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BIOLOGIA

MOLECOLARE
DEL GENE
JAMES D. WATSON ·TANIA A. BAKER • STEPHEN P. BELL
ALEXANDER GANN • MICHAEL LEVINE· RICHARD LOSICK

QUINTA EDIZIONE

URGIA

ZANICHELLI
BIBLIOTECA
DELLA
FACOLTÀ DI MEDICINA
E CHIRURGIA
ni Zanichelli
T ~ione
a. Medicine & Biology. Dizi onario
McConkey Genetica umana
Mutagenesi ambientale a cura di Migliore

cl cienze mediche e biologiche


Italiano Inglese Inglese Italiano
Delfino, E. Lanciotti, G. Liguri, M. Stefani
Pasternak Genetica molecolare umana
Pierce Genetica
Primrose, Twyman, Old Ingegneria genetica
Biotecnologie di base a cura di Ratledge. Kristiansen
Dizionario enciclopedico di medicina
liano Inglese Reed, Holmes, Weyer, Jones Metodologie di base
per le scienze biomolecolarl
1ichelli. Dizionario enciclopedico
co Inglese Italiano Italiano Inglese Singer, Berg Geni e genomi
\V Vv•~•v"v/ - - · · _.)•ROM
Smith Biotecnologie
Lecointre, Guyader La sistematica della vita Sudbery Genetica molecolare umana
Watson, Gilman, Witkowski, Zoller DNA ricombinante
Biologia generale e Antropologia fisica
Barnard, Gilbert, McGregor Osservazioni, analisi, test, Microbiologia, Virologia e Parassitologia
verifiche in biologia Collier, Oxford Virologia medica
Brum, McKane, Karp Biologia Davis, Dulbecco , Eisen, Ginsberg M icrobiologia (41 edizione)
Campbell, Reece Biologia (21 edizione - anche in 6 volumetti) Dulbecco, Ginsberg Virologia
Campbell Principi d i biologia Levine Virus (NCS 18)
Campbell, Reece L'essenziale di biologia Parassitologia a cura di Cox
Curtis, Barnes Biologia (51 edizione) Perry, Staley, Lory Microbiologia (2 volumi)
Farish Biologia umana Prescott, Har1ey, Klein Microbiologia
Futuyma Biologia evoluzionistica Saylers, Whitt Microbiologia
Krommenhoek, Sebus, van Esch Biologia in immagini. Atlante Schlegel Microbiologia
di microscopia elettronica, anatomia vegetale, istologia, Seely, Vandemark, Lee Laboratorio di microbiologia
embriologia, radiografia Stanier, lngraham, Wheelis, Painter Il mondo dei microrganismi
Lewin Le origini dell'uomo moderno (NCS 22) (2• edizione)
Lewontin La diversità umana (NCS 4)
Luria, Gould, Singer Una visione della vita. Introduzione Immunologia, Patologia, Anatomia, Fisiologia
alla biologia Dellantonio, Umiltà Atlantino di anatomia del sistema
McMahon, Bonner Dimensioni e vita (NCS 12) nervoso
Purves, Sadava, Orians, Heller Biologia (anche in 7 volumetti) Eisen Immunologia generale
Fisiologia a cura di Klinke, Silbemagl
Biologia molecolare, Citologia, Istologia Gazzaniga, lvry, Mangun Neuroscienze cognitive
Alberts, Johnson , Lèwis, Raff, Roberts, Walter Biologia Gray Anatomia a cura di Williams, Bannister, Berry
molecolare della cellula (41 edizione) Collins, Dyson, Dussek, Ferguson 3 voli. (41 edizione)
Alberts, Bray, Hopkin, Johnson, Lewis, Raff, Roberts, Walter Green Introduzione fisiologia umana
L'essenziale di Biologia molecolare della cellula Kapit , Elson Colorare l'anatomia
(21 edizione)
Le malattie a cura di Phillips, Murray. Crocker
Cooper La cellula. Un approccio molecolare
Marieb Elementi di Anatomia e Fisiologia dell'uomo
Cross, Mercer Ultrastruttura delle cellule e dei tessuti
Neuroscienze a cura di Purves (21 edizione)
De Robertis, De Robertis Biologia della cellula e molecolare
(51 edizione) Nicholls, Martin, Wallace Dai neuroni al cervello
De Robertis, De Robertis Elementi di biologia della cellula Parham Immunologia
e molecolare Patologia a cura di McGee, lsaacson, Wright (3 voi.)
Karcher Laboratorio di biologia molecolare Poritsky Neuroanatomia funzionale
Kessel Istologia generale e dei sistemi f?ritchard, Alloway Neuroscienze mediche
Lodish, Berk, Zipursky, Matsudaira, Baltimore, Damell Biologia R ~ichert Neurobiologia
molecolare della cellula (21 edizione) Roitt, Brostoff, Male Immunologia (51 edizione)
Ptashne, Gann Geni e segnali Thiel Atlante fotografico di anatomia chirurgica
Sadava Biologia cellulare Thompson Il cervello
Watson, Baker, Beli, Gann, Levine, Losick Biologia molecolare
del gene 2 volumi (51 edizione - anche con CD-ROM) Biochimica
Branden , Tooze Introduzione alla struttura delle proteine
Genetica e Biotecnologie Fersht Struttura e meccanismi d'azione degli enzimi
Ayala, Kiger Jr. Genetica moderna Garrett, Grisham Biochimica
Berg, Singer A tu per tu con i geni (NCS 19) Koolman, Rohm Testo atlante di biochimica
Brooker Genetica Nelson, Cox Introduzione alla biochimica di Lehninger
Glick, Pasternak Biotecnologia molecolare (3• edizione)
Griffiths, Suzuki, Lewontin, Gelbart Genetica. Nelson, Cox Principi di biochimica di Lehninger (31 edizione)
Principi di analisi formale (51 edizione) Ninfa, Ballou Metodologie di base per la biochimica
Griffiths, Gelbart, Miller, Lewontin Genetica moderna e la biotecnologia
Griffiths, Gelbart, Miller, Lewontin Genetica moderna voi. 1 Ricciotti Biochimica di base
Griffiths, Gelbart, Miller, Lewontfn Genetica moderna voi. 2 Ricciotti Fondamenti di biochimica
Hartl Genetica umana Ritter Fondamenti di biochimica
Hennig Genetica Rossini Principi di biochimica ormonale
Hoffee Genetica medica molecolare Stefani Introduzione alla biochimica
Knippers Genetiça molecolare Stefani, Taddei Chimica Biochimica e biologia applicata
Lewin Il gene VI Stryer, Berg, Tymoczko Biochimica (51 edizione)
Lollini Terapia genica Voet, Voet B iochimica
Mange, Mange Johansen Genetica e l'uomo Voet, Voet, Pratt Fondamenti di biochimica
JAMES D. WATSON ·TANIA A. BAKER
STEPHEN P. BELL • ALEXANDER GANN
MICHAEL LEVINE· RICHARD LOSICK

BIOLOGIA
MOLECOLARE ·
DEL GENE
QUINTA EDIZIONE

ZANICHELLI
Titolo o riginale: Molecular Biology of the Gene, Fifth Edicio n
Copyright © 2004 by Pearson Educatio n, !ne., pub lishi ng as Benj am in C ummings
Copyright © 1965, 1970. 1976, 1987 by The Be njamin C ummings Publishing Cornpa ny, lnc.

Autho rized translatio n from the English languagc editio n. en1 i1led Molec11/11r Biology ofthe Gene, 5th Ed itio n
by Watson. James D.: Baker Tania A.: Be li . Stc phcn P. : Gana A lexandcr: Levine Michael: Losick Richard.
pubLished by Pearson Education. lnc .. publishing as Be njamin Cummings.
Ali rights rescrved. No pan of this book may be re produced or transmilled in any form or by any means. electron ic
or mechanical. including photocopying. recording o r by any informa tio n storage re l rieval syste m. without permission
from Pearson Ed ucation. lnc.

Tradu zione: Gi anfra nco Badaracco, Massimo Crippa, Nicoletta Landsberger, Alessand ra Viganò

© 2005 Zaniche lli edito re S.p.A., via Ime rio 34. 40126 Bo logna [78901

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Fotocopie per uso personale (cioè privato e individuale) nei limiti del 15% di ciascun volume possono essere
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Conkommercio dcl 18 dicembre 2000, dietro pagamento del compenso previsto in tale accordo.

Per riproduzioni ad uso non personale reditore potrà concedere a pagamento l'autorizzazione a riprodurre
un numero di pagine non superiore al 15% delle pagine del presente volume.
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La ristampa degli esemplari esistenti nelle biblioteche di tali opere ~ consentita. non essendo concorrenziale
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Redazione: Red & Graph, Fi renze


Progeuo grafico e impaginazione: Massimo Vallese. Firenze
Indice analitico: imona Vannini
Coperrina:
- Progello grafico: b ia nca gra phic de ign. Mila no
- Reali:::.:::.a:::.ione: Anna Maria Za mboni
- Immagine di copertina: Ma n Ray. The meeting, l9

Prima edizione ita liana: luglio 1967


econda edizione italiana: genna io 1972
Terza edizione ita liana: feb bra io 1978
Quarta edi zione italia na: gennaio 1989
Quinta e dizio ne ita liana: luglio 2005

Rista mpa
5 4 3 2009 2008 2007 2006

Realizzare un libro è un'operazione complessa. che richiede nume rosi controlli:


sul testo. sulle immagini e sulle re lazio ni che si stabiliscono tra essi.
L'esperie nza sugge risce che è p raticamente impossibile pubblica re un libro
privo d i e rrori . Saremo quindi grati ai lellori che vorranno segnalarceli.
Per segnalazioni o suggerimenli relativi a questo libro rindirizzo a cui rivolgersi è:
Zan icbelli ed itore S.p.A.
Via 1rnerio 34
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fax 05 I293322
e·rnai I: Iinca_uni versi taria@za nichell i.it
sito web; www.zanichelli.il
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identificando il libro inte ressato a ll"interno del ooslro catalogo on line (www.zaniche lli.i1/f_calalog.h1ml}
e selezionando il link E RRATA CORRIGE. dove sono disponibili le eventuali correzioni io forma to PDF.

Per comunicazioni di tipo commerciale: universita@1..anichelli.it

Sta mpa: G rafica Ragno


ia Lombardia r.
-WQ6..I Tolara di Sotto. Ozzano Emilia ( Bo logna)
per conto di Z anichelli edi1ore .p.A.
Via I merio~. L6 Bologna
Pr

entre la quinta edizione di Biologia molecolare del gene andava in stam-

J\'_/J pa, il completamento della sequenza del genoma umano non era più
una novità. Quando la prima edizione del libro fu pubblicata nel
1965, un simile evento non era facilmente pronosticabile. Pochi avrebbero
previsto, quando fu pubblicata la quarta edizione nel 1987, quanto veloce-
mente si sarebbe giunti a comparare tra loro interi genomi, e non solo singo-
li geni. Un salto qualitativo altrettanto importante è stato compiuto nella
spiegazione delle strutture proteiche. Negli ultimi anni, le strutture degli ap-
parati molecolari che dirigono i processi di base descritti in questo libro - tra-
scrizione del DNA, replicazione, sintesi proteica, eccetera - sono state risolte
a livello di singoli atomi e molti meccanismi del loro funzionamento sono
. . .
stati sp1egat1.
La nuova edizione di Biologia molecolare del gene include naturalmente queste
ed altre nuove conoscenze. Nel momento in cui è stata progettata questa ulti-
ma versione, tutti gli autori si sono detti d'accordo nel mantenere la struttura e
lo scopo della prima versione e ciò non per una questione di convenienza; in-
fatti, e inevitabilmente, quasi tutto il testo è stato riscritto e tutti gli argomenti
sono stati trattati tenendo conto delle nuove chiavi di lettura ottenute grazie
agli straordinari avanzamenti scientifici occorsi dalla pu~b!icazione dell' ultima
edizione. Ci sembrava che, nell'epoca dei genomi, ci fosieancora la necessità di
un libro che spiegasse che cosa siano i geni e come funzionino: là.,5q:mo per cui
Biologia molecolare del gene era stato originari;µnènte concepito. /'_~:
C i siamo pertanto astenuti dagli aspetti ent.idopedistici e dalle d,igressioni
nelle discipline più immediatamente affini, quali, ad esempio, la b}_Qlogia cel-
lulare. Volevamo, inoltre, che la nuova edizione si foèalizzasse su c·oncetti e
principi quanto le precedenti. Pertanto siamo i'i~r~i ~n st~etta misura all'uso
di esperimenti (che compaiono principalment~- ri'çj bp~jns~riEl~el testo) per
illustrare i conten uti della trattazione. C iò ha consemié-0 di·non appesantire
il libro. Nella prima edizione l'autore scriveva: "Spesso il dato sperimentale
viene semplicemente 'presentato' e, a causa della mancanza di spazio, non
vengono descritti gli esperimenti che ne dimostrano la validità. Dovendo sce-
gliere se dare spazio ai dettagli sperimentali, sacrificando la trattazione di un
concetto importante, preferisco esporre il concetto". L'attuale edizione di
Biologia molecolare del gene incarna app ieno questa filosofia.
Pertanto, lo schema di questa nuova edizione sarà familiare a chi lo ha già
usato in precedenza. Si inizia (nella Parte 1) con una serie di capitoli (modifi-
cati nella presente edizione) che delineano i profili della biologia molecolare:
riassumono la storia della genetica e della biologia molecolare, ed enunciano
i principi chimici fondamentali che determinano la struttura e la funzione
delle macromolecole. Il testo quindi è organizzato in modo tale da seguire lo
scorrere naturale degli argomenti. Nella Parte 2 sono trattati la natura del ma-
teriale genetico, la sua organizzazione e la sua conservazione; in aggiunta ai
capitoli sulla struttura del DNA, sulla replicazione, sulla ricombinazione e
sulla riparazione, ne è stato inserito uno nuovo sui cromosomi, sulla cromati-
na e sui nucleosomi. Questa parre aggiuntiva riflette l'attenzione per il con-
testo molecolare in cui si trova un certo gene e come esso ne influenzi la fun-
zione e la regolazione.
IV I Premessa C~"78'l0-C

Il passaggio di informazione dal gene alla proteina - la o idderra espressione


genica - è trattato nella Parre 3; nella Parre 4 viene discussa la regolazione di
questo processo. In oltre questa parte contiene i capitoli che i occupano d el-
1'espressiòne genica nello sviluppo animale e nell'evoluzione della diversità
animale, che rinnovano un uso già presence nelle precedenti edizioni, dove in
uno o due capitoli venivano collegati i meccanismi di base della biologia mo-
lecolare ai problemi biologici più urgenti. Nella presence edizione. quesci ca-
pitoli esplorano la scoperta forse più significativa ottenuta comparando le e-
quenze genomiche di vari animali: animali diversi - incluso l' uomo - con-
tengono in gran parre gli stessi geni e quindi le differenze era di loro devono
essere per lo più il risultato di variazioni nell'espressione di tali geni.
I.: attuale edizione presenta una nuova parre - la Parre 5 - che include capito-
li sui metodi sperimentali - le tecniche di biologia molecolare, genomica e
bioinformatica - e sugli organismi adottati come modelli sperimentali, il cui
studio ha permesso di svelare molti dei principi socresi alla biologia moleco-
lare.
In precedenza abbiamo menzionato la quantità di strutture studiare a livello
atomico negli ultimi anni. Fra queste non ci sono solamente molci degli enzi-
mi che mediano i processi di base della biologia molecolare e moire delle pro-
teine che regolano quei processi, ma anche il nucleosoma. Mentre è sempre
vero che la comp rensione dei concetti di base di biologia molecolare non ri-
chiede la conoscenza di dettagli scruccurali - e questo, peraltro, è uno dei
punti di forza di questa disciplin a - è altrettanto vero che la chiara percezione
dei suoi fenomeni meccanici si ottiene solamente dalla osservazione di questi
particolari. Di conseguenza, i dettagli strutturali sono stati inseriti q uando
consentono di comprendere meglio il funzionamento delle molecole; e ciò è
staro fatto in modo omogeneo in tutto il libro.
I.:inizio di ciascuna parte comprende una breve descrizione di quanto verrà
trattato nei capitoli successivi ed alcune forografìe. Tutte le foro provengono
dall'archivio del Cold Spring Harbor Laborarory e sono stare scattate, in lar-
ga parre, nel laboratorio a Long Island durante i simposi ospitati ogni anno
fin dall'estate del 1933. Le didascalie identificano i personaggi ritrarci nella
foto e l'anno in cui questa fu scattata. Per le forografìe si ringraziano Clare
Bunce e l'archivio del CSHL.
Alcune parti della presente edizione traggono spunto da un corso incrodurri\·o
alla biologia molecolare, tenuto da uno degli autori (Richard Losi · alla Har-
vard Universicy. I.:aurore ringrazia Steve H arrison e Jim \ ang per il loro con-
tributo al corso negli anni passati, che si riflette nella struuura d Capitolo 6
1 Per Kraul is ci ha consenrico di usa- ed in altre parti del libro. In qualità di autori, abbiamo mo.srr.aco &·erse stesu-
re MolScripr (Kraulis P.J. 199 1. re del libro a vari colleghi ed i loro commenti sono rari preziosi nel migliorare
I\IOLSCRIPT: A program ro produ- l'accuratezza e la fruibilità del testo e delle figure. In pamcolare ringraziamo:
ce borh derailed and schemaric plors
Arnie Care, Richard Ebright, Mike Eisen, Chris Fromme, Ira Hall, Adrian
of prorein srrucrures. journal ofAp-
Krainer, Karolin Luger, Bill McGinnis, M att 1ichae.. Lily Mirels, N ipam Pa-
plied Crymzllography 24: 946-950).
Ro berr Esnouf ci ha consenrito l' uso
rei, C raig Peterson, Mark Ptashne, Uttam RajBhan<lary e Bruce Stillman. Inol-
di Bo bScripr (Es no uf, R.M. 1997 tre, C raig Hunter ha preparato la sezione sul nemarode per il Capi colo 21 --
joumal of Molecular Graphics 15: remmo ringraziare anche coloro che ci hanno ;Orniro le figure o i m~ o::;;
132-34). lnolrre, Ethan Merrirr ci ha prepararle, in particolare: Sean Carroll, erh Da.rsr, Edward Egei.mali. ~ :: -=
forni to Rasrer3D (Merrirr EA. e Ba- Halder, Stuart Kim, Bill McGinnis, Steve Pa ock, Phoebe Rice. ).far-::
con D.J. 1997 Rasrer3D: Photorea- Peter Sorger, Andrzej Stasiak, Tom Steirz, Dan \ 'oyras e Steve est.
lisric Molecular Graphics. Methods Siamo molto grati a Leemor Joshua-Tor per a,·er eseguito tutte le illus-~~­
in Enzymology 277: 505-524), e delle strutture molecolari, spesso disegnandone più di una ed aiutane
Barry Honig ci ha consenrito l'uso di pazienza a scegliere quella che meglio i confaceva a ciò che doYe\~
GRASP ( icolls A., Sharp K.A., e
lustrato. Vorremmo anche ringraziare coloro che ci hanno forni co
Honig B. 199 1 Prorei n folding and
associarion: lnsighrs fro m rhe inrer-
re 1 : Per Kraulis, Robert Esnouf, Erhan Merrirr e Barry Honig. Le ...:.":iGZ••
facial and rhermodynamic properries atomiche delle varie strutture sono stare ottenute dalla Pro tein ~
oi hydrocarbons. l'roteins 11 : 28 1- (www.rcsb.org/pdb/) ; le didascalie delle figure contengono i rifer.;:::i::-o111111
:'96) loro che hanno risolto tali strutture.
Il nostro programma di disegno è stato sviluppato ed implerr.!'"'-
e sa-0a-11a90-0 Premessa I V

gruppo di persone molto competenti ed entusiaste, presso il Dragonfly Me-


dia Group, guidate da Mike Demaray e Craig Durane. Renate Helmiss ha
sviluppato alcuni dei nostri schizzi originali ed ha eseguito numerose figure.
Ringraziamo tutti coloro che hanno seguito l'evoluzione di questo libro al
Cold Spring Harbor Laboratory Press. Jan Argentine, per essere stata meno
fiscale nel farci rispettare le scadenze di quanto non sia stata impegnata, in-
sieme a noi, a risolvere i problemi posti da esse. Maryliz Dickerson, per I'or-
ganizzazione del materiale da noi prodotto e Nora Rice, per aver coordinato
gli incontri tra gli autori ed altri aspetti del progetto. John Inglis, il quale ha
dato inizio a questa collaborazione, per la sua disponibilità ed i suoi consigli
nei momenti critici del progetto. Più di ogni altro, Kaaren Janssen, la nostra
redattrice, ha mantenuto "la rotta" con un'energia, un entusiasmo ed un' ope-
rosità che sono andati ben oltre le nostre ragionevoli aspettative; semplice-
mente le cose non sarebbero mai arrivate in fondo senza di lei.
Vorremmo anche menzionare coloro che presso l'editore Benjamiri Cum-
mings hanno coordinato la produzione del libro. Frank Ruggirello ha so-
vrainteso il lavoro svolto da Jim Smith, Kay Ueno, Corinne Benson, Alexan-
dra Fellowes, Jeanne Zalesky e Donna Kalal. Ingrid Mount, della Elm Street
Publishing Services, è sopravvissuta alle numerose modifiche apportate al le
figure ed al testo anche nelle fasi finali del processo. Michele Sordi, della Ben-
jamin Cummings ha organizzato il gruppo di lavoro.
Per concludere, vorremmo ringraziare le nostre famiglie e gli amici che, du-
rante questo periodo, ci hanno sostenuto, nonostante le nostre assenze sia· fi-
siche che mentali.

