ANALISIS MICROBIOLOGICO DE LA

ENSALADILLA RUSA
1. PREPARACION DE LA MUESTRA

• Homogenización de la muestra. Necesitamos poner en

suspensión las bacterias que haya en nuestro alimento. Para ello, el
sistema que vamos a usar es un disruptor de paletas.

• Se pesan x g del alimento y los introducimos en la bolsa donde se

rompe el alimento (bolsas de Stomacher).

• Se añaden x ml de agua de peptona: medio tamponado que

mantiene estable la población bacteriana que haya en el alimento
pero no permite que se dividan.

• Trituramos durante x min.

• Una vez triturado, volcamos el contenido en la botella. A partir de

la botella madre vamos a realizar diluciones seriadas. A partir de
estas diluciones vamos a hacer siembras con x μl en cada placa.

-Despues de este paso previo de preparación de la muestra haremos los

siguientes analisis :

a)Coliformes fecales

b)Microorganismos aerobios

c) Levaduras y mohos

d)Enterobacterias

e)Salmonela

f) Staphylococcus
 a) Coliformes fecales
1. Definición.

Coliformes fecales: grupo dentro de las enterobacterias capaz de fermentar la

lactosa con producción de ácido y gas a 37ºC en un tiempo máximo de 48 h.

2. Medios de cultivo.

Medio específico para coliformes fecales (FC).

3. Siembra.

- Sembrar por duplicado 1 ml de dilución madre en placas Petri con medio FC.
- Repetir la operación con las siguientes diluciones.
- Incubar a 44ºC durante 24 h.

4. Recuento.

Contar las colonias de color azul de las placas que contengan entre 15 y 300.
b)Microorganismos aerobios

1. Definición:

microorganismos: Bacterias, levaduras y mohos que se desarrollan en aerobiosis,

cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.

2. Medios de cultivo:

Agar para recuento (PCA).

Agar blanco (AB).

3. Siembra:

-Sembrar por duplicado 1 mL de muestra líquida o 1 mL de dilucion madre en placas

Petri esteriles
-Repetir la operación con las siguientes diluciones decimales.
-Verter en cada placa unos 15 111Lde PCA a 45°C ± 1ºC
-Mezclar el inóculo con el medio y dejar que solidifique.
-Incubar a 30°C ±1ºC durante 72 h ±3 h.
-Contar las colonias de aquellas placas que contengan un maximo de 300.
c) Levaduras y mohos
1. Definicion

Levaduras: Microorganismos aerobios mesofilos que, en cinco dias, a 25"C, se

desarrollan en la superficie del medio sólido, formando colonias mates o brillantes,
presentando frecuentemente contorno regular y una superficie más u menos convexa
cuando el ensayo se realizasegún el siguiente método.

Mohos: Microorganismos aerobios mesófilos, filamentosos, que en la superficie de un

mediosólido a 25ºC, desarrollan colonias cuando el ensayo se realiza según cl siguiente
método.

Este desarrollo puede proceder de la germinación de esporas o del crecimiento de

fragmentosmicelares.

2. Medio de cultivo:

Agar glucosa y cloranfenicol (CGA)con gentamicina.

3. Siembra:

-Sembrar 0.1ml de muestra líquida o 0,l rnL de dilución madre en placas Petri con el
-medio CGA.
-Extender con asa de Drigalski
-Repetir la operación con las siguientes diluciones decimales.
-Incubar a 25°C ±1ºCdurante 5 días.

4. Recuento:

Contar las colonias de cada placa a los 3,4 y 5 días de incubación.

d)Enterobacterias
1. Definición:

Enterobacteriaceae: Bacterias que fermentan la glucosa y dan una reacción oxidasa

negativa cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.

2. Medios de cultivo:

• Caldo tamponado con bilis, verde brillante y glucosa (caldo EE) a doble y
simple concentracion
• Agar bilis cristal violeta y glucosa (VRBG).
• Agar glucosado (AG).
• Agar nutritivo (AN).

3. Reactivo:

-Reactivo para la prueba de la oxidasa.

4. Siembra:

Enriquecimiento:

Sembrar 10 mL de muestra líquida o 10mL de dilución madre en tres tubos con 10 mL

de caldo EE a doble concentración.
Sembrar 1mL de la muestra líquida o 1 mL de dilución madre en tres tubos de caldo EE
a simple concentración.
Repetir esta operación con las siguientes diluciones decimales.
incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ±2 h.

