Lezione 2

gli acidi nucleici rappresentano le unità fondamentali, infatti possono essere considerati come polimeri di
nucleotidi, nel caso del RNA lo zucchero interessato è il ribosio, mentre nel DNA è il deossiribosio, che può
presentarsi sia nella sua forma aperta che è chiusa, l'assenza del ossidrile in due conferisce il nome allo
zucchero. una molecola di fosfato da carattere acido alla struttura. le basi azotate possono essere purine o
pirimidine, le quali presentano legami delocalizzati, con risonanze e gli elettroni pi greco si trovano su tutta
la molecola. presentano inoltre dei sostituenti, l’adenina e la guanina sono purine, mentre la citosina e la
timina sono pirimidine. sia le p4urine che le pirimidine possono presentare gruppi amminici e carbonilici, o
metili come nel caso della timina. Il legame tra uno zucchero ed una base azotata è un legame glicosidico.
gli atomi vengono numerati in modo diverso se si tratta di uno zucchero o di una base azotata, gli atomi
della base sono detti 1 2 3 4… mentre gli atomi dello zucchero sono numerati come uno primo due primo
tre primo... il legame che si instaura avviene tra il carbonio uno primo dello zucchero e l'azoto uno di una
pirimidina o l'azoto 9 di una purina, legame glicosidico, mentre il fosfato Lega sul carbonio 5 attraverso un
legame fosfoesterico. il legame tra lo zucchero e la base forma un nucleoside, il quale può essere
monofosfato di fosfato o trifosfato. la presenza di più fosfati rappresenta un contenuto energetico
maggiore, e permette la catalisi di reazione che hanno un Delta g positivo e che quindi sono
termodinamicamente inaccessibili.

le basi azotate con gruppi amminici adiacenti ad un doppio legame o gruppi carbonilici adiacenti a doppi
legami possono dare il fenomeno di tautomeria, che può essere chetonolica per basi che presentano
carbonili ho amino in meno per vasi che presentano gruppi amminici adiacenti a doppi legami. c l'equilibrio
tautomerico è spostato a sinistra verso le forme carboniliche ed amminiche, Mirko e in bassa percentuale
sono presenti le forme tautomeriche ovvero una percentuale di uno per 10^5. Le forme carboniliche ed
amminiche sono donatori di legame idrogeno, mentre le forme che Theo e Noli che ed in mini che sono
accettori di legame idrogeno.

due nucleotidi sono legati da un legame fosfodiesterico attraverso il tre primo dello zucchero adiacente,
questo vale dal primo all'ultimo nucleotide. sono le estremità a dare la polarità, infatti si individua come 5
primo il nucleotide che presenta il 5 primo fosfato libero dal legame fosfo di Esther ico, mentre per tre
primo si intende l'estremità tre primo h libera dal legame fosfodiesterico. la polarità è importante anche
per la direzione di sintesi del DNA.

La struttura del DNA è stata risolta negli anni 50, furono fondamentali gli studi di risoluzione della struttura,
si comprese che i nucleotidi fossero legati dal legame fosfodiesterico, chargaff aveva visto che cambia il
contenuto totale delle singole basi, ma il rapporto adenina timina e citosina guanina non varia. non si
sapeva ancora che il DNA fosse la molecola portatrice dell'informazione genetica, tanto è vero che pauling
studiava le proteine attraverso la cristallografia a raggi X, e attraverso questa potrei identificare le Alpha
eliche, le posizioni dei singoli atomi e le strutture tridimensionali. furono gli anni di sviluppo anche delle
tecnologie NMR, le quali presentano come limite la dimensione delle molecole. infatti per molecole più
grandi è necessario produrre dei cristalli ordinati, ciò avviene grazie alla luce ai raggi X, che viene diffratta e
si genera uno spettro, il quale va risolto per stabilire la distanza in angstrom degli atomi. il DNA è incapace
di cristallizzare, ma generava delle fibre su cui cristallografia lavorarono per ottenere spettri migliori.
Pauling che aveva ipotizzato una tripla elica, video che essa non si formava attraverso i dati sperimentali.
rosalind Franklin ottenne una foto ai raggi X, e successivamente ottenne delle foto sempre migliori, la
fotografia fu mostrata in un convegno da wilkins, Watson che si trovava lì, vide la fotografia, ed insieme a
crick intuì la disposizione delle basi all'interno di un elica, attraverso un appaiamento AT-CG, come se fosse
riproducibile l'ingombro sterico e la regola di Chargaff. attraverso la fotografia con tutti gli atomi tra loro
disposti scattata da rosalind Franklin si comprese che la struttura del DNA era altamente ripetuta.
l'appaiamento delle basi adenina timina e citosina guanina è il modo migliore per massimizzare i legami
idrogeno, infatti in questo modo si forma il numero massimo di legami idrogeno, i tautomeri rappresentano
un problema poiché il gruppo amminico deve donare l'idrogeno e non può legare la timina se si trova nella
sua forma imminica.

il DNA è formato da una doppia elica destro gira a filamenti anti paralleli. la distanza tra le basi azotate è di
0,34 nanometri, il passo delle eliche è di 3,4 nanometri, ad ogni giro di elica ci sono circa 10 coppie di basi.
nella struttura B del DNA le basi azotate sono perpendicolari all'asse dell'elica, si crea un solco maggiore ed
un solco minore, per fare in modo che le basi siano parallele all'asse bisogna avere delle aperture maggiori
dal lato e delle aperture minori dall'altro, le quali danno delle informazioni sulla sequenza del DNA, che
aiutano a riconoscere il riconoscimento specifico del DNA, ai fini della lettura si sfrutta il solco maggiore ed
il solco minore, nelle ansie si espongono le basi fondamentali per il riconoscimento. la struttura B è una
struttura media dell’elica di DNA, le basi possono essere spostate o piegate o subire un ripiegamento detto
twist, oltre a poter presentare delle irregolarità di sequenze di basi come ripetizioni, che possono far
deviare la struttura dalla struttura media. Le coppie di basi per giro in realtà sono 10,5, infatti in vitro si
sono purificate strutture di DNA diverse, alcune probabili altre meno. La struttura B del DNA viene assunta
con una percentuale di umidità al 92%. Con una percentuale di umidità di circa il 75% si osserva la forma a:
un'elica destro gira con 11 paia di basi per giro d’elica, in cui le basi non sono più perpendicolare all'asse
dell'elica ed i due solchi si presentano praticamente uguali, questa struttura si osserva anche durante
l'appaiamento con l’RNA, ovvero durante la trascrizione, anche l'RNA riesce ad assumere questa forma. La
forma Zeta è formata da un'alternanza di purine e pirimidine citosina guanina, dov'e il legame glicosidico
della base si trova in posizione anti, rispetto ad altri appartamenti citosina guanina dove si trova in
posizione sin, in questo caso il giro dell'elica è formato da 12 paia di basi elica è sinistrorsa. Questa forma
del DNA è stata osservata in concentrazioni saline alte in alcuni tipi di soluzioni ed è adatta alle interazioni
con la forma B del DNA, che è una forma compatta e preferita dall’acido nucleico. le basi assorbono la luce
UV, con un assorbimento massimo della luce a 260 nanometri. si può osservare anche l'effetto iper cromico
del DNA: il fenomeno di aumento della capacità di assorbimento del DNA quando esso viene denaturato, le
basi che di solito si trovano all'interno nel caso della denaturazione si espongono e riescono ad avere più
interazioni con la luce. un singolo filamento ha un coefficiente di estinzione molare diverso da quello della
doppia elica, infatti se viene effettuata la lettura prima della doppia elica e successivamente del filamento
denaturato, si osserva un aumento del coefficiente di estinzione molare, di cui il massimo è a 260
nanometri per la doppia elica, mentre è più alto nel caso del singolo filamento. attraverso la curva di
denaturazione si può tenere traccia della separazione dei due filamenti, l'aumento di temperatura può
essere seguito attraverso lo spettrofotometro rivelando l'assorbanza a temperature variabili, l'assorbanza
aumenta e viene eletta man mano nell’esperimento, assorbanza che successivamente viene rapportata in
funzione alla temperatura: il grafico che ne viene fuori e una sigmoide, che viene fuori dalla teoria della
cooperatività, poiché le interazioni di Van der Walls stabilizzano e cooperano con la doppia elica che cede
eh si apre in uno stretto range di temperature. tale fenomeno permette la determinazione della
temperatura di melting o fusione, temperatura alla quale il 50% delle molecole sono denaturate. la derivata
prima della curva presenta un massimo che sarà la temperatura di fusione. si necessita sempre di ioni
positivi che stabilizzano le cariche negative, infatti con un aumento delle concentrazioni saline si può
spostare la curva verso destra, in modo da aumentare la temperatura di fusione della doppia elica. le
concentrazioni saline alte sono utili ai fini dei l'ibridazione, infatti permettono l'appaiamento di filamenti
anche non esattamente complementari, si riesce a formare il doppio filamento che però fonde più
facilmente, infatti alle giuste concentrazioni saline si appaiano anche i filamenti che temperatura ambiente
non si accoppierebbero. le coppie citosina guanina sono legate da tre legami idrogeno ed hanno un
quantitativo in più rispetto alla temperatura di fusione. gli organismi termofili e gli organismi estremofili, in
molti casi rappresentati da archeobatteri sono simili ad alcuni eucarioti, per stabilizzare la doppia elica
vanno eliminate le cariche negative attraverso l'utilizzo di sali o di proteine dette poliammine. la
denaturazione può avvenire anche con solventi organici o aumentando il pH. la rinaturazione può avvenire
abbassando la temperatura o favorendo il rincontro dei filamenti in altro modo.

le RNA presenta come zucchero il ribosio, il quale presenta l’ossidrile in due che è un'importante differenza
chimica. al posto della timina c'è l’uracile, che differisce di un metile determinante ai fini della riparazione. il
DNA invece sempre a doppio filamento altrimenti vengono attivati i sistemi di riparazione, di apoptosi,
mentre le RNA può assumere più strutture. il DNA è sempre a doppio filamento ma può formare delle
strutture transitorie. le RNA nello spazio somiglia di più alle proteine, poiché può disporsi in loop o hairpin,
formando anche tre o quattro filamenti che tra loro possono essere non del tutto appaiati. le RNA doppio
filamento forma la struttura a e non la struttura B, a causa del ossidrile del ribosio. tali strutture sono date
dal folding del RNA su se stesso. la presenza dell’oh in due primo da un'instabilità rispetto al DNA, infatti le
RNA è più facilmente degradabile. La degradazione può avvenire attraverso le deossiribonucleasi o le
ribonucleasi, l'erronea può degradarsi in ambiente acquoso quando esso è debolmente alcalino, L’ossidrile
diventa nucleofilo ed attacca il fosfato che diviene ciclico, dando un'estremità con il fosfato ciclico ed
un'unità senza legame fosfodiesterico. il DNA necessita di essere stabile, le RNA non necessariamente,
infatti il fosfato ciclico e anche un meccanismo utilizzato dalle ribonucleasi, che attraverso il magnesio o
cationi bivalenti in genere rendono più nucleofilo OH, e sono utili per bilanciare le cariche negative. le RNA
può anche avere delle funzioni catalitiche, le RNAasi P processo gli RNA ribosomiali, così come i ribozimi
autocatalizzano la propria idrolisi, ma non possono essere considerati veri e propri enzimi poiché
funzionano una sola volta. le RNA nei virus può fungere da materiale genetico, l’RNA Messaggero funge da
intermediario tra proteine e DNA, infatti esso presenta soltanto quattro basi azotate, che nella traduzione
possono dare vita a 20 aminoacidi. il TRNA fa da raccordo tra il ribosoma e le mRNA, i ribozimi vengono
utilizzati nella sintesi proteica e la catalizzano, sono in grado di regolare l'espressione genica, inoltre si
pensa che le prime forme di vita fossero soltanto ad RNA. il DNA il le proteine non sono flessibili, le
proteine non si possono tramandare alla progenie, le RNA può fare anche catalisi ed è tra le forme
primordiali di molecole della vita.