James Watson
Tania A. Baker
Stephen P. Beli
Alexander Gann
Mkhael Levine
Richard Losick

J
j
Si ringraziano rutti i docenti per i loro importanti suggerimenti e commenti, in special modo coloro che:

hanno rivisto il testo C urtis Loer, University ofSan Diego


Ann Aguanno, Marymount Manhattan College Virginia M cDonough, Hope College
Charles F. Austerberry, Creighton University Michael]. McPherson, University ofLeeds
David G. Bear, University ofNew Mexico Health Victoria Meller, Tufts University
Sciences Center W illiam L. Miller, North Carolina State University
M argaret E. Beard, Holy Cross Dragana Miskovic, University of Waterloo
Gai! S. Begley, Northeastern University D avid MuUin, Tulane University
Sanford Bernstein, San Diego State University Jeffrey D . N ewman, Lycoming College
Michael Blaber, Florida State University James B. Olesen, Bali State University
N icole Bournias, California State University, San Amhony ] . O tsuka, Illinois State University
Bernardino Karen Pal ter, Tempie University
John Boyle, Mississippi State University James G. Patton, Vanderbift University
Suzanne Bradshaw, University ofCincinnati Ian R. Phillips, Queen Mary, University ofLondon
John G. Burr, University ofTexas, Dallas Steve Picksley, University ofBradford
Michael A. Campbell, Pennsylvania State University, Todd P. Primm, University ofTexas, EL Paso
Erie, The Behrend College Eva Sapi, University ofNew Haven
hirley Coomber, King's College, University ofLondon Jon B. Scales, Midwestern State University
Anne Cordon, University ofToronto Michael Schultze, University of York
umana Dana, Texas A&M University Venkat Sharma, University of Wést Florida
Jeff DeJong, University ofTexas, Dallas Erica L. Shelley, University of Toronto, Mississauga
Jurgen D enecke, University ofLeeds Elizabeth A. Shephard, University College, London
usan M. Di Bartolomeis, Millersville University Margaret E. Stevens, Ripon College
anrosh R. D'Mello, University ofTexas, Dallas AkifUzman, University ofHouston, Downtown
Robert J. Duronio, University ofNorth Carolina, Quinn Vega, Montclair State University
Chapel Hill . . Jeffrey M. Voight, Afbany College ofPharmacy
teven W Edwards, University ofliverpool Robert W iggers, Stephen F. Austin State University
Allen Gathman, Southeast Missouri State University Bruce C. W ightman, Muhlenberg College
Amhony D. M. G lass, University ofBritish Columbia
Elliott S. Goldstein, Arizona State University
Ann Grens, Indiana University, South Bend hanno sperimentato il testo in classe
Gregory B. Hecht, Rowan University C harles F. Ausrerberry, Creighton University
Roberr B. H elling, University ofMichigan C hristine E. Bezocré, Elmira College
David C. Hi ggs, University ofWisconsin, Parkside Asuid H elfant, Hamifton College
~Iark Kainz, Cofgate University Gerald Joyce, The Scripps Research lnstitute
Gregory M . Kelly, University of Wéstern Ontario Jocelyn Krebs, University ofAlaska, Anchorage
Ann Kleinschmidt, Allegheny College C ran Lucas, Louisiana State University in hreveport
Dan Krane, Wright State University Anthony J . Otsuka, Illinois State University
~ fark Levin thai, Purdue University C harles Polson, Florida lnstitute ofTechnology
Gary ]. Lindguester, Rhodes College Ming-Che Shih, University oflowa
~J
VII

Evidenze sperimentali indicano che i filamenti


Parte prima del DNA si separano durante la replicazione 26
Chimica e genetica

Cj.faO.]i.i 1
• L'informazione genetica all'interno del
DNA viene trasmessa attraverso la
sequenza dei suoi quattro componenti
La visione mendeliana del mondo nucleotidici 28
Il .DNA non può essere lo sram po che ordina
• Le scoperte di Mendel
Il principio della segregazione indipendente
6
6
direrramente gli amminoacidi durante
la sintesi proreica 28
ox 1 Le Leggi di Mendel 6 CRNA dal punto di visra chimico è molro
simile al DNA 28
Alcu ni al lel i non sono né dominanti né recessivi 7
2.2 Prova che i geni controllano l.tz sequenza
Principio dell'assortimento indipendente 8 amminoacidica deffe proteine 29
• La teoria cromosomica dell'eredità 9
• li dogma centrale 30
• Box
Linkage genico e crossing over
1.2 I geni sono Legati ai cromosomi
9
10
Ciporesi dell'adattatore di Crick
La sintesi delle proreine in proverra
31
32

• Mappatura dei cromosomi 11 Il paradosso dei ribosomi non specifici


La scoperra dell' RNA messaggero (mRNA)
32
33
• L'origine della variabilità genetica
attraverso le mutazioni 14 La sintesi enzimarica dell 'RNA su uno
sram po di DNA 34
• Prime ipotesi sulla natura dei geni
e sul loro funzionamento 15
La dererminazione del cod ice genetico 35

• Primi esperimenti per trovare


una relazione gene-proteina 16
• La determinazione della d irezione
della sintesi proteica 36
I segnali di inizio e di rerminazione (srop)
Sommario 17 sono anch'essi codificati nel DNA 38
Bibliografia 17
• L'era della genomica 38
Sommario 39
G.fa't.l'·' 2 Bibliografia 39
Gli acidi nucleici trasmettono
l' informazione genetica CiJQlt.]!.i 3
• "l'esplosiva"· scoperta di Avery: il DNA
può portare la specificità genetica 20
L' importanza dei legami debol i nelle
interazioni fra molecole
I gen i virali sono anch'essi acidi nucleici 21
• La doppia elica 21 • Caratteristiche dei legami chimici
I legami chimici possono essere spiegaci
41

Box 2.1 La regol.tz di Chargajf 23 in termini di meccanica quantistica 42


AJla ricerca delle polimerasi che sinterizzano La formazione dei legam i chimici implica
il DNA 24 cambiamenti della forma di energia 43
VIII I Indice e aa.os-11a90-0

Esisce un equilibrio fra i legWii creaci e quelli


distrutti 43 • I legam i ad alta energia nelle reazioni
biosintetiche 60

• Il concetto di energia libera


~è correlata al llG in modo esponenziale
44
44
I legami peptidici si idrolizzano
spontaneamente 61
Un llG pos~civo viene accoppiato ad uno
I legami covalenti sono molto forti 44 negauvo 61
• I legami deboli nei sistemi biologici
I legami deboli possiedono un'energia
45
• L'attivazione dei precursori nelle reazioni
di trasferimento di gruppo 62
compresa fra 1 e 7 kcal/mol 45 La versacilicà dell'ATP nel trasferimento
Alle temperature fisiologiche i legami deboli si di gruppo 63
formano e si rompono continuamente 45 Lattivazion~ degli amminoacidi per mezzo del
La distinzione fra molecole polari e non polari 45 legame con AMP 63
Forze di van der Waals 46 I precursori degli acidi nucleici sono accivati
Legami idrogeno 47 dal G- G 64
Alcuni legami ionici sono legami idrogeno 48 Limportanza del rilascio di G- G neUa sintesi
degli acidi n~cleici 65
Le interazioni deboli richiedono superfici
complementari 49 La roccura del G- G caratterizza la maggior
parte deUe reazioni biosintetiche 65
Le molecole d'acqua formano legami idrogeno 49
Sommario 67
Box 3.1 L'unicità delle forme molecolari ed il Bibliografia 67
concetto di adattamento strutturale
selettivo 50
Legami deboli fra molecole in soluzione
acquosa 51 L3.faO.]!.i 5
Le molecole organiche che rendono a formare
I legam i deboli e forti determinano la
legami idrogeno sono idrosolubili 51
struttura delle macromolecole
I legami idrofobici stabilizzano le
macromolecole
Il vantaggio di un /lG compreso fra
52
• Le strutture d i ordine superiore sono
determinate da interazioni
2 e 5 kcal/mol 53 intramolecolari e intermolecolari 68
I legami deboli permettono la formazione di li DNA può formare un'elica regolare 68
complessi enzima-substrato 53 LRNA forma una grande varietà di strutture 70
I legami deboli mediano la maggior parte delle La struttura chimica degli elementi base che
interazioni proteina:DNA e proceina:proteina 53 formano le proteine 70
Sommario 54 Il legame peptidico 72
Bibliografia 54 Esistono quaccro livelli strutturali nelle
proteine 72
a eliche e foglietti ~ sono forme comuni di
struttura secondaria· 73
AUlt.l!·' 4 BOi .1 Determinazione della struttura delle
L'importanza dei legami forti proteine 74
• Le molecole che cedono energia sono
termodinamicamente insta b ili 55
• La formazione di legami idrogeno
determina la conformazione specifica
delle proteine 77
• Nelle reazioni biochimiche gli enzimi
abbassano l'energia di attivazione 57
Le a eliche si avvolgono l' una ull'al rra
formando scrurrure "coiled-coil" 78
• L'energia libera nelle biomolecole
Lidrolisi dei legam i ad alca energia porta ad
58 • La magg ior parte delle proteine ha una
struttura mod ulare, conten ente due
un G igni.fìcacivamente negacivo 58 o tre domin i -9
e ss-0a-11e90-0 Indice I IX

Box5.2 Le grandi proteine sono spesso formate da Box6.l Il DNA ha, in soluzione, I Opaia
diverse catene polipeptidiche più piccole 80 di basi per giro d'elica: l'esperimento
Le proteine sono formate combinando un con la mica 103
n umero straordinariamente piccolo di motivi La doppia elica presenta un solco maggiore
strutturali 81 ed un solco minore 104
Le diverse funzioni proteiche derivano dalla Il solco maggiore fornisce molte informazioni
combinazione di diversi domini 81 di tipo chimico 104
• I legami deboli permettono un corretto La doppia elica esiste in conformazioni
posizionamento delle proteine sulle multiple 105
molecole di DNA e RNA 82 Il DNA alcune volte può formare un'elica
Le proteine scorrono lungo il DNA per trovare levogira 107
uno specifico sito di legame 84 Le due catene del DNA possono separarsi
Le proteine usano strategie diverse per (denaturazione) e riassociarsi 108
riconoscere !'RNA 85
Alcune molecole di DNA sono circolari 110
• L'allosteria, ovvero la regolazione di una
funzione proteica attraverso il • La topologia del DNA 111
cambiamento di forma 86 Il numero di legame topologico (linking
Esempi di regolazione allosterica mediata da number) è una proprietà non variabile del
piccoli ligandi, da interazioni proteina-proteina DNA circolare covalencemence chiuso 111
e da modificazioni post-traduzionali 86 Il legame topologico comprende due
Non tutta la regolazione proteica avviene componenti: il twist e il wriche 111
mediante eventi alloscerici 89 LflJ è il linking number di un cccDNA
Sommario 90 completamente rilassato in condizioni
Bibliografia 91 fisiologiche 113
Il DNA nelle cellule è superavvolto ·
neganvamen ce 114
I nucleosomi introducono superavvolgimenti
Parte seconda negativi nel DNA degli eucarioti 114
Manutenzione del genoma Le ropoisomerasi possono rilassare il DNA
superavvolto 11 5
GUH·l!·' 6 I procarioti posseggono speciali topoisomerasi
che introducono superavvolgimenci nelle
La struttura del DNA e dell'RNA molecole di DNA 116
• La struttura del DNA 98 Le topoisomerasi permettono anche
leliminazione di nodi e la separazione
di molecole di DNA 116
Il DNA è formato da catene poli nucleotidiche 98
Le copoisomerasi usano un legame covalente
Ciascuna base si trova nella sua forma proteina-DNA per cagliare e successivamente
cautomerica preferita 100 risaldare i filamenti del DNA 117
I due filamenti della doppia elica sono tenuti Le topoisomerasi formano un ponce sul nick
assieme dall'appaiamento delle basi con e permettono il passaggio di un filamento
un'orientazione antiparallela 101 di DNA attraverso l'altro 118
Le due catene della doppia elica hanno I topoisomeri di DNA possono essere separati
sequenze complementari 101 mediante elettroforesi 119
Il legame idrogeno è importante nel Box 6.2 Dimostrazione che il DNA ha una
determinare la specifici tà delle coppie di basi 101 periodicità dell'elica di I 0,5 paia
Le basi possono ruotare all'esterno della di basi per giro utilizzando le proprietà
doppia elica 102. topologiche di un DNA circolare 120
Il DNA è normalmente una doppia elica I.:eridio causa uno srotolamento della doppia
destrogira 102 elica del DNA 120
X j lnd1ce 0 88-08-17890-0

• La struttura dell ' RNA 12 1 La micosi mantiene il medesimo numero


1.:RNA contiene il ribosio e l'uracile ed è parentale di cromosomi 144
normalmente a singolo filamento 12 1 Le fasi G del ciclo cellulare da nno
Le ca[ene d i RNA si ripiegano su se S[esse il [empo di preparare il ciclo cellulare
per fo rmare brevi u atti a doppia elica simili successivo e permenono cli conuollare
al D A cli fo rma A 122 che il ciclo precedente sia terminato
corre[tamente 146
1.:RNA può ripiegarsi per fo rmare complesse
suum1re [erziarie 124 La meiosi riduce il numero dei cromosomi
paren[al i 146
Alcuni RNA sono enzimi 124
Al m icroscopio possono essere evid enziati
Il ribozima hammerhead raglia !'RNA am averso d iversi livelli di struttura del cromosom a 148
la fo rmazione cli un fosfato cicl ico 2' , 3' 125
G li RNA hanno avu to una parte imponan[e • li nucleosoma 149
nell'evoluzione biologica? 126 I nucleosomi sono i ma[toni fo ndamentali
del cromosoma 149
Sommario 127
Bibliografia 128 Box .1 La nucleasi micrococcica e il DNA
associato con il nucleosoma 150
G li istoni sono piccole proteine cariche
positivamente 151
G.faH·l!·' 7 La struttura atom ica d el nucleosoma 154
Cromosomi, cromatina e nucleosoma
Le interazioni fra il co re istonico e il D NA
sono mediate da m olti contatti indi pendenti
• La sequenza del cromosoma
e la diversità 130 dalla sequenza 156
Le code N-[erminali degli isto ni stabil izzano
Il cromosoma può essere circolare o lineare 130
il D NA avvolgendos i attorno ali' ottamero 156
O gni cellula mantiene un numero definiw
d i cromosomi 131 • Strutt ure d i ordine superiore della
La grandezza del genoma è correlata alla cromatina 157
complessità del!' organism o 132 1.:iscone H l lega il D NA linker fra i
Il genoma di E coli è fo rm ato quasi nucleosomi 157
interamente da geni 134 I nucleosomi disposti in serie possono
G li organ ismi più complessi hanno una formare strutture com plesse: la fibra
minore densità gen ica 134 d a 30 nm 159
I geni rappresent~no soltanto una piccola Le code N-term inali degli istoni intervengono
porzione del DNA cromosom ico eucariotico 135 nella formazione della fibra da 30 nm 160
La maggior parte delle sequenze intergen iche Un ulteriore compattamento è determinato
umane è formata da D N A ripetuto 137 dalla formazione di ampie anse d i D NA
nucleosomico 160
• Duplicazione del cromosoma Varianti isconiche alterano la fu nzione del
e segregazione 138 nucleosoma 162
I cromosomi eucariotici per essere mantenuti
durante la divisione cell ulare richiedo no i • Regolazione della struttura della
cromatina 162
centromeri, i telomeri e le origini di
replicaz:one 138 l.: interazione del DNA con l'otrnmero
isconico è dinamica 162
La duplicazione del cromosoma eucariotico
e la segregazione avvengono in fas i separate I complessi di rimodellamento possono
del ciclo cellulare 140 facilitare il movimento dei nucleosomi 163
La srrurrura del cromosom a cambia d urante Alcu ni nucleosomi sono posizionaci, in vivo,
la divi ione cellulare eucariotica 142 in siti specifici: pos izionamento dei
La coesione dei croma[idi fra[el li e la nucleosomi 16'
conden azione dei cromosomi sono media[e Box 7 .2 Detenninazione della poSt::ione dn
dalle prQ[eine 1C 143 nucfeosomi ne/In cellula 166
C BB-08-1 7890-0 Indice I Xl

Le modificazioni della coda N-terminale degli Proteine che si legano al singolo filamento
istoni alterano l'accessibilità alla cromatina 168 stabilizzano la sua struttura prima della
Enzim i specifici sono responsabili delle replicazione 192
modificazioni degli istoni 170 Le topoisomerasi rimuovono i
Le modificazioni del nucleosoma e il superavvolgimenti prodoni dall'apertura
rimodellamenro lavorano insieme per del DNA alla forca replicativa 193
aumentare l'accessibilità al DNA 171 Gli enzimi che lavorano al la forca replicativa
estendono il substrato utile per la DNA
• Assemblaggio dei nucleosomi 171 polimerasi 194
I nucleosomi sono assemblati immediatamente
dopo la replicazione del DNA 17 1 • La specializzazione delle DNA
polimerasi 195
I..: assemblaggio dei nucleosomi richiede dei
trasportatori di .istoni 174 Le DNA polimerasi sono specializzate in ruoli
differenti all'interno della cellula 195
Sommario 175
Le proteine, che permettono lo scivolamento
Bibliografia 176
delle polimerasi (sliding clamp) sul DNA,
aumentano la processività della DNA
polimerasi 197

A.fait.l!·' 8 Le sliding clamp vengono aperte e depositate


sul DNA da posizionatori specifici 200
La replicazione del DNA
Box 8.2 L'ATP controlla la fonzione
• La chimica della sintesi del DNA 178 di posizionamento della proteina
La sintesi del DNA richiede
sliding clamp 200
deossiribonucleosidi trifosfati • La sintesi del DNA a livello della forca
e una struttura innesco:stampo 178 replicativa 202
Il DNA è sintetizzato allungando Le interazioni fra le proteine della forca
il terminale 3' dell'innesco 179 replicativa danno luogo al replisoma
I..:idrolisi del pirofosfato è il motore di E. coli 203
per la sintesi del DNA 179
• La fase di inizio della replicazione 206
• Il meccanismo d 'azione della DNA Specifiche sequenze genomiche promuovono
polimerasi 180 l'inizio della replicazione del DNA 206
La DNA polimerasi utilizza un singolo sito Il modello dei repliconi per l'inizio della
arrivo per catalizzare la sintesi del DNA 180 replicazione 207
La DNA polimerasi assomiglia ad una mano Il replicatore include un siro di legame per
che afferra il complesso innesco:stampo 181 l'iniziatore dove la doppia elica viene separata
Le DNA polimerasi sono enzimi processivi 185 facilmente 207
Attività esonucl easiche correggono eventual i Box .3 Identificazione delle origini di
errori farti sul DNA neosintetizzato 187 replicazione e replicatori 208

• La forca replicativa
Entrambi i filamenti di DNA vengono
188
• Selezione delle origini e attivazione
operata dall'iniziatore 211
sinterizzati a livello della forca replicativa 188 ox 8. La replicazione del DNA di E. coli
I..:inizio di un nuovo filamento di DNA è regolata dai Livelli di DnaA·ATP
richiede un innesco di RNA 189 eSeqA 211
G li RNA primer devono essere rimossi Interazioni proteina-proteina e proteina-DNA
affinché la replicazione del DNA determinano il processo di inizio
possa essere completata 189 della replicazione 213
La DNA dicasi apre la doppia elica iX 8.5 Struttura ipotetica del complesso
per formare la forca r~plicariva . 190 proteico per la replicazione 2 15
BOx .1 Determinazione della polarità della I cromosomi eucariotici vengo no replicati
DNA elicasi 191 un a sola volta ogni ciclo cellulare 2 17
Xli I Indice o 88-08-1 7890-0

La formazione di un complesso pre-replicacivo Gli enzimi di riparazione per escissione di basi


guida l'inizio della replicazione eliminano le basi danneggiare "ribaltandole"
negli eucarioti 21 7 fuori dal DNA 241
La formazione e l'attivazione del pre-RC Gli enzimi che riparano per escissione
sono regolate in modo cale da permettere nucleotidica cagliano il D A danneggiato
un solo ciclo di replicazione durante ad entrambi i margini della lesione 243
ciascun ciclo cellulare 220 La ricombinazione ripara le rotture del DNA
Similarità fra l'inizio della replicazione degli recuperando la sequenza nucleotidica dalla
eucarioti e quella dei procarioti 221 doppia elica non danneggiata 245

• La terminazione della replicazione


Le topoisomerasi II sono necessarie per separare
222 La sintesi di DNA cranslesione permette alla
replicazione di superare il d anno 246
le molecole di DNA neosintecizzace 222 Box 9.3 La famiglia Y delle DNA polimerasi 248

Il normale meccanismo di sintesi del filamento Sommario 249


lagging non è capace di copiare le estrem ità Bibliografia 250
dei cromosomi lineari 222
La celomerasi è una particolare D NA
polimerasi che non richiede uno scampo
esogeno 224 GU•t.l!·' 1O
La celomerasi risolve il problema della La ri com binazione omologa a livel lo
replicazione delle terminazioni allungando molecolare
il terminale 3' del cromosoma 225
Sommario
Bibliografia
226
227
• I diversi modelli per la ricombinazione
omologa 251
Il modello di Holliday spiega alcuni passaggi
chiave della ricombinazione omologa 252
Il modello della riparazione delle rotture
CiJQlt.J!·j 9 a doppio filamenro descrive in modo più
La mutabilità e la riparazione del DNA accurato molti eventi ricombinativi 254
D iversi meccan ismi portano all'insorgenza
• Gli errori di replicazione e la loro
riparazione 229
sul DNA di rotture a doppio filamento e la
ricombinazione omologa può iniziare 257
I diversi tipi di mutazione 229 Box 10.1 Come risolvere un intermedio di
Alcuni errori di replicazione sfuggono alla ricombinazione con due giunzioni
correz10ne 230 di Holliday 258
BOx 9.1 L'espansione delle ripetizioni a • Gli apparati proteici ker la
triplette come fonte di malattia 230 ricombinazione omo oga 260
La riparazione dei mismacch rimuove gli La elicasi/nucleasi RecBCD processa, per la
errori che sfuggono al sistema di correzione ricombinazione, le molecole di DNA rocce 26 1
di bozze 231
La proteina RecA si assembla sul DNA
• I danni al DNA 236 a singolo filamento e promuove l'invasione
Il DNA va incontro a fenomeni di mutazione del filamento 263
spontanea in seguito a idrolisi e All'interno del filam ento RecA si formano
deamminazione 236 dei nuovi appaiamenti tra filam enti 266
Box 9.2 Il test di Ames 236 In tutti gli organismi sono presenti degli
Lalchi lazione, lossidazione e l'irradiazione omologhi di RecA 267
danneggiano iJ DNA 237 Il complesso RuvAB ricono e pecifìcamence
Le murazioni sono causare anche dagli le giunzion i di Holliday e promuove la
analoghi delJe basi e dagli agenti intercalanti 238 migrazione del pu nto d'incrocio 268
Per terminare la ri ombinazione RU\-C caglia
• La riparazione del D A danneggiato 239 specifici filamenti di D~ -:\a livello
Riparazione diretta del danno al D. ·:\ 240 della giunzione di Hollida.· 269
e 88-08-1 1s90-0 Indice I Xlii

• La ricombina zione omologa n e gl i


eucarioti 270
La struttura delle ricombinasi in tirosina
legate al DNA svela il meccanismo
La ricombinazione omologa negli eucarioti ha dello scambio del DNA 291
funzio ni aggiuntive 270 Box 11.1 L'applicazione della ricombinazione
La ricombinazione omologa è richiesta sito-specifica all'ingegneria genetica 29 1
per la segregazione dei cromosomi durante
la meiosi
In meiosi si ha una formazione program mata
270 • Funzion i biologiche della
ric ombinazione sito-specifica 292
di rotture a doppio filamento 272 I.:integrasi di À promuove l'integrazione e
lescissione del genoma virale nel cromosoma
La proteina MRX processa le estremità tagliate della cellula ospite 293
per assembl are le proteine simili a RecA che
scambiano il filamento 274 I.: escissione del fago À rich iede una n uova
proteina che curva il DNA 294
Dmcl è una proteina simile a RecA che
funziona specificamente nella ricombinazione La ricombinasi H in inverte un segmento
meiotica 275 di D NA permettendo l'espressione di geni
alternativi 295
La ricombinazio ne meio tica è data dall'attivi tà
di molte proteine 275 Hin per ricombinare necessita di un enhancer
a DNA 296
• Il cambio del gruppo di compatibilità 276 Le ricombinasi convertono molecole circolari
Il cambio del gruppo di compatibilità inizia di D N A multimeriche in monomeri 297
co n una rottura a doppio filam ento in
Ci sono altri meccanismi per portare
un punto specifico 277 la ricombinazione su specifici segmenti
Il cambio del gruppo di compatibilità è un di D NA 299
eve n~o di conversione genica non associato al


crossm g over
Le conseguenze genetiche della
278
• La trasposiz ione
La trasposizione m uove alcuni elementi
301

ricombinazione omo loga 280 genetici in nuove posizio ni cromosomiche 301


La co nversione genica avviene perch é il DNA, Ci sono tre classi principali di elemen ti
durante la ricombinazione, viene riparato 28 1 trasponi bili 302
Sommario 282 I rrasposoni a D NA contengono il gene
Bibliografia 283 della rrasposasi, fiancheggiato dai siti di
ricombinazione 303
I rrasposoni possono essere sia elementi
au tonom i ch e non autonomi 303
AU;t.l!·I 11 I retrotrasposoni si mili ai virus e i retrovirus
contengono delle sequenze terminali
La ricombinazione sito-specifica ripetute e due geni importanti per la
e la trasposizione del DNA ricombinazione 304

• La ricombina zione conservativa sito-


specifica 285
I retrotrasposoni poli-A assomigliano ai geni
La trasposizione a D NA avviene con un
304

La ricombinazione sito-specifica avviene su m eccanism o del tipo taglia e incolla 305


specifiche sequenze del D N A bersaglio 285 Nella trasposizione del tipo taglia e incolla
Le ricombinasi sito-specifiche tagliano e l'intermedio è risolto con il sistem a di
riuniscono il D NA per m ezzo di un riparazione delle rotture 306
intermedio covalente p roteina-DNA 287 Esistono m olteplici meccanismi per tagliare
La ricombinasi in serina introduce nel D NA il filamento non trasferito durante
delle rotture a doppio filam ento e poi scambia la trasposizione del D NA 307
i fi lamenti per promuovere la ricombinazione 288 La trasposizione a D NA con un
Le ricombinasi in tirosina rompono meccanismo replicativo 308
e riun iscono una coppia di fi lamenti I retrotrasposoni simili ai virus ed i retrovirus
di D NA alla volta 289 si muovono tramite u n intermedio a RNA 310
Box 11.2 Il meccanismo di formazione del • Il ciclo della trascrizione nei batteri 342
cDNA retrovirale 312 I promotori batterici hanno diverse sequenze
Le DNA trasposasi e le integrasi retrovirali è àttività, ma hanno comunque delle
fanno parte di una superfamiglia proteica 314 caratterisciche ben definire 342
I retrotrasposoni poli-A si muovono con un Box 12.1 Sequenze consenso 344
meccanismo del tipo "splicing inverso" 315 Il fattore cr media il legame della polimerasi
al promotore 344
• Alcuni esempi di elementi trasponibili
e della loro regolazione 317 La transizione verso il complesso aperto
comporta dei cambi strutturali nella RNA
La famiglia dei trasposoni IS4 è costituita polimerasi e nel promotore 346
da elementi compatti dotati di molteplici
meccanismi per controllare il numero La trascrizione è iniziata dall'RNA polimerasi
delle copie 318 senza l'ausilio di un primer 347
Box 11.3 Gli elementi del mais e la scoperta L'RNA polimerasi sintetizza alcuni
dei trasposoni 318 RNA corti prima di entrare nella fase
di allungamento 348
La trasposizione di T n 1O è accoppiata alla
replicazione del DNA cellulare 320 La polimerasi in fase di allungamento è una
macchina che simultaneamente sintetizza e
Il fago Mu è un trasposone molto robusto 321 corregge le bozze di RNA 348
Per evitare di trasporsi nel proprio DNA, Mu Box 12.2 Le RNA polimerasi a singola
utilizza l'immunità del sito bersaglio 323 subunità 349
Gli elementi Tcl/Marinersono elementi di La trascrizione termina grazie a dei segnali
grande successo negli eucarioti 325 all'interno della sequenza dell'RNA 350
Gli elementi Ty del lievito si traspongono
• La trascrizione negli eucarioti 352
nel genoma in porti di sicurezza 326
I prom~tori base o prossimali (core promoter)
Gli elementi UNE promuovono la propria della RNA polimerasi II sono costituiti
trasposizione e perfino quella di RNA cellulari 327 da una combinazione di quattro elementi 352
• La ricombinazione V(D)J 328 L'RNA polimerasi II forma un complesso di
Gli eventi precoci della ricombinazione pre-inizio con i fattori generali di trascrizione
V(D)J avvengono con un meccanismo simile sul promotore 353
ali' escissione dei trasposoni 330 TBP si le~a al DNA e lo piega usando un
foglietro l:S inserito nel solco minore 355
Sommario 332
Bibliografia 332 Gli altri fattori generali di trascrizione hanno
anche funzioni specifiche nella fase di inizio 356
In vivo, l'inizio della trascrizione ha bisogno di
altre proteine, incluso il complesso mediatore 357
Parte terza Il mediatore è composto da molte subunità,
Espressione del genoma alcune delle quali sono conservate dai lieviti
all' uomo 358
Un nuovo gruppo di fatto ri stimola
CiJQlt.J!·i 12 l'allungamento e la capacità di correzione
I meccanismi della trascrizfone della Poi II 358
La polimerasi in allungamento si associa con
• Le RNA polimerasi e il ciclo della un nuovo gruppo di fattori proteici, necessari
trascrizione 338 alla maturazione dell'RNA 360
Le RNA polimerasi sono in diverse forme ma Le RNA polimerasi I e III ricono cono
condividono molte caratteristiche 338 promotori discinti, utilizzan o un gruppo
La trascrizione da parre della RNA polimerasi diverso di fattori di trascrizione, ma hanno
avviene con una serie di passaggi 340 comunque bisogno di T BP 362
L'inizio della trascrizione richiede ere passaggi Sommario 364
d~cinci 340 Bibliografia 365
e aa-OS-1 1s90-0 Indice I 'XV

