ACTIVIDADES.

I.- Fraccionamiento Celular.

- Corte pequeños trozos de hígado y de acelga (u otro material vegetal) tratando

de cortar solo aquellas regiones o partes de la muestra enriquecida en
cloroplastos (que sea de coloración verdosa).

- Colocar cada fracción por separado en un mortero y adicionar cierta cantidad

(según se indique) de una solución de NaCl al 0,9% (suero fisiológico) y triturar.

- Con la ayuda de una pipeta Pasteur retire el sobrenadante y traslade a un tubo de

ensayo con tapa (simulando un homogeneizador).Agite durante un tiempo.

- Filtre el homogeneizado con la ayuda de un embudo y gasa hacia un tubo de

centrífuga, ocupando no más de 2/3 de dicho tubo.

- Centrifugar durante 10 minutos a 800 rpm para obtener la FRACCIÓN 1a.

- Una vez terminado de centrifugar retire el sobrenadante y colóquelo en otro tubo

de centrífuga (limpio). Repetir lo anterior a 3000 rpm durante 30 minutos para
obtener la FRACCIÓN 2.

- El primer precipitado o FRACCIÓN 1a contiene determinados organelos

celulares, pero ¿Cuáles son éstos? .Con la ayuda de una pipeta Pasteur coloque
1-2 gotas de dicha fracción en un portaobjeto, agregue una gota de azul de
metileno y observe al microscopio (40x, 100x, 400x y 1000x). ¿qué observa?

- Al resto de la FRACCIÓN 1a adicione 2 ml (aprox.) de una solución de

sacarosa 1M y homogeneice.

- Tome otro tubo de centrífuga (limpio) y adicione en 1/3 del tubo una solución de
sacarosa 2M y sobre ésta 0,5/3 del homogeneizado de la FRACCIÓN 1a.

- Si finalizó de centrifugar para la obtención de la FRACCIÓN 2, retire e

introduzca en la centrífuga el tubo para obtener la FRACCION 1b y centrifugue
durante 10 minutos a 1000 rpm.

- De la FRACCIÓN 2 retire el sobrenadante y deposítelo en un frasco limpio y

rotulado SOBRENADANTE A.

- El segundo precipitado o FRACCIÓN 2 contiene determinados organelos

celulares, pero ¿Cuáles son éstos? .Con la ayuda de una pipeta Pasteur coloque
1-2 gotas de dicha fracción en un portaobjeto, agregue una gota de azul de
metileno y observe al microscopio (40x, 100x, 400x y 1000x). ¿qué observa? ¿A
qué se debe esto? Fundamente su respuesta.

- Una vez trascurrido el tiempo de centrifugación (10 minutos) con ayuda de una
pipeta Pasteur retire el sobrenadante y llévelo a un frasco con tapa (limpio) y
rotulado SOBRENADANTE B.
 - Coloque 1-2 gotas de la FRACCIÓN 1b. (obtenida recientemente) agregue una
gota de azul de metileno y observe al microscopio (40x, 100x, 400x y 1000x).
¿qué observa?

- Guarde una cierta cantidad de cada FRACCIÓN en un frasco con tapa limpio y
rotulado para un posterior análisis.

NOTA: Si trabaja con la muestra de tipo vegetal no agregue azul de metileno para la
observación de la FRACCIÓN 2 al microscopio.

II.- Cromatografía.

Separación de pigmentos vegetales mediante cromatografía en papel.

Materiales
• Mortero. • Alcohol metílico puro (recuerde que es muy
• Tijeras. tóxico).
• Espinacas u hojas • Cápsula de Petri o vaso de precipitados.
verdes. • Capilar o micropipeta (cuentagotas en su
• Embudo con papel de defecto).
filtro.
• Tubo de ensayo en • Papel filtro.
gradilla.

• Éter etílico.
Nota: Los cloroplastos poseen una mezcla de pigmentos con diferentes colores:
clorofila-a (verde intenso), clorofila-b (verde), carotenos (amarillo claro) y xantofilas
(amarillo anaranjado) en diferentes proporciones.