la differenza tra procarioti ed eucarioti è nella presenza del nucleo, infatti gli eucarioti presentano un
nucleo come compartimento separato, rispetto ai procarioti che presentano un nucleo IDE dove si
assembra il DNA, che si trova vicino alla membrana plasmatica. i batteri possono avere più di un
cromosoma, e non è detto che siano tutti circolari, ma possono essere anche lineari, oltre ad avere plasmidi
che possono essere manipolati. gli eucarioti presentano più cromosomi lineari e molti di essi sono diploidi,
proprio come i lieviti, infatti anche i lieviti presentano i cromosomi nel nucleo. la dimensione del genoma
tra procarioti di eucarioti e diversa, infatti la dimensione del genoma aumenta con la complessità
dell'organismo. in escherichia coli si hanno 5 milioni di basi, nell'umano 3,2 miliardi di basi. ci sono piante e
pesci con dimensioni e numero di geni determinati, anche nel numero di proteine. ci sono 5000 geni
codificanti nei batteri e 25.000 geni codificanti nell'uomo, ma le percentuali di DNA codificante sono
diverse. nel 1952 ricercatori osservarono il DNA di vari organismi e stabilirono il valore c. in un protozoo vi
può essere molto materiale genetico e ciò non dipende dalla sua complessità, ma anche dalla densità
genica: i batteri non hanno molto spazio per materiale non codificante, già a livello dei lieviti il materiale
codificante scende dall 80 al 70%, mentre nell'uomo si aggira intorno all' 1,2%, dove i geni sono interspersi
tra miliardi di basi non codificanti. nell'uomo si hanno sia introni che esoni, un trascritto presenta anche
sequenze che non vengono tradotte. per una RNA che possiede 23 chilo basi, la quantità di basi codificanti
ovvero di geni è 1,3 kbasi. negli anni 60 fu preso il DNA di vari organismi e Rinaturato, si osservò che il DNA
non rinaturava tutto insieme e si vide che alcune porzione rinaturavano più facilmente mentre altre più
difficilmente, ciò dipendeva dal fatto che le sequenze ripetute rinaturavano più velocemente. il DNA umano
può presentare ripetizioni in tandem che si ripetono ugualmente, ripetizioni satellite tra 50 o 100 kbasi,
mini satellite ripetizione di qualche migliaio di basi, micro satellite di qualche centinaio di basi, trasposoni
ovvero geni che formano sequenze disperse come i line o sine, che sono lunghe o Corte sequenze Inter
sperse, che hanno la capacità di trasporre e non si trovano mai l'una dietro l'altra, si possono presentare
anche delle sequenze retro trasperse. il 60% delle sequenze Inter geniche serve alla cellula per regolare
l'espressione genica, 1/3 è rappresentato dai geni o da sequenze ad essi correlate come i telomeri, gli
introni, mentre il resto rappresentato da ripetizioni. un polimorfismo è rappresentato da geni che si
presentano con una variante nella popolazione che può dare risposta diversa ad un farmaco, essi possono
essere cercati per vedere se un farmaco fa bene ad un paziente. rappresentano una variante genica
presente almeno nell 1% della popolazione. il polimorfismo può essere di sequenza se varia soltanto un
nucleotide, che dà vita ad aminoacidi con funzioni diverse, generando inserzioni o delezioni. il polimorfismo
di numeri di copie può avvenire su sequenze satelliti o ripetizioni, che possono causare delle patologie, le
sequenze intra geniche possono essere differenti se su di esse vengono effettuati i test del DNA, e sono utili
nella risoluzione di delitti. variano all'interno della popolazione e attraverso la comparazione con le
sequenze della madre e del padre si può correlare il DNA ad un individuo, un polimorfismo per variante
strutturale può presentare duplicazioni delezioni o inserzioni di basi.

Lezione 3

Oggi risolviamo un problema e cioè quello di far entrare tutto il DNA ALL’interno di un nucleo. Qualcuno si è
divertito a ragionare con dei parametri della grandezza di un singolo nucleotide. Ha ragionato su quanto
spazio occupassero i nucleotidi se messi semplicemente uno dietro l’altro. Così il dna sarebbe lungo 2 metri.
Grandezza improponibile per qualunque dimensioni cellulare men che meno la dimensione de micro che
dell’ordine dei 6-7-10 micron. Quindi una molecola che è potenzialmente lunga due metri deve riuscire a
compattarsi in maniera tale da poter rientrare nella struttura nucleare. Come fa il DNA a compattarsi? Il
primo livello di compattamento è proprio la doppia elica che comunque, anche se di poco, compatta il dna
perché il doppio filamento assume la conformazione dell’elica e inizia ad accorciarsi ma è un’orchestra di
compattamento minimo. A questo punto. Il primo problema che il DNA incontra nel compattamento sono
le cariche negative, problema che avremo sempre con gli acidi nucleici. Se mettiamo vicini più filamenti di
Dna, c’è bisogno di qualcosa che controbilanci le cariche negative. Non bastano solo i cationi presenti nella
cellula perché altrimenti si andrebbe ad alterare la concentrazione salina della cellula stessa. Per questo,
intervengono delle particolari proteine, necessarie a strutturare gli acidi nucleici. Devono ovviamente
essere cariche positivamente e quindi essere ricche di amminoacidi con carica positiva (lisina e arginina che
hanno dei gruppi amminici carichi positivamente a pH fisiologico). Il primo livello di compattamento è la
formazione del nucleosoma: una regione di DNA di circa 147 paia di basi si avvolge 1,65 volte attorno a
delle proteine. Questo DNA prende il nome di “DNA core”. Quello che invece resta libero dall’ottamero
istonico si chiama “DNA linker” (formato da 20-60 paia di basi). È il DNA che collega un nucleosoma all’altro.
Gli istoni bilanciano le cariche negative del DNA, il quale è avvolto intorno ad un ottamero istonico, che
forma un nucleosoma ed un DNA core. gli istoni danno un ripiegamento a tre Alpha eliche più un tratto non
strutturato detto histon fold, sequenze istoniche conservate dal lievito all'uomo. Presentano una diversa
lunghezza delle regioni amino e carbossi terminali, vengono assemblati in dimeri e tetrameri, le Alfa e li che
si avvolgono e interagiscono. l'assemblaggio avviene secondo una gerarchia, h3 ed h4 formano il tetramero,
mentre h due a ed h due B formano il dimero, due di Mary che possono essere separati. nel core si forma
prima il tetramero e poi i due di Mary h2a ed h2B. Il DNA deve interagire con le proteine altrimenti non si
copia né si legge, non si possono trasmettere le informazioni. Viene interagisce con le proteine in maniera
sequenza specifica o aspecifica, le proteine che servono al DNA per copiare non possono dipendere dalla
sequenza, altrimenti vi sarebbero alcuni tratti compatti ed altri che verrebbero copiati. altre proteine come
quelle utili alla trascrizione sono sequenza specifiche e devono leggere il DNA. gli istoni che invece devono
agire per compattare il DNA sono aspecifici ed interagiscono con lo scheletro zucchero fosfato, che è tutto
uguale all'interno dell'acido nucleico. le proteine interagiscono con l'ottavo Heroes tonico facendo circa 40
legami idrogeno, solo 7 di questi legami si formano con le basi azotate. gli istoni ed i nucleosomi si
assemblano essi conservano, si neo sintetizzano se il DNA interagisce con gli istoni ma non interagisce con
le proteine e viceversa. il DNA non deve essere coperto dagli istoni, poiché se una regione è in attiva
trascrizione con molti promotori, gli istoni li trovano occupati e in quel momento non si posizionano, allo
stesso modo viceversa con i fattori di trascrizione che non leggono i promotori. il DNA deve piegarsi intorno
all’ottamero, il solco minore presenta molte coppie adenina timina, mentre il solco maggiore presenta
molte coppie guanina citosina, e l'accoppiamento deve avvenire in questo modo preferenzialmente.
L’istone h1 non fa parte dell’ottamero e Lega il DNA linker, che è compreso tra i nucleosomi e può essere
più o meno lungo, l'interazione dell’istone H1 avvicina queste regioni. L’istone h1 non è necessario per
formare nucleosomi ma manda avanti il compattamento. Non basta avvolgere 1,65 volte il DNA ottone
nucleosomi per entrare nel nucleo, ma bisogna compattarlo di 10.000 volte. L’istone h1 consente
l'avvicinamento fisico dei nucleosomi mascherando le cariche negative. si passa da una struttura con una
fibra uno spessore a 10 nanometri, detta anche a fibra di perle, ad una fibra a 30 nanometri più compatta
per l'avvicinamento dei nucleosomi grazie all’istone H1. Dal punto di vista spaziale ci sono diverse ipotesi,
infatti è possibile vedere in vitro diverse strutture, che non è detto che siano reali. vi sono due modelli uno
a solenoide e l'altro a zig zag, dove gli istoni sono avvolti su un'elica che forma il solenoide e va dall'altro
lato attraverso un foro. esistono entrambe le strutture e dipende dal DNA linker, dalla sua lunghezza e dalla
sua composizione si può assumere la forma di solenoide o la forma a zig zag. le code ammino terminali del
l’istone prudono dal nucleosoma, l’histon fold viene avvolto dal DNA. le code sono ricche in lysine ed
arginine, e messe in strutture di ordine superiore. eliminando le code il DNA non va oltre la fibra 10
nanometri. anche con la fibra attenta ma nanometri non vi è compattamento sufficiente, si forma lo
scaffold nucleare, attraverso una serie di proteine non del tutto identificate, dette proteine SNC o di
mantenimento della struttura del nucleosoma, che sono accoppiate alle topoisomerasi, il DNA forma delle
anse che protrudono e tornano indietro, che sono grandi da 60 a 90 kbasi. si passa da una doppia elica da
uno spessore di 2 mm, fino ad uno spessore di 1400 nanometri. si passa prima dai 10 ai 30 nanometri,
successivamente si formano le anse, e infine si forma il cromosoma mitotico. Infatti vi è una competizione
tra le proteine di assemblaggio e le proteine che leggono le informazioni del DNA. la cromatina può essere
più o meno assemblata, è detta eterocromatina se compatta ed illeggibile da altre proteine, e difficilmente
espressa, ed è una forma assunta dai cromosomi in regioni non codificanti, come i centromeri ed i telomeri,
che soltanto a duplicazione di queste regioni vengono aperti. altre regioni passano da uno stato di
eterocromatina ad uno stato di eu cromatina, vi sono complessi di rimodellamento della cromatina atp
dipendenti che possono far scivolare il nucleosoma sul DNA, i siti che erano precedentemente coperti dopo
lo scivolamento risultano essere leggibili. il DNA uno cede il nucleosoma al DNA due oppure avviene in
modo perpendicolare, il sito affacciato verso il nucleosoma si distorce ed è reso accessibile.

il passaggio da eu cromatina ad eterocromatina fa parte dei meccanismi della regolazione dell'espressione

genica, poichè i geni per essere espressi devono eucromatizzare. in tale meccanismo entrano le code
istoniche che se presentano residui di lisina ed arginina possono essere modificate chimicamente attraverso
meccanismi di acetilazione, metilazione, ubiquitinazione. la modifica delle code facilita l'apertura e la
chiusura della struttura cromatinica. H3 ed H4 soprattutto vengono modificati a livello della lisina 9, la quale
può essere metilata o acetilata.

la risoluzione della struttura del DNA definì che gli fosse la molecola dell'informazione. non è sfuggito ai
nostri occhi che l'accoppiamento ipotizzato dia un meccanismo di copia, proprio a causa della
complementarietà. negli anni 50 si ragiona sulla duplicazione e su cosa succede alla doppia elica. in questa
fase indipendente se gli organismi siano procarioti e non si conosceva la capacità semi conservativa del
DNA. furono formulate tre ipotesi: l'ipotesi conservativa prevedeva che la doppia elica parentale generasse
due eliche figlie, le quali venivano assemblate, e successivamente alla gabbia si avevano due eliche vecchie
e due eliche nuove. l'ipotesi dispersiva, e fu saggiata anche l'ipotesi semi conservativa. Nelson e Stanley
esclusero le varie ipotesi crescendo di batteri prima con la somministrazione di un isotopo di azoto ovvero n
15, e successivamente n 14, infatti per isolare le eliche scelsero un isotopo la pesante ed un isotopo
leggero. per avere la separazione centrifugarono in gradiente di cloruro di cesio. Misero i batteri che
contenevano n 15 nelle eliche parentali e poi vi misero n 14, se la duplicazione fosse stata conservativa si
sarebbe ottenuto un DNA nuovo ed uno vecchio, dove si sarebbe potuto osservare una banda più pesante e
l'altra più leggera, dove il vecchio filamento presentava n 15, mentre il nuovo n 14. se la duplicazione di
DNA fosse stata dispersiva si mescolavano le due bande e si otteneva soltanto una banda di uguale peso. se
la duplicazione del DNA fosse stata semi conservativa le due doppie eliche pesavano uguali e si otteneva
una sola banda. dopo la prima generazione si ottenne una sola banda ed esclusero l'ipotesi conservativa.
alla seconda generazione si pensava all'ipotesi dispersiva poiché si ottenne la banda di uguale peso, la semi
conservativa presentava le due eliche vecchie n 15, mentre le nuove tutte a base di n 14, quindi si
ottennero due bande in gradiente di cloruro di cesio, naturalmente si ottennero due doppioni che che
avevano un filamento parentale più un filamento di nuova sintesi.

il processo di sintesi del DNA passa attraverso tre fasi: inizio, allungamento, terminazione. l'allungamento e
identico in tutti gli organismi, mentre cambiano l'inizio e la terminazione a seconda della complessità. la
pubblicazione del DNA rappresenta una reazione di sintesi ed è un processo integro. gli enzimi coinvolti
nella polimerizzazione del DNA sono detti DNA polimerasi: la prima DNA polimerasi isolata fu quella di
escherichia coli, che rappresenta un organismo modello per i procarioti, saccaromices cervisiae rappresenta
un modello per gli eucarioti inferiori, mus musculus per i mammiferi, questo perché in un primo momento
gli esperimenti furono condotti principalmente su questi organismi, mentre successivamente si lavora o
anche su altri organismi. nei procarioti si enuncia solitamente ciò che accade in escherichia coli, e anche
negli eucarioti avviene una sorta di generalizzazione.

