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Lezione numero 4 Patologia generale 11/10/07

La volta scorsa abbiamo visto come le cellule possano morire, non solo come risultato di un danno che arrivi
dall'esterno e che quindi in qualche modo alteri delle funzioni che risultano vitali per la cellula stessa a
seguito di uno stimolo che definiamo “patologico”, ma abbiamo visto come le cellule muoiano anche di
“propria spontanea volontà” in situazioni particolari, alcune delle quali sono estremamente importanti.
Iniziamo ricapitolando un po' tutte quelle situazioni in cui si può osservare quel tipo di morte cellulare che
abbiamo definito apoptosi, e che abbiamo definito anche come morte cellulare programmata, o morte
fisiologica, o morte per suicidio, e così via. Nel nostro organismo come vedete ci sono circa 100000 cellule
che sono prodotte ex-novo praticamente ogni secondo. E' quindi intuitivo e logico pensare che, affinché in
un organismo adulto ci sia un mantenimento di quella che si definisce “omeostasi tissutale”, sia necessario
che un identico numero di cellule venga immediatamente eliminato e che qualora ci fosse uno
sbilanciamento nel rapporto tra cellule entranti nel sistema ed uscenti potrebbe accadere ciò che abbiamo
detto la lezione scorsa. La scoperta che la morte cellulare programmata esiste e svolge un ruolo
fondamentale, viene soprattutto da studi fatti inizialmente su organismi inferiori; infatti abbiamo visto la
volta scorsa come il Caenhorabditis elegans abbia rappresentato un ottimo modello per lo studio di questo
fenomeno perché questo nematode è caratterizzato dall'avere un determinato numero di cellule (1090), ed
avere questa peculiare proprietà di vedere 131 cellule morire immediatamente dopo la nascita per un
processo quindi programmato. Dato che il numero delle cellule che vanno incontro a questo processo è
sempre lo stesso, in assenza di qualsiasi stimolo patologico, vuol dire che quelle cellule in qualche modo
sono destinate a morire perché è presente un orologio biologico, o comunque un programma genetico che
viene attivato immediatamente dopo la nascita del nematode per uccidere queste cellule. Abbiamo fatto
l'esempio dell'apoptosi anche nella formazione, per esempio, delle dita dei mani e dei piedi, e questo avviene
per la rimozione di tutte quelle cellule che invece prima li mantenevano in condizioni completamente
diverse; abbiamo detto che una delezione cellulare spiega la perdita della coda nel girino durante la sua
evoluzione verso la fase adulta; è importante in patologia umana per quanto riguarda l’eliminazione di
cellule che consente la formazione di cavità (ad esempio i vari dotti, vasi, che sono ovviamente necessari per
la sopravvivenza, e questo è particolarmente caratteristico nella formazione degli organi di riproduzione).
Abbiamo anche detto che una massiccia delezione di cellule avviene nello sviluppo iniziale del sistema
nervoso, in cui abbiamo una quantità enorme di neuroni che viene eliminata (in quanto ormai inutili).
Nell’organismo adulto abbiamo altre situazioni in cui l’apoptosi è un tipo di morte cellulare assolutamente
necessario per la nostra sopravvivenza; nel sistema immunitario ogni giorno viene distrutta una quantità
enorme di linfociti (sia B che T), e abbiamo anche parlato della selezione interchimica che fa si che non si
sviluppino malattie autoimmuni (impedisce ai linfociti che potrebbero non riconoscere come self antigeni
presenti nel nostro organismo). Quando questo meccanismo di selezione, che prevede la morte per apoptosi,
non funziona, abbiamo lo sviluppo di malattie autoimmuni.
Infine l’apoptosi è innescata in una serie di situazioni in cui le cellule presentano dei danni; per esempio
quelle che vengono alterate da dei cancerogeni (tipo radiazioni UV, che inducono danno al DNA), attivano
dei sistemi di riparazione che, se non sono efficaci nel correggere i danni indotti dal cancerogeno, fanno si
che quelle cellule vadano incontro a morte. In questo caso l’apoptosi ha il significato di evitare eventi di tipo
mutazionale (la cellula magari sopravvive ma è una cellula che potrebbe divenire neoplastica
successivamente). Può succedere anche quando arrivano degli stimoli mitogenici che sono inopportuni
(arriva lo stimolo ma in realtà la cellula non si deve dividere): anche in questo caso la cellula muore per
apoptosi.
Un’altra situazione molto importante è l’eliminazione di cellule infettate da virus; infatti queste vengono
riconosciute come cellule non proprio corrette, e quindi intervengono dei meccanismi atti a “far fuori” la
cellula nel tentativo di eliminare l’agente patogeno.
Morfologicamente l’apoptosi si distingue dalla necrosi perché, mentre nella necrosi si ha il rigonfiamento
cellulare, dovuto ad alterazioni della membrana (che fanno si che entri più acqua; si formano delle bolle che
fanno spaccare la cellula e ciò porta alla liberazione di tutta una serie di fattori proinfiammatori),
nell’apoptosi il tutto avviene in maniera più discreta (la cellula inizialmente si raggrinzisce, probabilmente
perché perde acqua).
Anche nell’apoptosi si ha la formazione di bolle, che però non si spaccano; quindi non abbiamo liberazione
di componenti cellulari all’esterno: abbiamo invece che questi globuli, definiti corpi apoptotici, verranno
successivamente fagocitati e degradati da cellule di natura macrofagica o da cellule adiacenti. A seguito di
questi eventi si può affermare che normalmente l’apoptosi non è associata ad infiammazione (tuttavia
avremo infiammazione nel caso in cui il numero delle cellule che viene eliminato sia molto grande oppure il
processo avvenga in un tempo molto rapido. Probabilmente ciò avviene perché le cellule adiacenti non
hanno la capacità di inglobare i numerosi globuli formatisi ed evitarne la rottura con fuoriuscita del loro
contenuto all’esterno).

