice è
rivolta al mantenimento delle caratteristiche delle linee inbred che entrano nella costituzione dell'ibrido.
Nelle varietà che possono essere considerate in equilibrio Hardy-Weinberg (ecotipi, varietà costituite
mediante selezione massale, selezione fenotipica, selezione ricorrente, varietà ottenute mediante
selezione per linee e varietà sintetiche) i problemi che sorgono per l'accertamento di questi requisiti sono
molto più complessi. In molte specie, soprattutto foraggere, non si può far conto solo su caratteri
qualitativi di facile rilevazione, per i caratteri quantitativi che vengono presi in considerazione per
l'iscrizione al Registro non è invece facile dare un significato preciso ai termini usati dalla legge. Un
carattere quantitativo può essere infatti definito solo con il calcolo della media e della deviazione standard,
che sono dei parametri il cui valore assoluto può cambiare sensibilmente col variare delle condizioni
ambientali. La media delle dimensioni delle foglie e della altezza della pianta variano sensibilmente di anno
in anno, con la concimazione azotata, anche in relazione alla fertilità propria del terreno. Per i motivi
genetici ricordati, anche la variabilità è ampiamente soggetta ad oscillazioni da un ambiente all'altro ed
una popolazione presenta la variabilità minima nella sua zona di adattamento; man mano che le varietà si
allontanano poi dal proprio ambiente la variabilità aumenta progressivamente tanto che per una
popolazione in equilibrio il concetto di varietà dovrebbe restare legato ad una particolare area geografica.
L'iscrizione automatica al Registro Comunitario di varietà già inserite in singoli registri nazionali dovrebbe
essere pertanto posta in discussione (tabella 13). Il problema è particolarmente sentito per il seme di
graminacee foraggere destinato a soddisfare le crescenti richieste dei paesi del bacino del Mediterraneo.
Il mancato adattamento di tipi costituiti per ambienti molto differenti determina infatti una vera
esplosione di variabilità e la perdita precoce di moltissimi genotipi. Per i motivi appena illustrati, il
confronto tra le nuove costituzioni ed i tipi "standard" allevati alle stesse condizioni, dovrebbe assumere
un valore diagnostico superiore a qualsiasi dato preso in senso assoluto. Inoltre la presenza di marcatori
di facile rilevamento con particolari frequenze (es. frequenze geniche rilevate con marcatori isoenzimatici),
potrebbe aiutare notevolmente per l'identificazione della varietà e per il controllo della stabilità. In ogni
modo, per le varietà in equilibrio, i controlli sulla produzione del seme effettuati dal costitutore nella prima
fase, e dall'ente certificatore nella seconda fase, avranno sempre un'importanza primaria. Tale importanza
è rafforzata dal fatto che in pratica non esistono varietà in equilibrio perché la selezione naturale cambia
le frequenze geniche e genotipiche delle varietà selezionate. Il cambiamento delle frequenze è ovviamente
più rapido quando la varietà è moltiplicata in un ambiente con caratteristiche pedologiche e climatiche
molto differenziate rispetto a quello di origine della varietà.

Come al solito non ho messo l’ultima slide sui pomodori sennò ti vengo a prendere alle 7 di sera -.-“

la direttiva del 1998 l’unione europea dava una serie di indicazioni relative a 4 casistiche.

una riguardava le sementi conciate, una le biologiche, una le ogm e una le varietà da conservazione.

2) Le varietà geneticamente
modificate

Un altro obiettivo della direttiva è di


stabilire le condizioni specifiche per
l'inserimento delle varietà
geneticamente modificate (VGM)
nel catalogo ufficiale delle varietà le
cui sementi e i cui tuberi-seme sono
ammessi alla commercializzazione:
le sementi di VGM potranno essere
commercializzate soltanto se
riconosciute non pericolose per la salute dell'uomo e per l'ambiente. A fini di chiarezza giuridica e di
trasparenza, si prevede inoltre di applicare alle VGM il principio dello "sportello unico", cioè la possibilità
di introdurre una domanda unica di autorizzazione per tutti gli elementi necessari alla valutazione,
attualmente soggetti a procedure diverse. Si tratta di coordinare i procedimenti relativi all'impatto
ambientale e all'uso alimentare delle VGM, nonché alla loro ammissione nei cataloghi per la
commercializzazione delle sementi e dei tuberi-seme. Sarà adottato un regolamento al fine di istituire, per
l'ammissione di tali varietà, una procedura di valutazione dei rischi equivalente a quella prevista dalla
direttiva sull'emissione deliberata nell'ambiente di organismi geneticamente modificati. La nuova direttiva
prevede inoltre che la qualifica di “geneticamente modificato” debba essere citato nei cataloghi ufficiali
delle sementi e su qualsiasi documento o etichetta collegati alla loro commercializzazione. Se l'uso di una
semente comporta un pericolo per altre specie, per la salute umana o per l'ambiente, gli Stati membri
potranno essere autorizzati a vietarne, limitarne o condizionarne la coltivazione. Infine, per le sementi di
VGM come per le altre, tutte le misure previste dalla Commissione dovranno essere adottate nell'ambito
del comitato permanente per le sementi e i materiali di moltiplicazione agricoli, orticoli e forestali, di cui
fanno parte i rappresentanti degli Stati membri e della Commissione.