Sommario
B!aH·l!·I 13 Bibliografia
393
394
Lo splicing dell'RNA
• La chimica dello splicing dell'RNA 367
Le sequenze all'interno dell'RNA
determinano dove avviene lo splicing 367
C3UH·l!·I 14
La traduzione
L'introne viene escisso in una forma a cappio
de~t~ lariat e gli esoni fiancheggianti vengono • RNA messaggero 397
Uliti 368
Le catene polipeptidiche sono specificate
Gli esoni provenienti da diverse molecole di dagli open-reading frame 397
RNA possono essere unici attraverso uno
splicing in trans 369 Gli mRNA procariotici hanno un sito di
legame per il ribosoma che recluta
• Il macchinario dello spliceosoma 370 il macchinario per la traduzione 399
Lo splicing dell' RNA viene effettuato da un Gli RNA eucariotici sono modificati alle
complesso molto grande chiamato spliceosoma 370 estremità 5' e 3' per facili care la
traduzione 399
• Le vie dello splicing 372
Assemblaggio, riarrangiamenti e catalisi • RNA transfer 400
all'interno dello spliceosoma: il percorso I cRNA agiscono da adattatori tra codon i
dello splicing 372 e amminoacidi 400
Gli introni self-splicing dimostrano che I cRNA hanno in comune una struttura
!'RNA può catalizzare lo splicing 374 secondaria paragonabile ad un trifoglio 401
Gli introni del gruppo I rilasciano un introne I cRNA hanno una struttura
lineare anziché un cappio 374 tridimensionale ad "L" 40 1
Box 13.1 La conversione in ribozimi
degli introni del gruppo I
Come fa lo spliceosoma a trovare i siti di
375 • Il legame degli amminoacidi
al tRNA 402

splicing in maniera affidabile? I tRNA vengono caricaci per mezzo di un


377
amminoacido che si lega all'adenosina

• Lo splicing alternativo
I singoli geni possono generare diversi
379 dell'estremità 3' tramite un legame acilico
ad alta energia 402
prodotti grazie allo splicing alternativo 379 L'amminoacil-cRNA sincerasi carica i tRNA
Lo splicin~ alternativo è regolato da attivatori in due passaggi 403
e represson 381 Ciascuna aminoacil-cRNA sincerasi attacca
un solo amminoacido ad uno o più tRNA 404
Box 13.2 L'adenovirus e la scoperta
dello splicing 384 Le tRNA sincerasi riconoscono le
caratteristiche strutturali esclusive
Un piccolo gruppo di introni viene escisso
da uno spliceosoma alternativo, costituito dei rispettivi tRNA 405
da un corredo diverso di snRNP 386 La formazione dell'amminoacil-cRNA è
molto accurata 406
• Il rimescolamento degli esoni 387
Alcune amminoacil-cRNA sincerasi usano
G li esoni vengono rimescolati dalla un sito correttore per caricare il cRNA
ricombinazione per produrre dei geni che con un alto grado di accuratezza 406
codificano nuove proteine 387
Il ribosoma non è in grado di distinguere
• L'editing dell'RNA 389 era tRNA caricati in modo corretto
o sbagliato 407
L'editing dell' RNA rappresenta un al ero modo
per modificare la sequenza di un mRNA 389 Box 14.1 Selenocisteina 408

• Il trasporto dell'mRNA
L'mRNA maturo viene impaccato ed esportato
392
• Il ribosoma
Il ribosoma è costituito da una subunità
408

dal nucleo al citoplasma per la traduzione 392 maggiore e da una minore 409
XVI I Indice C SS-08-17890-0

Le subunità maggiore e minore si associano La formazione di un legame peptidico


e si dissociano ad ogni ciclo di traduzione 4 11 consuma due molecole di GTP e una di ATP 431
I nuovi amminoacidi vengono attaccati 14 3 Le proteine che si legano al GTP,
all'estremità C-terminale della catena i cambiamenti conformazionali
polipeptidica nascente 4 12 e la precisione e l'ordine degli eventi
I legami peptidici si formano mediante il della traduzione 432
trasferimento della catena polipeptidica
nascente da un tRNA all'altro 4 12 • Conclusione della traduzione
I fattori di rilascio terminano la traduzione
433

G li RNA ribosomiali sono determinanti sia in risposta ai codoni di stop 433


strutturali che catalitici del ribosoma 4 13
Alcune brevi regioni dei fattori di rilascio
Il ribosoma ha tre siti di legame per il tRNA 4 14 di classe I riconoscono i codoni di stop
I canali che attraversano il ribosoma e innescano il rilascio della catena peptidilica 434
permettono all'mRNA e alla catena Lo scambio_GDP/GTP e l'idrolisi del GTP
polipeptidica nascente di entrare e/o uscire controllano la funzione del fattore di rilascio
dal ribosoma 4 16 di classe II 435
• Inizio della traduzione 4 17 Il fattore di riciclaggio del ribosoma simula
G li mRNA procariotici vengono reclutati un tRNA 435
dalla subunità minore tramite appaiamento
di basi con l'rRNA 4 18 • Regolazione traduzione-dipendente
dell'mRNA e della stabilità delle
U n tRNA specifico, caricato con una proteine 437
metionina modificata, si lega direttamente l:RNA SsrA libera i ribosomi che traducono
alla subunità minore procariotica 4 18 mRNA spezzati 437
Tre fattori dirigono l'assemblaggio di un Box 14.4 Gli antibiotici arrestano La divisione
complesso iniziatore che contiene l'mRNA cellulare bloccando passaggi specifici
e il tRNA iniziatore 4 19 della traduzione 438
I ribosomi eucariotici vengono reclutati Le cellule eucariotiche degradano gli mRNA
sull'mRNA dal cap al 5' 420 incompleti o dotati di codoni di stop
- .
Box 14.2 uORF e IRES: eccezioni che prematun 441
confermano La regola 422
Sommario 443
Il codone d'inizio viene trovato leggendo Bibliografia 444
la sequenza dell'mRNA a partire
dall'estremità 5' 423
I fattori d'inizio della traduzione mantengono
l'mRNA eucariotico in una conformazione GUlt.l!·' 15
circolare 424 Il codice genetico
• Allungamento durante la traduzione
G li amminoacil-tRNA vengono trasferiti
425
• Il codice è degenerato
La percezione dell'ordine nella preparazione
445

al sito A d al fattore di allungamento EF-Tu 426 del codice 447


Il ribosoma adotta diversi meccan ismi per Tentennamento dell'anticodone 447
evitare di selezionare gli amminoacil-tRNA
errati 426 Tre codoni determinano la fine
della catena 449
Il ribosoma è un ribozima 428
Come venne svelato il codice 449
La formazione del legame peptidico e il
fattore di allungamento EF-G governano la Stimolazione dell'incorporazion e d i
traslocazione dei tRNA e dell'mRNA 429 amminoacid i da parte di mRNA imecici 450
Poli-U cod ifì ca la poli-fenilalanina -1
EF-G causa la traslocazione spiazzando il
tRNA legato al sito A 430 I copolimeri misti con enciron I ~e

di altri codoni ... - 1


EF-Tu-GDP ed EF-G-GDP devono scambiare
il GDP con GTP prima di poter partecipare [RNA uansfer
ad un nuovo ciclo di allungamento 431 definiti ~ :::; i
C 88-06-17890-0 Indice I XVII

Assegnazione dei codoni tramite copolimeri CAP e il repressore Lac influenzano in modo
. . ..
npennv1 453 opposto il legame dell' RNA polimerasi al
promotore lac 473
• Tre regole disciplinano il codice
genetico 454 Box 16.1 Rivelazione dei siti di legame
a/DNA 474
Tre tipi di mutazioni puntiformi alterano
il codice genetico 454 CAP possiede delle superfici separate per
l'attivazione e il legame al DNA 476
Evidenza genetica che il codice viene letto
in gruppi di rre unirà 455 La proteina CAP e il repressore Lac legan o
il DNA per mezzo di un comune mot\vo
• Mutazioni soppressore possono trovarsi
nello stesso gene o in geni diversi 456
srrurturale
Box 16.2 Gli esperimenti di eliminazione
477

La soppressione inrergenica coinvolge tRNA dell'attivatore 477


mutami 457 Le attività del repressore Lac e del CAP
I soppressori nonsenso leggono anche sono controllate allosrericamenre
i normali segnali di terminazione 458 dai loro segnali 480
La prova della validità del codice genetico 458 Box 16.3 jacob, Monod e le loro idee sulla
regolazione genica 481
• li codice è pressoché universale 459 Il controllo combinatorio: CAP controlla
Sommario 461 anche altri geni 483
Bibliografia 462 Fattori cr alternativi dirigono la RNA
polimerasi su set alterna rivi di promotori 483
NtrC e MerR: due attivatori trascrizionali
che funzionano per mezzo dell'allosteria
Parte quarta e non del reclutamento 484
La regolazione NrrC è dorato di un'attività ATPasica e lavora
sul DNA in siti lontani dal gene 484
C!i4H·l!·' 16 MerR attiva la trascrizione facendo ruotare
il DNA del promotore 485
La regolazione genica nei procarioti
Alcuni repressori trattengono la RNA
• I principi della regolazione
polimerasi sul promotore invece di escluderla 486
trascrizionale 467 AraC controlla loperone araBAD per mezzo
L'espressione genica è controllata da proteine
dell' an riattivazione 487
~egolarive 467
• Esempi di regolazione genica
Molri promotori so no regolati dagli attivatori, in passaggi successivi all'inizio
che favoriscono il legam e dell' RNA di trascrizione 488
polimerasi al DNA, e dai repressori, che
bloccano questo legame 468 G li operoni per la biosintesi degli
amminoacidi sono controllati da una
Alcuni attivatori funzionano alJostericamente prematura terminazione dell.a trascrizione 488
e regolano passaggi successivi al legame
dell'RNA polimerasi 469 Box 16.4 I ribointerruttori 492
Azione a distanza e formazione di un'ansa sul Le proteine ribosomiali sono dei repressori
DNA 470 traduzionali della propria sintesi 493
Il legame cooperativo e I' allosteria svolgono
molte funzioni nella regolazione genica 471 • L'esempio del fago À.: diversi livelli
di regolazione 495
Non tutta la regolazione dell'espressione Schemi di espressione genica alternativi
genica agisce sull' inizio di trascrizione 472 controllano la crescita lirica e quella

• La regolazione dell'inizio di trascrizione:


alcuni esempi nei batteri 472
lisogenica
Le proteine regolative e i loro siti di legame
496
498
L'espressione dei geni lac è co ntrollata da un Il represso re di À. lega loperatore in modo
attivatore e un repressore 472 cooperanvo 499
XVIII . l_
J _nd_ic_e_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __ __ __ __ __ _ _c _as_-0_8-_11_890_
-o

Box 16.5 Concentrazione, affinità e legame Box 17.2 lmmunoprecipitazione della


cooperativo 500 cromatina 521
Il repressore e Cro si legano in siti diversi G li attivatori reclutano an che modificatori
dell'operatore per controllare il ciclo dei nucleosomi che permettono al complesso
litico e quello lisogenico 502 trascrizionale di legarsi al promotore 522
Linduzione lisogenica richiede il taglio Arcività a distanza: anse e isolatori 523
proteolitico del repressore di À 502 Per la corretta regolazione di alcuni gruppi
Cautoregolazione negativa del repressore di geni sono necessarie specifiche regione
richiede delle interazioni a lunga distanza di controllo 525
e una ampia ansa di DNA 503
In seguito all'infezione di un nuovo ospite,
• lntewazion~ del segnale e controllo
un altro attivatore, Àcll, controlla la scel ta tra
combinatorio 526
ciclo litico e lisogenico 504 G li attivatori lavorano assieme in modo
Box 16.6 Approcci genetici che hanno sinergico per integrare i segnali 526
portato all'isolamento dei geni Integrazione del segnale: il gene OH è
coinvolti nella scelta tra ciclo controllato da due regolatori, uno recluta
litico e lisogenico 505 modificatori dei nucleosomi, l'altro recluta
Dalle condizioni di crescita di E. coli un mediatore 528
dipende la stabilità della proteina C II e, di Integrazione del segnale: legame cooperativo
conseguenza, la scelta tra ciclo litico degli attivatori sul gene dell'interferone ~
e lisogenico 506 umano 529
Canti terminazione trascrizionale Il controllo combinatorio dell'attività genica è
nello sviluppo di À 507 fondam entale per la complessità e diversità
La retroregolazione: l'espressione del gene degli eucarioti 529
int è determinata da un gioco di controlli Il controllo combinatorio dei geni del
sulla sintesi e la stabilità dell'RNA 508 mating-rype di Saccharomyces cerevisiae 530
Sommario 51 O • Repressori trascrizionali 531
Bibliografia 511
• Trasduzione del segnale e controllo
dei regolatori trascrizionali 533
I segnali sono spesso comunicati ai regolatori
GJUU.]!.i 1 7 rrascrizionali attraverso sistemi di trasduzione
La regolazione genica negl i eucarioti del segnale 533
Vari segnali controllano i regolatori
• I meccanismi che regolano trascrizionali eucariotici in diversi modi 535
la trascrizione sono conservati
dal lievito ai mammiferi 514 G li attivatori e i repressori possono essere
formati da più moduli 536
Gli attivatori hanno il dominio di legame
e quello di attivazione separati 514 • Silenziamento genico determinato
Box 17.l Il saggio dei due ibridi 516 dalla modificazione degli istoni e del
DNA 537
I regolatori degli eucarioti usano domini
differenti per il legame al DNA, ma il Il silenziamento nel lievito è mediato da
riconoscimento del DNA applica gli stessi deacerilazione e metilazione degli istoni 538
principi dei batteri 517 Le modificazioni degli istoni e l'ipotesi del
Le regioni d i attivazione non sono strutture codice istonico 539
ben definire 519 La metilazione del D A, nei mammiferi, è
• =>eo a e o di complessi proteici associata con il silenziamento genico 540
~co::o o ag · a. ivatori trascrizionali Alcuni stari di espressione genica sono
e e;: ·e :· · 5 19 trasmessi attraverso le d ivisioni cellulari
e:; aITI\ ton crascrizionali reclutano il anche in assenza del segnale di attivaz ione 541
omplesso trascrizion e w gcru 5 19 BOi 17.3 À lisogeno e mutamento epigenetico 542
<!:> 88-08-1 7890-0 Indice I XIX

• Regolazione dei geni eucariotici in fasi Il contatto cellula-cellula stimola l espressione


successive all' inizio della trascrizione 543 gen ica d ifferenziale nel batterio sporigeno
Alcuni attivatori controllano la fase di B. subtilis 566
allungamento della trascrizione piuttosto che Uno scambio regolatorio pelle-nervo è
q uella di inizio 543 controllato dal Notch signaling nel sistema
La regolazion e mediante splicing alternativo nervoso centrale degli insetti 567
può produrre proteine differenti in tipi Il gradiente del morfogeno Sonic hedgehog
cellulari diversi 544 controlla la formazione dei d iversi tip i di
I.: espressione dell'attivatore trascrizionale di neuroni nel tubo neurale dei vertebrati 568
lievito Gcn4 è controllata a livello traduzionale 547
• La biologia molecolare
• Gli RNA nella regolazione genica 547 dell'embriogenesi d i Drosophila 570
Il dopp io filamento d i RNA inibisce Una sintesi dell'em briogenesi di Drosophila 570
l'espressione di geni omologhi all'RNA 549 Box 18.4 Lo sviluppo di Drosophila 571
I corti RNA di interferenza (siRNA) provengono Il gradiente di un morfogeno controlla la
da dsRNA e determinano, con meccanismi regionalizzazio ne dorso-ventrale
differenziati, il silenziamento genico 549 dell'embrione di Drosophila 574
M icroRNA controllano l'espressione Box 18.S IL ruolo della sinergia degli attivatori
d i alcuni geni d urante lo sviluppo 551 nello sviluppo 577
Sommario 552 La segmentazione viene iniziata da alcuni
Bibliografia 553 mRNA localizzati ai poli anteriore
e posteriore dell'uovo non fecondato 579
Il gradiente di Bicoid regola lespressione
C
ffJijlt.l!·i 18 dei geni della segmentazio ne in modo
La regolazione genica durante lo sviluppo concentrazione-dipendente 580
I.:espressione di hunchback è regolata anche
Box 18.1 I saggi con i microarray: teoria a livello della trad uzione 58 1
e pratica 556 Il gradiente del repressore H unchback
• Strategie di regolazione dell'espressione stabilisce i d iversi limiti di espressio ne
genica differenziale durante lo sviluppo 556 dei genigap 582
Alcuni mRNA si localizzano precisamente H unchback e le proteine gap producono le
all'interno della cellula uovo e dell'em brione strisce di espressione genica
grazie a una polarità intrinseca della segmentazione 583
del citoscheletro 557 Box 18.6 Metodi bioinformatici per
Il contatto cellula-cellula e le molecole segnale L'identificazione di enhancer
secrete stimolano entrambi i cambiamenti complessi 584
dell'espressione genica nelle cellule vicine 557 I gradienti dei repressori gap producono
Il gradiente delle molecole segnale può istruire molte strisce di espressione genica 586
le cellule a segu ire diverse vie d i sviluppo I repressori a corto raggio consentono a
sulla base della loro posizione 558 enhancer diversi di lavorare
indipendentemente l'uno dall'altro all'interno
• Esempi delle tre strategie utilizzate
delle regioni regolatrici complesse d i eve 587
per stabilire l'espressione genica
differenziale 560 Sommario 588
La localizzazione del repressore Ashl controlla Bibliografia 589
il tipo sessuale (o gruppo di compatibilità)
del lievito attraverso il silenziamento
del gene HO 560
Box 18.2 ILcitoscheletro: asimmetria e crescita 562
can•t.l!·' 19
Genom ica comparata ed evoluzione
U n mRNA localizzato promuove il della diversità ani male
differenziamento muscolare nell'em brione
dell'ascidia 564 • La maggior parte degli animali
Box 18.3 Lo sviluppo di C iona 564 possiede essenzialmente gli stessi geni 592
Come può la duplicazione dei geni generare la L'origine evolutiva del linguaggio 613
diversità biologica? 594 Come fa FOXP2 a promuovere il linguaggio
Box 19.1 La duplicazione dei geni e l'importanza nell'uomo? 614
dell'evoluzione regolatrice 594 Il futuro dell'analisi genomica comparativa 616
Box 19.2 La duplicazione dei geni delle globine Somma.rio 616
produce nuovi schemi di espressione e Bibliografia 617
jùnzioni proteiche diverse 596
Box 19.3 La creazione di nuovi geni guida
l'evoluzione dei batteri 596
Parte quinta
• I tre modi in cui l'espressione genica
è cambiata durante l'evoluzione 597 Metodi
• Le manipolazioni sperimentali che
alterano la morfologia animale 598 CRJQlt.J!·' 20
Variazione dell'espressione di Pax6 genera Tecniche di biologia molecolare
occhi ectopici 598
Variazioni nell'espressione di Antp • Introduzione 623
trasformano le antenne in zampe 599 • Gli acidi nucleici 624
L'importanza della funzione proteica: L'elettroforesi su gel separa le molecole di
interconversione di ftz e Antp 600 DNA ed RNA in base al peso molecolare 624
Minime variazioni nella sequenza di un Le endonucleasi di restrizione tagliano le
enhancer possono produrre nuovi schemi di molecole di DNA in siti particolari 625
espressione gemca 600
L'ibridazione può essere usata per identificare
L'espressione non corretta di Ubx cam bia la specifiche molecole di DNA 627
morfologia del moscerino 602
Le sonde di ibridazione posso no identificare
Le variazioni delle funzioni di Ubx modificano DNA ed RNA separati elettroforeticp.mente 628
la morfologia dell'embrione di Drosophila 603
Isolamento di frammenti specifici di DNA 629
Le variazioni negli enhancer bersaglio di Ubx
Clonaggio del DNA 630
possono alterare gli schemi di espressione
gemca 604 Il clonaggio del DNA in vettori plasmidici 630
Box 12.4 I geni omeotici di Drosophila sono Il DNA inserito nel vettore può essere
organizzati in gruppi speciali sui introdotto negli organismi ospiti mediante
cromosomi 604 la trasformazione 63 1
Mediante clonaggio si possono creare librerie
• Le variazioni morfologiche nei crostacei
di molecole di DNA 632
e negli insetti 606
Un clone specifico di una libreria di DNA
Gli artropodi sono incredibilmente differenti 607 può essere identificato mediante ibridazione 633
Le variazioni dell'espressione di Ubx spiegano Oligonucleotidi sintetizzati chimicam ente 633
le modificazioni degli arti nei crostacei 607
La reazione a catena della polimerasi (PCR)
Perché gli insetti non hanno arti addominal i 608 amplifica i DNA mediante ripetuti cicli di
Box 19:5 L'impiego differenziale delle reti replicazione in vitro 635
geniche per l'innovazione evolutiva 609 Box 20.1 Aspetti legali e la reazione a catena
La modificazione degli arti per il volo sembra della polimerasi 637
derivare dal!' evoluzione di sequenze Gruppi di frammenti interni di DNA rivelano
regolatrici del DNA 610 la sequenza nucleotidica 637
• L'evoluzione del genoma e le origini Box 20.2 I Sequenators sono utilizzati per il
dell'uomo 612 sequenziamento ad afta resa 640
Luomo ha un numero sorprendentemente Il sequenziamento "in un col po solo" del
"i;- d. geni 6 12 _ genoma batterico 640
imile a q uello Il sequenziamento "in un colpo solo" consente
..-.....,,,,.,.,,.._,..,., _e dello l'assemblaggio parziale di e rese sequenze
613 genomiche 64 1
e 88-08-1 1s90-0 Indice I XXI