Come possiamo definire l’apoptosi?


Possiamo definire l’apoptosi come il risultato di una cascata di eventi molecolari (dipendenti da energia), che
possono essere indotti da una serie di stimoli molto diversi fra loro. In generale possiamo dire che l’apoptosi
si svolge in 4 distinti momenti:
1. iniziazione : non è altro che la ricezione da parte della cellula del segnale di morte;
2. controllo e integrazione : la cellula analizza la validità del segnale che le è arrivato (fa un lavoro di
screening per stabilire se questi segnali devono essere realmente eseguiti. La cellula può, durante
l’analisi, decidere se contrastare i segnali di morte, oppure farli continuare).
3. esecuzione : la cellula viene fisicamente distrutta (questo implica che nella seconda fase ci sia stato
“il consenso” per il proseguimento del processo).
4. clearance : i frammenti delle cellule morte vengono eliminati. Questo processo avviene tramite
fagocitosi, formazione di fagosomi che si fondono con i lisosomi, e successiva degradazione.

Quali sono le vie di segnale?


I segnali possono essere trasmessi mediante membrana (mediati da recettori presenti nella membrana
plasmatica). Questa modalità di morte si chiama “apoptosi recettore – mediata”.
Ci sono altri segnali che invece vengono trasmessi direttamente a organuli intracellulari. In questo caso si
parla di “via mitocondriale”, detta anche via intrinseca (in contrapposizione con quella estrinseca, che è
quella mediata da recettore).
I segnali possono essere tantissimi: possono essere ormoni, citochine, radiazioni, calore, infezioni virali etc.
Essi sono presenti praticamente dappertutto: e allora perché le cellule non muoiono sempre? Perché a
contrastare questi segnali di morte provvedono dei fattori che sono chiamati “fattori di sopravvivenza” (sono
spesso i fattori di crescita, ovvero quei fattori, generalmente peptidi, che causano proliferazione). Perciò il
destino della cellula è deciso dall’equilibrio tra fattori di morte e fattori di sopravvivenza.

