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Capacidad de gelificación
INTRODUCCION
El conocimiento de las propiedades funcionales de las proteínas es esencial para poder emplear las
mismas como ingredientes que impartan características deseadas a un alimento. En tal sentido, existe un número
muy reducido de estudios relacionados con las propiedades funcionales de las proteínas de amaranto (Martinez
1997).
Es sabido que el amaranto posee granos con un contenido importante de proteínas (14-19% p/p), las
cuales exhiben un balance muy equilibrado de aminoácidos esenciales (Teuntónico y Knorr, 1985; Bressani,
1989)
Este hecho convierte a las proteínas de amaranto en objetos muy atractivos desde el punto de vista
nutricional y como una fuente potencial para la alimentación humana.
Las principales fracciones proteicas presentes en el amaranto son álbuminas, globulinas y glutelinas.
Las dos últimas constituyen las principales proteínas de reserva del grano las cuales se encuentran localizadas en
el embrión y en el endosperma. Respecto a la fracción globulinas es sabido que participan de la misma, las
globulinas de reserva clásicas de muchos granos, tipo 7S (minoritaria desde el punto de vista cuantitativo) y 11S
y las globulinas-P, características del amaranto (Segura-Nieto et al. 1994, Romero-Zepeda y Paredes-Lopez,
1996; Chen y Paredes-Lopez 1997; Martinez et al 1991, Castellani et al. 1998, 1999, 2000).
Las globulinas-P poseen una composición polipeptídica semejante a las globulinas 11S, en la que se
destaca la presencia de un polipéptido particular de 56 kDa, que aparentemente sería responsable de su alta
capacidad de polimerización. En cuanto a las glutelinas, poseen como característica sobresaliente su baja
solubilidad, aún en medio alcalinos y elevado grado de agregación (Martinez y col. 1997).
Dadas las características de las proteínas de reserva del amaranto y el hecho que se desconocen sus
propiedades funcionales se decidió estudiar en aislados proteicos, una de las principales propiedades
relacionadas con la interacción proteína-proteína, como es la capacidad de gelificación.
OBJETIVO
Estudiar las propiedades funcionales de aislados proteicos de Amaranto relacionadas con las
interacciones proteína - proteína, específicamente con su capacidad de gelificación.
Para alcanzar este objetivo se procedió inicialmente a:
Analizar el efecto del tratamiento térmico sobre las características estructurales de las proteínas
presentes en aislados proteicos de Amaranto.
MATERIALES Y METODOS
1- Preparación de aislados proteicos: Las semillas de Amaranto fueron molidas en un molino Udy de 1 mm de
mesh; y tratadas posteriormente con hexano 10 % p/v, con el objeto de eliminar la fracción lipídica. La harina
resultante fue suspendida en agua 10 % p/v llevándose al pH requerido con Na(OH) 2N. Los pHs seleccionados
fueron 9 y 11. La suspensión se mantuvo con agitación durante 30 min. al pH seleccionado. Posteriormente se
centrifugó a 9000 g durante 20 minutos a temperatura ambiente. Los sobrenadantes resultantes se llevaron a pH
5 con HCL 2N, luego de lo cual se centrifugó a 9000 g durante 20 minutos a 4 °C.
Los precipitados obtenidos se resuspenden en un volumen pequeño de agua y se neutralizan con Na(OH) 0,1N.
Posteriormente son liofilizados. Los aislados así obtenidos se denominaron A9 y A11, de acuerdo al pH de
extracción.
2- La caracterización química de los aislados proteicos y de la harina original de Amaranto, se realizó mediante
los métodos clásicos descriptos por la AOAC (1996).
3- La caracterización polipeptídica se hizo por electroforesis nativa en geles de poliacrilamida continuos al 7 %;
y electroforesis desnaturalizante con dodecil sulfato de sodio, en geles de poliacrilamida formados por un gel
apilador (acrilamida 4 %), y un gel separador (acrilamida 12 %), en condiciones reductoras y no reductoras. Se
utilizó un equipo miniplaca BIO RAD modelo Miniprotean II, con sistema de buffers de Laemmli (1970). Las
corridas se llevaron a cabo durante 1 h a voltaje constante (200v).
