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3a lezione

METABOLISMO FASE I e II

Dopo le fasi di assorbimento e distribuzione a livello dei tessuti si devono prendere in


considerazione quelle fasi che portano il farmaco verso l'esterno del nostro organismo, verso la
fase di metabolizzazione e di escrezione. Il metabolismo del farmaco avviene all'interno
dell'organismo perché sono presenti una serie di strutture proteiche (gli enzimi) che hanno un
compito fondamentale. Queste strutture sono presenti nel nostro organismo perché ci saranno
delle sostanze naturali che devono essere soggette a delle biotrasformazioni e che consentono
sia di utilizzare energia e sia di consentire l'eliminazione di sostanze che si introduco
all'interno dell'organismo ma che non sono desiderate e che quindi possono avviarsi alle vie
principali di escrezione le quali sono: la via fecale, via polmonare, via urinaria, processo
traspirazione della cute ecc. A questo punto il metabolismo lo possiamo individuare come una
serie di reazioni che andremo ad analizzare. Queste reazioni possono essere un nemico dal
quale ci dobbiamo difendere perché in questo caso alcuni farmaci possono essere convertiti da
struttura farmacologicamente attiva, cioè dotata di un meccanismo d'azione in cui il bilancio tra
il beneficio che noi ne traiamo e il rischio al quale sottoponiamo al paziente è a favore della
prima, ad una struttura diversa che può alterare questo tipo di bilancio e che quindi può
diventare un nemico dal quale ci dobbiamo difendere dopo la somministrazione. Ma nella
maggior parte dei casi si tratta di un nostro prezioso collaboratore perché ci converte la nostra
sostanza in una più idrofila che è normalmente più facilmente eliminabili. Quindi quando ho
parlato di assorbimento ho dovuto far riferimento ad un giusto bilancio lipofilo/idrofilo per
garantire il superamento delle membrane dei fosfolipidi e far si che il farmaco pervenisse
all'interno del torrente ematico, una volta raggiunto questo torrente ematico, sempre in
funzione del giusto bilancio lipofilo/idrofilo poteva avvenire la distribuzione, ma in ragione di
determinate condizioni di pH e di lipofilia, si potevano avere anche interazione con le proteine
plasmatiche o si poteva alterare la possibilità di passaggio tra le membrane. Ancora una volta è
il bilancio fra lipofilia e idrofilia a regolare la possibilità di essere eliminati, perché se la molecola
viene convertita in una struttura più idrofila, una volta arrivata all'interno delle preurina, sarà
più difficilmente riassorbibile e di conseguenza sarà più facilmente eliminabile attraverso
questa via di escrezione. Il metabolismo esiste perché esiste un metabolismo fisiologico
all'intero del nostro organismo che prevede di dover ricavare, dalla materia vivente, dell’
energia e di produrre dei metaboliti di tipo secondario che poi possono essere riassemblati per
poter ricostituire la materia vivente. In questo bilancio di catabolismo e anabolismo del nostro
organismo, i farmaci, ovverosia sostanze di natura xenobiotica, quindi esterne al nostro
organismo, possono essere oggetto di una serie di biotrasformazioni perché somigliano ai
substrati naturali nei quali gli enzimi operano queste stesse reazioni.

Il metabolismo di uno xenobiotico è l’insieme delle trasformazioni chimiche (biotrasformazioni)


che la molecola subisce all’interno dell’organismo, principalmente ad opera di enzimi. La sua
‘logica’ è quella di trasformare la molecola in modo che possa essere facilmente eliminata
dall’organismo. Dato che le molecole idrofile sono eliminate più rapidamente di quelle lipofile, il
metabolismo consiste principalmente nella trasformazione di molecole lipofile in molecole idrofile.

Come si protegge l’organismo dagli xenobiotici?


Essenzialmente lo fa in 3 modi, (sono riportati nelle immagini).
1. Prevenendone l’ingresso nel distretto sanguigno e negli organi (assorbimento o
distribuzione) gli xenobiotici passano attraverso l’intestino ma:
non riescono ad attraversare la mucosa intestinale
non riescono ad attraversare la pelle o la mucosa respiratoria
non riescono a penetrare in alcuni organi (es. il cervello)
2. Eliminazione dello xenobiotico immodificato
Reni
Bile e intestino
Saliva
Pelle (sudorazione)
Polmoni (espirazione)
Latte, lacrime, sperma, secrezioni vaginali… e, nel caso degli ovipari, anche attraverso
le uova
3. Eliminazione dello xenobiotico dopo metabolismo/biotrasformazione.
Lo xenobiotico è trasformato dall’organismo in un prodotto idrofilo (metabolita) che è,
generalmente, molto solubile in acqua e, quindi, facile da espellere.

Prendiamo in considerazione prima il punto 3. Infatti il primo meccanismo con il quale ci


difendiamo è quello di eliminare queste sostanze attraverso il metabolismo. Infatti il farmaco
viene trasformato in un prodotto più idrofilo che generalmente è più solubile, più facile da
espellere. Quindi vedremo che sulla struttura del farmaco vengono introdotti dei gruppi
funzionali, gruppi ossidrilici, amminici, carbossilici, che fanno si che il farmaco, avendo
un'idrofilia maggiore, possa essere anche più facilmente eliminabile. Se questo non deve
avvenire come meccanismo di eliminazione, può avvenire invece l'eliminazione dello
xenobiotico immodificato. Infatti ci sono dei farmaci che così come vengono somministrati così
vengono eliminati dal nostro organismo. Sono molto pochi e non subiscono alcuna reazione. In
questo caso semplicemente attraverso i reni, la bile, l'intestino, sono i principali meccanismi di
escrezione, oppure la saliva, la pelle, i polmoni, le lacrime, lo sperma e tutte le altre secrezioni
dell'organismo attraverso cui i farmaci possono essere eliminati. Un terzo meccanismo è
quello di non farlo entrare proprio il farmaco all'interno dell'organismo. In questo caso
esistono delle barriere di cui l'organismo è costituito che cercano di evitare l'ingresso di
sostanze esterne all'interno dell'organismo. Ci sono infatti la mucosa intestinale, la pelle, la
mucosa respiratoria e la gliade (che costituisce la protezione della barriera ematoencefalica).
Queste sono tutte una serie di strutture che sono li preposte fisiologicamente a creare delle
barriere, delle membrane, per far si che non ci sia un ingresso di qualsiasi sostanza, ma solo di
quelle che in teoria dovrebbero essere utili a una finalità metabolica del nostro organismo.

Quali sono allora le conseguenze del metabolismo dei farmaci?


Siccome i farmaci una volta penetrati nell'organismo possono essere sottoposti a reazioni
chimiche, molto spesso devono esserlo, possono esserci delle conseguenze.

1. Prima considerazione: il farmaco viene trasformato in una molecola diversa che, tuttavia,
mantiene l'azione terapeutica, prolungando l'effetto del farmaco stesso. (OK)
Questa prima considerazione la segnaliamo come OK perché ci sta bene che somministriamo
una proteina terapeuticamente attiva, questa arriva al livello del fegato, principale laboratorio
chimico del nostro organismo, subisce una serie di trasformazioni tali che i gruppi chimici che
vengono introdotti sulla molecola non ne alterano la possibilità di interagire con il proprio
bersaglio. In questo caso abbiamo ottenuto un metabolita attivo che non fa nient'altro che
prolungare l'attività terapeutica.
2. Seconda possibilità: il farmaco viene trasformato in un metabolita inattivo. (OK)
In questo caso viene eliminato dal corpo senza ulteriori interazioni con il tessuto bersaglio. Se
questo avviene prima che il farmaco abbia esplicato la sua attività terapeutica, questo prende il
nome di metabolismo di primo passaggio perché è quello che consegue la sua
somministrazione, ed è quello che fa si che una quota di farmaco venga persa immediatamente
dopo le somministrazioni tipicamente attraverso le somministrazioni enterali.

3. Terza condizione: a questa condizione bisogna prestare massima attenzione perché il


farmaco può essere trasformato in una molecola diversa che può essere tossica o mal
tollerata dall'organismo. In questo caso il metabolismo non è più un prezioso
collaboratore che elimina i farmaci ma è una condizione che deve essere studiata prima
di mettere il farmaco in commercio. E' per questo che tutto il pattern metabolico del
farmaco, quando deve essere messo in commercio, deve essere presentato anche quello
allegato alla richiesta di registrazione al ministero della salute al quale dobbiamo andare
a descrive tutte le trasformazioni che il farmaco può subire e in quali concertazioni viene
poi ritrovato all'interno delle urine. Questo deve essere descritto perché deve essere
studiata poi l'attività dei singoli metaboliti per dimostrare che non solo il farmaco non è
tossico ma anche i metaboliti che si formeranno non sono dannosi per il nostro
organismo e questo fa si che ci sia quella valutazione del bilancio tra il beneficio e il
rischio a favore del beneficio e quindi a favore della registrazione e dell'immissione in
commercio.

Dove avviene il metabolismo dei farmaci?

Il distretto principale dove avviene la metabolizzazione dei xenobiotici è sicuramente il fegato.


In realtà i distretti dove potrebbe avvenire una modifica delle molecole di farmaco è molto vasta,
quelle principali sono sottolineate nella tabella: il siero, il cervello, ecc. Ma anche nella
microflora intestinale possono avvenire le trasformazioni e delle metabolizzazioni. infatti i
batteri sono presenti all'interno della flora intestinale in maniera endogena, e possono essere
deputati ad una serie di reazioni di trasformazione tali che possono migliorare o diminuire la
fase di assorbimento dei nostri farmaci trasformandoli in una sostanza completamente diversa
e che potrebbe avere un'attività farmacologica diversa. Le trasformazioni posso quindi avvenire
nei reni, nei polmoni, nella pelle in maniera vasta, ma il 99% delle biotrasformazioni avviene nel
fegato. La finalità di queste trasformazioni è rendere il farmaco struttura più lipofila in una
struttura più idrofila e più facilmente eliminabile.

Fegato (Epatociti)

All'interno dell'epatocita è possibile distinguere una serie di strutture, ovvero gli organelli
citosolici. In particolar modo prendiamo in considerazione il reticolo endoplasmatico ruvido.
Infatti sulla superficie di questo organello presente all'interno degli epatociti ci sono i
microsomi che sono quelle strutture proteiche dove ha sede il 99% del metabolismo dei
farmaci. Quindi le reazioni che trasformano gli xenobiotici sono delle reazioni microsomiali
epatiche. Alcune reazioni possono essere di tipo extramicrosomiali, ovvero sia possono
avvenire luogo all'interno del citoplasma della struttura dell'epatocita(nel citosol) ma nella
maggior parte dei casi quando ci riferiremo alle reazioni di biotrasformazione saranno delle
biotrasformazione sul reticolo endoplasmatico ruvido delle cellule degli epatociti. Perché questo
è il distretto dove c'è la maggior parte delle trasformazioni dei farmaci? Perché dipende dal pool
enzimatico che c'è a disposizione per le singole cellule. In particolare su questo reticolo
endoplasmatico ruvido c'è la localizzazione della maggior parte degli enzimi che sono in grado di
operare queste biotrasformazioni. La presenza degli enzimi ci garantisce la possibilità di
metabolizzare il farmaco.

Come si dividono le reazioni di metabolismo dei farmaci?


I processi metabolici si distinguono in due fasi: reazioni della I fase e della II fase.