Una volta che il segnale di morte è giunto, la cellula verifica se effettivamente “è saggio morire”, oppure se
questi segnali sono solo di disturbo (ad esempio creati da situazioni particolari alle quali la cellula cerca di
opporsi). Questa fase, definita di controllo e integrazione, viene svolta da particolari proteine; di queste
alcune favoriscono la morte, altre si oppongono ad essa. Nel caso in cui questo segnale di morte sia corretto,
queste proteine fanno trasmettere il segnale ad un qualcosa responsabile della fase di esecuzione (come se lo
stimolo attivasse una sorta di ipotetico “plotone di esecuzione” per uccidere la cellula).

Quali sono le proteine che fungono da canali di trasmissione per i segnali di morte verso la fase di
esecuzione?
Sono delle proteine, chiamate proteine adattatrici; due di queste, chiamate TRAD e FAD ( FAD sta per FAS
activated domain, cioè dominio di morte attivato dal FAS; TRAD sta invece per dominio di morte attivato
dal tumor necrosis factor, o TNF).
Il TNF è una citochina chiamata così perché, originariamente, nei tumori molto grandi, vi erano cellule in
necrosi nella loro parte centrale (perché quando il tumore supera una certa grandezza ha difficoltà ad irrorare
tutte le sue parti, per cui le cellule centrali vanno in ischemia). Vedendo che vi era una grande quantità di
TNF, si è pensato che fosse responsabile della necrosi tumorale. C’era addirittura chi iniettava TNF in
pazienti tumorali, nella speranza di uccidere il tumore (e invece uccideva il paziente).

Un’altra classe di proteine codificata da geni coinvolti nell’apoptosi è quella della famiglia BCL - 2. Il BCL
– 2 l’abbiamo introdotto l’altra volta, ed è un fattore antiapoptotico (significa B cell lymphoma perché si è
visto che in pazienti con traslocazione di cromosomi 16 – 18 si ha un frammento di un cromosoma che va a
finire nell’altro e questo fa si che il BCL – 2, che normalmente viene regolato da sequenze di geni adiacenti,
adesso venga attivato continuamente. L’aumento della proteina fa in modo che i linfociti di questi individui
non muoiano, come succede in una persona normale, ma sopravvivano).
Il BCL – 2 funziona nella via intrinseca dell’apoptosi (o via mitocondriale), mentre il TRAD e il FAD li
osserviamo nella via mediata da recettori (detta anche via estrinseca).

Siamo arrivati alla terza fase, ovvero quella in cui la cellula viene fisicamente distrutta. Questo è un processo
caratterizzato da eventi proteolitici: vengono attivate una serie di proteasi che distruggono le macromolecole
(proteine, DNA etc.). Sono proteasi particolari (chiamate caspasi): una di queste presenta un’omologia
notevole con la proteina responsabile della morte delle 131 cellule (che avevamo chiamato c.e.d. 3) del C.
elegans.

Perché si chiamano caspasi?


Si chiamano così perché queste proteasi hanno un sito attivo cisteinico (che spiega la C), e tagliano il
substrato, cioè la proteina target, in siti che sono immediatamente successivi all’aspartato ( e questo spiega la
porzione ASP della parola). Inoltre la parola caspasi è al plurale perché sono state identificate almeno 12
membri di questa famiglia. Sono proteasi molto conservate nell’evoluzione (e infatti troviamo diverse
analogie con proteasi che hanno la stessa funzione in specie meno sviluppate della nostra).

Di queste caspasi ne esistono 2 tipi:


1. caspasi inizianti, dette ACTIVATOR, che sono le caspasi 9 e 8;
2. caspasi esecutrici (sono quelle che realmente distruggono la cellula e sono attivate dalle caspasi
attivanti).
Il prof fa l’esempio delle forbici (le caspasi esecutrici) che non possono tagliare finché non vengono attivate
(viene loro tolto il nastro che le avvolge).