la polimerasi uno di escherichia coli fu scoperta da KornBerg, e gli valse il premio Nobel nel 1959. il suo
modello è valido per tutte le altre polimerasi, per funzionare necessita di tre elementi, di cui due di essi
sono substrati: sicuramente uno stampo, ma ciò è vero in parte perché esistono polimerasi stampo
indipendenti, lo stampo non rappresenta un substrato perché serve per copiare il filamento di nuova
sintesi. c'è bisogno di un innesco che è formato da una serie di oligonucleotidi, si presenta preformato,
poiché non si inizia mai una sintesi ex novo. viene fornito da altri enzimi come le RNA polimerasi, le quali
non necessitano di un innesco per funzionare, e l'innesco può essere anche chiamato primer. gli
oligonucleotidi sono fatti da altri enzimi e fungono da inneschi. Sono utili anche quattro deossinucleotidi tre
fosfato. tutte le polimerasi sono in grado di catalizzare la sintesi in direzione 5’-3’. l'innesco deve dare il
3’OH libero e deve essere appaiato allo stampo, se non è presente un complesso innesco stampo molte
DNA polimerasi non funzionano, in particolare gli ultimi nucleotidi in 3’ devono appaiare bene con lo
stampo. la reazione è una reazione di sostituzione nucleofila: la sostituzione nucleofila comincia con
l'entrata del nucleotide con il 3’OH libero dell'innesco, il quale attacca il fosfato in Alpha ed esce una
molecola di pirofosfato, che viene idrolizzata dalle piro fosfatasi. l'idrolisi del pirofosfato successiva se non
ci fosse non si avrebbe un Delta g favorevole per fare avvenire la reazione di sintesi del DNA, motivo per cui
ci vogliono i nucleotidi trifosfato per ottenere l'attacco, l'uscita e l'idrolisi del pirofosfato. si forma il legame
fosfodiesterico per allungamento del terminale 3’.

le DNA polimerasi hanno bisogno di un cofattore il quale molto spesso è rappresentato da piccoli ioni o
molecole che aiutano la catalisi, infatti molto spesso si tratta di ioni bivalenti come il magnesio o lo zinco, di
cui il magnesio è il componente più presente. il sito attivo della DNA polimerasi Lega con nucleotide
entrante ed i cationi di Valenti rendono più nucleofilo il 3’OH e l'ambiente intorno adesso, mentre l'altro
ione stabilizza le cariche negative e si trova più in profondità per stabilizzare i tre fosfati. la sintesi del DNA
uno dei processi più fedeli e controllati, in tutte le cellule la frequenza di errore è di uno elevato a 10 alla
nona o uno elevato a 10 alla decima nucleotidi copiati. la bassa percentuale d'errore non è soltanto opera
delle polimerasi, ma dipende anche dal controllo dei nucleotidi giusti, oltre al controllo dell' appaiamento
tra il nucleotide e lo stampo: l'ingombro sterico delle coppe adenina timina e citosina guanina è sempre
uguale, ma vanno alloggiate bene queste due coppie, prima attraverso l'interazione con lo zucchero e poi
posizionando il nucleotide il più vicino possibile ad OH. nel caso in cui entra un nucleotide sbagliato e
l'accoppiamento non è più corretto, lo zucchero non si stabilizza, il nucleotide non si stabilizza ed il fosfato
non si viene a trovare vicino ad OH, con la reazione che si rallenta di 10.000 volte, il nucleotide esce e non
viene aggiunto, tale meccanismo di controllo viene detto controllo cinetico. bisogna fare attenzione a non
inserire nucleotidi sbagliati, in quanto nelle cellule i ribonucleotidi sono più abbondanti dei
deossiribonucleotidi, infatti il sito attivo della polimerasi discrimina tra i due, nel caso in cui c'è il ribosio non
avvengono le interazioni, si perdono le forze di Van der Waals con lo zucchero, non avviene l'appaiamento
col fosfato in Alpha, si abbassa la velocità di reazione ed esce il nucleotide.

la DNA polimerasi è a forma di mano destra e presenta vari domini: nel palmo della mano c'è il sito attivo
che controlla l'accuratezza del l'appaiamento, infatti la DNA polimerasi scarta il nucleotide entrante,
attraverso il dominio detto delle dita. nel palmo ci sono lo stampo ed il primer ed il nucleotide che entra, la
base viene impilata ed un residuo di tirosina, l'elica ruota di 90 °, la rotazione attraverso alle dita chiude il
sito e mantiene il nucleotide per l'interazione del nucleotide con la lisina, lisina ed arginina stabilizzano il
fosfato. lo stampo und evitare che la polimerasi si confonda permette la copia di un solo nucleotide alla
volta per appaiamento. la polimerasi è fatta in modo che il DNA dopo essersi copiato esce all'esterno
ruotato di 90 ° allontanando il nucleotide successivo. il pollice tiene l'innesco nella giusta posizione
stabilizzando il complesso polimerasi substrato. la polimerasi sintetizza il legame fosfodiesterico e tiene
conto del numero di nucleotidi polimerizzati nell'unità di tempo, tale unità e detta velocità della polimerasi,
velocità che in fase S è di 8 ore. le polimerasi che duplicano il DNA genomico devono essere veloci, se si
rilasciassero e poi si ri attaccassero ci vorrebbe un secondo a nucleotide, molte di esse riescono a legarsi al
complesso innesco stampo e non si staccano per molto tempo. più rimangono legate e più sono processive.
si attaccano sintetizzano un certo numero di nucleotidi e poi si staccano.

le tautomeria si verificano una volta ogni 10^5, la guanina in forma enolica non Lega la citosina, bensì Lega
meglio alla timina, causando errati appaiamenti. la polimerasi presenta un correttore di bozze e necessita
del complesso innesco stampo appaiato altrimenti essa rallenta, il complesso innesco stampo scivola nel
sito esonucleasico e idrolizza il legame fosfodiesterico in direzione 3’-5’. l'attività esonucleasica non ci
sarebbe se non ci volesse il corretto appaiamento, infatti il correttore di bozze esiste a causa della direzione
di sintesi 5’-3’. se la direzione fosse opposta e si aggiungerebbero i nucleotidi 5’ fosfato, il 3’OH libero del
nucleotide tre fosfato causa l'idrolisi del pirofosfato, se a livello del 3’OH vi è un errato appaiamento si
idrolizza il legame e viene aggiunto il nucleotide giusto. Il 5’ fosfato porta tre fosfati, entra il nucleo di te e
avviene l'idrolisi di pirofosfato, l'innesco aggiunge il nucleotide il quale se è errato non presenta tre fosfati e
non ha l'energia per correggere l'errore, per cui non vi sarebbe attività esonucleasica, si perderebbero i
fosfati e la reazione non andrebbe avanti. anche il controllo cinetico può aggiungere dei nucleotidi errati,
per cui si passa da 10^5 a 10^7, e vi sarebbero troppi errori per genomi molto grandi, motivo per cui
esistono i sistemi di riparazione.

Lezione 4

negli anni 60 si ci chiese come andava avanti la duplicazione ed attraverso esperimenti di marcatura si
evidenziarono le caratteristiche delle molecole, dapprima venne usata la radioattività, mentre oggi ci sono
problemi di sicurezza ed autorizzazioni, c'è bisogno di una camera calda per manipolare isotopi radioattivi,
la tecnica non è delle più sensibili, per cui si preferisce operare attraverso nucleotidi o amminoacidi
marcati. attraverso la timidina triuriata si visualizza la molecola del DNA. Cairus marcò il DNA di escherichia
coli per isolarlo durante la duplicazione tenendo una micrografia molto complicata. la prima duplicazione si
svolse con un isotopo marcato, la seconda si svolse metà con isotopo con marcato e metà senza e fu isolata
la forma theta, attraverso il fatto che l'intensità del DNA marcato è doppia rispetto alle altre due
duplicazione, stabilendo che a un certo punto del DNA si apre una forca di replicazione e si vedono i due
pezzi ancora da duplicare. le forche di replicazione viaggiano ed in molti casi partono da una bolla dalla
quale si formano due forche in direzione opposta, che si rincontrano alla terminazione dal lato opposto,
tale meccanismo rende la duplicazione più veloce. la polimerasi sintetizza soltanto in direzione 5’-3’ il
sintesi è antiparallela allo stampo, da 3’OH la polimerasi aggiunge nucleotidi su un filamento antiparallelo.
vi sono dei problemi in entrambe le direzioni, sul filamento lento si formano i frammenti di okazaki, un
filamento si trova verso la forca ed è il filamento veloce, l'altro filamento viene detto lento perché va
sintetizzato all'indietro. se la forca è bidirezionale un lato sarà veloce e l'altro sarà lento, dall'altro si
invertono, infatti bisogna sempre indicare la direzione per le forche. sul filamento veloce levo limerà si
seguono la forca finché non perdono di processività o incontrano dei blocchi, come ad esempio la
terminazione o dei filamenti già sintetizzati. lo stampo parte dal 5’, all'inizio non ho abbastanza stampo sul
filamento lento, per cui va prima un po srotolato rispetto al filamento veloce e poi vanno sintetizzati i
primer ad RNA ad opera della RNA polimerasi, in alcuni casi lo stampo può essere sintetizzato da una
subunità della DNA polimerasi o da enzimi a parte. si aggiunge prima l'innesco ad RNA, poi la DNA
polimerasi aggiunge i deossiribonucleotidi, si aggiunge poi un'altro innesco e si forma fino al prossimo
filamento di okazaki. Ci sono delle interruzioni del legame fosfodiesterico, né batteri si formano frammenti
di okazaki, rispetto agli eucarioti dove sono più corti. l'interruzione del legame fosfodiesterico e detta Nick,
tutto è stato polimerizzato infatti tra la mancanza della sequenza polimerizzata sono stati sintetizzati i
nucleotidi ma non sono stati legati, poichè una parte di essi va eliminata ovvero i ribonucleotidi. nei batteri
arriva l'enzima RNAasiH che riconosce l'ibrido tra il DNA ed RNA e idrolizza i legami tra i due ribonucleotidi,
partecipando alla rimozione, ma ciò non basta. essa non può rimuovere l'ultimo legame, interviene l'attività
esonucleasica della DNA polimerasi in direzione 5’-3’ che deve eliminare l'ultimo nucleotide al 5’ legato ad
un deossinucleotide. in escherichia coli è la DNA polimerasi uno ad avere questo ruolo, dopo ciò si è
formato un buco o gap e vi sono dei nucleotidi non copiati, quindi la DNA polimerasi uno utilizzando il
frammento di okazaki precedente come innesco riconosce il 3’OH, Lega e copia e si ferma al frammento di
okazaki successivo, e si ferma lasciando un Nick, la DNA ligasi ha come substrato un Nick, a livello dello
stampo vi sono due nuovi filamenti interrotti da legame fosfodiesterico. Chi eucarioti l'innesco viene
sintetizzato dalla primasi che è contenuta all'interno della polimerasi Alfa degli eucarioti. essa arriva,
sintetizza un innesco primasico, una subunità ad attività DNA polimerasica allunga di un po le basi, avviene
lo switch polimerasico, con la polimerasi Delta e la polimerasi epsilon, le quali si sostituiscono alla
polimerasi Alfa, la prima si posiziona sul filamento veloce, mentre l'altra è deputata al filamento lento. i
frammenti di okazaki sono più brevi di quelli batterici, e questo è l'unico caso di sequenza più breve rispetto
ai batteri. La DNA polimerasi quando la polimerasi Delta non si ferma all'incontro dell'innesco essa lo
disloca continuando a copiare la struttura RNA più DNA dislocata, che viene riconosciuta dall endonucleasi
specifiche FEN1 che idrolizzano il legame ibrido lasciando un Nick che la Ligasi poi attraverso l'unione del
3’OH e del 5’ fosfato utilizza il nad e l’ATP a seconda della ligasi coinvolta. la ligasi atp dipendente, con il
trifosfato attacca il gruppo amminico della lisina, il fosfato in Alpha del ATP esce sotto forma di pirofosfato e
fornisce l'energia per il legame, la ligasi a questo punto porta legato l’AMP, che viene trasferito al fosfato
libero del Nick, legando con un legame 5’-5’ fosfato. il gruppo uscente è dato da OH che attacca il fosfato ed
esce AMP conformazione del legame fosfodiesterico. il meccanismo.at p dipendente si trova nei fagi
mentre nei procarioti e negli eucarioti il meccanismo è nad dipendente.