Reazioni di fase I
Per reazioni di fase I (Le reazioni della prima fase sono dette BIOTRASFORMAZIONI perché
avvengono a livello dei gruppi funzionali con modificazione della struttura originale) si
intendono tutte quelle modifiche della struttura del farmaco che sono deputate all'introduzione
di gruppi funzionali sulla sua struttura che siano dei gruppi funzionali più idrofili. Allora un
esempio di reazione di fase I possono essere reazioni di idrossilazione in cui si introduce un
gruppo OH, possono essere reazioni di dealchilazione in cui si toglie una catena carboniosa in
modo tale da rendere disponibile ad esempio un gruppo NH2. Possono essere reazioni di idrolisi.
Per la reazione di idrolisi prendiamo in considerazione l'esempio dell'aspirina (riportata nelle
immagini).L'aspirina, ovvero l'acido acetilsalicilico.
Questo che vedete nell'immagine è il suo reale destino metabolico all'interno dell'organismo.
L'acido acetilsalicilico viene convertito dapprima, nella quasi totalità della dose che
somministriamo, in acido salicilico. La differenza tra i 2 sta nell'acetilazione del gruppo
ossidrilico in orto rispetto alla funzione carbossilica di conseguenza questo estere deve essere
scisso. La scissione degli esteri è demandata ad una serie di enzimi che operano l'idrolisi. Questi
enzimi sono delle idrolasi, o per meglio dire delle esterasi, che sono in grado di staccare questa
porzione e di rendere più evidente la funzione ossidrilica. Perché avviene questo? Questo
avviene perché così si liberano dei gruppi funzionali più idrofili sulla superficie del farmaco in
modo tale che questa struttura, che prima aveva una sua lipofilia, adesso è già più disponibile a
formare dei legami con la soluzione acquosa. A questo punto possono seguire alle reazioni di
fase I delle reazioni di fase II che sono invece delle reazioni di coniugazione. Per reazioni di
coniugazione si intende l'interazione tra il farmaco o i gruppi funzionali del farmaco, che
abbiamo introdotto e liberato in fase I, con del materiale biologico già disponibile all'interno del
nostro organismo e che facciano si che il coniugato che si venga a formare sia ancora più
idrosolubile e quindi ancora più facilmente eliminabile. Nel caso di reazioni di fase II di
coniugazione, questa in particolare che è riportata per la reazione di metabolizzazione
dell'aspirina è una reazione di Glucuronazione cioè di coniugazione con l'acido Glucuronico.

Come potete vedere nelle immagini, la struttura dell'acido glucuronico presenta diversi gruppi
ossidrilici se questi gruppi li consideriamo da un punto di vista della possibilità di interazione
con l'acqua, siamo partiti da una molecola che in acqua ha difficoltà a solubilizzarsi, tanto è vero
che nell'aspirina si devono attuare delle strategie per rendere la compressa effervescente e
sufficientemente idrosolubile per poterla somministrare, al contrario invece il derivato
Glucuronato che si forma nell'organismo è fortemente idrosolubile e quindi facilmente lo si
ritrova in questa forma a livello della concentrazione urinaria e viene eliminato sotto questa
forma.
È importante precisare che le due fasi(I e II) non sono assolutamente legate da fattori
cronologici né topologici, cioè non è necessario che si realizzi la prima fase affinché possa
avvenire la seconda.
Ci sono dei farmaci che subiscono direttamente coniugazione con l'acido glucuronico perché
posseggono dei gruppi funzionali che possono essere derivatizzati con l'acido glucuronico. Non
c'è necessità di passare per nessuna idrossilazione, dealchilazione o deaminazione ma si va
direttamente nel caso in cui si ha disponibilità di una porzione libera e polare per un
interazione di reazione direttamente di fase II per l'escrezione. Al contrario può avvenire
prima la reazione di fase II, si ottiene un derivato intermedio, il quale poi a sua volta sarà
oggetto di una reazione di fase I che introduce nuovi gruppi polari e saranno quei gruppi polari
poi eventualmente ad essere oggetto di una nuova reazione di fase II. Quindi le reazioni di fase I
non precedono necessariamente le reazioni di fase II.

Il destino metabolico dei farmaci

Il farmaco una volta somministrato può subire diversi destini.


Le reazioni di fase I possono essere utili anche per l'attivazione di determinate sostanze che non
posseggono attività farmacologica e vengono somministrate come profarmaci (farmaci di per se
inattivi) e l’azione del metabolismo può successivamente dare origine alla forma attiva,(quindi un
profarmaco è una struttura in grado di liberare il farmaco attraverso una reazione di
metabolizzazione)questa poi subisce le reazioni di fase II e viene escreta. I farmaci già attivi,
invece, possono dar luogo a metaboliti attivi o metaboliti inattivi a seconda delle reazioni
metaboliche a cui vanno incontro, oppure possono essere coniugati come tali e poi escreti.

Ad esempio ci sono degli esteri che sono più lipofili e che quindi possono assorbiti con il giusto
bilancio lipofilo/idrofilo a livello del tratto intestinale e che poi però necessitano l'intervento di
una idrolasi o di una esterasi, come abbiamo visto prima, per essere scissi e per liberare
effettivamente la porzione di farmaco che esplicherà la sua attività. Un esempio è la
pivampicillina che è un profarmaco dell'ampicillina. L'ampicillina è un derivato β-lattamico che
aveva una sua difficoltà di assorbimento. L'ampicillina, è stata la prima penicillina
somministrabile per via orale, questa aveva una biodisponibilità del 30%. Allora se escludiamo
che bisognava innalzare leggermente la lipofilia per garantire un miglior passaggio per
diffusione passiva all'interno dell'epitelio monostratificato intestinale, si sono fatti degli esteri,
tra questi la pivampicillina è quella che ha trovato miglior applicazione, questa infatti si assorbe
bene, ha una biodisponibilità dell'80%, arriva sotto forma di estere nel torrente ematico e poi
questo estere viene scisso e così dal profarmaco pivampicillina si libera l'ampicillina che è
quello che è responsabile dell'attività farmacologica vera e propria. Di conseguenza il
profarmaco può essere, convertito con queste reazioni di fase I, in un metabolita attivo. Questo
metabolita esplicherà la sua attività e poi può essere soggetto con le reazioni di fase II alle fasi di
escrezione. Al contrario invece il farmaco attivo, può subire reazioni in cui resta ancora come
metabolita attivo o come metabolita può essere convertito in una sostanza non più attiva e poi
essere destinato con le reazioni di fase II alla coniugazione e quindi all'escrezione.
Reazioni di fase I e reazioni di fase II

Nelle reazioni di fase I prenderemo in considerazione i seguenti fenomeni: Ossidazione,


Riduzione e Idrolisi. In particolare per quanto attiene per le reazioni di ossidazione queste
possono avvenire sul Carbonio, sull'Azoto, sull'Ossigeno. Possono poi interessare i gruppi
alcolici e possono essere convertiti in aldeidi o in acidi carbossilici in funzione di quello che è il
grado di ossidazione che siamo in grado di raggiungere. Al contrario di queste reazioni ci sono
le reazioni di Riduzione, riduzione che può avvenire sull'atomo di carbonio, oppure può
interessare i gruppi amminici, riduzione degli aldeidi in alcool. Infine ci sono le reazioni di
idrolisi che abbiamo visto possono essere esterasi o amidasi, cioè per la scissione di esteri o
ammidi. Tutte queste sono le reazioni di fase I che hanno la finalità di introdurre o di rendere
disponibili gruppi funzionali polari sulla struttura del farmaco. Una volta avvenute queste
reazioni, oppure direttamente, perché non è necessario che avvengono prima queste reazioni
(ricorda indipendenza temporale e topologica), possono avvenire invece le reazioni di
coniugazione, quelle reazioni in cui al farmaco viene aggiunto qualcosa di già disponibile
all'interno del nostro organismo e che sono reazioni di coniugazione con l'acido glucuronico,
reazioni di acilazione, di metilazione, di coniugazione con il glutatione e infine reazioni di
solfatazione (guarda immagini). Nell'immagine è riportato tra parentesi anche qual è il distretto
in cui queste reazioni avvengono e possiamo notare che il 99% di queste reazioni avvengono a
livello della struttura del reticolo endoplasmatico ruvido microsomiale a livello delle cellule del
fegato, ovvero a livello dell'epatocita.

Enzimi di fase I
I nomi degli enzimi che operano queste reazioni di ossidazione, di idrolisi, sono piuttosto vari.
Ciò che ci interessa notare (dalle immagini) è che ogni reazione è caratterizzata da un suo
enzima e ogni enzima ha la sua denominazione peculiare per quella che è la reazione che
porterà avanti. Ciò che è importante sottolineare è che i fenomeni di ossidazione e di riduzione
sono quasi tutti demandati ad una famiglia di enzimi che prendono il nome di citocromi, di cui il
citocromo P450 (CYP), localizzato a livello del sistema microsomiale epatico, rappresenta
l'enzima di principale importanza di tutto il metabolismo degli xenobiotici all'interno
dell'organismo. Ci sono poi enzimi di minor importanza come ad esempio l'alcool deidrogenasi.
Ricordiamoci che questo enzima opera la conversione dell'etanolo (CH3CH2OH) in acido acetico
(CH3COOH) quindi l'enzima toglie atomi di idrogeno (deidrogenasi) e fa si che da CH 2OH si
ottenga COOH. L'acido acetico può entrare nel ciclo di Krebs e pertanto possiamo ricavare
energia sotto forma di ATP a partire dall'etanolo. Altri enzimi importanti nel nostro organismo
sono ad esempio le monoammino ossidasi (MAO) che sono enzimi in grado di convertire le
ammine biogene. La maggior parte dei neurotrasmettitori del nostro organismo sono delle
monoammine e di conseguenza le monoammino ossidasi sono importanti nella trasformazione
di questi mediatori in delle sostanze non più attive e che poi possono essere recuperate e
riconvertite di nuovo nell'organismo. Anche da un punto di vista dell'idrolisi ci sono degli
enzimi importanti. Abbiamo infatti già parlato di esterasi e di amidasi. 2 famiglie che vanno a
costituire essenzialmente quella grossa superfamiglia di idrolasi, di minor importanza ci sono
ad esempio le colinesterasi, le idrolasi ecc. La cosa importante è comumque che la famiglia di
enzimi più importanti che operano queste trasformazioni sono i citocromi e principalmente il
citocromo P450. Dove sono localizzati questi citocromi? Sono localizzati sul sistema
microsomiale epatico e sono esposti verso la parte esterna della membrana che costituisce la
struttura del reticolo endoplasmatico ruvido. La loro disposizione quindi sul reticolo
endoplasmatico fa si che siano disponibili verso l'esterno del reticolo stesso e in questo modo
riescono ad incontrare tutte le quelle sostanze che entrano in grande quantità all'interno degli
epatociti e sono in grado di trasformarle con queste reazioni di ossidoriduzione che i citocromi
sono in grado di effettuare.

Perché i citocromi ed in particolar modo il citocromo P450 fanno avvenire queste reazioni di
ossidazione e di riduzione? Strutturalmente si tratta di una proteina in cui c'è una parte
costante, la protoporfirina 9, e poi una parte variabile che è la struttura esterna proteica di circa
50000 Da (50kDa). Ricordiamo che la protoporfirina 9 è presente all'interno dei globuli rossi
dove costituisce il gruppo presente all'interno dell'eme, dove coniugata con un atomo di ferro
centrale, è in grado di legare l'ossigeno in elevata quantità.
Com'è fatta la protoporfirina 9?