La strategia dell'accoppiamento delle estremità I.:analisi biochimica è particolarmente efficace


consente di produrre ampi assemblaggi nelle cellule semplici, studiabili con gli
genom1c1 643 strumenti tradizionali e della generica
Analisi sull'incero genoma 644 molecolare 667
Analisi genomica comparativa 645 I batteri possono essere studiaci dal punto
di vista citologico 667
• Le proteine 649 I fagi e i batteri ci hanno rivelato molce cose
Specifiche proteine possono essere isolate da fondamentali sul gene 668
estratti cellulari 649
• li lievito di birra, Saccharomyces
La purificazione di una proteina richiede cerevisiae 668
un saggio specifico 649
Lesiscenza di cellule diploidi e aploidi facilita
Preparazione di un estratto cellulare che lanalisi generica di S cerevisiae 669
contenga proteine attive 649
È facile ottenere mutazioni precise nel lievito 670
Le proteine possono essere separare era loro
utilizzando la cromatografia su colonna 650 S cerevisiae possiede un genoma piccolo e ben
caratterizzato 670
La cromatografia per affinità può facilitare
Le cellule di S cerevisiae cambiano forma
una più rapida purificazione delle proteine 65 1 durante la crescita 671
Separazione di proteine su gel di
poliacrilarnmide 652 • li verme nematode, Caenorhabditis
Gli anticorpi possono essere usaci per
e/egans 672
visualizzare proteine separate per elettroforesi 652 e elegans ha un ciclo virale molto rapido 672
Le molecole proteiche possono essere e elegans è costituito da relativamente poche
sequenziate direttamente 653 linee cellulari ben studiate 673
Proteomica 655 La via della morte cellulare fu scoperta in
Bibliografi~ 656 e elegans 674
I.: interferenza da RNA (RNAi) fu scoperta
in e elegans 674
• li moscerino della frutta, Drosophila
Cj.fali.l!·' 21 rne/anogaster 675
Organismi modello
Drosophila ha un ciclo virale rapido 675
• I batteriofagi 658 Le prime mappe genomiche sono state
Saggi per la crescita fagica 660 realizzate in Drosophila 676
661 I mosaici generici consentono lanalisi
Curva di crescita a passaggio unico
dei gen i letali nei moscerini adulti 678
Incroci era fagi e rese di complementazione 661
La ricombinasi di lievito FLP consente la
Trasduzione e DNA ricombinante 662 produzione efficiente di mosaici generici 678
• I batteri 663 È facile generare moscerini della frutta
Analisi ddla crescita batterica 663 transgenici che contengano DNA esogeno 679
I batteri si scambiano DNA mediante
coniugazione, trasduzione mediata dai fagi e
• li topo comune, Mus rnuscu/us
Lo sviluppo embrionale del topo dipende
681

trasformazione con DNA 663 dalle cellule staminali 681


I plasmidi batterici possono essere usati È facile introdurre DNA esogeno
come vettori di clonaggio 665 neU'embrione di topo 682
I trasposoni possono essere utilizzaci per La ricombinazione omologa consente
generare murazioni per inserzione e fusioni l'ablazione selettiva di singoli geni 683
era il gene e l'operone 665
I topi mostrano un'eredità epigenetica 685
Gli scudi sulla biologia molecolare dei batteri
hanno ricevuto impulso dalla tecnologia Bibliografia 686
del DNA ricombinante, dal sequenziamento
del genoma e dal profilo crascrizionale 666 Indice analitico 687
Parte prima

La visione mendeliana
del mondo

Gli acidi nucleici


trasmettono
l'informazione,
genetica

L'importanza dei
legami deboli nelle
interazioni fra molecole

L'importanza dei
legamifo~
2 I Parte prima • Chimica e genetica C 88-08-17890-0

differenza del resto del libro, il materiale che compone i cinque capitoli
della Parte 1 è rimasto perlopiù inalterato rispetto alle edizioni prece-
_r- denti. Esso mantiene la sua importanza, anche oggi, in tempi in cui pro-
cede il sequenziamento del genoma. Nello specifico, i Capitoli 1 e 2 raccol-
gono un compendio storico del modo in cui la genetica e le sue basi moleco-
lari sono stare fondate, e ne vengono descritte le idee e gli esperimenti fonda-
mentali. I Cap itoli 3, 4 e 5 illusrrano i principi chimici che sottendono le
strutture e le interazion·i delle macromolecole che rivestono grande impor-
tanza nel resto del libro - DNA, RNA e proteine. La maggior parte del mate-
riale non modificato è stato mantenuto inalterato rispetto alle edizioni prece-
denti, mentre una parte è stata riorganizzata e sono stati aggiunti esempi più
recenti.
Il Capitolo 1 si occupa degli eventi fondanti per la storia della genetica, dal clas-
sico lavoro di Gregor Mendel fino a quello di Oswald T. Avery. La trattazione è
completa e va dal famoso esperimento di Mendel sui piselli, che ha svelato le
leggi base dell'ereditarietà, alla scioccante (per quei tempi) scoperta di Avery
che il DNA è il materiale genetico. Il Capitolo 2 copre la successiva rivoluzione ,
della biologia molecolare, dalla proposta di Watson e Crick della struttura a
doppia elica del DNA, attraverso la decifrazione del codice genetico e il "dogma
centrale" (il DNA "fà' RNA che "fa" proteine). Il Capitolo si chiude con la di-
scussione dei recenti sviluppi che nascono dal sequenziamento completo dei ge-
nomi di molti organismi e del loro impatto sulla biologia moderna.

Foto dagli archivi di Cold Spring Harbor Laboratory

Vernon lngram, Marshall Nirenberg e Matthias


Staehelin, simposio del 1963 sulla sintesi e struttura
delle macromolecole. lngram d imostrò che i geni
controllano la sequenza amminoacidica delle proteine;
la mutazione che causa l'anemia falciforme causa la
variazione d i un singolo amminoacido nell'emoglobina
(Capitolo 2). N irenberg ha decod ificato il codice
genetico, usando la sintesi proteica " in vitro" diretta
da filamenti stampo di RNA artificiali (Capitol i 2 e 4).
Per questa scoperta, ha ottenuto il premio Nobel per
la medicina nel 1968. Staehelin ha lavorato su piccole
molecole di RNA, i tRNA, che traducono il codice
genetico nella sequenza amminoacidica delle
proteine (Capitoli 2 e 14).

Raymond Appleyard, George Bowen e Martha


Chase, simposio del 1953 sui virus.
Appleyard e Bowen, entrambi genetisti dei fagi,
sono fotografati insieme a Chase, che, nel 1952,
insieme ad Alfred Hershey, eseguì l'esperimento che
convinse la maggior parte degli studiosi che il DNA
rappresentava il materiale genetico (Capitolo 2).
Cl 88-08-1 7890-0 Parte prima • Chimica e genetica [ 3

La chimica elementare presentata nei Capitoli dal 3 al 5 si occupa della natu-


ra dei legami chimici - sia deboli che forti - e ne descrive il ruolo in biologia.
Iniziamo , nel Capitolo 3, con i legami chimici deboli , principalmente i lega-
mi idrogeno, le forze di van der Waals e le interazioni idrofobiche. Queste
forze mediano la maggior parte delle interazioni tra macromolecole - per
esempio tra proteine o tra proteine e DNA. Le interazioni deboli svolgono un
ruolo critico nel!' attività e nella regolazione della maggior parte dei processi
cellulari. Gli enzimi si legano ai loro substrati utilizzando interazioni deboli
e i regolatori trascrizionali si legano ai loro siti sul DNA per "accendere" o
"spegnere" i geni mediante lo stesso tipo di interazioni.
Le singole interazioni sono molto deboli e si dissociano in fretta dopo essersi
formate. Questa reversibilità gioca un ruolo importante in biologia: all'inter-
no delle cellule le molecole interagiscono in modo dinamico (cioè in modo
reversibile}, altrimenti il sistema si fermerebbe. Allo stesso tempo, alcune in-
terazioni devono essere stabili, almeno in tempi brevi. Per conciliare queste
necessità, apparentemente contraddittorie, numerose interazioni deboli ven-
gono usate contemporaneamente.
I legami forti uniscono i componenti di ciascuna macromolecola. Cosn e
proteine sono costituite da amminoacidi in una precisa sequenza, collegati tra
loro da legami forti , e il DNA è costituito da nucleotidi assemblati in modo
simile. (Anche gli atomi che formano gli amminoacidi ed i nucleotidi sono
tenuti insieme da legami forti .) Questi legami sono descritti nel Capitolo 4 .

.Melvin Calvin, Francis Crick, George Gamow e James


Watson, simposio del 1963 sulla sintesi e struttura delle
macromolecole. Calvin vinse nel 1961 il p remio Nobel per il
suo lavoro sull'assimilazione della C02 da parte delle piante.
Crick e Watson condivisero il premio Nobel nel 1962 per la
risoluzione della struttura del DNA (Capitolo 2). Gamow, un
fisico che venne attratto dal problema del codice genetico
(Capit oli 2 e 14), fondò un gruppo informale di scienziati di
simili vedute, chiamato "RNA Tie Club" (nella foto Gamow
indossa la cravatta del club, che lui stesso disegnò).

Calvin Bridges, simposio del 1934 sugli aspetti della


crescita. Bridges (fotografato mentre legge un giornale)
era membro del famoso "fly group" d i T. H. Morgan, che
adottò in maniera p ionieristica il moscerino della frutta (la
Orosophila) come organismo genetico modello (Capitoli
1 e 21 ); con lui è il Dr. T. Buckholtz.
4 I Parte prima • Chimica e genetica e 88-06-17890-0

Nel Capitolo 5 vedremo come i legami deboli e forti, insieme, determinino


la struttura tridimensionale propria delle macromolecole, e quindi le invesca-
no di fu nzioni specifiche. Pertanto, i legami deboli olcre a mediare le intera-
zioni era macromolecole, agiscono anch e, ad esempio, era amminoacidi non
adiacenti di una proteina, determinando il modo in cui la catena primaria si
p iega in una scrurtura tridimensionale. Similmente, i legam i d eboli sono re-
sponsabili dell'appaiamento delle due eliche del DNA.
Nel Capitolo 5 prenderemo anche in considerazione come la funzione di
una proteina viene regolata. Uno dei modi è quello di variare la forma della
proteina, un meccanismo noto come regolazione alloscerica: in una specifica
co nformazione, la proteina può svolgere una determinata funzione enzima-
tica, o legare u na determinata molecola bersaglio mentre in una·conforma-
zione diversa questa capacità può essere persa. Queste variazioni strutturali
possono essere la conseguenza del legame con un'altra proteina o con una
mo lecola di piccole dimensioni, quale uno zucchero. In altri casi, un effetro
allosterico può essere indotto da modificazioni covalenti. Per esempio, l'at-
tacco di uno o più gruppi fosfaro ad una proteina è in grado d i modificarne
la forma. Un al ero modo in cui una proteina può essere concrollaca è quello
di rego larne l' interazione co n un'alcra molecola. In questo modo una data
proteina può essere reclutata da diverse proteine bersaglio, in risposta a se-
gnali diversi.

Foto dagli archivi di Cold Spring Harbor Laboratory

Joan Steitz e Fritz Lipmann, simposio del


1969 sul meccanismo della sintesi proteica.
La ricerca di Steitz si focalizzava sulla
struttura e la funzione delle molecole di
RNA, particolarmente su quelle coinvolte
nello splicing (Ca pitolo 13) ed è stato uno
deg li autori delle edizioni precedenti d i
questo libro. Lipmann dimostrò che i gruppi
fosfato dell 'ATP sono la fonte d i energia d i
molti p rocessi biologici (Capitolo 4). Per
questa scoperta vinse il premio Nobel per la
medicina nel 1953.

Max Perutz, nel simposio del 1971 sulla struttura e


funzione delle proteine a livello tridimensionale.
Perutz condivise con John Kendrew, nel 1962, il premio
Nobel per la chimica; usando la cristallografia a raggi X,
dopo 25 anni di lavoro, furono i primi a risolvere le
strutture atomiche di due proteine: rispettivamente
l'emoglobina e la mioglobina (Capitolo 5).
La visione mendel iana
del mondo

facil e considerare l' uomo unico tra gli esseri viventi. Soltanto noi ab- • Le scoperte di Mendel
biamo sviluppato linguaggi elaborati ch e permettono l'interazion e
• La teoria cromosomica
complessa di idee ed em ozioni . Le grandi civiltà hanno cambiaro il no-
d ell'eredità
stro mo ndo in un modo che è inconcepibile per altre forme viventi. C'è
sempre stata, quindi , la tendenza a pensare che qualche cosa di speciale dif- • Linkage genico
ferenzi l' uomo da tutte le altre specie. Questa convinzione ha trovato e crossing aver
espressione nelle molte forme di religione attraverso le quali cerchiamo l'o-
rigine e le ragioni della nostra esistenza e, così facendo, cerchiamo di creare • Mappatura
dei cromosomi
regole pratiche di vira. Poco più di un seco lo fa sembrava normale pensare
che la specie umana e tutte le altre forme viventi fossero state creare in un • L'origine della
preciso mo mento, proprio come ciascuna vira umana inizia e fìnisce in un variabilità genetica
preciso momento. attraverso le mutazioni
Questa co nvinzione fu per la prima volta messa seriamen te in dubbio 140
• Prime ipotesi sulla
anni fa, quando C harles D arwin ed Alfred R. Wallace proposero le loro
natura dei geni e sul
teorie sull 'evoluzione, basare sulla selezione dell'organismo p iù adatto. Essi
loro funzionamento
affermarono che le va rie forme di vita non sono cosranri, ma danno conti-
J
nuamente origine ad animali e piante leggermente diversi, alcuni dei quali • Primi esperimenti per
si adarrano a sopravvivere e si moltiplica no in modo più effìciente. Quando trovare una relazione
formularono qu esta teoria, essi non conoscevano l'origine di questa conti- gene-proteina
nua variazione, ma si resero conro, correttamen te, ch e queste nuove carat-
rerisri ch e, che costituivano la base d ell'evoluzione, dovevano persistere nel-
la progenie.
In princip io ci fu una grande reazione contro Darwin, soprattutto da parte
di coloro che non amavano pensare che l'uomo e la scimmia, animale dalle
sembianze piuttosto "indecen ti ", potessero avere un antenato co mune, an-
che se quesro era vissuto 10 milioni di ann i prima. C i fu l'opposizione ini-
ziale anche di molti biologi, che ritennero non convincenti le prove pro-
dotte da Darwin. Tra questi vi era il famoso naturalista Jean L. Agassiz, al-
lora ad Harvard , che passò molti anni a scrivere contro Darwin e il suo se-
guace T homas H . Huxley, che, fra tanti , fu il divulgatore della teoria evo-
luzionistica di maggior successo. Alla fine del XIX secolo, però, le prove
scientifìche erano quasi complete; sia la distribuzione geografica di piante
e anim ali che il loro ri trovam ento nei res ti fossili del passato geologico po-
tevano essere spiegaci solamente postul ando ch e gruppi di organ.ismi in
continua evoluzione fossero discesi da un antenato comune. Oggi l'evolu-
zione è comunem ente accettata da rutti , tranne ch e da una piccola mino-
ranza di fondamentalisti, le cui obiezioni non sono basate sul ragionamen-
to m a sull'adesione inco ndizion ata a prin cipi religiosi.
Una co nseguenza immediata della teoria darwiniana sta nel renders i conto
che la vita sulla Terra esisteva già più di 4 miliardi di anni fa in forme sempli-
ci, che, probabilmente, assomigliavano ai batteri, la più semplice forma di vi-
ta oggi nota. [esistenza dei batteri suggerisce che l'essenza della vita si trova
in organismi molto p iccoli. La teoria evoluzionistica, inoltre, suggerisce che i
principi base della vita possono essere applicati a tutte le forme viventi.
6 I Parte prima • Chimica e genetica C> 88-08-17890-0

Le scoperte di Mendel

Gli esperimenti di G regor Mendel riassumono i risulrari di incroci rra piante


di piselli che differivano per caratterisriche ben determinate, come la forma
dei semi (lisci o rugos i), il loro colore (gialli o verdi), la forma del baccello
(gonfio o rugoso) e la lunghezza del gambo (lungo o corro). Il fatto che Men-
del si fosse concentrato su caratteristiche ben definite fu di grande importan-
za; molti coltivato ri", in precedenza, avevano tentato di seguire l'eredirarietà
di caratterisciche più grossolane, quali il peso del corpo, e non furono capaci
di scoprire la benché minima regola sulla trasmissione dei caratteri dai geni-
tori ai figli (vedi Box 1.1 , Le leggi di Mendel).

Il principio della segregazione indipendente

Dopo essersi accertato che ciascun ceppo parentale trasmettesse effettiva-


mente il carattere di interesse - cioè che producesse una progenie con con no-
taci identici a quelli dei gen itori - Mendel eseguì una serie di incroci era geni-
tori (P) che differivano per singole caratteristiche (qual i la forma o il colore
del seme) .
Tutta la progenie (F 1 = prima generazione filiale) aveva l'aspetto di uno solo
dei due genitori. Per esempio, in un incrocio tra piselli con semi gialli e piselli
con semi verdi, tutta la progenie aveva semi gialli. Il tratto che compare nella
generazione F 1 è detto dominante, mentre il tratto che non appare in f 1 è det-
to recessivo. ·
Il significato di questi risultati divenne evidente quando Mendel incrociò in-
dividui della generazione F 1 tra loro. Questi incroci fornirono un importante
risulcato: il carattere recess ivo riappariva in circa il 25% della progenie F2 ,
mentre quello dominante appariva nel 75% degli individui di questa proge-

Box 1.1 Le leggi di Mendel ~ ---


L'attributo più notevole di una cellula vivente è la cap aci- cromosomi rimanesse costante. Queste evidenze, però,
tà di trasmettere le proprietà ereditarie d a una genera - semplicemente suggerivano (ma non dimostravano) che
zione cellulare all'altra. L'esistenza dell'ereditarietà deve i cromosomi portassero i caratteri ereditabili.
essere stata notata dai p rimi umani che notarono il pas- La prova determinante venne prodotta all'inizio del XX
saggio di caratteristiche, quali il colore degli occhi e dei secolo con la scoperta delle regole base dell'ereditarie-
capell i, dai genitori ai figli. Le basi f isiche di questo feno - tà . I concetti fu rono dap prima proposti da Gregor Men-
meno, però, non vennero capite fino ai primi anni del XX del nel 1865, in un lavoro intitolato Esperimenti su p iante
secolo, quando, dura nte un periodo di partico lare attività ibride, illustrato al la Società d i scienze naturali di Brno.
creativa, venne formulata la teoria dell'ereditarietà. Nella sua presentazione, Mendel descrisse nei dettagli il
La trasmissione ereditaria attraverso spermatozoo e uova modello di trasmissione dei caratteri nelle piante di pisel-
divenne nota nel 1860, e nel 1868 Ernst Haeckel, notando lo (ved i testo), le sue conclusioni sui princip i dell'eredita-
che lo spermatozoo è composto in larga parte da mate- rietà e la loro rilevanza nel le controversie sulle teorie su l-
riale nucleare, postu lò che il nucleo fosse responsabile l'evoluzione. Il clima scientifico, però, non era favorevo le,
dell'ereditarietà. Passa rono quasi vent'anni prima che i e queste idee vennero completamente ignorate, non-
cromosom i fossero individuat i come i fattori "attivi", da- ostante Mendel si sforzasse di interessa re al l'argomento
to che prima fu necessario studiare i dettagli di meiosi, i biologi più in vista dell 'epoca . Nel 1900, 16 anni dopo la
mitosi e fecon dazione. Una volta ultimati questi stud i, si morte di Mendel, tre ricercatori, lavorando indipenden-
poté vedere che, a d ifferenza degli altri componenti cel- temente su sistemi diversi, confermarono la portata del
lulari, i cromosom i erano suddivisi esattamente tra le cel- lavo ro, dimenticato, di Mendel. Hugo De Vries, Karl Cor-
lule figlie. Inolt re, il complicato meccanismo secondo cui, rens ed Erich Tschermak, che eseguirono esperimenti. si-
durante la meiosi, il numero di cromosomi delle ce llu le mili a quelli di Mendel, giunsero alle st esse conclusio ni,
uovo e degli spermatozoi viene ridott o ad un numero prima di venire a conoscenza d ei risultati dello stesso
aploide fu ind icato come necessario affinché il numero di Mendel.
<C 88-08-17890-0 1. La visione mendeliana del mondo I 7

nie. Per ciascuna delle serre caratteristiche che Mendel studiò, il rapporto dei generazione a
tratti dominante e recessivo nella generazione F2 era sempre approssimativa- parentale •

mente di 3: 1. Quando questi esperimenti furono effettuati per una terza ge- RR rr
nerazione (F 3) , tutti i piselli della generazione F 2 con il carattere recessivo di- t t
mostrarono di trasmettere il tratto alla loro progenie. Quelli con il carattere gameti @ 0
dominante, invece, ricadevano in varie categorie: un terzo trasmetteva il ca-
rattere alla progenie (producendo solo progenie con la caratteristica domi- generazione
y
nante); i rimanenti due terzi producevano progenie con caratteri misti in rap- ibrid a F1
porto 3: 1 tra dominante e recessivo. Rr
Mendel interpretò correttamente i suoi risultati come segue (Figura 1.1): le
varie caratteristiche sono controllate da coppie di fattori (che oggi chiamia- gameti gameti
femminili r maschi li
mo geni), uno di origine paterna, l'altro di origine materna. Per esempio, va-
rietà pure di piselli a seme liscio contengono due copie (o alleli) del gene che
determina il carattere "liscio" (RR), mentre varietà di piselli a seme rugoso
contengono due copie dell'allele per la "rugosità" (rr) . I gameti della varietà
liscia contengono ciascuno una copia del gene (R) per il carattere "liscio"; i
gameti della varietà rugosa contengono ciascuno un gene per la "rugosità" (r).
In un incrocio tra RR ed rr, la fecondazione produce una pianta F 1 che con-
tiene entrambi gli allçli (Rr). I semi appaiono rotondi, perché R è dominant.e
su r. I.: apparenza o la struttura fisica di un individuo sono noti con il termine g enerazione Fi

fenotipo, mentre la sua composizione genetica costituisce il genotipo. Indi-


Figura 1.1
vidui con lo stesso fenotipo possono avere genotipi diversi, sicché, per deter- La prima legge di Mendel (segregazio-
minare il genotipo di un organismo, è spesso necessario effettuare incroci per ne indipendente) spiega il rapporto
parecchie generazioni. Il termine omozigote si riferisce ad un gene in cui il 3:1 tra fenotipi dominante e recessivo
contributo dell'allele materno e paterno è identico (ad esempio: RR o rr) . Per nella proge_n ie Fi. R rappresenta il ge-
ne dominante e r quello recessivo. I se-
contro, quei geni in cui il contributo dell'allele materno e paterno è diverso m i lisci cost it uiscono il fenotipo domi-
(per esempio Rr) sono detti eterozigoti. nante, quelli rugosi il fenot ipo recessi-
Una o più lettere o simboli possono essere usati per rappresentare un partico- vo.
lare gene. I.:allele dominante di un gene può essere indicato da una lettera
maiuscola (R), da un+ a esponente (r ) o semplicemente da un segno+. Nella
presente trattazione useremo la prima convenzione, in cui l'allele dominante è
indicato da una lettera maiuscola e l'allele recessivo da una minuscola.
È importante sottolineare che un determinato gamete contiene solo una del-
le due copie (un allele) dei geni presenti nell 'organismo da cui proviene (per
esempio: o R oppure r, ma mai tutt'e due) e che i due gameti sono prodotti
in numero uguale. Esiste, perciò, una probabilità del 50% che un gamete
proveniente da una pianta di pisello della generazione F 1 contenga un parti-
colare gene (R oppure r). Questa opzione è puramente casuale. Quando si
esamina una quantità numericamente limitata di individui della generazione
F2 , non ci si aspetta di trovare un rapporto 3 : 1 esatto tra il carattere dominan-
te e quello recessivo. Talvolta, il rapporto potrebbe essere leggermente supe-
riore, oppure leggermente inferiore. Se si esaminano, però, campioni nume-
ricamente maggiori, ci si aspetta di trovare che il rapporto tra i piselli con il
tratto dominante e quelli con il tratto recessivo si avvicini maggiormente a
quello atteso di 3: 1.
Il riapparire del tratto recessivo nella generazione F 2 indica che gli alleli reces-
sivi non sono modificati né vengono persi nella generazione F 1 (Rr), ma che i
geni dominanti e recessivi sono trasmessi indipendentemente e sono pertan-
to capaci di segregare indipendentemente durante la formazione dei gameti.
Il principio della segregazione indipendente è spesso citato come la "prima
legge di Mendel".