ad aiutare l'avanzamento della forca ci sono le elicasi, le proteine SSB e le topoisomerasi. le elicasi sono
composte da un esamero a sua volta composto da tanti monomeri che presenta un buco al centro, il foro
infatti serve per far passare un singolo filamento: le elicasi aprono il DNA perché la forca per aprirsi
necessito della rottura dei legami idrogeno con l'energia fornita dall' idrolisi del ATP, le elicasi possono
essere veloci ed andare in direzione 5’-3’ o viceversa. non si presentano come completamente
simmetriche, ma presentano due monomeri con l’ATP, due monomeri con ADP più fosfato e due siti liberi,
per un totale di sei molecole di atp idrolizzate. l'idrolisi dell’atp avviene a due molecole alla volta, i siti poi
vengono occupati dall’ADP più fosfato, l'enzima successivamente ruota con due monomeri per volta e si
muove, apre la forca e rende gli stampi disponibili alla DNA polimerasi. dietro all’elicasi il filamento vuole
riappaiarsi, i singoli filamenti non ci devono essere, infatti per mantenere i filamenti aperti arrivano le
singles strand binding protein, le quali legano in modo cooperativo ai singoli filamenti generati. devono
legare in maniera aspecifica, quindi interagiscono con lo scheletro zucchero fosfato, e se si posizionano sul
DNA e quando la polimerasi arriva vengono spiazzate e può avvenire la copia.

la DNA sliding clamp somiglia all’elicasi, è a forma di anello ed è multimerica, ma deve alloggiare il doppio
filamento, mantiene la polimerasi sul doppio filamento aumentandone la processività. È legata alla
polimerasi e la richiama sul doppio filamento o la tiene sui filamenti, e responsabile del rilascio della
polimerasi richiamandola sullo stampo, come nel caso di frammenti di okazaki successivi, dove viene persa
l'affinità e permette il rilascio della polimerasi. necessita di energia e con un idrolisi richiama la polimerasi
sul DNA o la posiziona. Il clamp leader lega lo sliding e l’ATP e riconosce il complesso innesco stampo,
posiziona la polimerasi, avviene l'idrolisi del fosfato e il rilascio della polimerasi.

il linking number ho numero di legame è il numero di avvolgimenti che ciascun filamento fa sull'altro. con
un DNA circolare chiuso il riavvolgimento LK corrisponde al numero dei giri d’elica ed è una proprietà
topologica che non dipende dalle torsioni, e può variare soltanto se viene rotto il legame fosfodiesterico.

il numero di twisting è il giro di un filamento intorno all'altro e tiene conto del numero di basi, è 10,5 se non
ci sono altri avvolgimenti, quindi TW uguale LK.

Writhing o super avvolgimento è il numero di incroci degli assi del duplex nello spazio e su se stesso. la
somma deve dare sempre LK, mentre le forme rilassati e super avvolgimenti danno zero. i super
avvolgimenti quando si strutturano sulla cromatina come nel caso dell'ottamero istonico non vengono
contati come zero. vengono tollerati fino a un certo numero di super avvolgimenti positivi o negativi. il DNA
lineare a doppio filamento può accumulare super avvolgimenti a valle della forca, che se troppi numero
bloccano la duplicazione, poiché la polimerasi troverà un groviglio e non provvederà alla duplicazione.

le topoisomerasi tagliano il filamento per cambiare lk. interviene la topoisomerasi anche per il doppio
filamento incagliato, dove viene rotto uno dei dei due filamenti facendo passare un filamento dalla parte
all'altra. Se è in grado di rompere un solo filamento viene detta topo1, se rompe due filamenti è detta topo
due. topo uno usa l'energia per spostare da una parte all'altra un filamento, presenta un Oh di una tirosina
nel sito catalitico ed è in grado di attaccare il legame fosfodiesterico di una regione in tensione, dove avrò
l'uscita del 3’OH, avrò il 5’ fosfato legato alla tirosina e il 3’OH libero. l'energia del legame fosfodiesterico
viene conservata per formare il nuovo legame fosfotirosinico. Il 3’OH riattacca il 5’ fosfato e la tirosina esce.
la topoisomerasi riconosce regioni supercoaling che hanno favorito una locale denaturazione del DNA,
riconoscendo la regione parzialmente Lega con la sua tirosina al 5’ e con il 3’ libero alla fine si allontana la
topoisomerasi.

molti farmaci chemioterapici attaccano la duplicazione, la maggior parte di essi sono aspecifici come nel
caso del 5 fluorouracile che inibisce la sintesi delle pirimidine. la sei mercaptopurina e un analogo delle
purine, gemcitabina citabina sono analoghi della deossicitidina, sono fosfori lati e inseriti nel DNA, per poi
essere riconosciuti dalla polimerasi, possono dare un DNA crosslink con i residui di guanina, il cisplatino e il
biscloro nitrosourea causa nel blocco della polimerasi che trova residui crosslinked. sono inibitori delle
topoisomerasi doxorubicina ed etoposide, i quali bloccano la topoisomerasi due, la girasi non riconosce i
substrati eucariotici, infatti viene utilizzata come target dai chinoloni, come la ciprofloxacina. nel caso degli
antivirali azt ed aciclovir sono inibitori della trascrittasi inversa quando vengono fosforilati, mentre la mono
fosforilazione avviene ad opera di una timidina chinasi specifica.

vi sono diverse polimerasi, in particolare escherichia coli ne possiede 5, dove la polimerasi tre è la piu
veloce e la più processiva, è in grado di copiare tutto il genoma, a attività esonucleasica 5’-3’, mentre la
polimerasi uno toglie l'ultimo nucleotide e copia il gap, e poco processiva e lavora per brevi tratti, le
polimerasi 2 4 e 5 invece hanno funzioni diverse.
Il complesso sliding caricatore: le proteine tau fanno da ponte per legare il core della polimerasi tre, è
formato da tre subunità per velocizzare la duplicazione sui due filamenti, il complesso si assembla sulla
forca. L’elicasi Apre il filamento veloce con la polimerasi e la primasi, mentre sul filamento lento ci saranno
le proteine SSB, infatti il filamento esposto viene coperto dalle proteine SSB per un pezzo, mentre la forca
procede e poi rientra per essere copiata. la primasi è l'unica non essere associata, sintetizza i frammenti di
okazaki, si rilascia, si espone e poi si rilascia di nuovo. la primasi si associa a distanze più lunghe nei batteri
perciò i frammenti di okazaki risultano più lunghi. Le proteine Tao posizionano le tre subunità della
polimerasi in maniera alternata, dapprima esposte e poi si richiudono, mentre l'elicasi apre il doppio
filamento utilizzando atp. la sintesi avviene in modo veloce e le altre subunità si avvicendano sul filamento
lento.

gli eucarioti posseggono circa 15 polimerasi, di cui la polimerasi per sintetizzare il DNA genomico sono tre,
Alfa possiede attività primasica per l'innesco e sintetizza parte del DNA, le polimerasi epsilon e Delta
servono per il filamento veloce e per il filamento lento, la polimerasi gamma viene utilizzata per il DNA
mitocondriale, mentre le altre polimerasi intervengono nei sistemi di riparazione. la cellula possiede dei
guardiani per il danneggiamento, le altre polimerasi non sono né veloce né processive, ma intervengono se
riconosciute o richiamate da altre proteine.

gli eucarioti posseggono la Alfa primasi che è lenta e poco processiva, si stacca dopo poco e le altre due la
sostituiscono, infatti parliamo di tre polimerasi diverse, i frammenti di okazaki sono più corti e negli
eucarioti le forche sono più lente rispetto ai procarioti.

i sistemi unidirezionali come nel caso del plasmide COLE1 dove si apre la forca e parte la duplicazione in una
sola direzione. la replicazione a circolo rotante è stata identificata nel fago x 174 di Coli. c'è un filamento
positivo ed uno negativo, si ha un Nick in uno dei due filamenti, che fornisce il 3’OH per la sintesi mentre
l'altro fa da stampo. il filamento scorre la polimerasi fa più copie che poi vengono tagliate, legate e
successivamente si copia il complementare. il primo stampo ruota affinché venga copiato più volte.

lezione 5

Le forche si aprono in punti specifici che sono detti origine di replicazione, dove a partire da questi si apre la
forca in due direzioni. avviene un'apertura della doppia elica, arrivano le proteine, il primer e partono le
due forche in due direzioni diverse. un filamento sarà veloce per una forca e lento per l'altra. a partire
dall'origine due forche di DNA batterico si incroceranno al lato opposto. Coli ha un solo ori o origine di
replicazione da dove parte tutto e si copia tutto il DNA. all'interno di ori ci sono sequenze ricche di adenina
e timina, poiché presentano soltanto due legame ad idrogeno.

negli anni 60 brenner e Karin sperimentarono e stabilirono che il replicone è il DNA sintetizzato da una sola
ori, e visto che colica soltanto un'origine duplicazione è esso stesso replicone, in modo diverso dagli
eucarioti che presentano più di un replicone, vi è poi un replicatore che un set di sequenze da dove parte
l'inizio e contiene tutto ciò che serve, mentre l'iniziatore una proteina che riconosce le sequenze del
replicatore e dà avvio alla replicazione. le seguenze agiscono in cis all'interno del DNA, mentre si trovano in
trans all'esterno, l'iniziatore si trova in trans dove va a riconoscere il replicatore, infatti in trans in genere vi
sono le proteine.

La ori di Coli è detta oriC: presenta due elementi duplicati più volte, nel replicatore ci sono delle sequenze a
9 paia di basi ripetute 5 volte e delle sequenze a 13 paia di basi ripetute tre volte. il DNAAE l'iniziatore di
coli che riconosce la sequenza da 9 paia di basi, richiama la proteina iniziatrice e Apre la bolla di
replicazione, un meccanismo che non avviene all'interno degli eucarioti.

ci sono tre ripetizioni delle sequenze adenina timina, il DNA box Lega DNAA che è legata all’ATP, che sarà
idrolizzato e o l’ATP o L’ADP riconosce la sequenza non a 5, ma quella a tre ad alta affinità, mentre le altre
due sono legate all’ATP. il complesso avvolge e piega il DNA attorno a sé sulla sequenza a 9 paia di basi the
naturando la doppia elica in prossimità della sequenza 13 paia di basi ricche in adenina e timina.

DNA deve riconoscere legata all’ATP tutte e 5 le sequenze, il complesso avvolge il DNAE denatura in
prossimità della sequenza 13 paia di basi, aprendo di fatto la bolla. DNAA chiama le proteine, l’elicasi, DNAB
e DNAC che aiuta DNAB a legarsi, ovvero l’elicasi più il caricatore che richiamano la primasi per aggiungere
il primer ad RNA, la sintesi del primer fa staccare il caricatore formato dal complesso innesco stampo, che
richiama la sliding clamp che viene richiamata sul suo substrato portando le altre proteine con la terza
subunità della polimerasi. sono processi regolati e sono le cellule a scegliere il giusto momento. coordinare
la duplicazione è diverso tra batteri ed eucarioti, i quali hanno un ciclo cellulare. i batteri devono avere
sintesi e duplicazione uguale velocità, la velocità di crescita è data dai nutrienti ed all'ambiente fino ad un
certo numero di duplicazioni, poi avviene la fase lag, dove la duplicazione è più lunga, fino ad arrivare una
fase esponenziale, successivamente ad una fase stazionaria ed infine alla morte delle cellule batteriche in
condizioni di scarsi nutrienti e per le troppe cellule.

in fase esponenziale escherichia coli duplica ogni 20 minuti, il batterio ha bisogno di capire in quale fase si
trova, altrimenti rilascia molecole incomplete alla progenie. l'inizio della duplicazione viene regolato da 4 5
sistemi di regolazione.

rida regulation inactivation DNAa I: DNAA può legare mammano e formare il multimetro per aprire la bolla
di replicazione, ci sono meccanismi inibitori. vengono richiamate altre proteine come HDA, che stimola
l'attività Atpasica di DNAA, lo stimolo avviene attraverso l'idrolisi dell’atp, poiché DNAA ed ADP non sono in
grado di cominciare la duplicazione. HDA stimola l'idrolisi dell’ATP, ma non il multimetro e nemmeno la
sintesi.

vi sono sequenze riattivatrici come DARS 1 e DARS 2 che legano gli oligomeri DNA ADP e favoriscono lo
scambio ATP ADP. tutte le proteine atpasiche presentano uno scambio di nucleotidi, è un passaggio
limitante per le reazioni biochimiche, il rilascio di ADP per caricare l’ATP è regolativo. le sequenze dars
stimolano lo scambio e DNAA torna a legare l’ATP.