C'è un atomo di ferro con una struttura tetrapirrolica, unita da ponti metilenici, sulla quale
possono essere presenti sostituenti vinilici o metilici, e ci sono poi 2 catene di acido propionico
terminale. Questo atomo di ferro che si trova quindi con questa posizione, formando 4 legami
con gli atomi di azoto nelle strutture tetrapirroliche, ha 2 valenze ancora disponibili, quella al di
sopra e quella al di sotto del piano. All'interno del piano forma 4 legami con i 4 atomi di azoto
ma poi ha altri 2 gruppi di coordinazione perché il ferro può formare sino a 6 legami di
coordinazione, uno al di sopra, (quello che vedete verso di voi, e uno al di sotto del piano, come
se andasse dietro la struttura dell'immagine)che sono ancora disponibili, ed è proprio questa
disponibilità di interazione che fa sì che quest'atomo di ferro possa interagire con una molecola
di ossigeno. Molecola di ossigeno che viene dapprima legata e poi resa disponibile in modo tale
che all'arrivo di un farmaco, che abbiamo indicato come HX (qualsiasi struttura che contenga
idrogeni), un atomo di ossigeno di questa molecola possa essere destinato all'utilizzo
all'introduzione all'interno del farmaco. Quindi quello che avviene è una reazione di
ossidazione, non intesa come la conoscevamo in chimica generale (quindi variazione del
numero di ossidazione), perché il numero di ossidazione dell'ossigeno è sempre -2 all'intero
delle molecole, tranne 0 allo stato elementare, ma quello che ci interessa di questa reazione di
ossidoriduzione è che introduciamo atomo di ossigeno all'interno delle molecole organiche
(infatti in chimica organica si parla di ossidazione o di riduzione se introduciamo atomi di
ossigeno o atomi di idrogeno). Allora nel nostro caso la nostra molecola, il farmaco, HX diventa
HOX, cioè il gruppo ossidrilico viene introdotto sulla sua struttura. Con questa reazione ad
esempio possiamo convertire il propano CH3CH2CH3 in isobutano CH3CHOHCH3 in cui sul CH2
centrale è stato aggiunto un atomo di ossigeno.

Riassumendo la funzione del citocromo P450: questo sta sulla struttura delle reticolo
endoplasmatico ruvido, ha disponibilità di atomi di ossigeno, al passaggio dei farmaci li rende
disponibili e fa sì che possano essere introdotti per andarli a funzionalizzare e a renderli più
idrofili.

Appunto storico: perché si chiama citocromo P450? Il nome deriva dal fatto che la struttura
dell'eme, che all'interno dei globuli rossi è responsabile della colorazione rossa del nostro
plasma, anche in questo caso abbiamo una colorazione rossa, infatti non è cambiata la forte
coniugazione dei doppi legami presenti in questa molecola. Infatti dobbiamo sapere che le
molecole appaiono colorate quando hanno una forte presenza di legami coniugati:
un'alternanza di doppio legame a legame singolo e cosi via costituisce un cromoforo, cioè una
struttura eccitabile da un punto di vista degli elettroni. Quando arriva la radiazione luminosa, una
parte dell'energia viene trattenuta e una parte lasciata passare e noi siamo in grado di vedere
solamente il colore complementare rispetto a quello che viene trattenuto.

Questa molecola come si vede dalle immagini ha una struttura che contiene questa alternanza di
doppi e singoli legami. Questa estesa coniugazione fa sì che la protoporfirina 9 sia colorata di
rosso determinando questa colorazione non solo del sangue ma anche dell'epatocita (anche in
assenza di sangue!) quindi il nome deriva da questo: cito-cromo, da la colorazione alla struttura
delle cellule (cito) e quindi colorazione della cellula. P450 invece perché a 450 nm avevamo il
picco massimo di assorbimento della lunghezza d'onda.

Classificazione dei CYP450


La famiglia del citocromo P450 è una famiglia piuttosto vasta, all'interno della quale è possibile
individuare, in funzione delle omologie di sequenza proteica, una serie di sottofamiglie. In
particolare il CYP450 viene diviso in 3 famiglie principali in funzione del grado di omologia
strutturale. Le strutture proteiche all'interno degli epatociti sono state caratterizzate e si è visto
che quelli che hanno omologia che non si differenzino per più del 20% appartengono alla
stessa famiglia. Quindi se c'è un citocromo 1A1 e 1A2 avranno una sequenza primaria che non
si differenzia per oltre il 20% tra l'1A1 e la 1A2, questi appartengono alla stessa famiglia di
citocromi. Mentre nel caso di un' enzima appartenente al CYP della famiglia 2 c'è una differenza
di oltre il 20% degli amminoacidi che vanno a costituire la struttura proteica. Su questa base è
stato scelto quindi di classificarli in una seria di famiglie e quindi alla famiglia 1 appartengono
poi delle sottofamiglie. Nell'ambito delle sottofamiglie l'omologia di sequenza va non oltre il 5%
e quindi quelle proteine che appartengono all'1A1 si differenziano rispetto all'1A2 per soltanto
il 5% della sequenza primaria degli amminoacidi che lo vanno a costituire. Vediamo che la
famiglia 2 è quella più complessa.

Quali sono gli enzimi più coinvolti nel metabolismo dei farmaci?
Il CYP3A4 è sicuramente quello più importante! Quello maggiormente responsabile della
metabolizzazione dei farmaci dell'organismo. Il 90% dei farmaci è soggetto alla
metabolizzazione del CYP3A4 altre volte il 2D6, il 2C9, ma nella stragrande maggioranza dei casi
il citocromo coinvolto sarà il CYP3A4.

Queste reazioni di ossidazione, introduzione di una funzione OH sulla struttura dei farmaci,
possono avvenire sia sulle strutture nucleoaromatico, sia sulle strutture caratterizzate da una
struttura alifatica di partenza. Questi citocromi quindi possono catalizzare una serie di reazioni
che ora andremo ad esaminare una per volta.

REAZIONI DI FASE I →Ossidazione, Riduzione, Idrolisi.

Reazioni di Ossidazione

IDROSSILAZIONE AROMATICA
Se somministriamo la Lidocaina, che è un anestetico locale, questa potrà essere oggetto
dell'introduzione di un gruppo ossidrilico. Infatti al passaggio nell'epatocita incontrerà i
citocromi P450 e sul reticolo endoplasmatico si trasformerà in una struttura in cui si introduce
questo gruppo ossidrilico, e questo derivato ossidrilico può poi essere sfruttato per far avvenire
le reazioni di coniugazione e quindi l'eliminazione della struttura della lidocaina dal nostro
organismo.

C'è regioselettività nel far avvenire questa reazione da parte dei citocromi? Questa reazione di
introduzione del gruppo OH rispetta le caratteristiche chimiche che noi già conosciamo per le
molecole organiche, ovvero l'introduzione di questo gruppo OH, operata dal citocromo P450,
avviene indipendentemente dagli altri sostituenti che ci sono sull'anello aromatico o valgono
ancora quelle considerazioni di sostituente orto para orientante, di sostituente attivante e
disattivante di determinate posizioni?

Ebbene proprio la reazione di idrossilazione aromatica rispetta la regioselettività nella


formazione del metabolita fenolico. Quindi in funzione di quelli che sono i sostituenti già
localizzati ci si può aspettare dove andrà a finire il gruppo OH da parte dell'interazione del
citocromo. Infatti ad esempio se guardiamo questa struttura, noi sappiamo che i gruppi alchilici
sono dei gruppi attivanti orto para orientanti, e quale sarà la posizione più favorita per
l'introduzione del gruppo OH? Guarda immagine: questa posizione si trova in para rispetto al
CH3, in orto a quest’ altro CH3 e quindi il gruppo ossidrilico potrà andare in questa posizione
molto bene. In quest'altra posizione in cui si trova in meta rispetto al primo e in meta rispetto al
secondo andrà meno bene. Infine in questa posizione che si trova in para rispetto a questo CH 3
e in orto rispetto a quest'altro ci può andare ma soffre di un effetto disattivante in questa
posizione causato da ingombro sterico. Quindi la reazione più favorita è l'introduzione del
gruppo ossidrilico in questa posizione dello spazio. Quindi abbiamo visto che c'è regioselettività
nella formazione dei metaboliti fenolici.
Quindi para>orto>meta.
Sostituenti attivanti restano ancora i gruppi ossidrilici, gli eteri, le ammine, gli alogeni
rappresentano invece l'unica anomalia di questa reazione. Infatti normalmente gli alogeni li
abbiamo visti come disattivanti, rallentanti, nelle reazioni di sostituzione elettrofila aromatica
invece nel caso della reazione catalizzata da un enzima resta solo l'effetto orientante ma non c'è
disattivazione, non c'è rallentamento nella cinetica di reazione. Ricordiamo che parliamo di
preferenzialità nella posizione, di regioselettività e poi velocità con cui la reazione potrà
avvenire. Quindi attivante orto para orientante erano tutti questi gruppi tranne gli alogeni che
restano solamente orto para orientante, invece dovevano essere disattivanti, dovevano
rallentare la reazione ma con i citocromi non si ha nessun rallentamento perché tanto la
reazione è catalizzata da un enzima, cioè da una struttura proteica preposta a farla avvenire con
un elevatissima velocità e non si ha alcun momento di rallentamento.
Sostituenti invece realmente disattivanti sono i gruppi carbossilici, solforici, le solfonamidi, il
gruppo trifluorometile che se posizionati sulla molecola fanno si che questa posizione venga ad
essere sfavorita nella sostituzione, nella reazione di idrossilazione aromatica. Quindi se ho un
anello aromatico con un sostituente attivante, io mi troverò che le posizioni para e orto sono
favorite (nelle immagini ho messo delle frecce più grandi), al contrario invece mi troverò che la
sostituzione in beta diventerà sfavorita e rallentata per la presenza già dei sostituenti sulla
molecola. Se invece ho 2 gruppi, presenti sulla struttura dell'anello aromatico, entrambi attivanti,
mi ritroverò che tutte le posizioni diventano equivalenti perché si trovano in orto rispetto a
questo sostituente o in orto rispetto a quest'altro e di conseguenza avremo l'uguale probabilità
di poter introdurre un gruppo ossidrilico su una struttura aromatica.
Quindi l'idrossilazione aromatica la opera il citocromo P450 con il meccanismo determinato
dalla protoporfirina 9 che si lega all'atomo di ossigeno e lo rende disponibile all'introduzione
per sostituzione elettrofila aromatica.

EPOSSIDAZIONE
Reazione operata sempre dai citocromi P450, è la reazione di epossidazione. Non più quindi
introduzione di un OH, ma introduzione solamente di un atomo di ossigeno sotto forma di
epossido ( Un epossido è un etere ciclico in cui l'ossigeno è uno degli atomi di un anello a tre
termini).