Dove dobbiamo andare a cercare ciò che è responsabile della morte delle cellule?
Sono stati fatti degli esperimenti in cui sono stati aggiunti degli estratti cellulari privi di nucleo a cellule
normali. L’aggiunta che abbiamo fatto non riesce a indurre la morte delle cellule normali. Se invece
prendiamo estratti cellulari di cellule che stavano andando incontro a morte per apoptosi, e li aggiungiamo
alle cellule normali, noteremo che queste ultime moriranno per apoptosi. Ciò sta a significare che una
cellula che sta andando incontro a morte, rilascia delle sostanze che, aggiunte a cellule assolutamente
normali, ne provoca la morte. In tutto questo discorso il nucleo non c’entra nulla perché gli estratti cellulari
aggiunti alle cellule normali ne erano privi.
Verrà inoltre indotta l’apoptosi di cellule normali se a queste aggiungiamo mitocondri di cellule che stavano
andando incontro a morte (non succede nulla, invece, se aggiungiamo RE, apparato di Golgi etc). Questo fa
pensare che il mitocondrio abbia qualche ruolo nell’indurre l’apoptosi. Successivamente si è visto che in
realtà è fondamentale (o almeno sembra esserlo) una sostanza chiamata CITOCROMO C del mitocondrio
(un citocromo coinvolto nella catena respiratoria).

Esaminiamo ora come il mitocondrio induce l’apoptosi. Normalmente il citocromo C sta dentro il
mitocondrio perché questo ha dei pori che di solito sono chiusi (quindi il citocromo c non può uscire). Se
però una qualunque situazione fa uscire il citocromo c (per apertura dei pori) nel citoplasma,questo si lega ad
una proteina (chiamata APAF – 1) e questa, a sua volta si complessa con altre molecole simili fino a quando
si forma una struttura chiamata apoptosoma. Quindi l’apoptosoma si attiva e recluta una procaspasi (la 9).
La procaspasi è una caspasi inattiva (che quindi non può tagliare), che quando viene reclutata
dall’apoptosoma viene attivata (tramite clivaggio) a caspasi 9.
Questa a sua volta contribuisce, insieme all’apoptosoma, al reclutamento di un’altra procaspasi, la 3 (che è
una caspasi esecutrice). La procaspasi 3 viene clivata, si forma la caspasi 3 (attiva) che può iniziare a tagliare
i substrati che trova sul suo cammino, tra cui, ad esempio, tantissime proteine. A questo punto la cellula è
irreversibilmente destinata alla morte. Quindi il citocromo c (o meglio la sua fuoriuscita dal mitocondrio) è
un evento chiave nell’attivazione di questa particolare via che porterà alla morte la cellula.

Abbiamo detto che nella via mitocondriale ha un ruolo importante una famiglia di geni, che è quella del BCL
– 2 (questi geni ovviamente codificheranno per delle proteine). Queste proteine regolano la permeabilità
della membrana mitocondriale, in maniera diversa.
Il gene di BCL – 2 è localizzato nel cromosoma 18; a volte, in alcuni individui, avvengono delle
traslocazioni che coinvolgono questo cromosoma (anche se fortunatamente non sono troppo frequenti). La
traslocazione fa si che si determini una iperespressione (ovviamente anomala) di questo gene, che verrà
stimolato a produrre grandi quantità della proteina per la quale codifica. Nel linfoma a cellule B avviene
proprio questo fatto. Dato che la proteina Bcl – 2 è antiapoptotica, la cellula non morirà.

La famiglia BCL – 2 comprende però non solo geni antiapoptotici, ma anche geni proapoptotici.
E allora quand’è che la cellula morirà?
Dipenderà dalla quantità di complessi dimerici che si vengono a formare, e dal loro tipo.
Infatti:
• bcl – 2 - bcl – 2 → nessuna apoptosi
• bax - bax → apoptosi