Aislamiento:

Aisla en placas de VRBG a partir de cada tubo.

Incubar a 37°C ±1°C durante 24 h ±2 h.

Selección:

Resembrar 5 colonias típicas bien aisladas (de color rojo violeta y a veces rodeadas de
un halo de precipitación del mismo color, o mucosas) en placas de AN.
Incubar a 37°C f 1°C durante 24 h ± 2 h.

5. Confirmacibn bioquimica:

Prueba de la oxidasa: Se realiza con cada una de las colonias aisladas. La prueba es
positiva si al cabo de 10sg Aparece una coloracion violeta
Prueba de fermentación de la glucosa:
Sembrar por picadura en tubos de AG a partir de cada una de las colonias aisladas
oxidasa negativo.
Sembrar por picadura en tubos de AG. La prueba es positiva si en la totalidad del tubo
aparece una coloración amarilla.
e) Salmonella

1. Definición.

Salmonella: es una enterobacteria no coliforme causante de muchas infecciones

intestinales. Su presencia en los alimentos es baja, por lo que requiere de un
enriquecimiento para poder detectar su presencia (análisis cualitativo, no de recuento).
Según este protocolo, serán positivas aquellas colonias de color rojo (debido al cambio
de pH por fermentación de la xilosa y descarboxilación de la lisina) y más aún si
presentan un color negro en el centro (por la produción de SH2).

2. Medios de cultivo.

- Agua de peptona tamponada.

- Caldo tetrationato-bilis-verde brillante: 250 μl de lugol + 150 μl novobiocin + 100 μl
verde brillante + 2 ml BO
- Medio específico Salmonella- Shigella XLD (Agar-xilosa-lisina-desoxicolato).

3. Siembra.

a) Preenriquecimiento: Pesar asépticamente y en envase estéril, 25 g del producto por

analizar. Añadir 225 ml de agua de peptona tamponada para obtener una solución al
1:10. Mezclar bien e incubar a 37ºC durante 16-20 horas.

b) Enriquecimiento: retirar 2 ml de la botella de preenriquecimiento y añadirlas al caldo

tetratonato-bilis-verde brillante e incubar a 42-43ºC durante 18-24 horas.

c) Aislamiento: Se sembrará por duplicado y sin recargar el asa de siembra en la

segunda placa a partir de la botella de enriquecimiento en medio específico XLD.

d) Confirmación bioquímica por galerías API: Los kits comerciales API son una ayuda
en la identificación rápida de Salmonella. Consisten en una serie de pocillos donde el
medio viene deshidratado. El proceso consiste en tomar biomasa de las colonias con el
asa de siembra y depositarla en la ampolla que acompaña al kit. Dejamos esta ampolla
en reposo a Tª ambiente 5 minutos y posteriormente, con una pipeta Pasteur se echan 2-
3 gotas en cada uno de los pocillos. En las reacciones anaerobias se sella con parafina
estéril.

Además existen 2 pruebas que necesitan de otros reactivos que la complementen:

Prueba deI indol: Se hace con 2 gotas del reactivo de Kovacs en el pocillo
correspondiente dejándola actuar 10 segundos. El positivo es un color rojo.

Prueba de Voges- Proscahuer: con una gota de KOH 20% y 2 gotas de α-naftol durante
20 minutos. Tiene que virar a rojo.
4. Recuento.

Observar si existe alguna colonia de color rojo en la placa.

f) Staphylococcus aureus

1. Definición.

Staphylococcus aureus: Pertenecen a la familia Micrococaceae y son cocos Gram +,

catalasa +, coagulasa + y son capaces de fermentar el manitol. En este ensayo nos van a
dar colonias de color blanco y harán que el medio vire de rojo a crema por un cambio de
pH.

2. Medios de cultivo.

Sal y manitol (Añadir cloruro sódico al 7,5% al Agar rojo de fenol y manitol).

3. Siembra.

- Sembrar por duplicado 1 ml de dilución madre en placas Petri con medio Sal y
manitol.
- Repetir la operación con las siguientes diluciones.
- Incubar a 37ºC durante 24 a 48 h.

4. Recuento.

Contar las colonias de color blanco de las placas que contengan entre 15 y 300.
 Despues de analizar la muestra, si esta supera los limites legales que se contemplan en
la ley, no será apta para su consumo.