E' una reazione importante, soprattutto su alcune sostanze che sono contenute nel fumo della
sigaretta. (Con questo esempio capiamo perché il fumo è nocivo). Quando andiamo ad
assumere con il fumo di sigaretta la nicotina, insieme è contenuta un'altra serie di idrocarburi
aromatici e tra questi è presente anche il benzo-a-pirene che è una struttura pentaciclica,
costituita da 5 anelli aromatici condensati tra di loro. Questi una volta introdotti all'interno
dell'organismo possono viaggiare all'interno del torrente ematico fino a raggiungere la
struttura del citocromo P450 a livello del sistema microsomiale epatico. In questa sede gli
enzimi presenti daranno luogo ad una reazione di ossidazione perché c'è quella disponibilità di
ossigeno e allora il benzo-a-pirene viene subito convertito nel suo derivato 4,5-epossido
(reazione catalizzata dal citocromo P450). L'altra possibilità è che si venga a formare l'epossido
in una diversa posizione perché questi anelli aromatici hanno eguale disponibilità di densità
elettronica su questi doppi legami e quindi si forma l'epossido in posizione 7,8 (7,8-epossido).
Questo va ancora in contro a reazioni di idrossilazione, sempre catalizzate da questi citocromi,
convertendo il gruppo che abbiamo appena introdotto in un derivato diolico. Il diolo subisce
ancora epossidazione in questa posizione. L'epossido si forma in questa posizione perché si
trova in posizione immediatamente adiacente al gruppo OH che abbiamo introdotto e quindi la
densità di elettroni, la possibilità di far avvenire la reazione diventa funzione del sostituente già
introdotto. Infatti prima abbiamo visto che le posizioni in orto e i gruppi OH sono favorite nelle
reazioni dei citocromi, quindi una volta innescato questo meccanismo, qui abbiamo un eguale
probabilità (vedi immagini) ma poi la molecola si apre e non c'è più uguale probabilità,
sicuramente si formerà l'epossido in questa posizione. Di questo epossido se ne possono venire
a formare 2 forme: l'isomero α ogni 2 legami al di sopra del piano e l'isomero β son i 2 legami
al di sotto del piano.
Una volta formatasi questa struttura, questa molecola è ancora fortemente lipofila, può viaggiare
all'interno dell'organismo e può intercalarsi, in virtù della sua perfetta planarità, all'interno delle
basi che costituiscono il DNA. Una volta arrivato nel DNA si mette tra una base e l'altra perché è
perfettamente schiacciata. Ma poi ricordiamo che il gruppo epossidico che si è formato in
grande quantità (la reazione non avviene con uguale probabilità, infatti si forma il 99%
dell'isomero β e l'1% dell'isomero α). L'isomero β che si è appena formato si va ad intercalare e
questo epossido è pronto ad interagire come una molla, perché è fortemente tensionato, nel
momento in cui subisce attacco nucleofilo da qualche gruppo. Ricordiamo che la posizione 7
della guanina è un nucleofilo molto valido e di conseguenza il suo doppietto tenderà a reagire
qui sopra e quindi lo stereoisomero β induce un legame sugli acidi nucleici, una mutazione nel
DNA e determinare quindi un’ induzione di un fenomeno di tipo tumorale. Fenomeno che può
avvenire in maniera diffusa all'interno dell'organismo ma che poi può avvenire in maniera più
spiccata a livello del tratto polmonare perché l'elevata concentrazione che noi realizziamo con
l'inalazione che fa sì che ci sia una maggior quantità di benzo-a-pirene localizzato a livello del
tessuto polmonare e quindi il fumo provoca il cancro in linea generale e lo può procurare in
particolar modo a livello del tessuto polmonare per l'elevata concentrazione di benzo-a-pirene
che si localizza in quel distretto.

Altri distretti che possono essere oggetto di reazione di ossidazione, in particolare, di


idrossilazione da parte dei citocromi sono i siti in α agli eteroatomi presenti nelle molecole.

Quando all'interno di un farmaco abbiamo un atomo di azoto o un atomo di ossigeno o un


atomo di zolfo il carbonio immediatamente adiacente si trova con una condizione particolare
perché la distribuzione degli elettroni in questo legame non sarà più uguale come se avessimo
un legame C-C. con un legame C-O si avrà che l'ossigeno essendo più elettronegativo tenderà ad
attrarre di più gli elettroni verso il suo nucleo lasciando una carica δ - sull'atomo di ossigeno e
una carica leggermente δ+ sull'atomo di carbonio adiacente. Quindi questo atomo di carbonio
che si trova povero di elettroni può subire subito un attacco dal citocromo P450 che è in grado
di introdurre un gruppo su questa posizione in maniera molto selettiva.
Ricapitolando, l'idrossilazione aromatica avviene sulla struttura del benzene e segue le
condizioni dei regioselettività, la reazione di epossidazione avviene sempre su strutture
aromatiche e segue sempre quello schema di regioselettività e la reazione di idrossilazione può
poi avvenire in alfa agli eteroatomi presenti all'interno delle molecole. Quindi se abbiamo un
farmaco R'CH2N ci possiamo trovare immediatamente nella condizione (riportata
nell'immagine) in cui si ha l'introduzione di un OH in α, cioè sul carbonio adiacente rispetto
all'azoto. Questa struttura può poi evolvere perché questo gruppo si va a staccare e si ottiene N-
dealchilazione perché si ha distacco tra l'atomo di carbonio e l'atomo di azoto che avevamo
visto legati precedentemente, si forma l'aldeide e si libera il gruppo amminico corrispondente.
Tutto questo avviene sia su l'atomo di azoto e si liberano le ammine, avviene sull'atomo di
ossigeno e si liberano gli alcool, se avviene su l'atomo di zolfo si libera il tiolo corrispondente.

Facciamo un esempio concreto di N-dealchilazione: prendiamo come esempio la caffeina,


vediamo la N-demetilazione della caffeina nell'uomo.

La caffeina chimicamente è una purina, appartiene alla classe delle trimetilxantine. Ha un


gruppo metilico in posizione 1, uno in posizione 3 e uno in posizione 7. Questa molecola sulla
base di quello che abbiamo detto potrà subire una reazione di metabolizzazione da parte del
citocromo P450 sull'atomo di carbonio immediatamente adiacente all'azoto. L'unico che ha
questa condizione è questo CH3 in posizione 1, quello in 3 e quello in 7.
Vediamo cosa succede se avviene questa reazione in posizione 1: si ha la scissione e quindi la
liberazione della purina e di questo gruppo carbonioso che vi era legato sotto forma di aldeide.
Quindi si libera una molecola di formaldeide e poi si libera questa base xenantinica che è la 3,7
dimetilxetantina ovvero la teobromina contenuta nel cacao. Se la reazione avviene in posizione
7: resta la 1,3 dimetilxenantina che è la teofillina contenuta nel tè. Se la reazione coinvolge
invece il CH3 in posizione 3 si ha la liberazione della paraxantina che è in realtà è quella che
avviene per l'84% della quantità della caffeina che noi andiamo a somministrare.
Quindi il percorso metabolico della caffeina introdotta è la sua conversione in altre xenantine:
84% paraxantina (con dealchilazione in posizione 3), 12% teobromina (posizione 1) e 4%
teofillina (posizione 7).
Ricordiamo ancora una volta che queste reazioni avvengono nel sistema microsomiale epatico
con i citocromi che danno luogo a questa reazione di introduzione di un gruppo ossidrilico in α
all'eteroatomo e poi lo fanno scindere liberando un aldeide e l'ammina libera. Notiamo bene che
liberandosi l'ammina si ottiene un gruppo più idrofilo rispetto alla molecola di partenza e
quindi viene rispettato quel principio che caratterizza le reazioni di fase I, ovvero introdurre dei
gruppi funzionali sulla molecola che siano più idrofili e quindi più facilmente eliminabili.
La N-dealchilazione non sembra un’ossidazione ma il meccanismo con cui avviene la reazione
prevede prima una idrossilazione in cui il -CH3 diventa -CH2OH e poi successivamente si ha la
dealchilazione con formazione di formaldeide, quindi di fatto è un ossidazione.

Piccolo particolare: il fatto che si liberasse formaldeide ha fatto pensare che la caffeina potesse
essere cancerogena, mutagena. In realtà degli studi hanno dimostrato che questa potenziale
mutagenicità della caffeina è rispettata solo in vitro. Infatti in vivo tutta la formaldeide che si
libera viene immediatamente ossidata ad acido carbossilico che non è più reattivo. Infatti in
vivo interviene un altro enzima, un'altra ossidasi che converte la formaldeide in acido formico
che entra nel ciclo della metabolizzazione e quindi non si esplica attività cancerogena.

OSSIDAZIONE DEGLI ALCOOL PRIMARI


Queste reazioni non sono più condotte da parte dei citocromi ma vengono condotte da degli altri
enzimi di cui il principale rappresentante è l'alcool deidrogenasi che è presente sia a livello
epatico ma è presente anche a livello gastrico e in piccola percentuale è presente anche
addirittura nel torrente ematico. Il sistema ADH è costituito da enzimi extramicrosomiali.

L'alcool deidrogenasi è un enzima extramicrosomiale, infatti non sta più strettamente localizzato
a livello della struttura del reticolo endoplasmatico ruvido. L'alcool deidrogenasi ha il compito di
convertire la struttura dell'alcool dapprima in un aldeide e infine in un acido carbossilico.
Cosa si può formare da un alcool primario? Esempio: Immaginate gli alcool, gli aldeidi e gli acidi
carbossilici come un condominio dove a piano terra abitano gli alcool, al piano intermedio
abitano gli aldeidi e i chetoni e al secondo piano sopra tutto sono presenti gli acidi carbossilici.
Questo schema rappresenta le condizioni di ossidazione che possiamo realizzare. Quindi dal
piano terra (alcool primario) si può arrivare o ad aldeide e chetone oppure ad acido carbossilico
dal piano intermedio (aldeidi e chetoni) per ossidazione si ottengono gli acidi carbossilici,
mentre per riduzione si ottengono gli alcool primari. (Se la immaginiamo in questo modo
possiamo ricordarci gli stadi di ossidazione alcool, aldeide e chetone, acido carbossilico).
Altro particolare: dagli alcool primari, ad esempio dall'alcool etilico si forma prima l'acetaldeide e
poi si può formare l'acido acetico che rientra nel ciclo di Krebs e che quindi produce energia.
Quando beviamo una grande quantità di alcolici noi andiamo a far lavorare moltissimo l'alcool
deidrogenasi che ha il compito di convertire questo alcool etilico in una struttura energetica,
tanto è vero che l'alcool fa pure ingrassare perché abbiamo una grandissima quantità di
energia disponibile che poi viene immagazzinata sotto forma di acidi grassi. Al tempo stesso se
andiamo a saturare questa possibilità di conversione, si potrebbe avere che l'alcool tende a
perdurare ad elevata quantità, ma che si formino anche grandi quantità di aldeide che induce la
nausea e il vomito. Queste reazioni di ossidazioni avvengono sugli alcool primari in modo tale
da poterli convertire ad acidi carbossilici. Gli alcool secondari si possono convertire solamente
in aldeidi e chetoni, gli alcool terziari invece non si trasformano proprio in niente.
Altro sito di possibile ossidazione, non sono soltanto i carboni coinvolti in queste reazioni di
ossidoriduzione, ma anche gli atomi di azoto, quindi la presenza di un azoto all'interno della
molecola di un farmaco può dare luogo ad ulteriore ossidazione se lo convertiamo in un N-
ossido. La struttura amminica terziaria, l'unica possibile ossidazione è quella di mettere a
disposizione questo doppietto e di fargli legare con un legame dativo un atomo di ossigeno.
(Molto simile a ciò che faceva il citocromo P450, cioè introduciamo atomi di ossigeno sulla
strutta del farmaco. Se questa operazione non la facciamo sul carbonio ma sull'azoto facciamo
un reazione di N-ossidazione, convertendo la molecola in un N-ossido). La struttura della
piridina è uno dei siti dove si può avere N-ossidazione nella conversione in N-ossido. Questo per
quel che riguarda le ammine terziarie. Le ammine secondarie si possono invece convertire
proprio in un idrossilammina, introduzione del gruppo ossidrilico su l' atomo di azoto. Non più
la necessita di fare un legame dativo ma reale introduzione di un gruppo OH sulla struttura della
ammina secondaria. Anche le ammidi secondarie (vedete quando sono primarie e quando sono
secondarie) possiamo fare ossidazione introducendo un OH su l'NH. Quella più importante però
è l'ossidazione delle ammine primarie, perché il destino metabolico dei gruppi NH2 nel nostro
organismo normalmente è quella di essere convertita prima in un derivato idrossilamminico
NHOH, ma poi la reazione va molto avanti, si forma il nitroso derivato fino a poi a formare il
nitroderivato sulla molecola. Quindi i gruppi NH2 si possono convertire per ossidazione in
gruppi NO2. Vedete che viene rispettato perfettamente quel principio che dicevo prima, ovvero
che le reazioni di ossidazione sono quelle che in cui aumentano gli atomi di ossigeno e
diminuiscono gli atomi di idrogeno nelle molecole organiche, da NH 2 si forma NO2. Meno
idrogeni, più ossigeni.