Alcuni alleli non sono né dominanti né recessivi

Negli incroci riportati da Mendel un membro della coppia di geni era chiara-
mente dominante sull'altro. Questo comportamento, però, non è universale.
A volte il fenotipo eterozigote è intermedio tra i due fenotipi omozigoti. Per
8 I Parte prima • Chimica e genetica e 88-08-17890-0

generazione parentale esempio, l'incrocio tra una linea pura di fiori di "bocca di leone" (Antirrhinum)
di colore rosso ed una linea pura bianca produce una generazione F 1 di colore
intermedio rosa. Se gli individui di questa progenie sono incrociaci tra loro, la
X risultante progenie F2 avrà individui di colore rosso, rosa e bianco in rapporto
1:2:1 (Figura 1.2). In questo caso, quindi, è possibile distinguere gli eterozigo-
AA aa ti dagli omozigoti in base al loro fenotipo. Si noti, inoltre, che le leggi di Men-
t t del non dipendono dalla dominanza di un allele di un gene sull'altro.
® gameti @
l J
+ Principio dell'assortimento indipendente
generazione F,

Mendel estese i suoi incroci a piante di piselli che differivano per più di una
caratteristica. Come in precedenza, egli iniziò con due ceppi puri, che tra-
smettevano, cioè, i loro caratteri alla progenie. Uno dei ceppi aveva semi gial-
Aa li e lisci, l'altro semi verdi e rugosi. Dato che i caratteri giallo e liscio erano
1
dominanti sui caratteri verde e rugoso, tutta la generazione F 1 aveva semi
+ + gialli e lisci. Gli individui della generazione F 1 vennero poi incrociati tra loro
@ gameti 0J per produrre una serie di individui della generazione F2 , che vennero esami-
nati per le caratteristiche dei semi (fenotipo). In aggiunta ai due fenotipi ori-
generazione F2 ginali (giallo liscio; verde rugoso) ne emersero altri due (ricombinanti): gial-
lo rugoso e verde liscio.
gameti
maschili Di nuovo Mendel fu in grado di interpretare i risultaci, postulando che ciascu-
na coppia di geni venisse trasmessa in modo indipendente ai gameti durante
la formazione delle cellule sessuali. Questa interpretazione è illustrata nella Fi-
gura 1.3. O gni gamete contiene solamente un tipo di allele da ciascuna cop-
pia di geni. Pertanto i gameti prodotti da una generazione F 1 (Rr JY) saranno
composti da RY, Ry, r Y oppure ry, ma mai da Rr, JY, RR o YY Inoltre, in que-

Figura 1.2
generazione
parentale
RRYY
t
®l
X

gameti

rryy
t
GJ
Eredità del colore nei fiori di bocca
di leone. Un genitore è omozigote per
i fiori rossi (AA) e l'altro omozigote per i
fiori bianchi (aa). Non è presente nes- generazione F 1 +
suna dominanza ed i fio ri eterozigoti
nella generazione F1 sono rosa . Il rap- RrYy
porto 1:2:1 tra fiori rossi, rosa e bianchi I
nella progenie F2 è illustrato con i colo- + + t +
ri appropriati .
®l @ gameti rY GJ
generazione F2

gameti gameti

Figura 1.3
Principio secondo cui agisce la secon-
da legge di Mendel (assortimento in-
dipendente). N ell'esempio, l'eredita-
rietà del colore dei semi gia llo (y) o ver-
de (g) avviene insieme a quello della
'orma dei semi: lisci (R) o rugosi (r). Gli
alleli Re Y so no dominanti su re y. I ge-
notipi dei vari genitori e della progenie
sono indicati d a combinazioni d i lettere
e i quattro diversi fenotipi sono distint i
da ombreggiature.
e 88--0S-11s90-0 1. La visione mendeliana del mondo I 9

sto esempio, tutti e quattro i possibili gameti sono prodotti con uguale fre-
quenza. Non c'è tendenza, per geni che originano dallo stesso genitore, a stare
insieme. Il risultato è che i fenotipi della progenie F2 appariranno nel rappor-
to di nove gialli lisci, ere verdi lisci, tre gialli rugosi ed uno verde rugoso, come
si vede nel quadrato di Punnett, dal nome del matematico britannico che lo
introdusse, nella parte inferiore della Figura 1.3. Questo principio dell'assor-
timento indipendente è spesso chiamato "la seconda legge di Mendel".

I La teoria cromosomica dell 'eredità


Uno dei motivi principali per cui le scoperte di Mendel non furono originaria-
mente riconosciute fu l'assenza di evidenze concrete sul comportamento dei
cromosomi durante la meiosi e la micosi. Queste conoscenze, tuttavia, diven-
nero disponibili quando le leggi di Mendel furono riaffermate nel 1900 e di-
mostrate nel 1903 dal biologo americano Walter S. Sucron. Nel suo classico la-
voro I cromosomi nell'ereditarietà, Sucton sottolinea l'importanza del facto che
ciascun gruppo di cromosomi diploidi consista di parti morfologicamente si-
mili e che, durante la meiosi, ciascun gamete riceva solamente un singolo cro-
mosoma da ciascuna coppia di cromosomi omologhi. Egli, quindi, sfruttò
questo facto per spiegare i risultati di Mendel, utilizzando l'assunto che i geni
fossero parti del cromosoma. Egli postulò che i geni "seme-giallo" e "seme-ver-
de" fossero portaci da una certa coppia di cromosomi e che i geni "seme-liscio"
e "seme-rugoso" fossero portati da una coppia diversa di cromosomi. Questa
ipotesi spiega agevolmente il rapporto di segregazione 9:3:3: 1 osservato. Seb-
bene il lavoro di Surcon non dimostrasse la teoria cromosomica del!' eredità, fu
enormemente importante nel "fondere" per la prima volta la genetica (lo stu-
dio degli incroci) e la citologia (lo studio della struttura di una cellula).

I Linkage genico e crossing over


Il principio dell'assortimento indipendente di Mendel è basato sul fatto che ge-
ni localizzati su cromosomi diversi si separino (segreghino) in modo indipen-
dente durante la meiosi. Spesso, però, due geni non segregano in modo indi-
pendente, perché sono localizzati sullo stesso cromosoma (geni concatenati
[linked genes] vedi Box 1.2, I geni sono legati ai cromosomi). Molti esempi di se-
gregazione non casuale furono scoperti quando una gran quantità di geni mu-
ranti divenne disponibile per eseguire l'analisi di incroci. In ciascun caso ben
studiato, il numero di gruppi di linkage era identico al numero aploide di cro-
mosomi. Per esempio, ci sono quattro gruppi di geni concatenati in Drosophila
e ci sono quattro cromosomi morfologicamente diversi in una cellula aploide.
li linkage, comunque, non è mai completo. La probabilità che due geni sullo
stesso cromosoma rimangano associati durante la meiosi variano da poco me-
no del 100% a circa il 50%. Questa variazione nel linkage suggerisce che esista
un meccanismo per lo scambio di geni su cromosomi omologhi. Questo mec-
canismo è noto come crossing over. Il primo a descriverne le basi citologiche
fu il belga F.A. Janssens. All'inizio della meiosi, attraverso la formazione di si-
napsi, i cromosomi omologhi formano delle coppie co n l'asse longitudinale
parallelo. A quesro stadio , ciascun cromosoma si è duplicato formando due
cromacidi. Quindi, le sinapsi avvicinano quattro cromacidi (una tetrade), che
si intrecciano tra loro. Janssens postulò che, probabilmente a causa della ten-
sione meccanica risultante da questo intreccio, i due cromacidi potessero rom-
persi in regio ni corrispondenti. Questi eventi sono in grado di creare quattro
10 IParte prima • Chimica e g enetica C BS-08·17890-0

Box 1.2 I geni sono legati ai cromosomi

Inizialmente, tutti gli esperimenti di incrocio utilizzarono mente in mezzo ad una popolazione di moscerini con oc-
caratteristiche già presenti in natura. Per esempio, Men- chi rossi . Dato che, in natura, tutti i moscerini hanno !jli
del usò semi acquistati da negozianti special izzati, che occhi rossi, il gene che determina il colore rosso venne
dovevano averli ottenuti da contadini. L'esistenza di for- chiamato gene selvatico; il gene che determina il colore
me alternative del lo stesso gene (al leli) fa sorgere la do- bianco venne chiamato gene mutante (allele) .
manda su come esse si siano originate. Un'ipotesi ovvia è Il mutante occhi-bianchi venne immed iatamente utilizza-
che i geni possano cambiare (mutare) per dare origine a to in esperimenti di incrocio (Box 1.2 Figura 1), con lo stra-
nuovi geni (geni mutanti). Questa ipotesi venne testat a biliante risult ato che il comportamento dell'allele seguiva
seriamente a partire dal 1908, dal grande biologo ameri- .e sattamente la segregazione del cromosoma X (cioè era
cano Thomas Hunt Morgan e dai suoi giovani collabo ra- legato al sesso). L'osservazio ne suggerì immediatamente
tori Calvin B. Bridges, Hermann J. Muller e Alfred H. Stur- che il gene potesse trovarsi sul cromosoma X, insieme ai
tevant. Essi lavorarono con il moscerino della frutta Dro- geni che controllano il sesso degli individui. L'ipotesi fu
sophila melanogaster. Il primo mutante scoperto fu un presto confermata da altri incroci che usavano geni mu-
maschio con occhi bianchi, anziché con i normali occhi tanti recentemente individuati. Molti d i questi altri gen i
rossi. La variante occhi-bianchi comparve spontanea- mutanti erano legati al sesso.

a b
generazione parentale generazione parentale

rosso <jl fenotipo b ianco O bianco <jl fenotipo rosso O

X X

ww genotipo wY ww genotipo WY
I

i •
1
t i @• t
@
® gameti Q © Gl gameti

f+
l

generazio ne F 1
'--ir f+
generazione F1
~r
rosso S? rosso O rosso ~ b ianco O

X
X

n ® en
Ww wY

n ® ®n ©
Ww WY

@) @) y

rrlriFil
generazione F2
!'.-t:r===rfl1
g enerazione F2

rosso <jl rosso <jl rosso O bianco O rosso <jl bianco <jl rosso O bianco O

Ww ww WY wY
ww Ww WY wY
Box 1.2 •Figura 1 L'ereditarietà di un gene legato al sesso nell'incrocio è un mo scerino con occhi-b ianch (wY), m ent re la
in Drosophila. I g eni localizzati sui cromosom i sessuali vengono femm ina è omozi gote p er il carattere occhio-rosso WVv). (b ) Il
espressi in modo d iverso nella p ro g enie maschile e femminile, maschio ha occhi-rossi (WY) e la femmina occn1 -b anch •w1).
oerché, se è presente solo un cro mosoma X, i geni recessivi La lettera Y in questo caso non indica un a e e ,.,.,a
oresenti su di esso saranno semp re espressi. Nella figura sono cromosoma Y, p resente nei masch d' :Jroscc- a a ::>osto
uS-Ja due ncroo che implicano un g ene recessivo (w, dell'omologo cromosoma X. e crorr:oso-a ~ -e o -esente
occh o bianco 1oca1 zza o su cromosoma X. (a) Il maschio alcun gene che corrisponda a ge-e • e ::e ~o,...,osoma X.
e 88-08-11090.0 1. La visione mendeliana del mondo I 11

estremità crom osom iche rotte, capaci di risaldarsi in maniera incrociata, in


modo tale che una porzione di ciascuno dei due cromatidi sia unita ad una
porzione dell'altro (Figura 1.4). Così facendo si creano dei cromatidi ricombi- sinapsi di cromosomi
duplicati a formare
nanti che contengono un segmento derivante da ciascuno dei cromosomi tetradi
omologhi originali. La prova fo rmale dell'ipotesi di Janssens, cioè che i cro-
mosomi si scambiano fisicamente del materiale genetico durante le fasi di si-
napsi, giunse più di vent'ann i dopo, quando, nel 1931 , Barbara McClintock
ed H arriet B. C reighton, che lavoravano alla Cornell University con piante di
frumento della specie Zea mais, escogitarono una elegante dimostrazione cito-
logica della rottur;t e della riunione dei cromosomi (Figura 1.5).
due cromatidi
si piegano uno
sull'altro

I M appatu ra dei cromosomi


T homas H unt Morgan e i suoi studenti, tuttavia, non attesero la prova cito-
logica fo rmale per sfruttare le implicazioni dell'ipotesi di Janssens. Essi pen-
sarono che geni vicini tra loro su un cromosoma sarebbero rimasti uniti du-
rante l'assortimento meiotico (linkage prossimale), rispetto a geni che si tro-
vavano lontani. Essi comp resero immediatamen,te che questo era un modo
per localizzare (mappare) le posizioni relative dei geni sui cromosomi e, quin-
di, di produ rre una mappa genetica. Il mod o in cui essi usarono le frequenze
delle varie classi.di individui ricombinanti è molto semplice. Prendiamo, per Figura 1.4
L'ipot esi di crossing o ver di Janssens.
esempio, la segregazione di rre geni tutti local izzati sullo stesso cromosoma.
La disposizione dei geni può essere determinata per mezzo di tre incroci, in
ciascuno dei quali due geni vengono seguiti (incroci a due fattori o bifatto ria-
li). Un incrocio tra AB e ab genera quattro tipi d i progenie: due genotipi pa-
rentali (AB e ab) e due genotipi ricombinanti (Ab e aB). Similmente, un in-
crocio tra AC ed ac genera le due combinazio ni parentali e le due ricombi-
nanti Ac ed aC, mentre l'incrocio tra BC e be genera i tipi parentali ed i ri-

genotipi p arentali
materiale
e Wx extracromosomico e Wx
1::11
\c::
~:t=1 ==w:D
~L
=I
c::I 1~
e wx Figura 1.5
rotondità Dimost razione di scam b io fisico di ma-
teriale tra cromosomi omolo g hi.
N el la m aggioranza degli organismi,
progen ie senza crossing over progenie con crossin g over cop pie omologhe di cromosom i hanno
forme id ent iche. Occasionalmente, pe-
e Wx e wx
rò, i d ue membri della cop pia non sono
identici; uno di essi mostra la presenza
ctj I;::, c=:I I ) d i materiale extracromosomico o di re-
e Wx e Wx g ioni co mpatte che formano, in modo
riproducibile, strutture rotondeggianti.
c Wx e Wx McClintock e Creighton scoprirono una
=l 1:3 cop pia d i questo t ipo e la usarono per
dimostrare che il crossing over implica
= I I= scambi o fisico d i mat eriale t ra i due
e wx e Wx
cromosomi appaiati. N ell'esperimento
qui illustrat o, la progenie omozigote e,
e wx e wx wx doveva nascere da un crossin g over
e I I e
t ra i loci e wx. Quando fu eseguita
= I I= un'analisi citologica sulla progenie c,
e Wx e wx wx furono osservat i cromosom i con
p.o rzioni rotondeggianti, che evidenzia-
rono che la regione lineare Wx era st a-
e wx e Wx
t a sost it u ita d alla regione rotondeg-
giante wx. Il riq uadro colorato nella fi-
e: I=> eltj' ! ~ !I I l:::i gura identifica i cromosomi della pro -
e wx e wx genie o mo zig ote e, wx.
12 I Parte prima • Chimica e geneti ca e aa-0a.11a90.o

Figura 1.6 30%


Assegnazione del probabile posiziona-
mento di tre geni ottenuto in base a 10% 25%
tre incroci bifattoriali.
a e b

combinanti Be e bC. Ciascun incrocio produrrà un rapporto specifico tra


progenie a genotipo parentale e progenie a genotipo ricombinante. Si consi-
deri, per esempio, che il primo incrocio dia il 30% di ricombinanti, il secon-
do incrocio il 10% ed il terzo il 25%. Questo ci dice che i geni a e e sono più
vicini tra loro di quanto lo siano i geni a e bo i geni be e e che le distanze ge-
netiche tra a e b e b e e sono pressoché uguali. La disposizione lineare dei ge-
ni che meglio interpreta questi dati è a-c-b (Figura 1.6).
[esattezza dell'ordine genico suggerito da incroci bifattoriali può general-
mente essere confermata da incroci trifattoriali. Quando i geni utilizzati nel-
!' esempio precedente vengono seguiti nell'incrocio ABCx abc, si ottengono
sei genotipi ricombinanti (Figura 1.7) . Essi ricadono in tre gruppi di coppie
reciproche. Il più raro dei gruppi è ottenuto mediante un doppio crossing
over. Guardando alla classe di minor frequenza, è spesso possibile confermare
(o smentire) la disposizione dei geni ipotizzata. I risultati della Figura 1.7
confermano immediatamente l'ordine previsto in seguito agl i incroci bifatto-
riali. Soltanto larrangiamento a-c-b rende plausibile il fatto che i ricombi-
nanti AcB ed aCb siano i più scarsamente rappresentaci.
Lesistenza di crossing over multipli significa ch e la quantità di ricombinazio-
ni tra i marcatori distali a e b (ab) è, di solito, inferiore alla somma della fre-
quenza di ricombinazione tra a e e (ac) e tra e e b (cb). Per ottenere una mag-
giore esattezza nella stima della distanza tra i marcatori distali, calcoliamo la
probabilità (ac X cb) che quando avviene un crossing over tra e e b, ne avven-
ga uno anche tra a e e, e viceversa (cb X ac). Questa probabilità sottratta alla
somma delle frequenze esprime più accuratamente la quantità di ricombina-
zioni. La semplice formula:

ab= ac + cb-2(ac)(cb)

è applicabile in tutti i casi in cui l'evenienza di un crossing over non influen-


za la probabilità di un altro crossing over. Sfortunatamente, la mappatura ac-
curata è spesso disturbata da fenomeni di interferenza, che sono in grado di
aumentare o diminuire la probabilità di crossing over correlati.

A e B

a e b
l
A e
+ B A e
+ B A e
l B A e
+ B

Figura 1.7 I=
Uso dt incroci t rifattor iali per determi- a e b a e b a e b a e b
nare l'ordine di geni. La coppia meno
frequente di ricombinant i reciproci de-
ve o rigi nare d a un do ppio crossing A e
+ B A e
+ b A e
+ b A e
+ B
over. Le percentuc;ili indicate per le varie
classi rappresentano i valori teorici atte-
si per un campione infinitamente gran-
de. Quando, sperimenta lmente, viene a e b a e B a e B a e b
analizzato un numero fin ito di individui 67.5% 7.5% 22.5% 2.5%
della progenie, i valori ottenut i saranno questa classe nasce questa classe nasce questa classe nasce
sog getti a fluttuazion i statistiche rispet- da una rottu ra tra da una rottura tra da una rottura tra
to ai valori stimati. ae c ce b a e e e tra e e b
e BS-0a-11a90-0 1. La visione mendeliana del mondo I 13

Mediante questo approccio, il gruppo della Columbia University condotto


da Morgan assegnò, nel 1915, una posizione precisa a più di 85 mutanti di
Drosophila (Tabella 1.1), localizzandoli in punti precisi su uno dei quattro

Gli 85 geni mutanti riportati in Drosophila


abella 1.1 melanogaster nel 1915*

Parte del corpo Parte del corpo


Nome coinvolta Nome coinvolta

Gruppo 1
Abnormal Addome Lethal, 13 Corpo, letale
Bar Occhio Miniature A la
Bifid Venatura Notch Venatura
Bow Ala Reduplicated Colore dell 'occhio
Cherry Colore dell'occhio Ruby Zampa
Chrome Colore del corpo Rudimentary Ala
Cleft Venatura Sable Colore del corpo
Club Ala Shifted Venatura
Depressed Ala Short Ala
Dotted Torace Skee Ala
Eosin Colore dell'occhio Spoon Ala
Facet Ommatidi Spot Colore del corpo
Forked Spina Tan Antenna
Furrowed Occhio Truncate Ala
Fused Venatura Vermilion Colore dell'occhio
Green Colore del corpo White Colore dell'occhio
Jaunty A la Yellow Colore del corpo
Lemon Colore del corpo
Gruppo2
Antlered Ala Jaunty Ala
Aptero us Ala Limited Banda addominale
Are Ala Little crossover Cromosoma2
Balloon Venatura Morula Ommatidi
Black Colore del corpo Olive Colore del corpo
Blistered Ala Plexus Venatura
Comma Marcatore del torace Purple Colore dell'occhio
Confluent Venatura Speck Marcatore del torace
Cream Il Colore dell'occhio Strap Ala
Curved Ala Streak Struttura
Dachs Zampa Trefoil Struttura
Extra vein Venatura Truncate Ala
Fringed Ala Vestigi al Ala
Gruppo3
Band Struttura Pi nk Colore dell'occhio
Beaded Ala Rough Occhio
Cream lii Colore dell'occhio Safranin Colore dell'occhio
Deformed Occhio Se pia Colore dell'occhio
Dwarf Dimensioni del corpo Sooty Colore del corpo
Ebony Colore del corpo Spineless Spine
Giant Dimensioni del corpo Spread Ala
Ki dney Occhio Trident Struttura
Low crossing over Cromosoma 3 Truncate Ala
Maroon Colore dell'occhio Whitehead Struttura
Peach Colore dell'occhio White ocelli Occhio semplice
Gruppo 4
Bent Ala Eyeless Occhio

*Le mutazioni cadono in quattro gruppi di concatenazione. Dato che i quattro cromosomi
erano st ati osservati con metodi citologici, ciò significava che i geni erano local izzati sui cro-
mosomi. Si noti che le mutazioni nei vari geni possono avere effetto, in modi diversi, su un sin-
golo carattere somatico, quale il colore del corpo.
14 IParte prima • Chimica e genetica <O 88-08-1 7890-0

no rmale

occhi ali ali ali occhi corpo zampe ali ariste


rossi dritte dritte lunghe rossi grigio /unge lunghe lunghe

104 99,2 75,5 67 54,5 48,5 31 13 o


bw a c vg pr b d dp al

occhi ali ali ali occhi corpo dachs ali aristaless


marroni piegate curvate vestig iali viola nero (zamp e corte) tozze (ariste corte)

m ut ante

Figura 1 .8 gruppi di linkage, o cromosomi. Ancora più importante fu l'intuizione che la


M appa genetica del cromosom a 2 di disposizione dei geni appartenenti ad un determinato cromosom a era lineare
Drosophila. e mai ramificata. La mappa genetica di uno dei cromosomi di Drosophila è il-
lustrata in Figura 1.8. Le distanze tra gen i in un mappa di q uesto tipo vengo-
no misurate in unità d i mappa, che sono una misura della frequenza di ri -
co mbinazio ne tra geni. In tal modo, se la frequenza di ricombinazione tra
due geni è del 5%, si d ice che i geni d istano tra loro cinque uni tà di mappa.
D ato che tra geni distanti è p ossibile che avvengan o doppi crossing over, l'as-
segnazio ne delle unirà di mappa è co nsiderata accurata solo nei casi di ricom-
binazione tra geni vicini tra loro.
An che quando due geni si trovano alle estremità opposte di un cromosoma,
essi segregano insieme almeno nel 50% dei casi, a causa di crossi ng over mul-
tipli. I due geni saran no separati se avviene un numero d ispari di crossing
over, mentre se ne avv'ene un numero pari, i geni segregheranno insieme.
Così, all'inizio dell'analisi genetica di Drosophila, fu impossibile determ inare
se due geni apparten evano a cromosomi diversi o se appartenevano alle d i-
verse estremità dello stesso cromosoma. Solo dopo che venne m appato un
gran numero di geni fu possibile dimostrare in modo convincente che il nu-
mero di gruppi di linkage era uguale al numero di cro mosom i visibili. Nel
19 15, Mo rgan , con i suoi studenti Alfred H . Sturtevant, H ermann J. M uller
e Calvin B. Bridges, pubblicò il libro Il meccanismo dell'eredità mendeliana,
che enunciava per la prima volta la validità generale delle basi cromosom iche
dell'eredità. Oggi, questo concetto, insieme alle teorie dell'evoluzione ed al ·
concetto di cellula, è co nsiderato uno dei maggiori traguardi nella compren-
sione della natura degli organism i viventi.

L'origine della variab ilità genetica


attraverso le mutazioni
A questo pun to, era possibile capire le variazioni ereditarie che si osservano
nel mondo bi ologico e che sono alla base della reoria delJ 'evoluzione. Nor-
malmente i geni vengono copiati in modo esano durante la duplicazione dei
cromosomi. A volte, però, avvengono variazioni (mutazioni) nei geni, che ge-
neran o fo rme alterate, la maggior parre delle quali - ma non tutte - funziona-
<Cl 88-08-17890-0 1. La visione mendeliana del mondo I 15

no peggio degli alleli selvatici. Quesro processo è piuttosto raro; se ciò non
fosse molti geni verrebbero murari durante ciascun ciclo cellulare e la prole
non assomiglierebbe, di norma, ai genitori. Esiste, però, un vantaggio nell'a-
vere una piccola, ma costante, quantità di mutazioni; essa rappresenta ùna
fonte costante di variabilità, che consente alle piante e agli animali di adattar-
si ad un ambiente fisico e biologico in continuo mutamento.
Sorprendentemente, però, i risultati dei genetisti mendeliani non furono fat-
ti propri dai biologi classici, che rappresentavano allora ''l'autorità" in farro di
relazioni evolutive tra le varie forme di vita. Furono espressi dubbi sul farro
che i cambiamenti genetici studiati da Morgan e dai suoi studenti potessero
essere sufficienti a spiegare l'insorgenza di strutture morfologiche radical-
mente nuove, quali gli occhi o le ali. Questi biologi, invece, credevano che
dovessero essere avvenute anche "macro mutazioni" più potenti, che avevano
permesso i grandi cambiamenti evolutivi.
Gradualmente, però, i dubbi scomparvero, soprattutto grazie agli sforzi e ai
risultati dei genetisti matematici Sewall Wright, Ronald A. Fisher e John Bur-
den Sanderson Haldane. Essi dimostrarono che, considerando l'età della Ter-
ra, la relativa bassa frequenza di mutazioni osservata nei geni di Drosophila,
insieme a vantaggi evolutivi di media portata, sarebbero stati sufficienti aga-
rantire l'accumularsi di nuovi attributi morfologici favorevoli. Nel corso degli
anni '30, i biologi cominciarono a rivalutare le loro conoscenze sull'origine
delle specie e a capire il lavoro dei genetisti matematici. Tra questi "neo-dar-
winisti" c'erano il biologo Julian Huxley (un nipote del primo difensore di
Darwin, Thomas Huxley), il genetista Theodosius Dobzhansky, il paleonto-
logo George Gaylord Simpson e l'ornitologo Ernst Mayr. Negli anni '40 tut-
ti e quattro scrissero lavori fondamentali che dimostravano che il mendeli-
smo e il darwinismo erano veramente compatibili.