Abbiamo detto che il BCL – 2 è antiapoptotico. Vi sono 2 teorie a sostegno di questo fatto:
1. il BCL – 2 sembra sia in grado di interagire con altre proteine bloccandone l’attività apoptotica;
2. il BCL – 2 serve per far si che non si apra quel poro che causa la fuoriuscita del citocromo c
(praticamente ne inibisce il rilascio).
Di questa famiglia, il BCL – 2, e anche il BCL – XL, sono dei geni antiapoptotici, quindi quando vengono
trascritti, le proteine che ne risultano vanno a chiudere i pori e di conseguenza non avremo apoptosi. Altri
geni della stessa famiglia, invece, codificano per delle proteine che sono proapoptotiche (ad esempio BAX e
BAD). Queste proteine sono normalmente presenti nel citoplasma, ma, in seguito a particolari stimoli, si
collocano sulla membrana del mitocondrio e formano delle “specie” di canali che favoriscono la fuoriuscita
del citocromo c.
L’uscita del citocromo c causa tutti quegli effetti che abbiamo citato prima.

Vediamo ora la via recettore - mediata. I segnali provengono dall’esterno della cellula: vi sono dei recettori,
chiamati recettori di morte (il prof. li chiama “recettori della famiglia Addams”), in quanto hanno un
dominio di morte che normalmente non è svelato, ma che lo diventa quando il recettore viene attivato.

Com’è fatto un recettore?


E’ costituito da una porzione che si affaccia all’esterno, una intermembrana e infine una porzione
intracitoplasmatica. L’ attivazione del recettore (da parte di un ligando x) avviene tramite modificazione
della sua struttura (in particolare la porzione intracitoplasmatica).
I recettori di morte sono diversi, e i meglio caratterizzati sono il recettore TNF, il recettore FAS e il recettore
per il fattore NGFR (che fu scoperto dalla Montalcini e veniva definito fattore di crescita; adesso si ritiene
che sia un importante fattore di morte cellulare). Questi recettori hanno notevole somiglianza tra loro,
soprattutto per quanto riguarda un dominio (chiamato dominio di morte, che sta nella porzione
intracitoplasmatica), che è caratterizzato da una sequenza di 80 aminoacidi; questa sequenza è sempre
uguale, indipendentemente dal recettore che stiamo esaminando.

Come vengono trasmessi i segnali di morte tramite i recettori?


La prima cosa che succede è che quando viene prodotto il ligando di uno di questi recettori (sia FAS –
ligando, TNF), questo fa si che i recettori, che sono dispersi nella membrana, si associno fra di loro. La cosa
particolare è che si forma un trimero (FAS – FAS – FAS, ad esempio). Questo processo causa la
modificazione della porzione intracitoplasmatica, in modo tale da legare delle proteine (chiamate proteine
adattatrici, con sequenza complementare a quella del recettore), che a loro volta legano le procaspasi. Il
legame causa l’attivazione della procaspasi a caspasi, che a loro volta attiveranno altre caspasi, e così via,
fino a che si arriva alla caspasi esecutrice.
Una differenza tra le due vie è che nella via estrinseca è coinvolta la caspasi 8, nella via intrinseca abbiamo
la caspasi 9 (questo è un particolare che ci fa distinguere le 2 vie).

Per quanto riguarda il recettore per il TNF, è praticamente la stessa cosa, con l’unica differenza che la
proteina adattatrice non si chiama FAD ma TRAD.
Il TNF quindi provoca la morte cellulare legandosi con il suo recettore; ci sono invece delle situazioni in cui
il TNF induce la sopravivenza della cellula.
Questo fatto è rimasto un mistero per lungo tempo; adesso si ritiene che il diverso destino della cellula
(morte o sopravvivenza) dipenda dal tipo di proteina adattatrice che si lega al recettore attivato. Quindi per
quanto riguarda il TNF, se si lega una certa proteina si ha l’apoptosi per attivazione delle caspasi; se invece
se ne lega un’altra, questa recluterà un’altra proteina adattatrice che manderà segnali di sopravvivenza.
Inoltre (per quanto riguarda il TNF) il TRAD, ovvero la proteina adattatrice, non basta per provocare
l’apoptosi: occorre anche utilizzare il FAD.