Analizzate le reazioni di ossidazione di fase I, si prendono ora in considerazione, sempre della


fase I, le razioni di tipo riduttivo (che sono il contrario di quelle appena viste) e poi infine
analizzeremo quelle di idrolisi.
Reazioni di Riduzione

Le reazioni di riduzione sono meno importanti delle ossidazioni anche se molti profarmaci
vengono attivati solo per riduzione.
Le riduzioni possono avvenire nei microsomi, nel citosol delle cellule e anche nei batteri
intestinali anaerobi che costituiscono la flora intestinale.
Quando si ha una forma intermedia che si può ossidare o ridurre, l’ossidazione prevale
sempre sulla riduzione ed è irreversibile
Se abbiamo a che fare con un farmaco in cui c'è la possibilità in cui un gruppo si può ossidare o
si può ridurre, sicuramente avverrà l'ossidazione, però le riduzioni possono avvenire
comunque, sia nei microsomi, sia nel citosol delle cellule e soprattutto possono avvenire a livello
della flora batterica e intestinale ancora prima che il farmaco entri all'interno del nostro
organismo. Perciò dobbiamo prenderle in considerazioni perché sono le reazioni preferite dai
batteri, non tanto le reazioni preferite dal nostro organismo che preferisce le ossidazioni.

Sono l'inverso di quelle che abbiamo visto. Gli alcool possono andare al primo piano ad aldeidi e
chetoni, e al secondo piano ad acidi carbossilici. Allora se abbiamo un chetone all'interno di
una struttura è possibile la sua conversione in un alcool secondario, infatti la riduzione del
legame C=O porta la formazione di un alcool secondario. La riduzione di un aldeide porta la
formazione di un alcool primario.
Vediamo ancora quali gruppi si possono ridurre. I doppi legami presenti sulle strutture,
soprattutto quando sono α -β insaturi, cioè coniugati rispetto ad un altro gruppo carbonilico
presente nella molecola: C=O, poi legame singolo e dopo doppio legame C=C (vedi figura).

Questo doppio legame, che si chiama α -β insaturo è un insaturazione tra il carbonio in α al


carbonile e il carbonio β al carbonile, può dare luogo alla molecola ridotta semplicemente alla
formazione del chetone. Chetone che poi può andare in contro alla reazione che è riportata
sopra che può portare alla formazione dell'alcool secondario. Molto spinta invece è infine la
riduzione dei gruppi para-chinonici presenti all'interno delle strutture farmacologicamente
attive. Alcuni farmaci, il menadione (la vitamina K) hanno questo nucleo con il C=O e il C=O
all'interno della sua struttura, è una para-chinone (p-chinone). I para chinoni possono subire
riduzione in maniere molto spinta e diventare il corrispondente diolo aromatico. Questa
struttura in para diolica dura molto poco perché poi basta che si espone semplicemente all'aria
senza nessun enzima che la reazione ritorna indietro nella forma p-chinonica. Quindi il
metabolismo riduttivo esiste ma nel nostro organismo è poco rilevante perché tenderà a
prevalere la forma ossidata dei farmaci.

La stessa cosa che abbiamo visto su gli atomi di carbonio può valere anche sugli atomo di
azoto.
Riduzioni sull’atomo di azoto

Dall'N-ossido si può tornare indietro alla formazione dell'ammina terziaria. Dal gruppo nitro si
può avere la formazione fino a del nitroso derivato, poi dell'idrossilammina, poi dell'ammina
primaria anilina. Questo è il contrario di quello che abbiamo visto prima nello schema di
ossidazione. Importante invece sono le riduzioni delle molecole che contengono un doppio
legame N=N (questo si chiama legame azoico). Il legame azoico può essere sotto forma di N-
ossido e quindi è azossi, poi diventa azo, poi idrazo e poi diventa ammina primaria ancora
attraverso una reazione di riduzione. Quest'ultima reazione è quella che è interessante da un
punto di vista farmaceutico infatti la scoperta dei farmaci sulfamidici è avvenuta assolutamente
per caso. (I sulfamidici sono una classe di chemioterapici, non sono di origine naturale ma
molecole di sintesi fatta in laboratorio. La scoperta dei farmaci sulfamidici è avvenuta
assolutamente per caso intorno agli anno 60).
Le vernici che venivano utilizzate in quel periodo erano costituite da una molecola in cui c'era
un doppio legame azoto-azoto (quindi un legame azoico).
Guardando questa molecola ci si rende conto della forte coniugazione dei legami: doppio legame,
legame singolo, doppio, ecc. Questa molecola si chiamava prontosil rosso ed era utilizzata per le
vernici. Tutti gli studi che sono stati condotti su queste molecole hanno consentito di dimostrare
che il doppio legame N=N può essere scisso da parte della flora batterica intestinale e quindi il
prontosil rosso è in realtà un profarmaco perché quando si trova a contatto con la flora batterica
intestinale questo doppio legame azoto-azoto subisce questo processo riduttivo che abbiamo
analizzato prima.
Cioè dal doppio legame N=N si forma prima il derivato idrazinico e poi la molecola si spezza qui
in mezzo e si libera una molecola con un gruppo sulfonamidico (R-SO2-NH2) e poi si libera la
1,3,4-triaminobenzene.Questa struttura, la sulfonamide con il gruppo amminico in para, si
chiama sulfanilamide ed è il capostipite della classe dei sulfamidici. Quindi questo farmaco si è
scoperto per caso perché nell'industria delle vernici si utilizzava il prontosil rosso che è stato
uno dei primi profarmaci della storia perché poi somministrato si scinde, libera per un
processo enzimatico il farmaco reale che è la sulfanilamide e che va all'assorbimento ed ha un
suo meccanismo d'azione vero e proprio.
Questi processi di riduzione li si possno vedere nel cloramfenicolo dove il gruppo nitro viene
convertito in ammina.

Quindi sono vari e vasti gli esempi di metabolismo riduttivo che possono avvenire all'interno
dell'organismo, sia a carico degli atomi di carbonio che a carico di quelli dell'azoto.

Reazioni di Idrolisi

Sono enzimi (idrolasi) che catalizzano l’idrolisi di legami chimici attraverso l’aggiunta di una
molecola di H2O.
Di maggiore importanza:
Amidasi
Esterasi
Endopeptidasi
Esopeptidasi
Possono dunque classificare in esterasi, se quello che viene scisso è un legame estereo, in
amidasi se quello che viene scisso è un legame ammidico. In linea generale si preferisce parlare,
nel caso delle amidasi, cioè di scissione di legami ammidici, o meglio di legame peptidici perché
le strutture proteiche contengono una vasta quantità di legami ammidici, si parla di
endopeptidasi quando questi enzimi sono in grado di tagliate i legami peptidici localizzati
all'interno della sequenza della struttura proteica, si parla in vece di esopeptidasi quando questa
scissione avviene nella parte estrema del peptide. Più precisamente le esopeptidasi, che
effettuano il taglio all'estremità terminali, possono essere delle carbossipeptidasi se questa
scissione avviene dal lato C-terminale della proteina, oppure possono essere delle
amminopeptidasi se la scissione del legame ammidico avviene sul lato N-terminale
Classificazione regioselettiva delle peptidasi:
ENDOPEPTIDASI: enzimi proteolitici appartenenti alla classe delle idrolasi, che catalizzano
l’idrolisi dei legami peptidici interni alla catena delle proteine o dei peptidi (ES. pepsina, tripsina,
chimotripsina, elastasi).
ESOPEPTIDASI: enzimi proteolitici che catalizzano l’idrolisi dei legami peptidici in
corrispondenza delle estremità delle catene proteiche (ES. carbossipeptidasi, amminopeptidasi).

Vediamo ora il meccanismo con cui avviene la scissione di questi legami esterei e amminici e
vediamo come è fatto il sito catalitico di una idrolasi (sia esterasi che amidasi).

E' necessario che a livello del sito catalitico, dove deve essere accomodata la nostra molecola e
deve essere scisso questo gruppo funzionale, ci debba essere un gruppo elettrofilo, molto spesso
è un metallo, per cui si parla di metalloproteasi (ad esempio un atomo di zinco). Lo zinco in
questa posizione è in grado di esercitare un forte effetto di elettrone attrattore. Se guardiamo il
legame carbonilico, già c'è una distribuzione degli elettroni in maniera non omogenea perché
sull'atomo di ossigeno è come se già ci fosse un δ - perché l'ossigeno è più elettronegativo del
carbonio. Quindi è come se avessimo δ - sull'ossigeno e δ+ sull'atomo di carbonio. Questa forte
polarizzazione, potenziata dall'elettrofilo come ad esempio dall'atomo di zinco delle
zincoproteasi, fa si che ci sia un orientazione perfetta di questo estere, in questa posizione, e il
δ+ del carbonio molto esposto all'interazione con un nucleofilo perché maggiore è il carattere
elettropositivo del carbonio che noi andiamo a realizzare tanto maggiore sarà la probabilità che
un doppietto presente su un altro residuo amminoacidico possa portare l'attacco e possa
scindere la struttura dell'estere.

In particolare, nella serina-idrolasi, questo doppietto è presente su un gruppo OH del residuo di


serina che si trova esattamente di fronte all'estere che deve essere scisso.
Si vede come la struttura tridimensionale dell'enzima diventa importante perché il sito catalitico
è costruito proprio in modo che qui c'è l'atomo di zinco, si metterà all'interno la molecola da
scindere e dall'altro lato e già disponibile l' OH di serina che deve andare a portare l'attacco e
deve spezzare in 2 la molecola.

(Ora per seguire la spiegazione del meccanismo seguire l’ immagine).


La serina porta l'attacco, se pensate che questo doppietto porta l'attacco su quest'atomo di
carbonio ricordiamoci cosa succedeva per gli acidi carbossilici: il doppietto porta l'attacco,
immediatamente questo doppietto del doppio legame tende a saliere qui sopra e si forma l'O-,
poi il doppietto scende e questo se ne va via sotto forma di gruppo uscente. Per essere un buon
gruppo uscente è necessario poi che ci sia qualcuno in grado di liberare questo idrogeno. Se ci
troviamo con l'acido coniugato di una qualsiasi base, questo protone può essere ceduto
facilmente e quindi si ottiene che il gruppo uscente non è più RO- ma è ROH (buon gruppo
uscente). Allo stesso modo, nel caso di questa scissione dell'ammide si viene a formare un
derivato simile all'ammoniaca con i 3 legami fatti dall'atomo di azoto che diventano ottimi
gruppi uscenti. Abbiamo quindi compreso qual è il meccanismo catalitico delle idrolasi che
possono essere poi classificati in serina-idrolasi, se questo Y è una serina con il suo gruppo OH,
oppure cisteina-idrolasi se questo è un gruppo SH, oppure possono essere delle aspartico-
idrolasi in cui c'è una molecola di H2O che ci darà questo meccanismo di scissione dell''estere.