I Prime ipotesi sulla natura dei geni


e sul loro funzionamento
Quasi immediatamente dopo la riscoperta delle leggi di Mendel, i genetisti
iniziarono a fare ipotesi sia sulla struttura chimica dei geni che sul loro fun-
zionamento. Tuttavia, non venne fatto nessun significativo progresso, perché
l'identità del materiale genetico rimaneva sconosciuta. Anche la -scoperta che
sia gli acidi nucleici che le proteine sono presenti .nei cromosomi non fu di
aiuto, dato che la struttura di nessuna delle due classi di molecole era nota in
modo completo. Le ipotesi che diedero maggiori frutti si focalizzavano sul
fatto che i geni, in qualche modo, dovevano auro-duplicarsi. La loro struttu-
ra doveva essere esattamente copiata ogni volta che da un cromosoma se ne
formavano due. Tale idea fece immediatamente sorgere il fondamentale que-
sito chimico sul modo in cui una molecola complicata potesse essere copiata,
generandone un'esatta replica.
Anche alcuni fisici furono affascinati dai geni, e quando la meccanica quanti-
stica irruppe sulla scena nei tardi anni '20, nacque l'idea che per comprende-
re il gene fosse necessario, prima, capire a fondo i concetti della fisica teorica
più avanzata. Tale modo di pensare, però, non attecchì mai effettivamente,
data l'ovvietà del fatto che nemmeno il migliore dei fisici o chimici teorici si
sarebbe gettato nell'impresa, avendo a che fare con una sostanza, la cui strut-
tura non era ancora stata chiarita. C'era solo un farro sul quale era possibile
argomentare: l'osservazione di Muller e L.J. Stadler i quali, indipendente-
mente, scoprirono che i raggi X eràno in grado di produrre mutazioni. Dato
che la probabilità che venga colpito un gene "grande" è superiore a quella che
venga colpito un gene "piccolo", la frequenza di mutazione di un daro gene,
irradiaro con una determinata dose di raggi X, è una misura delle dimensioni
<C> 88-08-17890-0 1. La visi one mendeliana del mondo / 15

no peggio degli alleli selvatici. Quesro processo è piuttosto raro; se ciò non
fosse molti geni verrebbero mutati durante ciascun ciclo cellulare e la prole
non assomiglierebbe, di norma, ai genitori. Esiste, però, un vantaggio nell'a-
vere una piccola, ma costante, quantità di mutazioni; essa rappresenta una
fonte costante di variabilità, che consente alle piante e agli animali di adattar-
si ad un ambiente fisico e biologico in continuo mutamento.
Sorprendentemente, però, i risultati dei genetisti mendeliani non furono fat-
ti propri dai biologi classici, che rappresentavano allora "l'autorità" in fatto di
relazioni evolutive tra le varie forme di vita. Furono espressi dubbi sul fatto
che i cambiamenti genetici studiati da Morgan e dai suoi studenti potessero
essere sufficienti a spiegare l'insorgenza di strutture morfologiche radical-
mente nuove, quali gli occhi o le ali. Questi biologi, invece, credevano che
dovessero essere avvenute anche "macro mutazioni" più potenti, che avevano
permesso i grandi cambiamenti evolutivi.
Gradualmente, però, i dubbi scomparvero, soprattutto grazie agli sforzi e ai
risultati dei genetisti matematici Sewall Wright, Ronald A. Fisher e John Bur-
den Sanderson Haldane. Essi dimostrarono che, considerando l'età della Ter-
_ra, la relativa bassa frequenza di mutazioni osservata nei geni di Drosophila,
insieme a vantaggi evolutivi di media portata, sarebbero stati sufficienti aga-
rantire l'accumularsi di nuovi attributi morfologici favorevoli. Nel corso degli
anni '30, i biologi cominciarono a rivalutare le loro conoscenze sull'origine
delle specie e a capire il lavoro dei genetisti matematici. Tra questi "neo-dar-
winisti" c'erano il biologo Julian Huxley (un nipote del primo difensore di
Darwin, Thomas Huxley), il genetista Theodosius Dobzhansky, il paleonto-
logo George Gaylord Simpson e l'ornitologo Ernst Mayr. Negli anni '40 tut-
ti e quattro scrissero lavori fondamentali che dimostravano che il mendeli-
smo e il darwinismo erano veramente compatibili.

I Prime ipotesi sulla natura dei geni


e sul loro funzionamento
Quasi immediatamente dopo la riscoperta delle leggi di Mendel, i genetisti
iniziarono a fare ipotesi sia sulla struttura chimica dei geni che sul loro fun-
zionamento. Tuttavia, non venne fatto nessun significativo progresso, perché
l'identità del materiale genetico rimaneva sconosciuta. Anche la ·scoperta che
sia gli acidi nucleici che le proteine sono presenti nei cromosomi non fu di
aiuto, dato che la struttura di nessuna delle due classi di molecole era nota in
modo completo. Le ipotesi che diedero maggiori frutti si focalizzavano sul
fatto che i geni, in qualche modo, dovevano auto-duplicarsi. La loro struttu-
ra doveva essere esattamente copiata ogni volta che da un cromosoma se ne
formavano due. Tale idea fece immediatamente sorgere il fondamentale que-
sito chimico sul modo in cui una molecola complicata potesse essere copiata,
generandone un'esatta replica.
Anche alcuni fisici furono affascinati dai geni, e quando la meccanica quanti-
stica irruppe sulla scena nei tardi anni '20, nacque l'idea che per comprende-
re il gene fosse necessario, prima, capire a fondo i concetti della fisica teorica
più avanzata. Tale modo di pensare, però, non attecchì mai effettivamente,
data l'ovvietà del fatto che nemmeno il migliore dei fisici o chimici teorici si
sarebbe gettato nell'impresa, avendo a che fare con una sostanza, la cui strut-
tura non era ancora stata chiarita. C'era solo un fatto sul quale era possibile
argomentare: l'osservazione di Muller e L.J. Stadler i quali, indipendente-
mente, scoprirono che i raggi X erano in grado di produrre mutazioni. Dato
che la probabilità che venga colpito un gene "grande" è superiore a quella che
venga colpito un gene "piccolo", la frequenza di mutazione di un dato gene,
irradiato con una determinata dose di raggi X, è una misura delle dimensioni
16 I Parte prima • Chimica e genetica e sa-0a.17a90-0

del gene stesso. Anche in questo caso, però, erano necessari così tanti presup-
posti, che nessuno, nemmeno Muller e Stadler, presero troppo suJ serio lesti-
me ottenute.

I Primi esperimenti per trovare una relazione


gene-proteina
Gli approcci più fruttuosi per trovare una relazione tra geni e proteine si fo-
calizzarono su quali proteine, presenti nella cellula, fossero influenzate dalle
mutazioni dei gen i. All'inizio questi studi erano complicati, dato che nessuno
aveva idea di quali proteine componessero strutture quali l'occhio o le ali. Di-
venne presro chiaro, però, che geni con effetti su attività metaboliche sempli-
ci erano più faci li da studiare dei geni che influenzavano le grandi strutture
anatomiche. Uno dei primi esempi util i venne dallo studio di una malattia
ereditaria che influenzava il metabolismo degli amminoacidi. Nell' uomo av-
vengono mutazioni spontanee che hanno un effetto sulla capacità di metabo-
lizzare l'amminoacido fenilalanina. Quando individui o mozigoti per il carat-
tere mutante mangiano cibo che contiene fenilalanina, la loro incapacità di
trasformare questo amminoacido in tirosina provoca l'accumuJo di livelli ros-
sici di acido fenilpiruvico nel sangue. Questo disturbo, un esempio di "errori
intrinseci del metabolismo'', suggerì al medico inglese Archibald E. Garrod,
fin dal 1909, che il gene selvatico è responsabile della presenza di un partico-
lare enzima, e che negli individui omozigoti mutanti lenzima è assente in
modo congeniro.
I..:ipotesi generale di Garrod di una relazione gene-enzima fu estesa, negli an-
ni '30, dal lavoro sui pigmenti dei fiori svolto da Haldane e Rose Scott-Mo n-
crieff in Inghilterra, da studi sui pigmenti dei peli di porcellino d' india da
parte di Wright negli Stati Un iti e da ricerche sui pigmenti degli occhi di in-
setro da parte di A. Kuhn in Germania e di Boris Eprhussi e George W Bead-
le, d apprima in Francia e poi in Califo rnia. In tutti i casi, le osservazioni rive-
larono che un particolare gene influenzava un passaggio nella formazione del
pigmento, la cui assenza cambiava, per esempio, il colore degli occhi d i un in-
setto da rosso magenta a rosso rubino. La man canza di conoscenze di base
sulla struttura degli enzimi in questione, tuttavia, impedì una disamina più
approfondita della relazione gene-enzima, e non potè essere fornita alcuna as-
sicurazione suJ fatto che gran parte dei geni controlla la sintesi di proteine (a
quel punto si sospettava che tutti gli enzim i fossero proteine) o che tutte le
proteine fossero sorto controllo genico.
Già nel 1936 divenne ovvio a rutti i genetisti mendeliani che i futuri esperi-
menti, atti a chiarire le caratteristiche d i base della generica mendeliana, non
sarebbero stati in grado di fornire prove concrete sul modo in cui i geni agi-
scono. Sarebbe staro necessario, per contro, trovare oggetti biologici più adat-
ti all'analisi chimica. Gli studiosi erano coscienti, per di più, che le conoscen-
ze contemporanee della chimica degli acidi nucleici e delle p roteine erano
completamente inadeguate per affrontare anche il più adatto dei sistemi bio-
logici. Fortunatamente, però, le limitazioni dell e conoscenze chimiche non li
trattennero dall'effettuare esperimenti generici con semplici muffe, batteri e
virus. Come vedremo, le basi chimiche divennero di ponibili quasi contem-
poraneamente alla capacità dei genetisti di util izzarle.
C88-08-1 7890-0 1. La visione mendeliana del mondo I 17

Sommario
L'eredità è co ntrollata dai cromosomi che sono i portatori I differenti alleli dello stesso gene originano da variazioni
cellulari dei geni. I fattori ereditari furono, per la prima vol- (mutazioni) ered itabili del gene stesso. Generalmente i ge-
ta, scoperti e descritti da Mendel nel 1865, ma la loro im- ni sono stabili e vengono copiati esattamente durante la
portanza non divenne chiara fìno all'inizio del XX secolo. duplicazione dei cromosomi ; le mutazioni avvengono solo
C iascun gene può esistere in una varietà di forme, chiamate raramente e generalmente sono dannose. Le mutazioni,
alleli. Mendel propose che ciascun genitore fo rnisse aJla tuttavia, hanno un ruolo positivo, dato che l'accumulo di
prole un fattore ereditario (oggi conosciuto come gene) per rare m utazioni favorevoli è la base per la variabilità generi-
ciascuna caratteristica ereditaria. La base fìsica di questo ca che a sua volra cosriruisce il presupposto per la teoria
compo rtamento è la distribuzione dei cromosomi omolo- dell'evoluzione.
ghi durante la meiosi: un solo cromosoma (scelto a caso) di Per molti anni, la srrurru ra dei geni e i fenomeni chimici at-
ciascuna coppia di cromosomi omologhi viene distribuito traverso i quali essi controllano le caratteristiche cellulari
per ciascuna cellula apolide. Quando due geni sono sullo furono un mistero. Quando una gran quanàtà di mutazio-
stesso cromosoma, tendo no ad essere ereditati insieme (lin- ni spontanee vennero descritte, divenne ovvio che la rela-
kage). Geni che influenzano caratteristiche differenà sono zione un gene-un carattere non esiste e che rutti i caratteri
ereditati indipendentemente gli uni dagli altri, perché loca- complessi sono controllati da più geni. L'idea più logica,
lizzati su cromosomi diversi. In ogn i caso, il linkage è diffi- proposta da Garrod nel 1909, fu che i geni influenzassero
cilmente completo, perché i cromosomi omologhi si ap- la sintesi di enzimi. Tuttavia, gli strumenti dei genetisti
paiano durante la meiosi, spesso si rompono in punti iden- mendeliani - organism i come il frumento, il topo e perfi no
tici e si riuniscono in modo incrociato (crossing over). Il il moscerino della frucra, la Drosophila - non eran o adatti
crossing over sostituisce gruppi dj geni , inizialmente loca- per ricerche chimiche dettagliate sulla relazione geni-pro-
lizzati su un cromosoma di o rigine paterna, a gruppi di ge- teine, Per questo tipo di indagini sarebbe diventato indi-
n i localizzati sul cromosoma di origine materna. spensabile l' uso di organismi più semplici.

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VPITOLO
Gli acidi nucleici
trasmettono
l'informazione genetica _ _,

f] esistenza di molecole speciali in grado di portare l'informazione gene- • L"'esplosiva " scoperta
tica fu postulata dai genetisti, molto prima che questo problema fosse di Avery: il DNA può
---l preso in considerazione dai chimici. Già negli anni '30, i genecisci ini- portare la specificità
ziarono a pensare a quale cipo di molecola potesse avere l'invariabilità scruc- genetica
curale necessaria per un gene e allo scesso cempo fosse in grado di mutare in
• La doppia elica
maniera repentina e permanente, caratteristica, quesca, alla base del proces-
so evolutivo. Fino alla mecà degli anni '40, non sembrava esistere un modo • L'informazione genetica
diretto per tentare di comprendere lessenza chimica del gene. Era noco, in- all'interno del DNA
fatti, che i cromosomi avessero un coscicuente molecolare unico, l'acido viene trasmessa
deossiribonucleico (DNA); ma non c'era modo di dimostrare che esso con- attraverso la sequenza
tenesse l'informazione generica, piuctosco che servire come impalcatura mo- dei suoi quattro
lecolare per una classe di proteine ancora ignote, designata a portare cale in- componenti nucleotidici
formazione. Era opinione generale che i geni fossero coscituici da amminoa-
• Il dogma centrale
cidi perché, a quel cempo, erano le uniche biomolecole noce sufficiente-
mente complesse. • La determinazione della
Pertanto, lo scudio della funzione dei geni ali' interno delle cellule era l' ap- direzione della sintesi
proccio più sensaco per capire la nacura dei geni stessi. Nei primi anni '40, proteica
le ricerche condotce principalmente da George W Beadle e da Edward Ta-
• L'era della genomica
tum sul fungo Neurospora crassa stavano fornendo daci sempre più convin-
centi in supporto all'ipotesi ormai crentennale di Archibald E. Garrod che i
geni controllassero la sintesi di enzimi specifici (l'ipotesi: un gene-un enzi-
ma). Visto che a quei tempi era stato dimostrato che rutti gli enzimi cono-
sciuti erano, di facto, proteine, il quesito fondamentale rimaneva il modo in
cui i geni partecipassero alla sincesi delle proteine. Fin dall'inizio, l'ipotesi
più semplice era quella che l'informazione concenuta nei geni determinasse
l'ordine dei 20 diversi amminoacidi all'interno delle carene polipeptidiche
delle proteine.
L'intuizione fu di ben poco aiuco anche per i migliori biochimici, che tenta-
rono di provare questa ipotesi, in quanto non esisteva alcun modo logico di
utilizzare gli enzimi per determinare lordine in cui gli amminoacidi venivano
aggiunti alla catena polipeptidica. Un cale schema avrebbe richiesto, per la
sincesi di un unico tipo di proteina, un numero di enzimi "ordinatori" pari al
numero di amminoacidi presemi nella proteina da sintetizzare. Poiché tutti
gli enzimi noti a quei tempi erano essi stessi delle proteine (ora sappiamo che
anche !'RNA può comportarsi come un enzima, in alcuni casi), sarebbe staro
necessario avere un numero superiore di enzimi "ordinatori" per sintetizzare
gli enzimi "ordinatori" stessi. Quesco, ovviamente, conduceva al paradosso
che una determinata proteina avesse molteplici specificicà enzimatiche, a me-
no che non si postulasse una serie di sintesi magicamente correlate tra loro.
Solo partendo da questo assunto (anche se con gran difficoltà) sarebbe stato
possibile determinare una cellula funzionante. Tutcavia, sembrava poco pro-
babile che la maggior parte delle proteine pocesse svolgere funzioni multiple.
Le conoscenze del tempo, infatti, portavano ad una conclusione opposta: una
proteina-una funzione.
20 I Parte prima • Chimica e genetica 0 88-08-17890-0

"L'esplosiva" scoperta di Avery: il DNA può


portare la specificità genetica
Il fatto che il DNA potesse essere la molecola chiave per la genetica emerse
in maniera alquanto inaspettata dagli studi sui batteri che causano la pol-
monite. Nel 1928, il microbiologo inglese Frederick Griffìth fece la sor-
·prendente osservazione che alcuni ceppi di batteri non infettivi diventavano
contagiosi se mischiati con dei corrispondenti ceppi patogeni uccisi con il
calor..e. Questa trasformazione 4a _!?<?_n virulenti a viruknti rappresentava un
cambio ereditario nei bacteri e ciò fu dimostrato usando dei discendenti di
questi ceppi neopatogeni per trasformare ulteriori ceppi non patogeni.
Emerse quindi la possibilità che i componenti genetici delle cellule batteri-
che patogene rimanessero intatti quando queste venivano uccise con il calo-
re. Inoltre, una volta liberati dalle cellule uccise dal calore, questi compo-
nenti potevano attraversare la parete delle cellule batteriche vive riceventi e
andare incontro ad una ricombinazione gènetic:_a con l'apparato generico
della_~!p la osP-ite (Figura 2.1). Successive ricerche confermarono questa in-
terpretazione genetica. La patogenicità riflette l'azione del gene "capsula", il
quale codifica per un importante enzima coinvolto nella sintesi della capsu-
la batterica, contenente carboidrati, che circonda la maggior parte dei batte-
ri che provocano la polmonite. Se è presente l'allele S (smooth, liscio) del ge-
ne capsula, allora attorno al batterio si forma una capsula, necessaria per la
patogeni ci tà (la formazione della capsula conferisce, inoltre, un aspetto li-
scio alle colonie formate da questi batteri). Se, invece, è presente l'allele R
(rough, ruvid~) di questo gene, non si forma nessuna capsula e i batteri non
sono patogeni.
Pochi anni dopo l'osservazione iniziale di Griffìth, si scoprì che gli estratti di
batteri uccisi erano in grado di indurre una trasformazione ereditaria e si ini-
ziò a ricercare la natura chimica dell'agente trasformante. A quei tempi, una
larghissima maggioranza di biochimici credeva ancora che i geni fossero delle
proteine. Fu, perciò, una grande sorpresa quando, nel 1944, dopo almeno
dieci anni di ricerche, il microbiologo americano Oswald T. Avery e i suoi
colleghi al Rockefeller Insriture di New York, Colin MacLeod e Maclyn
McCarty, annunciarono formalmente che il principio genetico attivo era il

cap 5
(gene capsula) cromosoma

uccisione
con ca lore
rilascio
d el fram mento
cap 5

cellula S (liscia)
patogena ricombinazione
e divisione
cellulare

cellula R (ruvida) ingresso nella ce llula


cellula S
non patogena capRdel frammento
cromosomico contenente cap5

Figura 2.1
Trasformazione di una caratteristica genetica di una cellula bat- m ico, cont enente il gene capsula, da una cellula 5 trattata con il
terica (Streptococcus pneumoniae) tramite l'aggiunta di cellule calore. Dat o che la maggior parte delle ce lule R riceve altri fram-
di un ceppo genetico diverso uccise con il calore. Nella figura menti cromosomici, l'efficienza d i trasformazione per un d ato ge-
viene presentata una cellula Rche riceve un fram mento cremoso- ne è, di solito, meno de 11%.
e 53-05-11s90-0 2. Gli acidi nucleici t rasmettono l'informazione genetica I 21

.;:)_ A (Figura 2.2). A supporto di questa loro conclusione venne illustrato


un esperimento chiave, al fine di dimostrare che l'attività trasformante con-
renu ta nelle loro frazioni altamente purificate veniva distrutta da una deos- cellula S
-i ribonucleasi pancreatica, un enzima precedentemente purificato che de- (liscia)
patogena
gradava specificamente le molecole di DNA, riducendole ai loro componen-
ti base nucleotidici e non aveva alcun effetto sull'integrità delle molecole
proteiche o sull'RNA. Caggiunta sia di una ribonucleasi pancreatica (che de-
grada l'RNA) , sia di diversi enzimi proteolitici (che degradano le proteine)
non aveva alcun effetto sull'attività trasformante.
! rottura delle cellule

I geni virali sono anch'essi acidi nucleici

Cn'alrra importante prova a conferma di quanto dimostrato sinora derivò da


udi chimici condotti con i virus e con cellule infettate da virus. Nel 1950
era già possibile ottenere un certo numero di virus sostanzialmente puri e
determinare quali tipi di molecole li costituissero. Questo lavoro portò al-
l'i mportante generalizzazione che tutti i virus contenessero acidi nucleici.
Dal momento che a quei tempi cresceva la consapevolezza che i virus conte-
nessero del materiale genetico, il quesito che immediatament~ggì fu
! isolamento del DNA

~uello _4i ca ire se_gli acidi nuclei ci fossero i f>Ortatori de_i_geni_y.irali. Una )
1
prova cruciale derivò da es erim~nti effet~~t~isoto i radioattivi sul! .2 Q. a~ (\~
moltiplicazione del virus batterico [batteriofago o fago) T2, un virus che
conteneva una componente interna di DNA e un guscio protettivo compo- \ ....,. (
sto da un aggregato di diverse molecole proteiche. In uesti es12erimenti del \., J
1952 Alfred D. Hershey e Martha Chase, nel Cold Spring Harbor Labora- ..._..
tory di Long Island, marcarono le E!Oteine dell'involucro con l'isotopo 355
e il nucleo di DNA con l'isoto o radioattivo 32P. Il virus marcato venne
quindi utilizzato per seguire i estmo sia e le proteine, sia degli acidi nu-
cleici durante la moltiplicazione del fago; in particolare per vedere uale deb
! aggiunta del DNA
alle ce llule R

le due_com onenti del virus parentale, contenenti atomi ra isiattivi entrfil- cellula R (ruvida)
- se nella cellula ospite e ~ale ria~isse 20!_nella E_ro~nie del fago. Il risul- non patogena
~to i questi es erimenti fu chia!:_issimo: nella ~o~nie del fago vL:eDl la_
maggior par~ e ~a~~ucleico pa~entale e non vi era traccia delle prote'-
ne (Figura 2.3). Inoltre, fu possibile dimostrare che nella cellula batterica

!
ricombinazione e ·
erano entrate pochissime proteine parentali e che, invece, la maggior parte d ivisione cellul are
ri maneva attaccata all'esterno della parete batterica e non sembrava svolgere
alcuna funzione, una volta che la componente di DNA era passata all'inter-
no. Quest' ultimo punto venne definitivamente stabilito dopo aver agitato
energicamente i batteri infettati in seguito all'entrata del DNA: gli involucri
proteici venivano rimossi senza che il batterio perdesse la capacità di forma-
re nuove particelle fagiche.
Oggi è possibile fare esperimenti ancora più convincenti con alcuni virus. Ad
esempio, il DNA purificato dal polyoma virus di topo può entrare nelle cellu-
le murine e iniziare un ciclo di molriplicazione virale e produrre migliaia di
nuove particelle di polyoma. La funzione primaria delle proteine di un virus Figura 2.2
Isolamento di un agente trasformante
è, perciò, quella di proteggere la sua componente genetica di acidi nucleici chimicamente puro. (Fonte: adattata
nei suoi movimenti da una cellula all'altra. Quindi non esiste alcun ruolo per da Stahl, F.W. 1964. The mechanics of
le proteine nella struttura del gene. inheritance, Fig. 2.3. Copyright © 1964.
Riprodotto con autorizzazione di Pear-
son Educatio n, lnc., Upper Saddle Ri-
ver, NJ.)