Il DNA può essere modificato chimicamente ma di meno rispetto alle RNA, ci sono diversi segnali, il più
studiato e la metilazione che consiste nell’aggiunta di un metile alle basi azotate, ogni organismo lo fa con
sistemi diversi. in questo caso si analizza il meccanismo di escherichia coli che è diverso sia dagli eucarioti
che da altri batteri. escherichiacoli fa diversi tipi di metilazione, di cui la principale è la metilazione dell'
adenina di sequenze palindromiche 5’-GATC-3’ da parte della DNA metiltransferasi, enzimi specifici che
riconoscono sequenze specifiche, in particolare il dam di coli riconosce le sequenze GATC. tali sequenze
vengono lette nello stesso modo in entrambi i filamenti, infatti filamenti vanno metilato entrambi. la
metiltransferasi riconosce entrambi i filamenti e li metila. La metilazione di tutte le sequenze GATC è
regolatoria, in quanto ad un certo punto è diversa, le sequenze che sono sempre metilate non danno
segnalazione, è regolatoria la sintesi del nuovo filamento che non è metilato, poiché non esiste il deossiatp
metilato. la metiltransferasi riconosce l’emimetilazione, infatti la polimerasi vede che il filamento parentale
è metilato, mentre il filamento di nuova sintesi no, per cui lei mi metilazione è un segnale. Nelle sequenze
GATC si trovano in corrispondenza dell'origine di replicazione e sono in parte sovrapposte alle sequenze a 9
paia di basi di DNAA, quando tali sequenze sono emimetilate, SeqA riconosce tali sequenze e le Lega, Coli
necessita che per un tempo le sequenze siano e mi motivate, poiché il legame tra sequenze mi mutilate e
SeqA impedisce di riconoscere di nuovo le sequenze a 9 paia di basi, che se vengono rimetilate
rappresentano un inibizione alla fase di inizio. GATC viene metilato a livello delle adenine, in caso di una
nuova sintesi filamento nuovo non è metilato, ma è e mi metilato, rappresentando il richiamo per SeqA che
Lega alle sequenze emimetilate di GATC, siccome molte sequenze si trovano vicino all'origine di
replicazione e sono sovrapposte a sequenze di riconoscimento di DNAA, dopo un po’ si metilano e DNAA
può rilegare. il complesso tra Seq e le sequenze emimetilate inibisce la trascrizione di DNAA, che è anche
repressore trascrizionale di se stesso. La sequenza 9 paia di basi viene riconosciuta da DNAA, che è
presente molte volte in coli. una regione di 1KB con 360 siti di legame che con DNAA sequestra know e
raddoppiano e si trovano lontane dall'origine di replicazione e sono dette DNA titrator.

tutti insieme questi processi regolano l'inizio, coli replicherà quando è necessario ed in tempo con la
duplicazione cellulare. Coli ha la duplicazione ed è più veloce quella della vita che del DNA, in fase
esponenziale coli duplica ogni 20 minuti, ergo per il cromosoma ci mette 40 minuti. quindi inizia a duplicare
prima e c'è un reinizio ad ogni ciclo replicativo, prima che sia terminata la replicazione del filamento
parentale.

negli eucarioti si ha un iniziatore col complesso di riconoscimento origine ORC, di cui il più studiato è quello
di saccaromices cervisiae. l'origine di replicazione negli eucarioti e difficile da individuare, vi è un elemento
che riconosce orc, degli elementi B1 e B2 ed intere regioni deputate all'inizio.

Se vengono inseriti elementi extra cromosomiali per essere ereditati devono contenere origini di
replicazione per essere riconosciuti dall'organismo. quando non si conoscevano le origini di replicazione di
saccaromices cervisiae furono effettuati degli esperimenti con degli elementi extra cromosomiali, che senso
ha origini di replicazione non venivano duplicati e non venivano trasmessi alla progenie. si presero molti
plasmidi e si inserirono nel genoma di saccaromices cervisiae a pezzi, ognuno in una cellula del lievito. non
tutti furono trasmessi, furono spezzettati poichè in uno di essi sicuramente vi era l'origine di replicazione.

ARS o autonom replication sintesis sequence, sono delle sequenze che dettano la replicazione, isolate e
caratterizzate per far partire la duplicazione indipendentemente dal DNA dell'organismo. Le si trovano in
ARC, nel lievito sono 350 queste sequenze che fanno partire la sintesi del replicone. da ognuno vengono
copiate circa 40.000 paia di basi, legano il complesso di origine e B2 facilita il legame con le elicasi.

negli eucarioti superiori possono essere anche 50.000 paia di basi che sono definite, nell'uomo si contano
migliaia di origini di replicazione, non tutte vengono utilizzate, ma soltanto tra le 30.000 e le 50.000 origini
di replicazione. il ciclo cellulare se nota degli errori non progredisce, anzi si ripristina e poi riprende. La casa
S del ciclo cellulare la fase di duplicazione, infatti in questa fase il genoma viene pubblicato una sola volta.
se la cellula non completa il ciclo cellulare essa è a rischio di vita e le figlie non possono ereditare diennea
incompleto. la fase S in genere dura 8 ore e si aprono forche diverse, con la sintesi di 50 nucleotidi al
secondo, per cui servono molte origini di replicazione, le quali sono circa 10.000, ma non tutte quelle
presenti fanno partire la duplicazione, che una volta avviata non dovrà più partire. se si attivano le forche 3
e 5, la forca due risulterà spenta e sarà duplicata così come la quattro per passaggio. 2 4 non saranno
attivate e non vanno attivate in questo caso.

Il primo step è la formazione di un complesso prereplicativo nella fase g uno del ciclo cellulare, che è una
fase che precede la fase S. il complesso orc deve legare l’atp, riconoscere il replicatore e reclutare due
caricatori delle elicasi, cdt6 e cdt1. Sull'origine di replicazione ci saranno 2 elicasi testa coda, portano due
copie, i caricatori posizionano le elicasi Sull'origine di replicazione e vanno via, restano soltanto orc e 2
elicasi, il processo è ancora fermo.

nel secondo step arriva il segnale di passaggio alla fase S, dove le cicline ed altre chinasi fosforilano altre
proteine che presentano gruppi OH nelle proprie catene aminoacidiche laterali. il processo è regolato da
chinasi ciclina dipendenti. DDK fosforila l’elicasi, Sd2 ed Sd3 facilitano il legame di proteine che attivano e
legano la sequenza a 11 paia di basi.

GINS e CDC45 attivano l’elicasi per aprire l’elica, legano l’elicasi soltanto con la sequenza a 11 paia di basi,
legame facilitato da sed2 ed sd3. L’elicasi Apre la forca, arrivano le polimerasi prima la forma epsilon poi la
forma Delta, arriva la polimerasi Alfa primasi e sintetizza il primer per mandare avanti la sintesi.
GI sono dei complessi pre replicati vi presenti su una o più origini della replicazione. alla fine della fase g
uno le cicline danno un segnale, le chinasi fosforilano i complessi prereplicativi ne attivano una parte. una
volta attivati avviene la duplicazione del DNA, ma va evitata l'attivazione di altri complessi, attraverso
segnali che provengono sempre dalle chinasi, che rendono impossibile la formazione di nuovi complessi
prereplicativi, quando la concentrazione di chinasi è ad alti livelli, livelli che saranno alti nelle fasi S, Gdue ed
M, ma risulteranno essere bassi di nuovo nella fase G1. in fase g uno non ci sono CDK e DDk, le quali non
possono attivare i complessi prereplicativi. i livelli delle chinasi impediscono la formazione di complessi pre
replicativi, con dei segnali dati dagli alti livelli di cdk e ddk.

La fase S ragiona con 50 nucleotidi sintetizzati al secondo e 10.000 origini di replicazione, la duplicazione del
DNA avviene in un'ora altrimenti avverrebbe in 8 ore, ma mi sono diverse origini di replicazione attivate in
momenti diversi, vi sono origini di replicazioni precoci, intermedie e tardive. Che si possono trovare
all'inizio, nel mezzo o alla fine. lo spostamento delle origini di replicazione a seconda della regione cambia il
destino di essa, ed è dettato anche dallo stato della cromatina che può essere più o meno assemblata, si
presenterà più compatta nelle sequenze dei telomeri e dei centromeri, mentre sarà meno compatta in
quelle regioni che saranno in attiva trascrizione, tali strutture influenzano la duplicazione. la sintesi inizia su
fasi eucromatiniche, e man mano su quelle eterocromatiniche. l'origine di replicazione tardiva in una
regione precoce, permette l'inizio della replicazione in modo precoce e non dipende dalla sequenza ma
dallo stato della cromatina, tale origine se viene spostata avrà un timing diverso. ORC non Apre, ma è
l’elicasi ad aprire la bolla. Orc richiama l’elicasi.

terminazione in escherichia coli: vengono incontrate sequenze terre di terminazione che legano tus e
bloccano la forca, le elicasi si dissociano, il cromosoma circolare presenta un unico problema, ovvero la
concatenazione dei cromosomi, che vanno decatenati, interviene la topoisomerasi due che taglia fa passare
e decatena, questo meccanismo viene svolto in particolare dalla girasi, che è anche il target di antibiotici
come i chinoloni.

i cromosomi lineare hanno un problema: il filamento veloce ha un primer al quale la polimerasi si Lega, la
forca sta arrivando al punto terminale, nel filamento veloce la polimerasi arriva fino in fondo, mentre sul
filamento lento avviene la copia, si formano dei gap, il 3’OH attacca i nucleotidi copiati, si forma un Nick che
viene riparato da una ligasi. alla fine seppure il frammento di okazaki presentasse un primer sul terminale,
tolti questi primer la polimerasi si attacca al frammento di okazaki precedente, chiaramente non c'è il
frammento e si otterrebbe un pezzettino non copiato, quindi di generazione in generazione si perderebbe
un pezzo con perdita di DNA. un singolo filamento di DNA non deve esserci, poi che significa che il DNA è
stato danneggiato. gli organismi minori come alcuni batteri ed alcuni virus utilizzano primer terminali, delle
proteine che presentano gruppi OH in catena laterale, poiché non vengono trovati frammenti di okazaki.
negli eucarioti il problema viene risolto dalla telomerasi: che un complesso formato da una
ribonucleoproteina, ovvero composta di RNA E proteine. all'interno di essa c'è un RNA, i cromosomi
contengono sequenze telomeri che Ricche in timina e guanina, come la sequenza TTAGGG. la telomerasi ha
attività di trascrittasi inversa, copiando il CDNA, quindi è una polimerasi che sintetizza DNA partire da RNA,
utilizzando come stampo se stessa. necessita di un complesso innesco stampo, dove le RNA funge da
innesco, mentre il filamento lento funge da stampo che va allungato. se il DNA finisce con sequenze
telomeriche, la telomerasi si appaia con tali sequenze e fa protrudere tre nucleotidi in più, oltre a fungere
da primo stampo. con il suo RNA riconosce il filamento lento come stampo, Lega il filamento lento e forma
un complesso innesco stampo che allunga il 3’OH del filamento lento ed ha attività elicasica, si stacca
scivola in avanti e Lega ai tre nucleotidi aggiunti ed aggiunge altre sequenze del omeriche per un numero n
di volte, infatti il numero dei telomeri dipende dall'organismo. la telomerasi Lega e appaia il filamento lento
lo stampo e allunga il filamento un po' come se stesse peggiorando la situazione, quindi funge soltanto da
nuovo stampo ed aggiunge un altro frammento di okazaki su sequenze telomeri che appena aggiunte, in
quanto non è in grado di aggiungere il doppio filamento, il suo vantaggio è l'aggiunta di sequenze non
codificabili, ma che possono essere anche perse dal DNA, ha la funzione di risolvere il singolo filamento. si
legano poi delle proteine che inibiscono le telomerasi e formano il t loop. formando delle sequenze
telomeriche auto appaianti, che sono in grado di rientrare o dislocare, possono anche generare una tripla o
una quadrupla elica, vien nascosto il singolo filamento nel doppio filamento ed è una regione ricca di
proteine tale da permettere l’ecclisse nel t loop della sequenza telomerica.

Dal singolo filamento dove vi era il frammento di okazaki adesso si è ottenuto un doppio filamento
conseguenze telomeriche, dove legano proteine che riconoscono i telomeri e si assemblano sempre di più
ed inibiscono l'attività delle telomerasi, le fanno di staccare dallo stampo e danno lo stop alle sequenze, la
regione a singolo filamento protrude, si insinua nella doppia elica, formando una tripla o una quadrupla
elica, una struttura coperta di proteine che legano il telomero e lo assemblano, tale struttura è etero
cronica per proteggere le estremità del cromosoma dal sistema di riparazione. le sequenze telomeri oche si
autoappaiano per formare la tripla elica, in particolare sono le sequenze ricche in guanina che possono
formare la quadrupla elica. vengono poi stabilizzate da cationi mono e bivalenti per ridurre l'attività delle
telomerasi, le quali favoriscono strutture g quadruplex. tali regioni possono essere lunghe da 200 a 400
ripetizioni, senza della mera si attiva si perde il materiale all'estremità del cromosoma, male del nome rasi
sono inattive nella maggior parte delle cellule, in particolare sono attive nelle cellule germinali ed in attiva
proliferazione. duplicazione dopo duplicazione si perdono i telomeri, che come se fungessero da orologio
cellulare, furono scoperti con i fibroblasti umani, e tale fenomeno fu definito come limite di Hayflick, la
lunghezza dei telomeri è correlata all' invecchiamento dei telomeri, nei lieviti invece la telomerasi è sempre
accesa, infatti essi sono capaci di duplicare all'infinito. Se vengono riattivate le telomerasi nei fibroblasti
viene persa la senescenza, come conseguenza si ottengono cellule tumorali, sui topi transgenici è stato
osservato che nella prima generazione è tutto ok, ma dopo un certo numero di generazioni a causa dei
telomeri più lunghi avviene un invecchiamento prematuro e si modificano l’ematopoiesi e la
spermatogenesi. possono avvenire il ingrigimento e la perdita delle unghie nelle cellule germinali. nelle
cellule tumorali non è soltanto la telomerasi ad essere un target. oggi giorno vengono costruiti cromosomi
artificiali con origini di replicazione, con i centromeri altrimenti non potrebbero separarsi e con i telomeri
per proteggere l'estremità, vengono poi adoperate nella terapia genica. gli istoni della molecola parentale
sono in singola copia, una parte degli istoni vecchi si conserva, mentre un'altra parte viene sintetizzata di
nuovo. vi sono gli chaperon degli istoni Caf, H3, H4, Nap, H2A, H2B che vengono richiamati dalla sliding
clamp. gli istoni sono in parte ereditari, le code amino terminali degli istoni vengono variamente modificate
influenzando l’eterocromatizzazione e l’eucromatizzazione, che può causare perdite del messaggio.