3) Le sementi biologiche

Viene affermata la possibilità di stabilire requisiti specifici per la commercializzazione di sementi adatte
alla coltivazione biologica. Se da una parte le coltivazioni biologiche stanno vivendo un momento di
espansione, gli operatori continuano a considerare di secondaria importanza l’utilizzo di sementi
biologiche anche in virtù del fatto che la legislazione vigente consente l’utilizzo di semente convenzionale.
L’obbligo di utilizzare semente biologica nelle coltivazioni biologiche era previsto partire dal gennaio 2001
(reg. CE 1935/95), ma questa data è stata procrastinata al gennaio 2004. In questo periodo i produttori
“biologici” possono usare semente convenzionale purché siano in grado di dimostrare che non è possibile
reperire semente biologica sul mercato. Queste problematiche, se risultano di importanza relativa per il
seme, sono fondamentali quando si tratta di materiale di moltiplicazione vegetativa.

4) Le sementi trattate chimicamente

La direttiva prevede la possibilità che vengano stabiliti requisiti particolari per la commercializzazione delle
sementi trattate chimicamente.

Linee per semente biologica: è necessario avere semente ad hoc per la produzione biologica e servono varietà
adatte. Enza zaden costituisce varietà, produce e vende seme. Il marchio di enza per il biologico è “Vitalis”.

Vitalis è sicuramente una linea produttiva che garantisce la coltivazione in biologico e comincia. Se andiamo
però a vedere le varietà proposte di fatto si trovano le stesse varietà proposte anche nel catalogo
convenzionale e questo ci dice che queste varietà non sono selezionate in maniera specifica per il mercato
biologico.

Una cosa molto interessante e di cui avere contezza, sempre relativamente al mercato del biologico,
recentemente un regolamento emesso dal parlamento europeo ha introdotto una deroga sulla
commercializzazione di materiale vegetale. Ha cioè consentito di commercializzare anche materiale
eterogeneo senza rispettare requisiti di registrazione. Quindi al di fuori dei dus e dei certificati! È la prima
volta che succede… Da quello che ho sentito in uno dei filmati del prof Ceccarelli che vi ho proposto
nell’esercitazione dell’altro giorno, lui spiegava che questa deroga è solo temporanea e vale solo per alcune
specie. Però i fautori dell’eterogeneità e popolazioni evolutive di cui ceccarelli è fautore, bene questo
materiale riscontra l’avvallo della comunità europea e può essere commercializzato. Se questo è bene o male
lo vedremo con gli anni ma bisogna registrare che una iniziativa che pone una variazione da parte della
legislazione vigente.

Varietà da conservazione: anche questa è un’iniziativa che porta una tolleranza diversa sui cardini delle leggi
convenzionali. Cosa sono le varietà da conservazione? Sono le antiche varietà, gli ecotipi e che sono il più
delle volte stati messi fuori legge da parte della legislazione stessa, questo perché il fenomeno varietale è
stato fortemente incentivato negli anni passati. A me non piace molto questa denominazione per due motivi:
1) mi confonde, molto spesso i vostri colleghi hanno confuso le varietà da conservazione con la selezione
conservatrice. La selezione conservatrice è l’attività del costitutore che mira a garantire la purezza di una
linea commerciale. Le varietà da conservazione sono un’altra cosa! 2) questo termine sembra indicare solo
la necessità di conservare questi materiali ma non basta conservare il materiale ma bisogna anche
valorizzarlo.