I La doppia elica
Mentre procedevano i lavori sull'analisi ai raggi X delle strutture proteiche,
àlcuni scienziati cercavano di risolvere l'immagine (pattern) di diffrazione ai
raggi X del DNA.
22 IParte prima • Chimica e genetica e 88-08-1 7890-0

~ proteina dell'involucro Il primo pattern di diffrazione fu acquisito nel 1938 da William Astbury, uti-
l.~ marcata con35
5 lizzando DNA fornito da Ola Hammarsten e Torbjorn Caspersson. Ma fu so-
DNA marcato lo nei primi anni '50 che furono scattate fotografie di diffrazioni ai raggi X ad
t con 32P alta qualità da Maurice Wilkins e Rosalind Franklin (Figura 2.4). Queste fo-

e mescolamento tografie mostrarono che la struttura basilare del DNA non solo era elicoidale,
del virus con ma era anche composta da più di una catena polinucleotidica - almeno due o
) le cellule ospiti
tre. Negli stessi anni vennero inequivocabilmente identificati i legami cova-
lenti del DNA. Nel 1952, un gruppo di chimici organici nel laboratorio di
Alexander Todd dimostrò che i nucleotidi del DNA erano uniti in maniera
regolare da legami fosfodiesterici 3'--75' (Figura 2.5).
Nel 1951, grazie al loro interesse nel motivo proteico dell'ex elica proposço da
Linus Pauling (che verrà discusso nel Capitolo 5), William Cochran, Francis
agitazione
energica
H. Crick e Vladimir Vand svilupparono un'elegante teoria sulla diffrazione
delle molecole elicoidali. Questa teoria permise di eseguire diversi tentativi
n-
lr
proteina
"fantasma"
35
marcata con 5
per risolvere la possibile struttura del DNA. La soluzione corretta, una dop-
pia elica complementare (vedi il Capitolo 6), fu scoperta nel 1953 da Crick e
James D. Watson, che, a quell'epoca, frequentavano il laboratorio di Max Pe-

c,#J-.. . .,.......,,.....~) !;,~",,~·"·" rutz e John Kendrew. Questi ricercatori trovarono infatti la configurazione
(energeticamente) più favorevole e stereochimicam en te compatibile con i da-
ri di diffrazione ai raggi X di Wilkins e Franklin.
Nella doppia elica, le due carene di DNA sono tenute ~da leg~mi idro-

moltiplicazione
del cromosoma
virale
Igeno (un legame debole non covalente: vedi il apito o 3) _rra coppie di b~
_iiLlil_amenti opposti (Figura 2.6). Questo appaiamento di basi è altamente
specifico: la base purinica adenina si appaia solo alla base pirimidinica timina,
mentre la base purinica guanina si appaia solo con la base pirimidinica citosi-
e produzione
di nuovi fagi na. Nel DNA a doppia elica, il numero di residui A deve essere uguale al nu-
mero di residui T, così come deve essere uguale il numero di residui G e resi-
dui C (vedi Box 2.1, Li regola di Chargajf). Ne consegue che le sequenze del-
ri lascio le basi sulle due catene di una data doppia elica sono in relazione comple-
di nuove
particelle
lmentare tra loro e che la sequenza di ogni filamento di DNA defi nisce esatta-
figlie mente quella del suo filamento complementare.
La scoperta della doppia elica rivoluzionò profondamente il modo in cui i ge-
netisti avrebbero da allora interpretato i loro dati. Il gene non era più un' en-
Figura 2.3
Dimostrazione che solo la componen-
tità misteriosa, il cui comportamento si poteva studiare solo con esperimenti
te di DNA del fago T2 trasporta l'in- genetici. Al contrario, divenne presto un vero oggerro molecolare a cui i chi-
formazione genetica e che l'involucro mici potevano fare riferimento in modo oggettivo, come già facevano con
proteico funziona esclusivamente da molecole più piccole quali il piruvato o l'ATP. Il grande entusiasmo, comun-
guscio protettivo.
que, non derivò solo dal fatto che la struttura era stata risolta, ma dalla natu-
ra stessa della struttura. Prima che fosse chiari ta, infatti, si era temuto che la
struttura non avrebbe fornito sufficienti informazioni per quanto riguardava
la funzione e la replicazione dei geni. Fortunatamente, però, la scoperta si ri-
velò notevolmente significativa. I due filamenti avvolti tra loro in una strut-
tura complementare suggerivano, infatti, che un filamento servisse da super-
ficie specifica (stampo) sulla quale si poteva "formare" l'altro filamento (Fi-
gura 2.6). Se questa ipotesi si fosse rivelata corretta, il problema fondamenta-
le della replicazione dei geni, un fatto su cui i genetisti discutevano da anni,
sarebbe stato allora risolto, almeno dal punto di vista concettuale.

Figura 2.4
La fotografia della qiffrazione a raggi X di una molecola d i DN A, fondamentale per la ri-
soluzione della sua struttura. Questa fotografia, fatta d a Rosalind Franklin al King's Colle-
ge di Londra, nell'inverno 1952-1953, confermò l'ipotesi che DNA ' osse elicoidale. Le li-
nee di d iffrazione che si uniscono al centro (config urazione incroci ata) (crossways pattern)
indicano una struttura elicoid ale. Le reg ioni molto scure n a o e 1n basso mostrano che le
basi puriniche e pirimidiniche sono impilate regolarmente una su 'altra ad una distanza di
3,4 A e sono p erpendicolari all'asse dell'elica. (Fon e: nprodorta con autorizzazione di
Franklin R.E., e Gosling R. 1953. Nature 171 :740.)
<!:> 88-08-17890-0 2. Gli acidi nucleici trasmettono l'informazione genetica I 23
Figura 2.5
Una porzione della catena polinucleo-
tidica del DNA che mostra i legami fo-
sfodiesterici 3· ~ 5· che uniscono i nu-
cleotidi. I gruppi fosfato uniscono il
carbonio 3' di un nucleotide con il car-
bonio 5' d.el successivo.

Box2.1
vecchio vecchio
Il biochimico Erwin Chargaff usò una tecnica chiamata cromatografia su carta
per analizzare la composizione nucleotidica del DNA Nel 1949, i suoi dati di-
mostrarono non solo che i quattro diversi nucleotidi non sono presenti in ugual
misura, ma che il rapporto esatto dei quattro nucleotidi varia da specie a specie.
(Box 2.1, Tabella 1). Questi risultati suggerivano la possibilit à che fosse l'ordine
p reciso dei nucleotidi nel la molecola di DNA a stabilire la specificità genetica.
Gli esperimenti di Chargaff dimostrarono, inoltre, che il rapporto relat ivo delle
quattro basi non era casua le. Il numero di res.idui aden ina (A) in tutti i campioni
di DNA e ra uguale al numero dei resi dui timina (T) e, allo stesso modo, i residui
guanina (G) erano pari a quelli citosina (C). Ino ltre, indipendentemente dalla
fonte del DNA, il rapporto purine-pirimidine era sempre app rossimativamente
uguale ad uno (purine =pirimidine). Ciononostante, il significato fo ndame nta-
le del la relazione A=Te G=C (regola di Chargaff) emerse solamente quando la
struttura tridimensionale del DNA venne correttamente risolta.

I dat i che portarono alla formu lazione de lla regola di Chargaff

Adenina Timina Adenina Guanina Purine


verso verso verso verso verso
Origine guanina citosina timina citosina pirimidine

Bue 1,29 1,43 1,04 1,00 1,1


Uomo 1,56 1,75 1,00 1,00 1,0
Gallina 1,45 1,29 1,06 0,91 0,99
Salmone 1,43 1,43 1,02 1,02 1,02
Frumento 1,22 1,18 1,00 0,97 0,99
Lievito 1,67 1,92 1,03 1,20 1,0
Hemophilus influenzae 1,74 1,54 1,07 0,91 1,0
Escherichia coli K2 1,05 0,95 1,09 0,99 1,0
Bacillo del la tubercolosi aviaria 0,4 0,4 1,09 1,08 1,1
vecchio nuovo nuovo vecch io
Serratia marcescens 0,7 0,7 0,95 0,86 0,9
Bacillus schatz 0,7 0,6 1,12 0,89 1,0
Figura 2.6
Fonte: da Chargaff E. et al. (1949), J. Bio/. Chem. 177: 405. Replicazione del DNA I fi lamenti sinte-
tizzati ex novo sono in arancione.
24 IParte prima • Chimica e genetica C88-08-17890-0

Alla ricerca delle polimerasi che sintetizzano il DNA

Per la prova rigorosa che una singola catena di DNA servisse da stampo per
la sintesi della catena complementare si dovette aspettare la messa a punto di
un sistema sperimentale in provetta (in vitro) per la sintesi di DNA. Questo
avvenne in largo anticipo su quanto previsto dai genetisti molecolari, il cui
mondo era allora assai lontano da quello dei biochimici, che, invece, avevano
una conoscenza avanzata delle tecniche per l'isolamento di enzimi. Al co-
mando di questo assalto biochimico alla replicazione del DNA c'era un bio-
chimico statunitense, Arthur Kornberg, che, nel 1956, aveva dimostrato la
sintesi del DNA in un estratto crudo di cellule batteriche. Nel corso degli an-
ni successivi, Kornberg prosegul nel dimostrare che era necessario un enzima
E_olimerizzante~pecifìco per catalizzare l'assemblaggio dei precursori Che for-
mavano il DN1\. Gli scudi di Kornberg sta ifirono che i costituenti nucleoti-
dici del DNA erano precursori ricchi gi energia (dATP, dGTP. d_ç,TP e
dTTP; Figura 2.71 Ulteriori scudi identificarono un -;ingol~ polipe_E__t1Ee, ~
PNA Polim~asi 1 (DNA Poi 1), come quello in grado di catalizzare la sinte-
si del nuovo ~lamento di DNA. Questo enzima lega, in se~enza, i precurso-
Figura 2.7
I nucleotidi del DNA. Nella figura sono
illustrate le strutture dei diversi compo-
nenti di ciascuno dei quattro nucleotidi .

nucleoside: deossicitidina deossitimidina

base pirimidinica· timina (DNA)

OH OH
zucchero: deossiribosio deossiribosio

nucleotide: deossicitidina-5'-fosfato deossitim id ina-5' -fosfato

nucleoside: deossiadenosina deossiguanosina

base purinica: adenina (DNA) guanina (DNA)

H"'-. /H
N

H-{;JÒJ H
- HH
. OH,0 N H.OH,~ N N N/

i
OH OH
zucchero: deossiribosio deossiribosio

nucleotide: deossiadenosina-5'-fosfato deossiguanosina-5'-fosfato


~ 88-08-1 7890-0 2. Gli acidi nucleici trasmettono l'info rmazione genetica I 25

S' s·
adenina-deossiribosio-trifosfato
S'

~ OH
3'
\. DNA polimerasi

pirofosfato

G-G
l
p;•ofod,,..;

fosfato

S' S'

Fig ura 2.8


Sintesi enzimatica d i una catena di
DNA, catalizzata dalla DNA Poli-
merasi 1.
~ ri nucleotidici gli uni agli altri con un legame fosfodiesterico 3' ~5' (Figura
2.8). Inoltre, il polipeptide funziona solo in presenza di DNA necessario a di-
1
sporre i quattro nucleotidi nel prodotto polinucleotidico finale.
La DNA Pol 1 utilizza un filamento di DNA che agisce da stampo per deter-
- minare la sequenza del filamento che sta sintetizzand9 Questo venne dimo-
strato facendo agire lenzima in presenza di molecole di DNA che conteneva-
no diverse quantità di coppie di basi A:T e G:C. In ciascun caso, il prodotto
sintetizzato enzimaticamente aveva lo stesso rapporto di basi del DNA stam-
po (Tabella 2.1) . Durante questo processo di sintesi, non mediato da altri
componenti cellulari, non avveniva alcuna sintesi di proteine o di altre mole-
cole, il che eliminava così in maniera chiara la possibilità che qualche altro
componente cellulare, diverso dal DNA, fungesse da portatore intermedio di
specificità genetica. Non vi erano più dubbi, pertanto, che il DNA ricoprisse
il ruolo di stampo di se stesso per la propria sintesi.

Confronto tra la composizione d i basi del DNA sintetizzato enzimaticamente


abella 2.1 e del suo DNA st ampo
Composizio ne in basi A +T A+T
del prodotto enzimatico G+C G+ C

Sorgente del DNA stampo Adenina Timina Guanina Citosina Nel prodotto Nello stampo

Micrococcus 0, 15 0,15 0,35 0,35 0,41 0,39


lysodeikticus
(u n batterio)
Aerobacter aerogenes 0,22 0,22 0,28 0,28 0,80 0,82
(u n batte rio)
Esche rich ia coli 0,25 0,25 0,25 0,25 1,00 0,97
Timo d i vitello 0,29 0,28 0,21 0,22 1,32 1,35
Fago T2 0,32 0,32 0,1 8 0,1 8 1,78 1,84
26 J Parte prima • Chimica e genetica e sa-os-11s90-o

Evidenze sperimentali indicano che i filamenti del DNA


si separano durante la replicazione

Contemporaneamente agli studi di Kornberg, nel 1958 Macthew Meselson e


Frank W. Scahl, allora al California lnscicuce ofTechnology, condussero un
elegante esperimento in cui separarono le molecole neo-sinterizzare di DNA
e dimostrarono così che i due filamenti della doppia elica si separano defìni-
civamente l'uno dall'alcro durante la replicazione del DNA (Figura 2.9). Il lo-
ro successo fu in parte dovuco all'ucilizzo, come marcacore, dell'isocopo pe-
sante 15N per differenziare i filamenti parentali e i filamenti neo-sinterizzaci
di DNA. I bacceri che crescono su un cerreno di coltura contenente l'isotopo
15N hanno un DNA più pesante di quello dei bacceri che crescono in condi-

zioni normali, cioè con 14N. Al successo dell'esperimento contribuì, inoltre,


lo sviluppo di tecniche per la separazione del DNA pesante da quello leggero
mediante un gradiente di densità con sali pesanti, quali il cloruro di cesio.
Quando al gradiente viene applicata una forza centrifuga elevata, la soluzione

batteri in crescita in 15N; trasferimento crescita continua


tutto il DNA è pesante in medium con 14 N in medium con 14 N

il DNA isolato dalle cellule viene mischiato con una soluzione di CsCI
(6M, p (densità) - 1,7g/m/) e messo in ultracentrifuga

p = 1,80

~
'i
~
,I
I
I DNA ibrido
\ DNA
leggero 14
N- 15 N pesante

la soluzione è centrifugata a
140000 x g per - 48 ore

DNA
leggero p = 1,65
i•N_14N

DNA
ibrido
1sN_1•N

DNA
pesante p = 1,80
1sN_1sN
prima del una generazione due generaztoni
trasferimento cellulare dopo ce ulari dopo
Figura 2.9 in 14 N il trasferimento il uasfenmento
Uso del gradiente di densit à al cl oruro in 14N 1n .sN
di cesio (CsCI) per dimostrare la sepa-
razione dei filamenti complementari la localiuazione delle molecole d1 DNA ne a oro•ena da centrifuga
durante la replicazione del DNA. può essere determinata coro a uce u ·:o oleW3
e as-0a-17s90-0 2. Gli acidi nucleici trasmettono l'informazione genetica J 27
Figura 2.10
Tre possibili meccanismi per la replica-
zione del DNA. Quando fu scoperta la
struttura del DNA, vennero p roposti d i-
versi modelli per spiegarne la repl ica-
zione; nella figura ne sono mostrati tre.
l.'.esperimento di Meselson e Stahl fu in
grado di distinguere chiaramente tra
questi modelli, dimostrando che il
DNA si replicava in maniera semicon-
servativa.

dispersiva semiconservativa conservativa

diventa più densa verso il fondo della provetta (il punto più lontano dall'asse
di rotazione) . Una volta scel ta la corretta densità iniziale della soluzione, cia-
scuna molecola di DNA si muove verso la regione della provetta in cui la sua
densità è uguale a quella d ella soluzione salina. In tal modo, le m olecole di
DNA pesanti formano una banda ad una densità più alta (e perciò verso il
fo ndo della provetta) di quella delle molecole di DNA leggere. Se batteri con-
tenenti il DNA pesante vengono trasferiti in un terreno di coltura contenen-
te l' isoropo leggero (cioè 14N) e fatt i crescere, i precursori nucleotidici dispo-
nibili per la sintesi di D NA saranno leggeri; pertanto il DNA sintetizzato do-
po il trasferimento sarà distinguibile da quello sintetizzato prima del trasferi -
mento in base al suo peso.
Se la replicazione del D NA richiede la separazione dei filamenti, si possono fa-
re previsioni abbastanza precise sulla densità delle molecole di DNA ottenute
dopo diversi intervalli di crescita nel terreno cli coltura leggero. Dopo che i
batteri sono cresciuti per una generazione in terreno leggero, tutte le molecole
di DNA dovrebbero contenere un filamento pesante e uno leggero e, perciò,
dovrebbero avere una densità intermedia. Questo è proprio ciò che Meselson e
Stahl trovarono. Conseguentemente, dopo che i batteri crebbero per due ge-
nerazioni, metà delle moleco le di DNA erano leggere e metà ibride, proprio
come previsto dalla separazione dei filamenti. Fu così dimostrato che la repli-
cazione del DNA è un processo semiconservativo, in cui i singoli filamenti
della doppia elica parentale rimangono intatti (sono conservati) ed ognuno
viene distribuito in una defle due molecole figlie durante il processo replicati-
vo (ecco perché la replicazione è semiconservativa) . Questi esperimenti esclu-
sero altri due modelli proposti a quei tempi: la replicazione conservativa e
quella clistributiva o dispersiva (Figura 2. l O). Nel modello conservativo, si ipo-
tizzava che entrambi i filamenti parentali rimanessero insieme e che i due fila-
menti neo-sintetizzati avrebbero formaro una molecola di DNA interamente
nuova. In questo modello, il DNA leggero si sarebbe formato dopo solo una
generazio ne. Nel modello disrributivo, che ai tempi era il più accreditato, si
postulava che i filamenti di DNA venissero rotti ogni 10 coppie cli basi e uti-
lizzati successivamente per innescare la sintesi di regioni altrettanto corte di
DNA. Questi frammenti corti si sarebbero poi uniti per formare i filamenti
28 I Parte prima • Chimica e genetica e ss-0a-1 1a90-0

completi. Questo modello complesso avrebbe portato a filamenti contenenti


DNA sia vecchio che n uovo (e perciò non conservativo) e un DNA del tutto
leggero si sarebbe formato solo dopo parecchie generazioni di crescita.

I L'informazione genetica all'interno del DNA


viene trasmessa attraverso la sequenza
dei suoi quattro componenti nucleotidici

La scoperta della doppia elica pose fine alla diatriba sul facto che il DNA fosse
la sostanza genetica primaria. Anche nella fase precedente alla dimostrazione
della separazione dei filamenti durante la replicazione del DNA, la maggior
preoccupazione dei genetisti molecolari riguardava il modo in cui l'informa-
zione genetica del DNA potesse ordinare gli amminoacidi durante la sintesi
delle proteine. (vedi Box 2.2, Prova che i geni controllano la sequenza. amminoa-
cidica delle proteine). Dal momento che tutte le catene di DNA erano in grado
di formare doppie eliche, l essenza della loro specificità generica doveva per for-
za risiedere nelle sequenze lineari dei loro componenti nucleotidici. Ovvero, in
qualità di entità contenenti informazioni, le molecole di DNA d ovevano essere
considerate delle parole molto lunghe (ora, come vedremo più avanti, vengo-
no considerate delle frasi molto lunghe), formate da un alfabeto di quattro let-
tere (A, G, Ce T). Nonostante vi siano solo quattro lettere, il numero di se-
quenze di DNA possibili (4N dove N è il numero di lettere nella sequenza), è,
comunque, straordinariamente grande, anche per le molecole di DNA più pic-
cole; infatti può esistere un numero virtualmente infinito di m essaggi genetici.
Oggi, noi sappiamo che un tipico gene batterico è composto da circa 1000
coppie di basi. Il numero di possibili geni con queste dimensioni è 4 1000 ; questo
numero è dieci volte superiore a quello dei geni noti in qualunque organismo.

Il DNA non può essere lo stampo che ordina


direttamente gli amminoacidi durante la sintesi proteica

Sebbene il DNA portasse l'informazione per disporre gli amminoacidi in se-


quenza, era abbastanza chiaro che la doppia elica stessa non potesse svolgere il
ruolo di scampo per la sintesi proteica. Per escludere un ruolo diretto del
DNA, furono eseguiti esperimenti che dimostrarono che la sintesi proteica
poteva avvenire anche in assenza di DNA. lri tutte le cellule eucariotiche la
sintesi proteica avviene nel citoplasma, che risulta separato dal DNA cromo-
somico dalla membrana nucleare. Doveva esistere, quindi , una seconda mo-
lecola che contenesse sia l'informazione, sia la specificità genetica del DNA e
che potesse spostarsi nel citoplasma e svolgere il ruolo di stampo per la sinte-
si proteica. Di conseguenza si cominciò a considerare con attenzione la se-
conda classe di acidi nucleici, sino allo ra abbastanza sconosciuta dal punto di
vista funzionale: l'RNA. Torbjorn Caspersson e Jean Brachet avevano osser-
vato che !'RNA si trovava prin cipalmente nel citoplasma; era fac ile immagi-
nare, poi, che un singolo filamento di DNA, quando non serviva come stam-
po per il fi lamento complementare di DNA, potesse essere utilizzato come
stampo per una catena complementare di RNA.

L'RNA dal punto di vista chimico è molto simile al DNA

I..:analisi dell a struttura dell' RNA dim ostra che la ua incesi può avven ire a
partire da uno stampo di DNA. D al pun ro di vi ta chimico, esso è molto si-
e 88-08-17890-0 2. Gli acidi nucleici trasmettono l'informazione genetica I 29

Box2.2 Prova che i geni controllano la sequenza amminoacidica delle p roteine

La prima evidenza sperimentale che i geni (DNA) control- L'emoglobina di tipo selvatico (wild type) è formata da
lassero la sequenza degli amminoacidi derivò dagli studi due catene polipeptidiche: la catena a e la catena p (vedi
sull'emoglobina presente nei pazienti affetti da lla malat- Box 2.2 Figu ra 1). Ciascuna catena ha un peso molecola-
tia genetica anemia falciforme . Se un individuo porta, in re di circa 16 000 dalton. In ogni molecola di emoglobina
entrambi i cromosomi omologhi, l'allele S del gene per la ci sono due catene a e due catene P e il peso molecolare
P-globina (questo gene codifica per una del le due cate- comp lessivo è di circa 64 000 dalton. La catena a e la ca-
ne polipeptidiche che compongono l'emoglobina), svi- tena p sono cod ificate da due geni distinti, perciò una
luppa un'anemia grave, caratterizzata dalla presenza di singola mutazione può coinvolgere il pol ipeptide a o
globuli rossi a forma di falce. Se, invece, uno solo dei due quello p, ma non entramb i. Nel 1957, Vernon M. lngram,
alleli del gene per la P-globina è del tipo S, l'anem ia è all'Università di Cambridge, d imostrò che l'emoglobina
meno grave ed i globuli rossi hanno una forma quasi nor- falciforme differiva da ll'emog lobina normale per un solo
male. Perciò il tipo di emoglobina nei globuli rossi è cor- amminoacido nella catena P: l'acido glutammico, nor-
relato al contenuto genetico. Nel caso SS, l'emoglobina malmente presente nell'emoglobina wild type in posizio-
è anomala ed ha una solubilità diversa dall'emoglobina ne 6, era sostituito da una valina. Ad eccezione d i questa
normale, mentre nella condizione +S, metà dell'emoglo- singola sostituzione, il resto delle sequenze amminoaci-
bina è normale e l'altra metà è fa lciforme . diche dell'emoglobina normale e di quella mutata erano
identiche. Dato che questa sostituzione di amminoacido
si osservava solo nei pazienti con l'allele S, l'ipot esi p iù
semplice che ne derivò fu che l'allele S codificasse la mu-
~-globinaWT a-globinaWT ~-globinaS
oI l ) (j e I ) o I ) tazione del gene della p-globina. Studi successivi su lla
sequenza amminoacidica dell'emoglobina isolata da alt ri

l l l tipi di anemia confermarono pienamente questa afferma-


zione; l'analisi della sequenza dimostrò che ciascun tipo
di anemia è caratterizzato da una singola sostituzione
amminoacidica in un'unica posizione nella catena poli-
peptidica. (Box 2.2 Figura 2).

Box 2.2 •Figura 1 Formazione dell'emoglobina di t ipo


selvatico e di quella falciforme. (Fonte: illustrazione, lrving
globulo rosso globulo rosso Geis, copyright dell'Howard Hughes Medicai lnstitute. Non
normale falciforme riproducibile senza autorizzazione.)

amminoacido Val Leu Lys Glu Gly His Asp Arg amminoacido Val His Leu Glu Glu Glu His Val Glu His
Hbl Asp HbS Val
:e"'o
e
HbG Glu HbC Lys
O> Honolulu
o
E Hb
:e"'o San
HbG
e
-"'
~ Norfolk
Asp
José
Gly
-o O>
·~
HbM Tyr o Hb E Lys
Boston E
·~ ~
"'> HbG Qj HbM Tyr
Philadelphia Lys -o Saskatoon
+:
e
Hb
"'
·.:
Zurich
Arg
"'>
HbM Glu
Milwaukee-1
Box 2.2 • Figura 2 Riassunto di alcune sostituzioni
amminoacidiche rilevat e nelle varianti HbD
~ Punjab
Glu
dell'emoglobina umana.
30 I Parte prima • Chimica e genetica C> 88-08-17890-0

Figura 2.11
Una porzione di una catena poliribo-
nucleotidica (RNA). Gli elementi in ros-
so sono quelli diversi dal DNA. estremità 5'

I
o
Is·
0=1-0-C H 20
o
OH

o
guanina
,...H
N
I
H

OH"i x""'
o=!-o-t~: H °
""'
o 3'
0 N

OH
o
I
estremità 3 '

mile alDNAli~~,.infat~ un~ ~olecola l~nga ~on r~~ifì1cata~ co~te­


è. e
nenre quattro t'1p1 d1 nucleot1d1 unm da legami fosfod1estenc1 3 ~5 (Figu-
ra 2.11 ). Solo due diversi gruppi chimici lo disti ngyono dal DNA. Il prim o
è una m odificazio ne minore nella componente gl c1tlica' (figu ra 2. 12). Lo
zucchero del DNA è il deossiribosio, mentre quell o dell' RNA è il ribosio,
uguale al deossiribosio tranne che per la presenza di un gruppo supplemen-
tare OH (ossidrile). La second a differenza è che l'RNA non contiene tim i-
na, ma una pirimidi na mol to simile: l'uracile. Nonostante queste differenze,
i po liribonucleotidi hanno parimenti la possibilità di formare el iche com-
plementari come il DNA. N é il gruppo ossidri le aggiuntivo , né l'assenza del
gruppo metilico presente nella timina, ma non nell' uridina, impediscono al-
l'RNA di formare una strutrnra a doppia elica unita dall'appaiamento delle
basi. Tuttavia, al contrario del DNA, nel la cellula l'RNA si trova come m o-
leco la a singola elica. La formazione di doppie eliche di RNA, nella maggior
parre dei casi, è dovuta all'appaiamento di due porzioni complementa ri del-
la stessa mo lecola)
,.......