Ma perché questa molecola di H2O è stata precedentemente attivata dall'acido aspartico che è
stato in grado di sottrarre un protone e di liberare l'OH- che va a portare l'attacco sul gruppo
carbonilico? Ancora si parla di metalloproteasi o di zincometalloproteasi se su questa posizione
della struttura dell'enzima è presente appunto una struttura metallica che potenzia la
polarizzazione δ- δ+ del gruppo carbonilico dell'estere o dell'ammide. Quello che abbiamo detto
rappresenta il meccanismo chimico alla base delle idrolisi di questi esteri e delle ammidi.
Studiando più nel dettaglio il processo ci rendiamo conto che in realtà non è solamente 1
residuo amminoacidico ad essere coinvolto nella scissione degli esteri e delle ammidi.
Normalmente si parla infatti di triade catalitica nelle serina-proteasi o nella cisteina-proteasi.
Si parla di triade catalitica perché in realtà il gruppo ossidrilico della serina deve essere
pronto, disponibile a poter portare l'attacco all'estere che deve essere scisso. Per poter essere
così pronto e disponibile vuol dire che non deve stare sotto forma di OH ma deve essere
deprotonato sotto forma di O- perché c'è una maggiore disponibilità di elettroni i quali saranno
responsabili dell'attacco nucleofilo dell'estere.
Chi allora c rende più nucleofila la serina all'interno del sito catalitico? Ebbene in questi enzimi
ci sono 3 amminoacidi, uno a fianco all'altro, 3 residui localizzati sempre nelle stesse posizioni
tridimensionali e fanno si che la serina venga attivata. Questo perché immediatamente affianco
alla serina c'è un residuo di istidina. E' proprio il residuo di istidina che con quest'atomo di
azoto va a sottrarre l'idrogeno a l'OH, quindi lo converte in O-. Questa posizione diventa NH, il
doppio legame passa da quest'altro lato, sta riportato sotto, diventa NH (lo vedete nelle
immagini). L' idrogeno che diventa surplus dell'istidina viene ceduto all'acido aspartico
immediatamente adiacente. Quindi se guardiamo il meccanismo in maniera completa è come se
l'acido aspartico depauperasse di un protone l'istidina, l'istidina si va a rivalere sulla serina, la
serina ha l'O- e va ad attaccare la funzione carbonilica dell'estere che poi viene scissa. Ed è per
questo che si parla di triade catalitica, perché c'è una compartecipazione di 3 residui
amminoacidici per poter innescare la scissione dell'estere o dell'ammide.

Triade catalitica
Serina esterasi

Facciamo adesso un esempio farmacologico di idrolisi esterea: la cocaina


La cocaina subisce un metabolismo di tipo idrolitico, infatti una volta che penetra all'interno del
nostro organismo dove agisce da stimolante del sistema nervoso centrale attraverso l'inibizione
del reuptake delle ammine biogene. La cocaina deve essere poi metabolizzata una volta
introdotta ed esplicata il suo effetto tossico o da anestetico locale. Questa metabolizzazione
avviene appunto per scissione dell'estere.
Quali esteri vengono scissi all'interno della cocaina? Questo è proprio un esempio dove il
metabolismo può avvenire in più modi. Una parte della molecola subisce metabolismo per
'idrolisi di questo estere metilico e quindi si ha la formazione di questo primo derivato con il
gruppo COOH libero. Vige ancora il concetto che le reazioni di fase I liberano gruppi funzionali
più idrofili che poi possono essere sottoposti alla coniugazione. Questa prima scissione del
gruppo metilico può poi essere seguita dalla scissione di un altro estere, l'estere benzilico che è
presente all'interno della molecola fino a liberare questa struttura, questo nucleo che si chiama
nucleo tropanico che è quello contenuto all'interno della cocaina e che non ha più attività.
Questo gruppo che si è liberato sono le porzioni che possono essere destinate ad un
metabolismo di fase II e a far si che si trovino dei metaboliti della cocaina con il nucleo tropanico
coniugato all'acido glucuronico o acetilato in modo tale da ritrovarle in questa forma all'interno
delle urine. Allora la cocaina non si elimina tal quale ma subisce prima 2 idrolisi, quella
dell'estere metilico e dell'estere benzilico e poi le reazioni di coniugazione, e questi sono i
metaboliti che vengono ritrovati.(quindi in un esame tossicologico cerchiamo questi), al
contrario nel sangue cercheremo la molecola che non ha subito ancora il processo di
metabolizzazione. Questo tipo di idrolisi può avvenire anche al contrario, vale a dire può
avvenire prima l'idrolisi della funzione benzilica, poi l'idrolisi della funzione dell'estere metilico
ma alla fine il metabolita che si ottiene è sempre lo stesso. La reazione che vedete al centro
invece non è una reazione di idrolisi ma una reazione di trans-esterificazione, cioè di
sostituzione di un estere con un altro, che può avvenire sia in un laboratorio sia nel nostro
organismo ad opera di alcuni enzimi.
Piccola curiosità : cosomministrazione della cocaina con gli alcolici. La cocaina in presenza di
elevate quantità di etanolo non sarà più caratterizzata da un estere metilico ma avviene la trans-
esterificazione e si forma questo metabolita che si chiama coca-etilene (cioè con l'estere etilico
anziché quello metilico). In questo modo aumenta ancora di più la lipofilia della molecola e
questa supererà più facilmente la barriera ematoencefalica, penetra nel sistema nervoso
centrale e diventa ancora più potente alla molecola di partenza (ricorda che comunque il
metabolismo di questa molecola poi sarà sempre lo stesso).

Reazioni di fase II
Coniugazioni
Criteri delle reazioni di coniugazione
Un substrato si lega ad una molecola endogena che di solito è:
1.polare
2.di medio peso molecolare (100-300 Da)
3.trasportata da un coenzima. La reazione è catalizzata da una transferasi.

Abbiamo detto che tutte queste reazioni sono accomunate da una caratteristica, cioè che il
nostro substrato deve legarsi ad una molecola endogena, già presente nel nostro organismo che
normalmente è molto polare e che è caratterizzata da un peso molecolare compreso tra i 100 e i
300 Dalton come l'acido glucuronico, e si presenta in forma attivata per poter essere legata al
nostro farmaco perché è trasportata da un coenzima. Ci saranno quindi degli enzimi che
saranno in grado di catalizzare la reazione di trasferimento, di questa porzione molecolare, sulla
struttura del nostro farmaco. La reazioni metaboliche di fase II sono endoergoniche (con
consumo di energia) avvengono, cioè, a spese di materiale endogeno, per cui è necessaria una
preventiva attivazione del materiale endogeno o del farmaco. Possono avvenire con gruppi
reattivi già presenti nella struttura dello xenobiotico/farmaco, oppure con gruppi reattivi
introdotti attraverso le reazioni di fase I, (-OH,-COOH,-NH2,-SH) cioè su un metabolita del
farmaco formato dalle reazioni di fase I, prevedono la formazione di un legame covalente tra la
molecola che vogliamo introdurre e quella del nostro farmaco stesso e che porta ad una
molecola più idrofila.

NOTA IMPORTANTE: Il concetto di incremento di idrofilia però non è sempre vero. E' vero per
tutte le reazioni di fase I e per tutte quelle di fase II, tranne la metilazione e l'acetilazione perché
se ci pensiamo l'introduzione dell'acetile o l'introduzione del metile fa diminuire nuovamente
l'idrofilia della molecola che stiamo prendendo in considerazione.

Reazioni di Metilazione
Il trasferimento dei radicali metilici avviene attraverso la mediazione della S-adenosil-
metionina (SAM), una forma attivata della metionina in grado di cedere gruppi metilici sulla
struttura dei farmaci. Tale trasferimento è catalizzato da enzimi transferasici localizzati nella
frazione solubile citosolica.

La S-adenosil-metionina rappresenta in pratica una forma attivata della metionina. La formula


della S-adenosil-metionina è questa che vedete nelle immagini: abbiamo l'adenina legata allo
zucchero e poi alla metionina.

In questo modo la metionina si trova in una forma elevata, in termini di energia libera, e in
questo modo la cessione del gruppo metilico trasportata sulla struttura della metionina diventa
possibile convertendo la S-adenosil-metionina che perde questo CH3 e perde anche la carica e si
converte in S-adenosil-omocisteina che corrisponde alla struttura con l'SH.
La differenza tra cisteina e metionina è la presenza di un gruppo tiolico rispetto ad un gruppo
metilico in questa posizione. Quindi dalla S-adenosil-metionina si forma la S-Adenosil-
omocisteina e si ottiene l'introduzione del gruppo metilico sulla struttura del gruppo OH o del
gruppo NH che avevamo liberato attraverso l'introduzione di reazione di fase I.

Le metilazioni agiscono diminuendo la solubilità, mascherando alcuni gruppi reattivi e non


facilitano l’eliminazione del farmaco.
Principali enzimi che catalizzano le reazioni di metilazione, utilizzando l' S-adenosil-metionina
come coenzima, sono:
O-Metilazioni:
Catecol O-metiltransferasi (COMT)
N-Metilazioni:
Istamina N-metiltransferasi (HNMT)
Nicotinammide N-metiltransferasi (NNMT)
Feniletanolammina N-metiltransferasi (PNMT)
S-Metilazioni:
Tiopurina S-metiltransferasi (TPMT)
Tiolo S-metiltransferasi (TMT)

Le COMT sono una famiglia di enzimi in grado di trasformare gli OH catecolici presenti sulle
ammine biogene in OCH3. Il catecolo è quello in cui ci sono 2 OH in orto l'uno rispetto all'altro
sulla struttura aromatica. In pratica nei derivati del fenolo se introduciamo un altro OH prendono
il nome di catecolo se stanno in orto, Idrochinone se stanno in para e Resorcina se stanno in
meta l'uno rispetto all'altro rispettivamente. L’ HNMT è un enzima in grado di introdurre un CH3
sull'atomo di azoto presente sulla struttura stessa dell'istamina. Ce ne sono una serie ma il
meccanismo è sempre lo stesso. Ovvero sul gruppo ossidrilico che abbiamo introdotto in fase I
può avvenire un ulteriore trasformazione nella conversione del derivato di tipo metilico
catalizzata dalla S-adenosil-metionina. Ricordatevi che le metilazioni diminuiscono la solubilità.

Esempi di O- e di N- metilazioni sono riportati nelle immagini.

L’azoto o l’ossigeno possono essere gli accettori del radicale alchilico; in particolare la N-
alchilazione si ha a carico degli anelli eterocicilici contenenti N, la O-metilazione si verifica
invece in composti fenolici (ES. catecolammine).

La O-metilazione delle catecolammine è catalizzata dalle COMT che sono le Catecol-O-Metil-


Transferasi ed è un processo di fondamentale importanza nella inattivazione fisiologica dei
mediatori adrenergici nonché di numerosi farmaci affini.
Gli OH catecolici possono essere convertiti con le Catecol O-metiltransferasi (COMT), quindi
trasferimento di unità metiliche sugli ossigeni del catecolo. Il cofattore che opera questo
trasferimento la S-adenosil-metionina, forma attivata della metionina per la cessione dell'unità
metilica su questa struttura. Esempi di queste reazioni le vediamo nelle immagini come la
catechina che era un vecchio farmaco antidiarroico.

Questo, diventa substrato delle COMT, infatti vediamo i 2 gruppi ossidrilici. In questa posizione
avremmo l'introduzione del gruppo metilico nella posizione meta che risulta tra l'altro favorita
rispetto alla posizione para. Allo stesso modo questa metilazione può avvenire anche sull'atomo
di azoto della piridina. Questa struttura che vedete nelle immagini è la struttura della nicotina.
Una delle vie di metabolizzazione della nicotina è appunto la conversione in N-metile, e poi il
derivato N-metilico protonato diventa più solubile in questo caso perché è protonato non
perché è più solubile per il bilancio idrofilo/lipofilo. Questo è il motivo per il quale la nicotina tal
quale che ha l'N subisce metabolizzazione per introduzione di un gruppo metilico perché si ha
la formazione dell'azoto protonato che è più solubile. Quindi vale ancora quel principio. Ma non
è la metilazione che fa si che aumenti l'idrofilia della molecola. E' l'introduzione di un azoto
carico che non può più essere riassorbito e che quindi verrà sicuramente eliminato in questa
forma. Quindi le metilazioni avvengono per questo motivo qua, non per 'aumento della lipofilia.