Lezione 6

Non è bene portare troppe mutazioni, altrimenti si compromette la vita, ma se non ci fossero state l'uomo
non esisterebbe. le cellule presentano sistemi che bilanciano i sistemi di velocità di mutazione e di
riparazione.

le variazioni di sequenza per due motivi distinti devono affrontare riparazioni diverse. un errore di
duplicazione da parte della DNA polimerasi, che ha una bassa frequenza di errore, ma arriva comunque a
uno per 10 alla settima, specie per i tautomeri che danno appaia menti errati, se il correttore di bozze non
corregge, alla duplicazione successiva si può verificare la mutazione. in una linea germinale muta anche la
progenie, sui cromosomi somatici possono dare patologie geniche per esempio per mutazione di un solo
gene, oppure il cancro per accumulo di mutazioni in geni cruciali per la regolazione del ciclo cellulare.
alcune sequenze sono regolatrici per l'espressione genica e possono generare fenotipi e mutazioni
particolari. un singolo nucleotide mutato dà vita a mutazioni puntiformi, possono avvenire transazioni
purina purina o pirimidina pirimidina, trasversioni purina pirimidina, inserzioni o delezioni di nucleotidi..
due lunghe inserzioni o delezioni del DNA da parte di meccanismi endogeni cellulari come trasposizioni o
ripetizioni genomiche. il DNA satellite è composto da ripetizioni più o meno lunghe ripetute in un numero
diverso di volte, che possono generare dei polimorfismi, i quali se analizzati permettono l'identificazione del
DNA di un organismo. un cambio di numero di ripetizioni può dare fastidio alle DNA polimerasi. A seconda
del problema le polimerasi possono reinserire una copia in più o una copia in meno delle ripetizioni. vi sono
triplette particolari molto ripetute anche nelle sequenze codificanti. la tripletta cag per la glutammina si
trova ripetuta in molte proteine, viene ripetuta di generazione in generazione cambiando il numero di
ripetizioni, tali ripetizioni sono tollerate entro un certo range, altrimenti la proteina non funziona più. la
DNA polimerasi se incontra delle ripetizioni si crea un loop sul nuovo filamento e si copia una tripletta in
più. se lo stampo crea un loop alla seconda generazione, il filamento avrà una tripletta in meno. nella Corea
di Huntington la proteina Huntingtina ha un certo numero di ripetizioni di CAG tollerate, in un numero che
va da 9 a 40 ripetizioni, al di sotto al di sopra di tale numero si verifica la patologia ereditaria, se nella linea
c'è una tendenza verso il limite massimo di ripetizioni, la generazione successiva una probabilità di
sviluppare la patologia, che a seconda del numero di ripetizioni può essere più o meno gravi, e una malattia
neurodegenerativa causata dalla trascrizione di proteine neuronali. la distrofia muscolare uno vede la
mutazione di DMPK, DM2 sul gene ZNF9. nella sindrome dell'x fragile ci sono diversi alleli di FMRN1 che
legano una RNA binding protein e non si produce FMRNP. se l'errore di duplicazione e l'inserzione di una
base errata si genera una distorsione della doppia elica, che viene detta mismatch, ovvero un appaiamento
che non avviene secondo la regola di Watson e Crick, se non viene riparato la mutazione viene fissata. la
base essendo nel il DNA non viene riconosciuta come estranea, ma riconosciuto il mismatch si ripara con il
mismatch repair. i procarioti gli eucarioti presentano sistemi simili: anche in questo caso escherichiacoli
funge da capostipite e da modello, gli eucarioti presentano più proteine più sistemi di rivelazione del
danno. l'acronimo del mismatch repair è MMR: è un sistema dedicato agli errori di duplicazione che è in
grado di rilevare la distorsione dell'elica ma non rileva i danni, piuttosto rileva le coppie che non sono ben
appaiate. In coli è presente la proteina mut: MUTs e un dimero e se individua una distorsione dell'elica Lega
ed idrolizza l’ATP, richiama MUTH che è un endonucleasi che taglia O A Monte o a valle del mismatch,
avviene poi un altro taglio, che viene riconosciuto da MUTS e si ottiene il gap a singolo filamento, viene
richiamata la DNA polimerasi di riparazione che copia il pezzo mancante, arriva poi la ligasi ed avviene la
riparazione completa. dopo il passaggio della DNA polimerasi, per non fissare la mutazione bisogna
riconoscere il nuovo filamento anziché lo stampo, altrimenti viene fissata la mutazione. in escherichia coli
viene sfruttata la metilazione del DNA, che è uno dei tanti sistemi, in particolare sulla sequenza GATC, ho
sequenza di controllo di inizio duplicazione. GATCE una sequenza palindromica e metilata sui due filamenti,
tutte le sequenze GATC sono metilate e sono presenti più o meno ogni 250 basi. quando la DNA polimerasi
passa il filamento di nuova sintesi non è metilato, quindi il DNA si trova in una forma di emi metilazione, per
il breve tempo successivo al passaggio della DNA polimerasi esso può essere riconosciuto. il mismatch deve
essere riparato subito dalla mismatch repair altrimenti la metiltransferasi mettila il filamento di nuova
sintesi. il mismatch repair segue la DNA polimerasi, MUTh riconosce le sequenze emimetilate e ci si Lega,
MUTS riconosce MUTL e chiama mu, avviene il taglio sul filamento di neo sintesi non metilato. SEQA
impedisce sui filamenti emimetilati la neosintesi, MUTH Lega le sequenze emimetilate selettivamente,
MUTS riconosce il mismatch, richiama MUTL che richiama MUTH la quale taglia il pezzo, la DNA polimerasi
procede alla riparazione, avviene la copia, arriva la ligasi E I filamenti vengono risaldati.

negli eucarioti le proteine non sono mut e non sia la emimetilazione, così come avviene in batteri di specie
diverse, così nei mammiferi è diverso. il meccanismo per regolare l'espressione non è diffuso su tutto il
genoma, mentre in escherichia coli l’emimetilazione e un po su tutto il genoma, rispetto agli eucarioti dove
c'è la metilazione per regolare l'espressione genica, ma non tutti sono metilati altrimenti avviene lo
spegnimento dell'espressione genica. il vitro i Nick indicano al mismatch repair di riparare con un taglio, sul
filamento lento con i frammenti di oga zagi c'è un Nick prima del legame, che indica al mismatch repair che
il nuovo filamento e nickato. sul filamento veloce si ha la sliding clamp, il mismatch repair viene chiamato
da pcna e tiene la proteina tau a guardia dell'errore, il mismatch repair segue la DNA polimerasi, e un
omologo di MUTS, ma è detto MSH, il quale interagisce con la sliding clamp. se le cellule non riparano il
proprio materiale genetico possono subire dei danni. gli errori duplicazione nel caso in cui il gene di MSH è
mutato ho il mismatch repair è mutato, generano la predisposizione al carcinoma rettale non poliposo
ereditario ed ad altri cancri.

le basi azotate sono soggette di continuo ad aggressioni, anche da parte dell'acqua, infatti il danno idrolitica
è uno dei danni principali, può avvenire l'idrolisi del legame glicosidico, che dipende dalla fluttuazione di
tecniche che generano siti abasici. il danno più frequente è la deaminazione, poichè tre basi azotate su
quattro presentano gruppi amminici. L'acqua attacca e sposta il doppio legame, avviene l'idrolisi e il gruppo
amminico viene spostato e va a formare un chetone, dalla citosina si passa al uracile, la denina viene
trasformata in ipoxantina, la guanina nel suo tautomero. la differenza è che nell’RNA c’è l’uracile, che
invece non è presente nel DNA dove c'è la timina. La citosina metilata, che va incontro a deaminazione
diventa timina. La deaminazione idrolitica avviene su una base ogni 100. i danni endogeni possono avvenire
con l'acqua, mentre i danni esogeni possono essere causati da sostanze mutagene, che molti casi risultano
anche essere cancerogene. L’OMS classifica dei sostanze cancerogene in base ai dati forniti dai gruppi di
ricerca e stabilisce se le sostanze appartengo un alle categorie 1,2a, 2B, 3 o 4, a seconda dei danni e se
aumenta la probabilità di sviluppare il cancro. nella categoria quattro ci sono gli agenti di cui è stato
stabilito che non sono cancerogeni, che non aumentano la probabilità di sviluppare un cancro, nella
categoria tre ci sono quelle sostanze per le quali non ci sono studi sufficienti a dimostrare la
cancerogenicità, nella categoria due B ci sono le sostanze che sono forse cancerogene con studi
contrastanti, nella categoria due a ci sono le sostanze probabilmente cancerogene di cui si hanno diversi
studi, nella categoria uno ci sono le sostanze cancerogene che aumentano le probabilità di rischio di
contrarre il cancro. gli studi vengono spesso effettuati sui batteri.

il test di Ames sulla salmonella, verifica la frequenza delle mutazioni batteriche, in quanto sono organismi
che duplicano più velocemente e molto di più. la cultura viene sottoposta a sostanze mutagene, si utilizza
un batterio che vive soltanto su un terreno con istidina, si fa crescere il batterio senza istidina e si vede che
esso non cresce, a meno che non si reverte il lavoro del ricercatore. due colonie su un miliardo di colonie
sono riuscite a crescere, in quanto hanno sviluppato mutazioni spontanee. alcune piastre con colonie
incubate con sostanze possibili cancerogene presentano delle colonie che crescono, per cui si decide che la
sostanza danneggia il DNA, in questo caso specifico in modo positivo.

le sostanze mutagene reagiscono con varie porzioni delle basi azotate, di cui la guanina è la più attaccata, i
gruppi elettrofili interagiscono con l'ossigeno e l'azoto dando deaminazione o alchilazione. nei test di ames
le molecole vengono incubate prima con enzimi epatici come il citocromo 450, nel caso del benzopirene
proveniente dal fumo di sigaretta, esso viene dapprima modificato nella sua forma diolica, poi come diidro
epossido e successivamente attacca il DNA E forma un addotto con la guanina del DNA. le radiazioni
ionizzanti e gli agenti ossidanti causano danni ossidativi, la guanina viene trasformata in 7-
8diidrossiguanina, che è un'unità di misura per il danno ossidativo, La 7 8 diidrossi guanina si appaia con
l’adenina invece che con la citosina, nel caso in cui essa non venga riparata. i raggi UV possono causare
carcinoma e melanoma dermico. le basi azotate assorbono la luce ultravioletta con un picco a 260
nanometri, se le basi vengono eccitate con raggi UV, l'irradiazione del DNA con la luce UV può provocare La
dimerizzazione di due pirimidine adiacenti, possono dare vita ad un dimero ciclobutanoico covalente che
non viene riconosciuto e copiato dalla DNA polimerasi. i raggi X ed i raggi gamma rompono i filamenti del
DNA, infatti sono detti clastogeni. si utilizza l'autoclave per serializzare gli strumenti in laboratorio, laddove
non è possibile a date temperature e pressioni si utilizzano i raggi UV che danneggiano il DNA batterico ed
impediscono la propria duplicazione. i raggi gamma i raggi X vengono utilizzati nella terapia tumorale,
anche la bleomicina ha un'azione clastogena. Gli analoghi delle basi si intercalano nella doppia elica, come
nel caso dell’etidio bromuro, che fluorescente s’intercala nel DNA E distorce l'elica, se esso è presente la
polimerasi lo salta ed inserisce una base in più o una base in meno.

la riparazione avviene con meccanismi diversi in base al danno, tali meccanismi riparano salvando la cellula
finché essi possono. vi è un sistema utilizzato dai batteri o dai fagi che è diretto, un enzima chiamato
fotoliasi utilizza l'energia UV e reverte il dimero della timina. uno dei danni degli alchilanti più rilevanti è la
trasformazione della guanina in 6ossimetil guanina, un danno che viene riparato dalla metiltransferasi
MGMT, che si presenta mutata a livello di alcuni tumori, riconosce direttamente la base danneggiata e
trasferisce il metile sulla cisteina del proprio sito attivo, che renderà l'enzima non riutilizzabile.

esiste il sistema base excission repair o BER, il quale riconosce le basi danneggiate ed idrolizza il legame
glicosidico, lascia il sito abasico, richiama un endonucleasi per il danno, e due endonucleasi tagliano a
Monte e a valle lasciando il sito abasico, che poi viene riempito dalla DNA polimerasi e legato dalla ligasi.
ripara i danni idrolitici come nel caso dell' uracile, che ha la sua uracilglicosilasi, che riconosce la
deaminazione della citosina, le glicosilasi corrono lungo il DNA saggiando le basi, quando flessibili le
glicosilasi ribaltano il substrato nel proprio sito attivo, e se trovano il danno lo idrolizzano. la citosina de
aminata porta alla formazione della timina, il danno viene riparato meno efficacemente dalle glicosilasi di
sicurezza che riconoscono una guanina appaiata ad una timina come una distorsione. Le citosine metilate
sono dette spot di mutazione, poiché sono più passibili di mutazione e le mutazioni avvengono più
frequentemente su di esse. durante l'evoluzione le citosine metilate sono andate perse. per le glicosilasi di
sicurezza OXOG riconosce gli appaiamenti adenina guanina ed idrolizza l’adenina. ci sono due modi per
riparare come lo short patch p, che aggiunge solo i nucleotidi mancanti e deriva dalla polimerasi B, mentre i
long pec derivano dalle polimerasi Delta ed epsilon, riconoscono il gap, vanno oltre, dislocano
l'appaiamento, la polimerasi copia e rimuove gli inneschi simili, proprio come nel caso di FEN1.