Varietà da conservazione: varietà, popolazioni, ecotipi, cloni e cultivar di specie di piante agrarie ed ortive
autoctone o non autoctone (purchè integratesi negli agroecosistemi locali e regionali), minacciate da
erosione genetica, coltivate sul territorio o conservate presso gli orti botanici, istituti sperimentali o di ricerca
e banche del germoplasma, per le quali sussiste un interesse economico, scientifico, culturale o paesaggistico.

la direttiva europea del 98 è stata recepita in italia solo nel 2007 quando è uscita una legge che indicava come
ci si poteva muovere in italia. Poi serve il decreto attuativo però che è arrivato nel 2009.
Quindi la legge del 2007 istituisce il registro delle varietà da conservazione, che poi è una sezione del registro
nazionale delle varietà. Le varietà da conservazione secondo la legge del 2007 devono essere varietà mai
iscritte al registro, coltivate da almeno 50 anni in situazioni locali e possono essere anche non più iscritte ma
minacciate da erosione o non più coltivati. Quindi tutti quei materiali che erano coltivati e con la legge del
2006 non potevano essere più commercializzati.

Concetti sulla commercializzazione delle varietà da conservazione: sono fatti di deroghe rispetto alla legge
del sistema convenzionale, uguagliante e limitazioni e vincoli.

Le deroghe riguardano alcune caratteristiche anche puramente formali come la denominazione delle varietà
(per esempio nelle varietà convenzionali è vietato fare riferimento esplicito a regioni geografiche. In quelle
da conservazione questo obbligo non c’è. C’è bisogno di iscrizione ma avviene in base a dichiarazioni del
costitutore e non rispetto ai DUS e non servono esami ufficiali. Un’altra deroga riguarda la vendita diretta: i
produttori di semi a livello locale possono anche vendere il seme.

Alcuni punti restano fermi: i controlli durante la produzione del seme, i requisiti qualitativi della semente e
anche la registrazione al servizio fitosanitario e il controllo delle fitopatologie.

Infine la legge pone delle limitazioni e vincoli alla commercializzazione: la commercializzazione è limitata alla
zona di origine e ci sono restrizioni quantitative sulla produzione.

Questo che vede è una foto del mais nostrano di Stroro. È stata la prima varietà da conservazione iscritta
all’apposito catalogo. È tipico del trentino.

Gli articoli di questo decreto individuano la zona di origine limitata a 3 comuni e ad una frazione di un quarto
comune (superficie veramente limitata quindi anche la zona di coltivazione).

Ci sono tante tipologie di mais.

Il nostro paese ha demandato alle regioni il tema della biodiversità di interesse agrario. Quindi le regioni
hanno promulgato delle leggi dove istituiscono dei registri e istituiscono sistemi di conservazione in situ e a
volte anche ex situ (anche se nel nostro paese ce ne è ben poca perché manca una banca del seme nazionale).
Non tutte le regioni hanno promulgato leggi in materie ma almeno una buona metà sì. Il lazio le ha pubblicate
quasi per prima. L’argomento biodiversità è gestito da sezioni dell’arsial ed è stato istituito un registro
volontario anche molto ricco. Ovviamente questa base regionale non è il top perché ognuno fa come gli pare
e c’è pure chi non fa nu cazz.

Nel 2015 è stata approvata la legge 194 che è una legge che vuole fare un sistema nazionale di tutti quelle
informazioni sulle varietà locali e agrobiodiversità che è presente nei registri regionali. Questa legge vuole
cercare di mettere insieme tutte le conoscende che si hanno a livello regionale per avere un inventario unico
e cercare di dare sistemi descrittivi che siano unici per tutti e permettano studi e confronti più semplici.
Questa legge istituisce una serie di iniziative e quindi un’anagrafe della biodiversità che sarà pubblicato in un
portale che è in via di costruzione. Tutto questo è gestito da un comitato permanente. Mazzu personalmente
ha l’onere e l’onore di far parte di questo comitato. Vi assicuro che l’italia ha un patrimonio inestimabile di
biodiversità, probabilmente il più ricco di molti altri paesi e questo x 2 motivi: l’italia è un paese
estremamente diverso a livello di clima, terreni, esposizione, versanti, altezza etc… e poi perché siamo stati
un paese politicamente diviso fino alla metà di due secoli fa e questo ha fatto sì che ogni stato ha avuto la
possibilità di evolvere le sue proprie tipologie e di non passarle ai vicini.

Potrebbero piacerti anche