Reazioni di Solfatazione

Importante biotrasformazione sintetica che interessa i fenoli (fenolo, naftolo), gli alcol alifatici
(etanolo), e le ammine aromatiche (catecolammine, serotonina). Si tratta di una reazione di
coniugazione con acido solforico in cui il radicale solforico è trasferito al farmaco tramite
l’intervento di una forma di composto solforico attivo, l’adenosina-3’-fosfato-5’- fosfosolfato,
(PAPS) e la reazione è catalizzata da enzimi transferasici presenti nella frazione solubile
cellulare.
Introduzione di un gruppo solfonico sulla struttura del gruppo ossidrilico. Queste
trasformazioni riguardano molto spesso gli alcool, cioè le molecole che hanno un gruppo OH
possono essere metabolizzate ulteriormente per solfatazione in modo tale che anziché avere il
gruppo OH si ottiene il gruppo OSO3H che è fortemente acido e quindi si converte in OSO3- con
carica netta negativa.

La molecola che si viene a realizzare è molto più solubile, molto più idrofila e quindi viene molto
più facilmente eliminata, però per potere introdurre il gruppo solfato è necessario che ci sia un
coenzima, un cofattore in grado in donare unità solfato in maniere fortemente attivata. Il
donatore, mentre prima era la SAM, in questo caso è la 3’-fosfoadenosina-5’-fosfosolfato (PAPS).

Cioè abbiamo un AMP che porta sulla posizione 3 un fosfato aggiuntivo e un solfato legato
all'altro fosfato che sta in posizione 5. In questa posizione il gruppo solfato può essere
facilmente ceduto grazie alla scissione dei legami fosfodiesterei simili a quelli che sono presenti
nell'ATP. E questo è un legame tra lo zolfo e il fosforo di tipo diestereo che quindi è sempre un
legame ad elevata energia. L'unità fosfato viene trasferita sulla struttura del gruppo ossidrilico
grazie alla diminuzione di energia che si ottiene in questa molecola. Questi derivati quindi che si
vengono a formare avvengono su fenoli, alcoli, ammine, tioli. Però dobbiamo in considerazione
il caso particolare in cui questa reazione non avvenga sugli OH ma sulle ammine. Infatti sull'OH
si ottiene OSO3H, sul fenolo la reazione è la stessa, sui tioli c'è SH e quindi si ottiene SOSO 3H ma
vediamo come avviene la reazione su l'NH.
L'ammina viene convertita prima in idrossilammina (metabolismo riduttivo che abbiamo visto
prima) e su questo derivato si ha la possibilità di un metabolismo per solfatazione. Questo tipo
di esempio è molto pericoloso perché nel caso di solfatazione di ammine aromatiche si ha poi
che il gruppo solfato appena introdotto si possa staccare perché il legame N-O-S è poco stabile e
si viene a formare una specie radicalica con carica netta positiva che si chiama IONE
NITRENIO. Questo una volta nel nostro organismo si comporta come un agente alchilante, cioè
come una sostanza in grado di legarsi irreversibilmente subito a dei nucleofili. Ricordatevi che la
posizione 7 della guanina è uno dei gruppi nucleofili più disponibili nel nostro organismo e
quindi attenzione che nel caso in cui abbiamo delle ammine primarie aromatiche bisogna fare
un ottimo studio del metabolismo dei farmaci perché queste molecole possono andare in contro
ai derivati dell'anilina che da prima a idrossilazione e poi a solfatazione, formazione dello ione
nitrenio, e quindi potenziale cancerogenicità della molecola che prendiamo in considerazione
per colpa della formazione dello ione nitrenio che potrà formare un legame covalente con il DNA
(posizione 7 dell'adenina) inducendo fenomeni di mutagenesi e cancerogenesi.

Un esempio concreto di metabolismo per solfatazione è questo che vedete nell'immagine di


questo farmaco antiemicranico (Rizatriptan). Questo subisce in reazione di fase I
l'idrossilazione della posizione 6 dell'anello aromatico, dell'anello indolico, e quindi si ottiene il
6-idrossi-rizatriptan. Poi la posizione idrossica che abbiamo appena esposto viene sottoposta a
reazione di solfatazione e il metabolita che si trova a livello urinario è il 6-idrossi-rizatriptan
solfato.

Reazioni di Glucuronidazione

Sono le reazioni principali perché agiscono su molti composti e poi perché l’acido UDP-
glucuronico è disponibile in grande quantità. Gli enzimi preposti sono localizzati nel reticolo
endoplasmatico liscio a differenza degli altri che sono tutti citosolici.

I GLUCURONIDI vengono escreti con la bile e poi attaccati dalle idrolasi batteriche dell’intestino.
A seconda che si tratti di N, O, S-glucoronidi vengono scissi in acido glucuronico e composto di
partenza, che può essere riassorbito e subire ulteriori trasformazioni.
La reazione di coniugazione che però domina all'interno del nostro organismo per oltre il 90%
delle reazioni di fase II è la reazione di Glucuronidazione. Ovverosia l'introduzione di residui di
acido glucuronico sui gruppi OH, SH, NH2 liberi delle molecole del farmaco. Questa reazione
prevede ancora una volta che per trasferire l'acido glucuronico sul farmaco sia necessaria una
forma attivata dell'acido glucuronico. Quindi abbiamo sempre la presenza di un cofattore ad alta
energia che rende disponibile questo materiale endogeno da dover legare chimicamente e
covalentemente al nostro farmaco. Il cofattore che avremmo in questa circostanza è l'UDP-
glucuroniltransferasi. (Perché abbiamo che l'acido glucuronico è legato preventivamente
all'uridin-difosfato che funge da trasportatore). Quindi l'uridin-difosfato legato all'acido
glucuronico rappresenta la forma ad elevata energia dell'acido glucuronico che in presenza del
farmaco può legarsi, andarsi a sostituire, potete vederlo nelle immagini il legame tra l'ossigeno
dell'acido glucuronico e il gruppo ossidrilico che da luogo a questo nuovo derivato ma si libera
una molecola di UDP che è quella che è a più bassa energia e che quindi può far avvenire la
reazione catalizzata quindi dall'enzima UDP-glucuroniltransferasi.
Riassumendo
la reazione:
l'UDP (l'uracile
legato allo
zucchero e a i
2 fosfati)
legato all''acido
glucuronico
rappresenta la
forma attivata
(ad alta
energia). Il
farmaco a
questo punto
può portare,
con il gruppo
OH che ha nel
suo doppietto,
con il gruppo
NH2 che ha un doppietto disponibile, un attacco nucleofilo su questo legame e si libera UDP
come gruppo uscente. L'UDP è un ottimo gruppo uscente nella nostra reazione e quindi
abbiamo la possibilità di introdurre l'acido glucuronico sulla struttura del farmaco. Il vantaggio
dell'acido glucuronico è che ha un gruppo carbossilico con pKa di circa 3. pKa di circa 3
significa che a pH 3 la forma protonata è in egual concentrazione alla forma completamente
dissociata. Se però mi porto ad un valore di già 4-5 di pH inizierà a prevalere la forma dissociata
di 10 o 100 volte rispetto alla forma completamente protonata. Siccome il pH delle urine è
normalmente 5/5,5 se non 7, a questo punto quando il farmaco sotto forma di glucuronide
arriva a livello del tratto urinario, immediatamente questo gruppo si dissocia completamente e
quantitativamente dando luogo ad una specie con carica negativa che in quanto tale non si
riassorbe e si concentra a livello delle urine.
Ecco perché la reazione di glucuronidazione è una reazione che garantisce l'eliminazione del
nostro farmaco come un metabolita a livello del tratto urinario sotto forma di molecola più
idrofila.
Qui nelle immagini è riportato l'esempio della Zidovudina (AZT Azidotimidina; farmaco anti-
AIDS).

Dal gruppo OH presente sulla molecola di Zidovudina è possibile introdurre l'acido glucuronico.
Ciò che ci interessa è che a livello del tratto urinario avremmo un derivato finale che ha la carica
negativa. I glucuronidi però non si eliminano solo a livello renale, ma in grande quantità
vengono eliminati anche attraverso la bile. Infatti la reazione ha sede a livello del fegato. Pertanto
immediatamente la molecola diventata più solubile tende a concentrarsi a livello della bile e
attraverso questa viene secreta all'interno dell'intestino. Quindi i glucuronidi si possono
eliminare sia per via renale e sia per via fecale perché arrivano con la bile all'interno
dell'intestino e sotto questa forma di glucuronidi vanno via con le feci.
Queste due vie di eliminazioni sono uguali?
La risposta è NO. Differiscono per un solo aspetto. Infatti una volta arrivato all'interno
dell'intestino, il farmaco potrà incontrare la flora batterica intestinale, la quale può essere
responsabile della scissione del legame che abbiamo appena realizzato, del glucuronide, e
libererà il farmaco un’ altra volta il quale si riassorbirà e attraverso il torrente ematico arriva
un’ altra volta al fegato. Il fegato lo metabolizza di nuovo nel glucuronide e attraverso la bile lo
elimina un’altra volta a livello dell'intestino. Quello descritto è un meccanismo che si chiama
circolo entero-epatico. E quindi i glucuronidi vengono eliminati prevalentemente sotto forma
renale, oppure per via biliare, ma al netto della quota che sarà sottoposta al circolo entero-
epatico e che quindi è necessario ripetere la metabolizzazione più volte per poter essere certi
dell'eliminazione del farmaco di tipo quantitativo.

Reazioni di Acetilazione

L’acetilazione è molto importante per tutti i composti che presentano funzioni amminiche.
L’agente acetilante solitamente è l'Acetil-coenzima A che trasferisce unità di acetile ai gruppi
amminici, l'acetil-coenzima A che rappresenta la forma ad elevata energia dell'acido acetico.

Si ottengono composti poco solubili che precipitano a livello renale perché l’acetilazione riduce
sempre l’idrofilia del farmaco rendendolo meno solubile.
Nelle immagini è riportata l'eliminazione tramite acetilazione della sulfanilammide. Queste
reazioni sono molto importanti per tutti i composti che presentano funzioni amminiche, infatti
vediamo che il gruppo amminico libero della sulfanilammide viene legato all'acetile e sotto
questa forma lo si ritrova all'interno delle urine. Tra l'altro questa eliminazione della
sulfanilammide per acetilazione è un fatto positivo. Infatti se fosse stata eliminata per
solfatazione avremmo avuto: NH2, poi idrossilammina NHOH, introduzione del gruppo solfato,
lo ione nitrenio che ricordiamo che è potenzialmente cancerogeno.
Lo studio del percorso metabolico ha dimostrato che questa molecola, quantitativamente, va in
contro a reazione di acetilazione e sotto forma di metabolita acetilato viene eliminato nel tratto
urinario. Con l'acetilazione, cosi come la metilazione, si ottengo dei composti meno solubili,
tanto è vero che l'effetto collaterale principale dei sulfamidici è la cristalluria (presenza di
cristalli all'interno delle urine) ovverosia la precipitazione a livello renale del farmaco. Infatti
l'urina è costituita prevalentemente da acqua ma arriva questo metabolita acetilato che è poco
solubile in acqua (sicuramente meno solubile della sulfanilamide) e questo può quindi
precipitare. Questi cristalli che contengono il farmaco sotto forma di polvere vengono poi
eliminati a livello renale. La precipitazione a livello renale può indurre anche dei fenomeni di
danneggiamento del rene che rappresenta quindi l'effetto collaterale della classe dei sulfamidici.
Reazione di Coniugazione con gli Amminoacidi

La coniugazione con aminoacidi prevede la sintesi di ammidi derivanti dalla coniugazione di un


radicale acido con una ammina.
Questa è una reazione molto frequente in cui il farmaco una volta liberato con dei gruppi
carbossilici COOH può essere legato a degli amminoacidi presenti nel nostro organismo. Si può
avere una coniugazione con la glicina, glutammina, cisteina, arginina (vedi immagini).
Questo tipo di biotrasformazione interessa sia farmaci acidi aromatici (acido salicilico) che
alifatici (acido fenil-acetico).