Nucleotide excise repair: coli presenta le proteine UVR identificate in suoi mutanti che non riuscivano a
sopravvivere ai danni dai raggi UV, poichè essi sono in grado di riparare dai danni dei raggi UV, infatti
riconoscono la distorsione e possono essere di tipo a, B, c,d, rappresentano un tetramero formato dal
dimero di B e due monomeri di A, che riconoscono la distorsione, si piegano, ed una volta riconosciuta
UVRC taglia a Monte ed a valle, il prezzo viene escisso, rimane un gap che viene riempito dalla polimerasi e
saldato dalla ligasi.

XP deriva da pseroderma pigmentoso ovvero persone che risultano essere sensibili alla luce, a causa di una
mutazione di NER, che sono proteine analoghe di UVR, la mutazione di questi geni genera la sindrome di
Cockane e la tricotiodistrofia. una delle proteine XP controlla il DNA come se fosse una glicosilasi BER, in
altre parti accoppiata alla trascrizione e se non viene riparato l'errore arriva la RNA polimerasi che trova un
blocco e non va avanti, richiama la proteina NER. BRCA1 e BRC2 danno sensibilità, se sono mutati aumenta
la probabilità di cancro alla mammella. BRCA1 e un sistema di riparazione accoppiato alla trascrizione.
lyndon modric aris e Sancore hanno vinto il premio Nobel per la chimica per gli studi di riparazione del DNA.

esistono sistemi di riparazione estremi che si possono attivare in caso di rottura doppio filamento del dna,
infatti bisogna avere un cromosoma fratello per procedere con la ricombinazione omologa, se non si può
intervenire i sistemi riparano alla meglio causando una mutazione. se il danno avviene a livello del doppio
filamento e non c'è nulla da copiare NHEJQ 70 ed 80 riconoscono la lesione e richiamano una DNA protein
chinasi con complesso che richiama artemide, la quale processo all'estremità e la ligasi le unisce
direttamente. se il DNA è rotto vuol dire morte sicura, ma nel caso in cui esso riesce a legare magari non si
sono perse regioni importanti. Le polimerasi della famiglia mu, che polimerizzano i nucleotidi
indipendentemente dallo stampo, una polimerasi deve copiare il filamento danneggiato e si blocca e
successivamente si stacca, vengono richiamate le trans lesioni che mettono due nucleotidi a caso senza
copiare e quindi causano una mutazione, fanno poi tornare la polimerasi del DNA che ricopia fissando la
mutazione. Vengono richiamate le polimerasi trans lesione, avviene l'inattivazione dei geni con la risposta
SOS, tale meccanismo avviene normalmente sui geni silenti, con dei repressori che legano LEXA, che si
spegne, se c'è il danno si produce RECA che Lega LEXA e la degrada, attiva i geni Sos ed arrivano le
polimerasi trans lesioni. negli eucarioti la sliding clamp dopo aver sentito il danno attiva il meccanismo per
l'espressione di polimerasi translesione.
gli eucarioti prima di passare tra le varie fasi del ciclo cellulare hanno dei checkpoint, il passaggio è dato
dalle chinasi ciclina dipendenti. se avviene un danno a livello del DNA la cellula si ferma dapprima a riparare
il riparabile e poi avviene lo sblocco. se il danno è troppo elevato, la cellula va in apoptosi. molti
antitumorali danneggiano il DNA nelle fasi g uno e g due della cellula, per mandare la cellula in apoptosi.

Lezione 7

La ricombinazione permette di riparare la rottura al doppio filamento, ricombinazione di tipo omologo e

permette anche lo scambio di materiale genetico. la ricombinazione avviene in tutte le cellule procariote ed
eucariote, a volte con funzioni diverse, ma in tutti i tipi di cellule è in grado di riparare i danni al doppio
filamento, sblocca le forche danneggiate, permette l'espressione di alcuni geni, ed il laboratorio crea
organismi geneticamente modificati.

due sequenze di natura nucleotidica o aminoacidica che si possono allineare, ovvero possono avere una
sovrapposizione di quanti più nucleotidi o amminoacidi una sull'altra, trovando il maggior numero di
nucleotidi identici, anche con l'inserzione nelle due sequenze di un gap per avere il maggior numero
possibile di collegamenti. la percentuale di identità é espressa come quanti amminoacidi o quanti nucleotidi
sono uguali in una sequenza di basi. se due sequenze hanno un'elevata percentuale di identità possono
essere dette simili, le sequenze simili sono omologhe se presentano un progenitore ancestrale comune.
sono ortologhe se vengono confrontati uguali geni, ma in organismi diversi. Sono dette paraloghe se si
trovano all'interno della stessa specie con più copie di un genere ma con piccole differenze. non bisogna
confondere l’omologia con l'identità.

La ricombinazione omologa è stata ipotizzata da Hollyday con un modello nel quale due DNA potevano
scambiare materiale a patto che ci siano due cromosomi omologhi, di cui su uno dei due sia la rottura a
doppio filamento, con un filamento che ha un'estremità 3’OH libera, sul singolo filamento ovviamente, il
3’OH può portare l'inversione del filamento in prossimità della doppia elica del cromosoma omologo, il
singolo filamento si insinua nel doppio filamento formando una struttura a croce, detta croce di Hollyday. la
giunzione di Hollyday può mutare a chiasma, con la migrazione del chiasma, attraverso un appaiamento tra
i due filamenti di cromosomi diversi, avviene poi la sintesi di nuovo DNA, poiché va copiato il cromosoma
intatto. la migrazione del chiasma viene ad un certo punto e di due cromosomi sono riseparati e riparati. il
taglio avviene alla seconda della direzione dei prodotti diversi o del Crossing over, oppure del non Crossing
over detto anche patch.

Due regioni cromosomiche che presentano dei geni con una regione ABC; 1AA, 2 localmente BB CC e
sull'altro aa, bb, e cc, con il Crossing over si ottiene che AA si trova su cc, avviene lo scambio tra un
cromosoma ed un altro. lo scambio è avvenuto se il pezzo di un cromosoma si trova sull'altro, ad esempio ci
sarà la regione B con un pezzo di B con di fronte un pezzo di bb, detto anche etero duplex.

in una rottura da danno che è stata causata dai raggi X O I raggi gamma, quindi di natura clastogena, la
ricombinazione omologa avviene per l'intervento di esso nucleasi per generare un filamento, che
digeriscono in direzione 5’-3’ rendendo il 3’Oh disponibile, avviene l'invasione del filamento e la sintesi di
nuovo DNA, con il ripristino delle due copie integre, viene copiata la parte persa a partire dal cromosoma
fratello, fino a che non si rincontrano le due doppie eliche, la ligasi effettua la saldatura dei filamenti e la
giunzione di holliday viene risolta con la separazione dei due filamenti.

se vi è un danno nel DNA che blocca la forca o danni non riparati, la poli nera si passa, si ferma, avviene la
ricombinazione e la riparazione. se avviene un danno chimico ad un nucleotide e non viene riparato prima
della sintesi, la polimerasi non può ricopiare a causa del danno, la forca reverte e crea un substrato per la
ricombinazione, dando vita due filamenti tronchi.

negli eucarioti con la riparazione di tipo DSB, le forche sono bloccate ed avviene il Crossing over.
in escherichia coli il DNA lineare richiama la combinazione anche se esso è rotto. l'estremità rotte vengono
riconosciute dalle proteine REC a tre subunità, ovvero b, c e d, e legano le estremità dei due filamenti, le
svolgono e digeriscono il DNA su entrambi i filamenti, poi una regione rientra e forma un'ansa nel DNA
quando viene ad incontrare i siti Key, sequenze specifiche col complesso in cui si ferma e si riorganizza,
ferma una delle due attività endonucleasiche e si digerisce una sola, l’estremità 3’ ferma e crea un'ansa,
l'altro lato viene digerito, si generano due filamenti rotti con un singolo 3’, avviene un ripiegamento nel
complesso RecBCD, che richiama RECA, che media lo scambio del filamento.

le sequenze chi presentano la sequenza nucleotidica GCTGGTGG, su escherichia coli si dovrebbero avere 80
siti chi, ma se ne hanno circa 1000, che sono utili sia per la ricombinazione che per indicare al complesso
RECBCD che quello è il DNA di coli, quindi viene utilizzato come sistema di difesa, anche nel caso in cui
entra viene a fagico, sul quale RECBCD non incontra seguenze chi e digerisce tutto il DNA.

RECA deve avere come substrato due DNA per favorire lo scambio del filamento in una delle due molecole,
ci deve essere un 3’OH, dei possibili substrati circolari, a patto che ci siano un 3’OH ed una regione
scambiabile. RECA viene reclutata quando si accumula DNA, 3’OH e le altre Rec vengono rilasciate, si
assembla in direzione 5’-3’ con tutti i monomeri uno dietro l'altro, lungo il filamento proteine DNA, mentre
il singolo filamento si alloggia in un primo sito. avviene il riconoscimento degli omologhi sul sito primario
sulla porzione a singolo filamento, la quale deve riconoscere il suo omologo, nel sito secondario c'è il DNA
da saggiare che è a doppio filamento, mentre RECA prova di appaiamenti, e quando trova una regione con
almeno Un'identità di 15 paia di basi media l'invasione del singolo filamento, viene spostato il secondo
filamento dall'elica, si forma la giunzione, se non vi è movimento non vi è sintesi di nuovo DNA copiato, la
migrazione ed il chiasma devono rompere i legami idrogeno delle basi con idrolisi di atp, le proteine
riconoscono un chiasmo e ne promuovono la migrazione, il tetramero RUV e l’esamero RUBb, che ha
funzione atpasica, fa migrare RUVA che riconosce i filamenti che vanno tagliati, arriva L’endonucleasi RUVC,
che viene chiamata da RUVA e RUVB, la quale Lega alla giunzione di Holiday e taglia a debole specificità di
sequenza, riconoscendo la struttura ma non la sequenza. Soltanto RUVC è leggermente specifica, altrimenti
il chiasma non migra, è in grado di tagliare in alcune sequenze palindrome come 5’-ATTGC-3’, taglia per un
numero di volte secondo il numero di scambi possibili.

se il Crossing over non funziona i cromosomi non segregano bene, bisogna avere prima l'allineamento e poi
il Crossing over, e fondamentale per la segregazione, non funziona se non c'è un buon allineamento dei
gameti, che potrebbero presentare pezzi di cromosomi non trasferiti, come nelle condizioni di scarsa
fertilità che danno un numero di cromosomi sbagliato.