4- El análisis térmico diferencial se realizó en un calorímetro Polymer Laboratories (Reometric Scientific0,
calibrado con indio como standard; a una velocidad de calentamiento de 10 °C/min. Los termogramas se
analizaron con sofware Plus V5.41.
5- Se prepararon dispersiones de los aislados A9 y A11 en agua, a una concentración de 1 mg/ml. En un primer
ensayo se los trató térmicamente durante 15 y 30 min a las siguientes temperaturas: 70 °C, 80 °C, 90 °C y 95 °C;
y en un segundo ensayo se fijaron dos temperaturas 70 °C y 90 °C, y se los trató térmicamente a distintos
tiempos, 3, 5, 10, 15 y 30 minutos.
En ambos tipos de ensayo, luego de dicho tratamiento, se midió la DO a 260 nm y 280 nm, en celdas de cuarzo
de 1 cm de paso óptico. Para poder realizar estas determinaciones se utilizó un espectrofotómetro Metrolab 1700
UV- visible con portacubetas termostatizables.
6- Se realizaron ensayos de calentamiento de suspensiones proteicas de concentración conocida, y luego de un
determinado tiempo de tratamiento, se observó el aspecto, color, consistencia y textura del producto.
A tal efecto se utilizaron tubos de vidrio de 5 cm de largo y 8 mm de diámetro, los cuales se sellaron en ambos
extremos con tapones de goma, se introdujo un volumen de suspensión de 0,5 ml aproximadamente.
Se utilizaron suspensiones de ambos aislados al 10 %, 7,5 % y 5 % p/v.
RESULTADOS
(A) (B)
Figura. 3. (A) Absorbancia en función del tiempo a 70°C y (B) a 90 °C de los aislados A9 y A11.
5- Tratamiento térmico de suspensiones. Cambios observados por electroforesis.
Las suspensiones de ambos aislados tratados térmicamente a 70°C y 90°C, a diferentes tiempos (3, 5,
10, 15 y 30 minutos), fueron liofilizadas y luego analizadas mediante electroforesis desnaturalizante en
condiciones reductoras y no reductoras. El análisis de los perfiles obtenidos muestra que:
Aislado A11
- Geles sin ME: A las dos temperaturas ensayadas a medida que aumenta el tiempo de tratamiento,
aumenta la cantidad de agregados de alta masa molecular que no penetran al gel, que penetran ligeramente y
aquellos que quedan retenidos en el gel de stacking.
- Geles con ME: Se observan exactamente las mismas especies polipeptídicas a todos los tiempos y a
ambas temperaturas de calentamiento. Dichas especies son equivalentes a las presentes en el aislado A11sin
tratar.
Estos resultados indicarían que el tratamiento térmico induce la formación de agregados estabilizados
principalmente por uniones S-S, los que estarían constituidos, en principio, por todas las especies polipéptidas
presentes en el aislado.
Aislado A9
- Geles sin ME: A 90°C, se detecta la formación de agregados de alta masa molecular que penetran o no
al gel separador y quedan retenidos en el gel de stacking. La formación de dichos agregados se incrementa con el
tiempo de calentamiento. Este efecto tiene mucha menor incidencia a 70ºC.
- Geles con ME: En este caso se detectan algunas diferencias entre el calentamiento a 70°C y 90°C. Si
bien en ambos casos están presentes las mismas especies proteicas que en aislado sin calentar; a mayor
temperatura permanecen algunos agregados que no pentran al gel.
Estos resultados indicarían que el tratamiento térmico induce la formación de agregados de alta masa
molecular, en este caso estabilizados por uniones S-S y quizás interacciones hidrofóbicas.
6-Ensayos de gelificación
En los primeros ensayos de gelificación se observó que el aislado A9 tiene mayor capacidad de
gelificación que el aislado A11, a pH 7; lo cual está relacionado a la concentración. El aislado A9 comienza a
gelificar a partir de 5% p/v de proteína, luego que esta dispersión es calentada durante 30 min a 90°C; mientras
que el aislado A11 requiere 7,5% p/v de proteínas y un calentamiento a 95°C durante 30 min para formar una red
estable. Estos resultados concuerdan con las variaciones de DO y perfiles electroforéticos obtenidos en función
del tiempo y temperatura de calentamiento.
Los geles formados en todos los casos fueron opacos y frágiles, constituidos por una matriz de gránulos
finos
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFIA
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