FUNDAMENTO

Todas estas sustancias presentan un grado diferente de solubilidad en disolventes

apolares, lo que permite su separación cuando una solución de las mismas asciende por
capilaridad a través de una tira de papel poroso (papel de cromatografía o de filtro)
dispuesta verticalmente sobre una película de un disolvente orgánico (etanol), ya que las
más solubles se desplazarán a mayor velocidad, pues acompañarán fácilmente al
disolvente a medida que éste asciende. Las menos solubles avanzarán menos en la tira
de papel de filtro.

Aparecerán, por tanto, varias bandas de diferentes colores (hasta siete o más,
dependiendo del material utilizado) que estarán más o menos alejados de la disolución
alcohólica según la mayor o menor solubilidad de los pigmentos. Estas bandas poseerán
diferente grosor, dependiendo de la abundancia del pigmento en la disolución.

Procedimiento.

1. Colocar en un mortero trozos de hojas de espinacas lavadas, quitando las

nerviaciones más gruesas, junto con 10 o 15 ml de éter etílico.
 2. Triturar sin golpear hasta que el líquido adquiera una coloración verde intensa
(utilizar campana de gases a lo largo de toda la práctica).
3. Filtrar en un embudo con papel de filtro y recoger en un tubo de ensayo (es
suficiente con 2 o 3 ml. de solución de pigmentos).
4. Colocar en un vaso pp metanol absoluto hasta una altura de 0,5 a 1 cm. y tapar
el vaso con la tapadera de una cápsula de Petri
5. Cortar una tira de papel de filtro de unos 7 - 8 cm. de alto y unos 5 cm. de ancho.
(tratando de no tocar mucho el papel con los dedos en la zona de sembrado)
6. En esta placa de papel marque suavemente una línea a 1,5 cm. de la base o borde
inferior con lápiz mina, sobre la cual sembrará sus muestras.
7. Poner con el capilar en el papel de cromatografía entre 5 y 10 gotas de solución
de pigmentos, espaciadas en el tiempo con el fin de que vaya secándose el éter
etílico y aumente la cantidad de pigmentos. Las gotas se pondrán siempre en el
mismo punto (se puede marcar con un lápiz),
8. Colocar el papel cromatográfico en el vaso pp que contiene metanol con la
mancha de pigmento a 0,5 o 1 cm. de la superficie del eluyente.
9. Esperar unos minutos a que el eluyente suba por la placa, teniendo el cuidado
que éste no llegue hasta el límite superior (sólo a unos 0,5 cm. del límite). Retire
la placa de la cámara, marque a hasta donde llegó el eluyente y deje secar.
10. Marque las machas obtenidas suavemente con un lápiz.
11. Calcule el Rf de cada mancha obtenida.

Resultados y Cuestionario.
1. La solubilidad en alcohol de los pigmentos es, de mayor a menor: carotenos,
clorofila a, clorofila b y xantofila. Indicar qué pigmento corresponde a cada
banda.
2. ¿Cuál(s) es o son la(s) diferencia(s) entre la clorofila a, clorofila b?
3. ¿Por qué se utiliza éter etílico para extraer la clorofila?
#. La molécula de la clorofila tiene un compleja estructura, compuesta por
cadenas orgánicas, que le confiere un elevado carácter “hidrófobo”. En
consecuencia se debe realizar la extracción con un solvente orgánico donde la
clorofila tenga una elevada solubilidad como es el caso del éter etílico pero
también es muy soluble en otros solventes orgánicos.

#.porque la clorofila no es soluble en agua y sdi en solventes orgánicos por lo

tanto se utiliza el eter porque es un solvente económico y que no interactua con
la clorofila.

4. ¿Qué pigmentos son los más abundantes?

5. Por encima de las clorofilas aparece más de una banda, ¿qué significado tiene?