Il processo apoptotico va immaginato come una serie di mosse e contromosse in cui i segnali di morte
vengono elaborati e la cellula risponde innescando una via che li inibiscono. A quel punto si creano altri
segnali di morte che cercano di superare gli sbarramenti della cellula e così via.
Abbiamo visto le due vie, intrinseca ed estrinseca, che portano all’attivazione delle caspasi esecutrici (il
“plotone d’esecuzione”).
Nonostante il segnale percorra due strade diverse, oggi sappiamo che queste due vie possono essere
connesse, e lo sono attraverso la proteina BID. Questa proteina viene attivata dalla caspasi 8 (che fa parte
della via recettore - mediata), tramite clivaggio, e ciò causa l’innesco dell’apoptosi anche tramite la via
mitocondriale. Non sembra essere invece possibile il contrario (cioè che la via mitocondriale possa attivare
la via recettore – mediata).

Abbiamo detto che l’apoptosi è come una partita a scacchi. Dopo l’attivazione delle caspasi esecutrici (che
proteolizzano tutto ciò che trovano), si riteneva che a questo punto il processo fosse irreversibile; invece
adesso si sa che la cellula che ha ricevuto dei segnali di morte (ai quali non è riuscita ad opporsi, e quindi
subisce l’attivazione delle caspasi) in realtà ha ancora una mossa da fare. Questa consiste nella produzione di
proteine chiamate IAPs (che significa inibitori dell’apoptosi).

Come fanno queste proteine a bloccare l’apoptosi?


Possono farlo o tramite un legame diretto con le caspasi (e impedendone l’azione), oppure inibendo
l’attivazione di caspasi inizianti o di caspasi esecutrici. Anche in una situazione in cui le caspasi sono state
attivate c’è quindi ancora questa “contromossa” che la cellula è in grado di fare.
Questo è possibile perché le IAPs hanno dei siti di legame sia per la caspasi 3 sia per la caspasi 9.

A questo punto sembra che la cellula abbia “fregato” i segnali di morte, ma non è così, perché la “partita a
scacchi” non è ancora finita. Può infatti succedere che vengano prodotte altre proteine che si chiamano
SMAC o DIABLO (hanno due nomi perché sono state scoperte contemporaneamente in due diversi
laboratori, e la scoperta è stata pubblicata nello stesso numero della stessa rivista).
Il nome SMAC significa secondary mitochondrial activated protein (il prof non è tanto sicuro della parola
protein, e poi non ha spiegato il nome diablo), cioè proteina in grado di attivare l’apoptosi secondaria (cioè
che viene prodotta in un secondo tempo).

Come funzionano queste proteine?


Funzionano legandosi alle IAPs, quindi il modo con cui le IAPs fregavano le caspasi, gli si rivolta contro.
Infatti il legame delle SMAC o DIABLO alle proteine IAPs inibisce il legame tra queste ultime e le caspasi
(perciò le caspasi sono di nuovo libere di svolgere il loro compito).
A conclusione di questo fatto diremo che la morte cellulare prevale (nonostante i disperati tentativi della
cellula di trovare dei sistemi per evitarla).

Per concludere dobbiamo dire che, parlando dei tumori, una delle possibili forme di terapia antitumorale
consiste nel cercare di mandare in apoptosi le cellule tumorali. Quindi, mentre prima si usava il
chemioterapico di un tempo (piuttosto rude, a detta del prof, in quanto il farmaco uccideva più cellule
normali che cellule tumorali), adesso invece si sta cercando il metodo per indurre una morte selettiva, per
due motivi:
1. per non danneggiare il resto delle cellule sane;
2. perché le cellule tumorali non sono tutte uguali (presentano diverse alterazioni e quindi bisogna
conoscerne i meccanismi).

Lo studio dei meccanismi che inducono la morte cellulare ha spinto molte multinazionali a cercare di
produrre farmaci selettivi in grado di indurre, ad esempio, l’azione delle caspasi (nei tumori), oppure in
grado di attivare degli antiapoptotici (nel caso in cui siamo di fronte a patologie in cui c’è un eccesso di
morte cellulare, come nelle malattie neurodegenerative).