La reazione avviene sostanzialmente con questi amminoacidi che come si può sono quelli più
polari e quindi è questo il motivo per il quale la coniugazione con l'amminoacido garantisce la
possibilità di essere più solubile. La reazioni con gli altri amminoacidi è molto meno frequente.
Questo è l'unico caso di reazione di coniugazione in cui ad essere attivato non è quello che
andiamo ad aggiungere, cioè l'amminoacido, ma è necessario attivare il farmaco.

Il farmaco prima di potersi coniugare con un amminoacido deve legarsi lui al coenzima A, si
forma così un complesso farmaco -coenzima A in modo tale che poi in presenza della glicina
potrà dare luogo alla reazione di formazione del coniugato con la glicina e il coenzima A
rappresenta il gruppo uscente. Questo è l'unico caso in cui c'è una reazione di coniugazione
dove non è attivata la porzione che leghiamo, ma è attivata la porzione farmacologicamente
attiva.
L'aspirina, avevamo detto che subiva dapprima, al 100% quasi della dose, una metabolizzazione
per idrolisi dove si staccava questa porzione (guarda immagine) ad opera di una idrolasi
(meglio ancora un esterasi) in modo tale da liberare il gruppo ossidrilico (reazione fase I
idrolisi), ma poi il 75% della dose subisce reazione di attivazione con il coenzima A e quindi
coniugazione con la glicina.

Prima avevamo visto un altro percorso. Infatti qui il percorso si divide in 2 parti: il 75% va
come coniugato con la glicina e il 25% viene coniugato con l'acido glucuronico (con l'UDP come
gruppo uscente). Alla fine quindi i metaboliti dell'aspirina non sono nient'altro che l'acido
salicilurico e il derivato glucuronide dell'acido salicilico che sono entrambi molto solubili ed
entrambi presenti a livello del tratto urinario.

Reazione di coniugazione con il Glutatione

Ultimo meccanismo di reazione di coniugazione di fase II che prendiamo in esame è demandato


ad una struttura proteica endogena presente nel nostro organismo che prende il nome di
Glutatione.

Il glutatione è un tri-peptide, cioè ha una sequenza: glutammato, cisteina e glicina. Il


glutammato è legato alla cisteina-glicina tramite la sua catena laterale. Questa struttura può
esistere in 2 forme, ed è una struttura circolante nel nostro organismo, cioè non è confinata a
livello epatico ma è presente addirittura nel torrente ematico. La reazione di coniugazione con
il glutatione è una di quelle reazioni che avvengono a livello extramicrosomiale.
Il glutatione è infatti presente in questa forma ridotta o nella sua forma ossidata con il ponte
disolfuro legato ad un'altra molecola di glutatione. Normalmente però il glutatione in forma
ridotta è quello responsabile della detossificazione all'interno del nostro organismo di
moltissimi farmaci. Infatti vediamo che il farmaco, in presenza del glutatione, viene legato con il
gruppo SH e quindi se il farmaco è dotato di una porzione elettrofila, di una porzione con una
parziale carica positiva, subisce attacco da parte del' SH e quindi si forma il complesso tra il
farmaco e il glutatione. Il coniugato con il glutatione che si è appena formato però non è stabile
e inizia a perdere diversi pezzi. In particolar modo la prima parte che si viene a staccare è
questa dell'acido glutammico, questa porzione si libera e si ottiene il derivato ancora coniugato
con la glicina. Poi si stacca anche la glicina e quello che ne risulta è una cisteina legata al nostro
farmaco.

Il residuo alchilico del farmaco è legato al gruppo SH della cisteina del tripeptide. Successivamente si ha il graduale
distacco degli aminoacidi dal glutatione. Inizialmente si stacca l’acido glutammico, poi viene distaccata la glicina.

Ricapitolando: tri-peptide, SH importante perché molto reattivo e come vede un elettrofilo ci si


va a legare. Una volta legato stacca l'acido glutammico, stacca la glicina e resta la cisteina.
Il percorso metabolico però non è terminato ancora perché la molecola con la cisteina può
subire N-acetilazione. Quindi subisce un'altra reazione di fase II e i derivati che si formano si
chiamano: acido alchil/aril (a secondo se questo è alifatico o aromatico)-mercapturico.

I derivati mercapturici che si vengono a formare, poi si rompono e alla fine nelle urine andiamo
a ritrovare solamente il farmaco con l'SH. Quindi il percorso finale della metabolizzazione con il
glutatione termina con la scissione del derivato mercapturico e la liberazione del farmaco con il
tiolo che è più polare e quindi può andare in contro o a eliminazione sotto questa forma o
andare in contro ad altre reazione di coniugazione di fase II. Però ciò che è importante è che
non è più presente un elettrofilo sulla nostra molecola ma si è convertito in un gruppo SH.
L'elettrofilo era pericolo perché poteva interagire con una serie strutture nucleofile del nostro
organismo e quindi poteva dare potenzialmente avvio a quei meccanismi di cancerogenesi che
abbiamo già visto. Ma non basta questo, vediamo ora il caso del paracetamolo (presente
nell'aspirina, tachipirina ecc).

Il farmaco si chiama paracetamolo perché para-acetoammido-fenolo. Il derivato acetoammidico


è abbastanza stabile e quindi non viene modificato. Invece il gruppo ossidrilico è come se fosse
già predisposto in reazione di fase I perché già ha l'OH dell'idrossilazione aromatica e quindi
subisce immediatamente la glucuronidazione (90/95% della dose lo troviamo come
glucuronide), tracce lo troviamo sotto forma di solfato. Entrambi i reattivi eliminati per via
renale. Dopo la somministrazione ci può essere però la possibilità che il farmaco non subisca
subito queste reazioni, ma in parte incontra il citocromo P450 che ricordiamo è molto diffuso e
ed è in grado di reazioni di ossidazioni. Ricordiamo che da gli alcool si potevano formare le
aldeidi e i chetoni. Infatti dal derivato fenolico si viene a formare un derivato imminochinone.
Questo imminochinone è estremamente reattivo, ha infatti questo doppio legame che è α β
insaturo sia rispetto a questo C=O, sia rispetto a C=N. Ha una grandissima capacità di reagire.
Una volta che si viene a formare deve reagire immediatamente con il glutatione. Infatti come si
formano le porzioni elettrofili in grado di reagire il glutatione si va a legare e poi si forma l'acido
mercapturico che si stacca e la molecola con l'SH si elimina per via renale. Tutto questo
(glucuronide, solfato e derivato del glutatione) se stiamo in condizioni fisiologiche. Ma se diamo
un elevatissima dose di paracetamolo (superiore ai 35 grammi), oppure ne diamo una grande
quantità (3/4 grammi) ad un bambino molto piccolo, oppure lo somministriamo a persone che
hanno un insufficienza di glutatione può succedere che la grande quantità non può essere più
soddisfatta dal glutatione che noi abbiamo e quindi il carbonio fortemente elettrofilo può reagire
con un nucleofilo endogeno. Ci sono le proteine già a livello della cellula epatica che sono dotate
di un loro potere nucleofilo e quindi potremmo avere un coniugato tra le proteine della struttura
cellulare epatica e il paracetamolo. Si ottiene così una necrosi delle cellule del fegato dovuta alle
elevatissime concentrazioni di paracetamolo. Quindi l'effetto collaterale del paracetamolo
(parliamo di dosi estremamente elevate di paracetamolo o comunque in quantità superiori a
quelle del glutatione) è la epatotossicità.

Possiamo somministrare allora il glutatione dall'esterno per risolvere il problema?


La risposta è SI! Infatti con la somministrazione del paracetamolo possiamo cosomministrare la
N-acetilcisteina la quale nella sua struttura ha l'SH della cisteina che è molto simile a l'SH del
glutatione. Quindi si andrà a legare lei che rappresenta la porzione minima del glutatione. La N-
acetilcisteina è contenuta nel Fluimucil che possiamo quindi somministrare insieme
all'aspirina ecc per minimizzare eventuali effetti collaterali.

Ricapitolando il tutto
Il destino di un farmaco può essere triplice: formazione di un metabolita attivo o addirittura
attivazione del farmaco. L'esempio è quello del prontosil rosso che rappresentava il profarmaco
che poteva essere convertito nel farmaco realmente attivo attraverso il nostro metabolismo che
in questo caso è alleato perché trasforma una struttura non idonea in una struttura
farmacologicamente attiva.

Secondo caso che potevamo avere era quella che a partire da una molecola funzionante si
otteneva una molecola non funzionante. Questo rappresenta un danno per quanto attiene
l'attività ma per lo meno non abbiamo effetti tossici. L'esempio concreto è quello del
Fenobarbitale che è un derivato barbiturico ottenuto tra la condensazione dell'urea con un
derivato dell'acido malonico. Il fenobarbitale ha questo anello aromatico che subisce reazione di
idrossilazione aromatica. Una volta ottenuta questa molecola con l'OH che va in para che è la
posizione preferita rispetto a quella orto e quella meta e si ottiene questo primo metabolita che
non funziona più perché è più polare e in quanto tale non supera più la barriera
ematoencefalica. Il derivato idrossilato a questo punto subisce reazione di coniugazione con il
glutatione e il barbiturico viene più rapidamente eliminato.
Tale composto è un ipnotico, può dare per idrossilazione un derivato inattivo.

Infine 3 caso è che quello in cui dal farmaco per metabolismo si ottiene una sostanza tossica. Il
paracetamolo con la formazione dell'intermedio imminochinonico che poi può essere
detassoficato grazie all'intervento del glutatione. Ultimo caso è quello in cui si ha una completa
variazione dell'attività. Infatti parlando degli anti-tubercolari dicemmo che dall'isoniazide
cambiando questo gruppo NH2 terminale introducendo un isopropile si poteva ottenere
l'iproniazide. Le persone in questo caso non guarivano più dalla tubercolosi ma erano felici
perché questo è un farmaco antidepressivo. Dobbiamo dire che però vale anche il contrario.
Ovvero se io somministro l'iproniazide come antidepressivo, questa sarà soggetta al
metabolismo. La reazione che può avvenire è che il carbonio in alfa all'eteroatomo può subire
prima reazione di idrossilazione e poi si stacca sotto forma di aldeide. Quindi si ha N-
dealchilazione che libera l'isoniazide a partire dall'iproniazide che funziona da antitubercolare
ma non da antidepressivo. Quindi perdita dell'attività farmacologica dell'iproniazide con
completa variazione dello spettro di attività.

Il farmaco cambia la sua attività dopo la metabolizzazione. L’iproniazide è un antidepressivo che


viene metabolizzato ad isoniazide che è invece un farmaco antitubercolare.

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