Il Crossing over avviene nella prima me usi con uno scambio e poi un secondo scambio tra cromosoma
paterno e materno. vanno create varie rotture al doppio filamento e la generazione di un singolo filamento
da parte di enzimi, si esprimono le proteine spo11 soltanto in miosi che sono dette ricombinarsi, le quali
generano rotture o scambio di DNA. le proteine presentano una tirosina che attacca il legame
fosfodiesterico, il legame 5’fosfato Lega due subunità di entrambi filamenti, il taglio avviene in modo
sfalsato, le esonucleasi MRX che degradano in direzione 5’-3’ dove spo11 va a legare, la topo isomerasi
riesce a far tornare indietro il 3’OH che attacca il fosfato della tirosina, spo11 si porta via a degradazione del
filamento, che spezzato, l'estremità 3’ mediano, filamenti omologhi RECA, RAD51, anche nel caso della
ricombinazione riparativa. Arriva DMC1, un filamento nucleo proteico, che media lo scambio, si copiano le
proteine che riconoscono il chiasma e la migrazione, avviene la risoluzione con lo scambio o il non scambio.

la ricombinazione può avvenire tra due regioni qualsiasi, ha consentito la costruzione di mappe genetiche,
più due geni sono lontani e più probabile che essi si ricombinano. RecA ed Sed omologhi competono con
SSB che coprono il filamento di DNA, se il filamento di DNA viene rotto, RECA presenta affinità maggiore di
SSB. vi sono punti caldi e punti freddi di ricombinazione, in particolare in coli sono i siti chi che determinano
la frequenza di ricombinazione, meglio eucarioti sono le interruzioni generate da SPo11, che interrompe il
filamento dove il DNA il più libero, in un DNA con attiva fase di trascrizione spo11 genera più Nick. nella
costruzione di mappe genetiche con frequenze di ricombinazione senza tener conto dei punti caldi, si
ottengono posizioni piuttosto diverse rispetto alle mappe reali. le interruzioni dei geni di ricombinazioni,
come BRCA2 che è coinvolto nell'aiutare di RAD51 ad assemblarsi sul DNA, non possono avvenire
ricombinazioni, in quanto essa è predisponente verso il cancro al seno, nella risoluzione del danno Recq
attivo può dare danni con sindromi a fenotipi diversi, come l'invecchiamento precoce.

un alele di un cromosoma si trova uguale nel cromosoma omologo. nel caso del patch solo due etero
duplex di un filamento paterno di fronte un filamento paterno in una regione di mismatch di base azotata e
non correttamente appaiate vengono riconosciute dal mismatch repair, non hanno un DNA di nuova o di
vecchia sintesi, perché il mismatch repair ripara a caso uno dei due filamenti. con quattro coppie di alleli AA
ed aa, due coppie si appaiano ed effettuano il Crossing over, ci sarà un filamento di A di fronte ad un
filamento di a. il mismatch repair ripara a caso, quindi se ripara copiando A, a verrà convertito in a, se
avranno ad esempio tre copie di A ed una di a. gli alleli su cromosomi diversi adesso si trovano sullo stesso
cromosoma oppure l'etero duplex converte un allele in un altro.

la ricombinazione sito specifica conservativa e una ricombinazione per trasposizione diversa dalla
ricombinazione omologa, nonostante entrambe presentano specificità di sequenza, quindi nel caso della
ricombinazione sito specifica non possono ricombinare sequenze casuali, ma sequenze specifiche che si
trovano in siti specifici del DNA, oppure sequenze specifiche in elementi non specifici del DNA. gli elementi
genetici mobili rappresentano circa il 50% del DNA, in buona parte sono elementi trasponibili, che possono
muoversi tra le cellule e rappresentano circa 1000 paia di basi, possono riarrangiare anche sequenze
adiacenti, che spostandosi possono modificare l'espressione genica dando vita al l'evoluzione. la
ricombinazione sito specifica vede un elemento che ricombina in una stessa sequenza di DNA invertendosi.
è trasponibile da un DNA donatore ad un DNA accettore senza specificità. Necessita però delle ricombinasi,
si forma il complesso sinaptico, ovvero il complesso ricombinari DNA ed avviene la ricombinazione. Sui siti
di ricombinazione ci saranno delle sequenze dove successivamente avverrà il taglio. l'inserzione del DNA
fagico nel DNA batterico dell'ospite, dove il DNA faGico viene riconosciuto e viene ricombinato in un punto
specifico del cromosoma batterico, in modo da non danneggiare l'ospite. la regione di riconoscimento e
simmetrica, mentre la sequenza di scambio e asimmetrica, la ricombinasi presenta varie subunità per il
taglio.

A seconda della disposizione delle sequenze se sussidi uguali ma su molecole diverse, una ripetizione
diventa il taglio, il donatore si inserisce nel accettore. se si parla della stessa molecola nello stesso verso,
durante la ricombinazione il frammento si scinde dall'ospite, mentre se il verso è diverso il frammento
inverte il suo verso dell'ospite.

La topoisomerasi presenta un dominio fosfotirosinico o serinico, il quale si reverte a fine reazione e le

ricombinate a serina taglialo in contemporanea i quattro filamenti con le quattro subunità diverse,
tagliando su R1,R2,R3,R4. Avviene il taglio, si forma il complesso sinaptico, avviene lo scambio E I filamenti
si ricongiungono. le ricombinarsi a tirosina tagliano due alla volta su due filamenti ciascuno, su due doppie
eliche, poi tagliano di nuovo su due filamenti ed avviene lo scambio.

la ricombinasi del fago p uno presenta dei siti di riconoscimento e scambio, CRE in cui si attivano prima due
subunità e poi altre due subunità, ed è utile per manipolare DNA per generare nuove molecole. se nelle
sequenze inserisco CRE, si ricombina anche il sito voluto. per facilità si utilizzano dei topi knock-out
geneticamente modificati mancanti di date funzioni, per studiare un'altra funzione, si manipolano per
esempio con la ricombinazione omologa nelle regioni del DNA dell'ospite e si creano due omologie sia sul
filamento estraneo che su quello interno, si ottiene ciò che si vuole, le omologie vengono riconosciute dal
sistema di ricombinazione omologa, vengono ricombinate nell'ospite, potendo interrompere le sequenze
geniche i preesistenti. se il topo muore nello stato embrionale vuol dire che quella funzione era essenziale
per la vita, altrimenti topi nascono mutati con un fenotipo studiabile, se non si ottiene nessun fenotipo, la
funzione è ridondante, per cui bisogna eliminare un'altra funzione omologa.

nel caso uno si usa la ricombinazione sito specifica per determinare quando un gene va a ricombinato, il
mio target funzionante si trova a valle OA Monte dei siti per le ricombinasi, a livello embrionale presenta la
funzione, dall'altro lato invece ho un OGM e faccio esprimere CRE a valle di un promotore specifico, faccio
incrociare i due topi, e solo il topo incrociato quando si esprime il promotore fa accendere CRE che vi
combine taglia la funzione.

inserzione del DNA fagico

inversione genica: frammento con un promotore che se viene invertito esprime i geni del lato opposto

mantenimento dell'integrità intestinale.

i fagi sono virus batterici che attaccano i batteri ed inseriscono il proprio DNA nell'ospite, il fago lambda
infetta escherichia coli ed è detto temperato, è in grado di svolgere sia il ciclo litico che lisogenetico, o si
inserisce nel DNA duplica e si Lisa, per poi essere rilasciato ed attaccare altri escherichia coli, solo se sa che
ci sono altre cellule infettabili, altrimenti si inserisce come profago nel diennea ospite, facendo avvenire
una ricombinazione sito specifica tra ATIP del fago e ATTB dei batteri. ATTIB presenta il legame per le
ricombinasi o per le integrasi Alfa, le quali riconoscono siti fagici e batterici, mentre ATT ed i siti per il
riconoscimento di altre proteine, fanno avvicinare i siti nel giusto orientamento e sono dette
architettoniche, in questo caso sono le proteine IHF, che fanno avvicinare i siti lontani: IHF si posiziona
avvicina i siti e li rende disponibili alle ricombinasi per l'integrazione, se invece il fago deve escindere XIS fa
avvenire l'appaiamento in modo diverso, impedendo l'integrazione.

mentre il DNA di escherichia coli duplica può avvenire la ricombinazione omologa di due molecole, le quali
possono non separarsi e causare la morte di coli. le ricombinasi XER separano i multimeri di DNA batterico
rendendoli monomeri.

Lezione 8

ti combinazione per trasposizione: è simile alla ricombinazione sito specifica, dove un elemento genico
definito viene inserito in un donatore non definito. avviene il trasferimento di un trasfusione da un sito
all'altro ho in doppia copia nel sito del donatore al accettore. sono definiti parassiti molecolari o junk DNA,
infatti si pensava che fossero elementi di fastidio che interrompessero le sequenze geni che fondamentali. il
DNA preserva se stesso con meccanismi regolatori, e preserva anche la cellula.

nei genomi eucariotici il 50% del genoma è ripetuto, rappresentato da trasposoni, elementi morti con
delezione che non sono più in grado di trasporre. si inseriscono nelle sequenze geniche interrompendo le
funzioni ho nelle regioni regolative, che sono ampie a livello degli eucarioti superiori, il rappresenta un
evento grave quando modificano la sequenza genica. una delle principali forme di mutazione che può
portare a malattie geniche o all'evoluzione della specie. Barbara miclentock li scopri nel mais, dove si
avevano si salti di DNA da un cromosoma all'altro, ed definì questi elementi trasponibili.

tutti gli organismi presentano i trasposoni, specialmente gli eucarioti superiori, come nel caso dell'uomo
dove gli elementi trasponibili sono tanti, mentre nel mais sono ancora di più.

esistono tre tipi di trasposoni: il primo tipo di trasfusioni è a DNA: sono costituiti da sequenze terminali
ripetute ed invertite all'interno di una sequenza che conteneva un gene per trasporsi (classe delle
ricombinasi per il taglio del DNA). Questo tipo di trasposoni è detto autonomo, se non contengono geni per
la trasposizione non sono in grado di trasferirsi, vi deve essere un elemento della stessa famiglia ed il gene
per la trasposasi, che riconosce gli elementi invertiti. Le estremità di duplicazione sono un sito bersaglio,
che indicano quante volte un gene è passato da un sito all'altro.
retro trasposoni simili a virus o retrovirus: sono simili a retrovirus quando sono in grado di infettare il
target. attaccano nelle regioni long terminal repeat, con delle ripetizioni invertite, nel trasposone c'è un
elemento per l'integrasi negli autonomi e una trascrittasi inversa. possono essere autonomi o meno e dare
vita a duplicazioni sul sito del target. sono differenti i in quanto i retrovirus impacchettano il proprio
genoma ed escono ad infettare altre cellule, mentre i retro trasposoni sono interni alla cellula.

retro trasposoni polia: rappresentano la classe più studiata nell'uomo, non hanno sequenze ripetute
invertite, presentano un 5’UTR untraslated e un 3’ untraslated, regioni che all'interno del RNA Messaggero
non vengono tradotte, presentano omologie con gli altri e RNA messaggeri e regioni ricche di adenina. due
regioni si presentano come open reading frame, in quelle regioni si codifica dal segnale d'inizio al segnale di
stop attraverso la traduzione proteica. ORF sono tutte le sequenze codificanti degli RNA messaggeri maturi.
ORF1 e ORF2 di una proteina che Lega l’ RNA dal trasposone e un altro fattore con due funzioni di
endonucleasi e trascrittasi inversa.

i trasposoni A DNA presentano un meccanismo semplice, specie quelli che non si duplicano, ovvero quelli
che si escindono e si inseriscono all'interno di altri. il trasposone con le proteine codificate si taglia dal
donatore e si va ad immettere nell’accettore. la trasposasi riconosce il bersaglio invertito e forma un
complesso sinaptico dove vanno ad inserirsi i pezzi per catalizzare le reazioni, si avvicinano le due sequenze
ripetute e la trasposasi taglia al livello del doppio filamento a Monte E A valle del trasposone. le sequenze
saranno leggermente sfalsate specie a livello del 3’OH, dove saranno tagliati 2,3,5,9 nucleotidi sfalsati, il
3’OH libero attacca al DNA target, avviene la trans esterificazione del 3’OH, che attacca il legame
fosfodiesterico e si inserisce nel target, il 5’ fosfato presenta dei buchi che vengono riconosciuti come
forma di danno, la polimerasi copia e riempie i gap, mentre le ligasi uniscono i Nick, di fatto aggiungendo
ripetizioni del sito target. il vecchio filamento da cui il trasposone si è escisso, presenta una rottura sul
doppio filamento, che verrà riparata con la ricombinazione omologa.

il meccanismo replicativo avviene sempre con le trasposasi ad estremità di taglio con un filamento da un
lato e l'altro dall'altro lato, le estremità saranno legate al DNA di partenza, si apre una forca sul target e si
copia il trasposone nello stesso DNA, che adesso avrà due copie dello stesso trasposone.

I retro trasposoni simili a virus presentano la terminazione come il DNA. nelle regioni LTR E A sinistra della
regione promotrice, per ottenere la trasposizione ci vuole la trascrizione interna del DNA ad RNA dal
promotore, l'elemento ad RNA viene riconosciuto dal gene e funziona come trascrittasi inversa, si retro
trascrive, prima con un filamento e poi con l'altro, proprio come se fosse un trasposone a DNA escisso,
l'estremità 3’OH attacca il target, avviene la riparazione del gap e la ligasi salda i Nick. i retrovirus si
impacchettano il proprio genoma nel capside, il secondo filamento di DNA s'inserisce nel genoma ospite.

con la ricombinazione si ottengono geni appositi per anticorpi specifici. dalle sequenze segnale che vanno
riconosciute avviene la ricombinazione di elementi noti a spaziatori diversi, con un eptamero a sinistra ed
un monomero a destra, lo spaziatore può essere a 12 O A 23 paia di basi. la ricombinazione avviene tra
spaziatori diversi.

vengono riconosciute dalle ricombinasi le sequenze