Il dogma centrale
Nell'aumnno del 1953 venne formulata l' ipotesi che il D A cromosomico
funziona d a stampo per le molecole di RNA che vengo no successivamente
trasportate nel citoplasma dove determ inano l'ord ine d egli a mminoacidi al-
ICI 66-08-1 7890-0 2. Gli acidi nucleici trasmettono l'informazione genet ica I 31

deossitimid ina uridina Figura 2.12


Differenze tra i nucleotidi del DNA e
dell' RNA. Un nucleotide del DNA vie-
t imina (DNA) uracile (RNA)
ne presentato accanto a quel lo del-
l'RNA. Tutti i nucleotid i dell'RNA con-
o tengono lo zucchero ribosio (mentre il
Il DNA contie ne il deossi ribosio), che

H
XNXH
I
s 1
possiede un gruppo ossidrile (o idros-
sile) sul carbonio 2 (in rosso). Inoltre,

H 4 2 l'RNA ha la base pirimid inica uracile al


3 posto della timina. Le altre tre basi so-
N O
no identiche nel DNA e nell'RNA.

o- OH2~ o I
OH
Q OH OH
deossiribosio ribosio

deossitimidina-5' -fosfato urid ina-5' -fosfato

l'interno delle proteine. Nel 1956, Francis Crick definì questo flusso d'infor-
mazione genetica il dogma centrale.

~ Trascrizione Traduzione
Duplicazione \JNA - RNA - Proteina

Le frecce indicano la direzione proposta per il trasferimento dell'informazio-


ne genetica. La freccia attorno al DNA evidenzia il fatto che il DNA è lo
stampo per la sua autoreplicazione. La freccia tra DNA e RNA indica che la
sintesi di RNA (trascrizione) è diretta da uno stampo di DNA. Allo stesso
modo, la sintesi delle proteine (traduzione) è diretta da uno stampo di RNA.
Ancora più importante è l'unidirezionalità delle ultime due frecce: ovvero la
sequenza dell'RNA non è mai determinata da uno stampo proteico, né si può
pensare che il DNA venga prodotto da uno stampo di RNA. Cidea che le
proteine non potessero fungere da stampo per !'RNA, ha retto nel tempo;
tuttavia, e lo vedremo nel Capitolo 11, le catene di RNA possono funzionare,
a volte, da stampo per catene di DNA con sequenze complementari. Tali in-
versioni di flusso dell'informazione sono, in ogni caso, eventi molto rari ri-
spetto al grandissimo numero di molecole di RNA sintetizzate a partire da
uno stampo di DNA. Il dogma centrale proclamato circa 50 anni fa rimane
comunque valido fino ai giorni nostri.

L'ipotesi dell'adattatore di Crick

Agli inizi, l'ipotesi più semplice e credibile fu che gli stampi di RNA per le
proteine potessero ripiegarsi e formare sulla loro superficie esterna delle cavi-
tà specifiche per i 20 amminoacidi.diversi. Queste cavità dovevano avere una
forma tale che solo un determinato amminoacido potesse occuparla, e in
questo modo l'RNA avrebbe fornito l'informazione per ordinare gli ammi-
noacidi durante la sintesi proteica. Nel 1955, però, Crick iniziò ad essere in
disaccordo con questo modello convenzionale, sostenendo che non poteva
funzionare. In primo luogo, i gruppi chimici specifici delle quattro basi del-
l'RNA (A, U, G e C) avrebbero dovuto interagire principalmente con gruppi
chimici solubili in acqua. Tuttavia, i gruppi atomici laterali propri di molti
amminoacidi (ad esempio, leucina, valina e fenilalanina) preferiscono di gran
32 IParte prima • Chimica e genetica e aa-OS-11a90.o

lunga l'interazione con gruppi insolubili in acqua (idrofobici). In secondo


luogo, anche se !'RNA avesse potuto ripiegarsi in qualche modo per esporre
delle superfici idrofobiche, sembrava piuttosto improbabile che lo stampo di
RNA potesse essere utilizzato per djscriminare accuratamente amminoacidi
con caratteristiche chimi che mol to simili, quali glicina e alanina o valina e
isoleucina, che differiscono solo per la presenza di un singolo gruppo metili-
co (CH 3). C rick, perciò, propose che, prima dell'incorporazione nelle protei-
ne, gli amminoacidi fossero attaccati a specifiche molecole adattatrici, le qua-
li, a loro volta, avevano delle superfici particolari in grado di legare in manie-
ra specifica le basi dell'RNA stampo.

La sintesi delle proteine in provetta

Per scoprire il modo in cui le proteine vengono sintetizzate si dovette aspetta-


re lo sviluppo di estrarti crudi (cell-free), in grado di esegllire tutci i passaggi ne-
cessari per la sintesi. Questi estratti vennero messi a punto da Paul C. Zamec-
nik e collaboratori agli inizi del 1953. Una chiave del loro successo, fu la di-
spon ibilità sia di amminoacidi marcati con isotopi radioattivi, usati per rileva-
re piccole quantità di proteine sintetizzate ex novo, sia di ultracentrifughe pre-
parativè, facili da usare, impiegate per il frazionamento degli estratti cellulari.
Figura 2.13 Già in precedenza il sito cellulare della sintesi proteica era stato individuato nei
Fotografia al microsopio elettronico
dei ribosomi attaccati al reticolo endo- riboso mi, piccoli organelli contenenti RNA e presenti nel citoplasma di tutte
plasmatico. Ouesta fotografia al micro- le cellule con un'efficiente sintesi proteica (Figura 2.13) .
scopio elettronico mostra una porzione Alcuni anni dopo, Zamecnick, che a quell'epoca collaborava con Mahlon B.
di una cellula pancreat ica. Nella parte H oagland, fece la storica scoperta che gli amminoacidi vengono uni ti alle
in alto a destra si osserva p arte di un
mitocondrio, mentre in basso a sinistra moleco le che oggi noi chiamiamo RNA transfer (tRNA) da una classe di en-
sono visibili molti ribosomi attaccat i al zimi denominati amminoacilsintetasi, prima della loro incorporazione nelle
reticolo endoplasmatico. Alcuni riboso- proteine. L'RNA transfer rappresenta circa il 10% di tutto l'RNA cellulare
mi sono li b eri nel citoplasma, mentre
altri sono attaccati alle membrane del
(Figura 2. 14).
reticolo endoplasmatico. (Fonte: per Questa scoperta giunse inaspettara per tutti, tranne che per C rick. Egli aveva
gentile concessione di K.R. Porter.) già proposto che questi "adattatori" potessero essere delle piccole molecole di
RNA, dal momento che le loro basi avrebbero dovuto appaiarsi con i nucleoti-
di appropriati delle molecole di RNA che servivano da stampo per la sintesi
delle proteine. Come vedremo in seguito e in modo più dettagliato (Capitolo
14), le molecole di RNA transfer di Zamecnik e Hoagland sono, di fatto, le
molecole adattatrici postulate da Crick. Ogni Rl;JA transfer contiene una se-
quenza dj basi adiacenti (l'ancicodone) che si lega in maniera specifica a gruppi
di basi contigue (codoni) lungo lo stampo di RNA durante la sintesi proteica.

Il paradosso dei ribosomi non specifici

Circa 1'85% dell'RNA cellulare si trova nei ribosomi e dato che il loro numero
aum enta notevolmente nelle cellule che hanno un'intensa attività di sintesi
proteica (ad esempio le cellule del fegato e del pancreas e i batteri in rapida cre-
scita), si pensò iruzialmente che !'RNA ribosomiale (rRNA) fosse lo stampo
per ordinare gli amminoacidi. Ma una volta che i ribosomi di E. coli vennero
analizzati, ne em ersero alcune caratteristiche critiche. In primo luogo, sia i ri-
bosomi di E.coli, sia quell i derivati da altri organismi, sono composti da due
subunità di dimensioni differenti, ciascuna delle quali conciene RNA, e queste
subunità possono rimanere unite o separarsi in man iera reversibile, a seconda
della concentrazione ionica circostante. Tutte le catene di rRNA all'interno
delle subunità minori hanno, poi, una lunghezza simile (circa 1500 basi in
E. coli) così com'è simile la lunghezza delle catene di rRNA delle subunità m ag-
giori. Infine, la composizione in basi dell 'rRNA di entrambe le subunità è più
o meno la stessa (ricca di G e C) in tutti i batteri conosciuti, nelle piante o ne-
gli animali, nonostante vi siano grandi variazio ni del rapporto AT/GC nei lo-
e 88-08-, 7890-o 2. Gli acidi nucleici trasmettono l'informazione genetica I 33

ro rispettivi D NA. Queste caratteristiche non erano previste dal modello in 3'
cui le carene di rRNA dovevano rappresentare un'ampia gamma di diversi
scampi di RNA prodocti da un numero elevaro di geni diversi. Le due classi di A
rRNA (maggiore e minore) non pocevano percanro fungere da scampo.

La scoperta dell'RNA messaggero (mRNA)

Le cellule infettare con il fago T4 fornirono il sistema ideale per trovare il vero
scampo. In seguiro all 'infezione di quesro virus, le cellule di E.coli cessano di
sintetizzare il proprio RNA e l' unico RNA sintetizzaro viene trascritto dal
DNA del fago T4. Inoltre, !' RNA fagico, non solo ha una composizione di ba-
si del cucco simile al D NA del fago stesso, ma non si lega alle proteine riboso-
miali che normalmente si associano all'rRNA per formare i ribosomi. D opo
essersi legaro ai ribosomi preesistenti, !'RNA del fago T4 si muove invece sul-
la loro superficie, in modo tale da esporre le proprie basi per l'appaiamento de-
gli amminoacil-cRNA precursori per la sintesi p roteica (Figura 2.15) . In tal
modo, !'RNA del fago organizza gli amminoacidi e rappresenta lo stam o di mRNA 3'1 O C G==:J S'
RNA er la sintesi_Eroceica 1 così a lungo cercaro. Esso viene chiamaro RN~ L__J
codone
messa ero mRNA dato che trasporca l'informazione DNA ai siti ribo-
somi i per la sintesi proteica. Losservazione che !'RNA del fago T4 si lega ai Figura 2.14
ribosomi di E.coli venne fatta nella primavera del 1960, e subiro dopo furono Struttura del tRNA per l'alanina di lie-
ottenuti i risultati che dimostravano l'esistenza di una classe separata di RNA vito, determinata da Robert W. Holley
messaggeri all'i nterno di cellule di E.coli non infetta te, e quesro escluse defini- e colleghi. L'anticodone in questo
tRNA riconosce il codone per l'alanina
tivamente il ruolo dell'rRNA come stampo. Discuceremo in maniera più ap- nell'mRNA. Nella struttura esistono al-
profondita nel Capirolo 14 il modo in cui la componente di rRNA dei ribo- cune modificazioni dei nucleosidi 1!f=
somi, insieme a circa 50 diverse proceine ribosomiali ad essa legate, agisca da pseudouridina, T = ribotimina,
DHU=S,6 diidrouridina, I= inosina,
m 1G=1 -metil-guanosina, m 1 = 1-metili-
nosina e m2G= N,N-dimetilguanosina.
DNA

mRNA
3'

mRNA
S' 3'

Figura 2.15
Trascrizione e traduzione. I nucleotidi
precursori dell'mRNA vengono assem-
blati per formare una copia comple-
mentare di un filamento di DNA. Cia-
scun gruppo di tre rappresenta un co-
done, complementare ad una tripletta
di nucleotidi nella reg ione dell'antico-
done di una molecola d i t RNA specifi-
ca. Quando awiene l'appaiamento d i
basi, un amminoacido portato all'estre-
m ità opposta della molecola di tRNA
catena polipeptidica viene aggiunto alla catena proteica na-
in crescita in arri vo scente.
34 I Parte prima • Chimica e genetica e 68-08-11s90-0

Figura 2.16 rilascio


Schema di un poliribosoma. Ciascun ri- del polipeptide
bosoma si attacca a un segnale di inizio
all'estremità S' d i una catena di mRNA
rompi•~
e compie la sint esi di un polipeptide
spost andosi lungo la molecola. Molti ri-
bosomi si possono attaccare contem-
poraneamente ad una molecola d i polipeptide
mRNA; questa struttura è chiamata po- in crescita
ribosoma
liribosoma.

rilascio
delle subunità
ribosomali

sito in cui avviene la sintesi proteica, mediante l'assemblaggio degli amminoa-


cil-tRNA precursori in specifiche posizioni del ribosoma dove essi possano
leggere e interpretare l'informazione portata dagli stampi di RNA messaggero.
ì Solo il 4% circa dell'RNA totale di una cellula è rappresentato dall'mRNA.
Questo RNA ha una lunghezza variabile a seconda del polipeptide che codi-
fica. Di conseguenza, è facile capire come questa classe di RNA fosse poco
considerata all' inizio. Dato che solo un piccolo segmento di mRNA è legato
al ribosoma in un preciso momento, una singola molecola di mRNA può es-

I
sere letta contemporaneamente da più ribosomi. La maggior parte dei ribo-
som i, infatti, si trova come singole componenti di poliribosomi (gruppi di ri-
bosomi che traducono lo stesso mRNA) che ne possono includere più di 50
unità (Figura 2.16). .

La sintesi enzimatica dell'RNA su uno stampo di DNA

Mentre si scopriva !'RNA messaggero, i biochimici Jerard Hurwitz e Sam B.


Weiss isolarono in maniera indipendente il primo degli enzimi in grado di
trascrivere !'RNA a partire da uno stampo di DNA. Questi enzimi, chiamati
RNA polimerasi, fun zionano solo in presenza di DNA, che funge da stampo
su cui si formano le catene a singolo filamento di RNA, utilizzando come
precursori i nucleotidi ATP, GTP, CTP e UTP (Figura 2.1 7 . ei bacteri , lo
r

sito d i aggiunta del nucleotide


al filamento di RNA in crescita

Figura 2.1 7
Sintesi enzimatica di RNA su uno
stampo di DNA, catalizzata dalla RNA 5'
polimerasi.
~ 7890-0 2. Gli acidi nucleici trasmettono l'informazione genetica I 35

Confronto tra la composizione di basi dell'RNA sintetizzato e del suo


Tabella 2.2 DNA stampo a doppia elica
Composizione in basi A+U A + T
d ell'RNA G+ C G+C

o-igine del DNA st ampo Adenina Uracile G uanina Citosina Osservata Nel DNA

12 0,31 0,34 0,18 0,17 1,86 1,84


, - mo di vitello 0,31 0,29 0,1 9 0,21 1,50 1,35
1
1
' =.st:.herichia coli 0,24 0,24 0,26 0,26 0,92 0,97
'.' crococcus /ysodeikticus 0,17 0,16 0,33 0,34 0,49 0,39
(un batterio)

stesso enzima produce ciascuna delle classi maggiori di RNA (ribosomiale,


rransfer e messaggero), usando appropriati segmenti di DNA cromosomico
come stampi. L'evidenza diretta che il DNA allinea correttamente i precurso-
ri ribonucleotidici derivò d~ll' osservazione del modo in cui la composizione
di basi dell'RNA variava a seconda dell'aggiunta di molecole di DNA aventi
rapporti diversi di AT/GC. In ogn i sintesi enzimatica il rapporto AU/GC
dell'RNA era del tutto simile a quello AT/GC del DNA (Tabella 2.2).
- olo uno dei due filamenti di DNA viene usato come stampo per produrre
l'RNA durante la trascrizione. Questo è logico, dato che i messaggi portati
dai due filamenti sono complementari, ma non identici e perciò codificano
per due polipeptidi diversi. La sintesi dell'RNA procede sempre in una sola
direzione, inizia cioè all'estremità 5' e finisce con il nucleotide ali' estremità 3'
-(vedi la Figura 2.17).
Da quel momento, furono ottenuti notevoli risultati che confermarono il
movimento dell'RNA dal nucleo, contenente il DNA, al citoplasma, conte-
nente i ribosom i. L'mRNA sintetizzato durante un breve lasso di tempo viene
marcato esponendo per poco tempo le cellule a precursori marcati con isoto-
pi radioattivi, e successivamente viene aggiunto un grande eccesso di ammi-
noacidi non marcaci (un esperimento di pulse-chase) . Questi esperimenti mo-
strarono che I'mRNA è sintetizzato nel nucleo. Entro un'ora la maggior parte
di guesc2 RNA lascia il nucleo e si ritrova nel citoplasma (Figura 2.18).

La determinazione del codice genetico


Figura 2.18
Dato che ci sono 20 amminoacidi, ma solo quattro basi, i nucleotidi possono Dimostrazione che l' RNA è sintetizzato
specificare un amminoacido solo se presi a gruppi. I gruppi di due nucleotidi, nel nucleo e si sposta nel cit oplasma.
però, ne possono specificare.solo 16 (4 X 4). Così, a partire dal 1954, si co- (a) Autoradiografia di una cellula (Te-
minciò a pensare seriamente a come potesse essere il codice genetico e ci si fo- trahymena) esposta a citidina radioattiva
per 15 minuti, cui è stata sovrapposta la
calizzò sul modo in cui le triplette (gruppi di tre nucleotidi) potessero fun- fotografia d i una sezione sottile della
zionare, anche se, di fatto, esse fornivano più permutazioni (4 X 4 X 4) di cellula. Ogni macchia scura rappresenta
quelle richieste nel caso in cui ciascun amminoacido fosse specificato da una il segnale d i un elettrone emesso da un
singola tripletta. Il presupposto che esistesse colinearicà, era la sequenza del- atomo di 3H (trizio) incorporato nel-
l'RNA. Q uasi tutto l'RNA sintetizzato ex
l'mRNA e la sequenza amminoacidica, era, pertanto, molto importante. Ne novo sta nel nucleo. (b) Autoradiografia
conseguiva che gruppi successivi di nucleotidi, lungo la catena di DNA, co- di una cellula analoga, esposta a citid ina
dificassero per l'amminoacido contiguo, lungo la catena polipeptidica. Il fat- radioattiva per 12 minuti e quindi lascia-
ta crescere per 88 minuti in presenza di
to che dovesse esserci colinearità fu dimostrato in un elegante esperimento di
citidina non radioattiva. Tutto il materiale
analisi mutazionale su proteine batteriche, da Charles Yanofsky e Sydney marcato, incorporato nell'RNA nei primi
Brenner nei primi anni '60. Le analisi genetiche di Brenner e Crick furono al- 12 minuti, ha lasciato il nucleo e si è spo-
trettanto importanti e, nel 1961, stabilirono che gruppi di tre nucleotidi era- stato nel citoplasma. (Fonte: per gentile
concessione d i D.M. Prescott, Università
no utili.zzati per specificare i singoli amminoacidi. della Colorado M edicai School; ripro-
Ma quali specifici amminoacidi corrispondessero a gruppi specifici di tre ba- dotta dal 1964 Progr. Nuc/eic Acid Res.
si (codoni) fu rivelato solo con esperimenti biochimici. La scoperta più im- lii: 35, usata con a·utorizzazione.)
36 I Parte prima • Chimica e genetica e sa-0a-1 1s90-o

Tabella 2.3 li codice genetico

uuu ucu UAU


Tyr
UGU
Cys
Phe
uuc ucc UAC UGC
Ser
UUA
Leu
UCA mm stop mm stop
UUG UCG ml stop UGG Trp

cuu ccu CAU CGU


His
cuc ccc CAC CGC
(])
e
o
CUA
Leu
CCA
Pro
CAA CGA
Arg . ....
~
·;::; Gin N
CUG CCG CAG CGG
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E AGU 5·
"& Asn Ser :i
AUC Ile ACC AAC AGC (Q

Thr
AUA ACA AAA AGA
Lys Arg
AUG Met ACG AAG AGG

GUU GCU GAU GGU


Asp
GUC GCC GAC GGC
Va l Ala Gly
GUA GCA GAA GAA
GAG Glu GGG
GUG GCG

portante venne da Marshall N irenberg e H einrich Matthaei. Nel 1961 , lavo-


rando insieme, questi ricercatori osservarono che l'aggiunta di un polinu-
cleocide sintetico poli U (UUUUUU . .. ) ad un estratto crudo in grado di sin-
terizzare proteine generava una carena polipeptidica contenente esclusiva-
mente l'amminoacido fenilalanina. Il gruppo nucleotidico UUU doveva, per-
ciò, speci ficare la fenilalanina. L utilizzo di polinucleotidi definiti, sempre più
complessi, come RNA messaggeri, portò rapidamente all'identificazione di
un sempre maggior numero di codoni. Particolarmente impo rtante per il
completamento del codice fu l'utilizzo di polinucleotidi tipo AGUAGU, rea-
lizzato dal chimico organico H ar Gobirid Khorana. Tali polinucleotid i pre-
definiti furono estremamente utili per determinare la sequenza di alcuni co-
doni. Nel 1966, il completamento del codice mostrò che 6 1 sui 64 possibili
gruppi di permutazione corrispondevano ad amminoacidi e che la maggior
parte di essi era codificata da più di una tripletta di nucleotidi (Tabella 2.3).

I La determinazione della d irezione


della sintesi proteica
La nacura del cod ice generico, una volta decerminaco, portò alla domanda
successiva: come una catena poli nucleotid ica diriga la sintesi di un polipepti-
de. Come abbiamo già visco, e ne discuteremo in maniera più approfondita
nel Capitolo 6, le catene polinucleotidiche (sia del D NA che dell'RNA) sono
sintetizzate in direzione 5' -73'. ~ome rocede la aj ntesi di una carena eo-
e aa-0a-1 1a90-0 2. Gli acidi nucleici trasmettono l'informazione genetica I 37

li e ridica? Viene assemblata dal terminale amminico a q_uello ca.rbossiliçQQ


viceversa?
L a rispostà a questa domanda si ottenne da un esperimento classico in cui la
sintesi proteica venne eseguita in un esuatto crudo. Questo sistema fu svi lup-
pato utilizzando un estratto di globuli rossi immaturi (i reticolociti) di coni-
glio; tali cellule, infatti, producono in modo molto efficiente le catene a e ~
dell'emoglobina. Ali' estratto crudo vennero aggiunti amminoacidi radioatti-
vi per pochi secondi (meno del tempo necessario per sinterizzare una catena
completa della globina) e la sintesi proteica venne immediatamente interrot-
ta. Una marcatura così breve è nota come pulse o pulse-labeling. Dopo la
sintesi, le catene di globina, che avevano completato il loro allungamento du-
rante il periodo di pulse-labeling, vennero separate dalle catene incomplete
tramite elettroforesi su gel (Capitolo 20). I polipeptidi completi (jùll length)
vennero poi trattaci con un enzima, la proteasi tripsina, che taglia la proteina
in punti particolari della catena polipeptidica, generando una serie di fram-
menti peptidici. Nella fase finale dell'esperimento, fu misuraca la radioattivi-
tà incorporata in ciascun frammento generato per proteolisi dalla tripsina (Fi-
gura 2.19). Bisogna tener presence che, durante il periodo del pulse, le carene
amminoacidiche delle globine presenti nell'estratto avevano lunghezze diver-
se (Figura 2 . l 9a) . Conseguentemente, le catene neo-sintetizzate non poteva-
no aver completato la sintesi durante il periodo di pulse, perché il tempo del
trattamento era inferiore a quello necessario per la sintesi completa di una ca-
tena. Per contro, le catene prossime alla fine della sintesi potevano essere
completate durante il pulse. Ne conseguiva, pertanto, che i peptidi generati
dalla digestione con tripsina contenenti la minor quantità di amminoacidi
marcati (dopo normalizzazione per la dimensione del peptide) dovevano de-
rivare da regioni della proteina che erano state sintetizzate per prime. Al con-
trario, i peptidi con la maggior quantità di radioattività dovevano derivare da
regioni della proteina sincecizzace per ultime. Il risultato di questo esperi-
mento è mostrato in Figura 2. l 9b. Si vede, infatti, che la radioattività mino-



"".te>
'B • Figura 2.19
Incorporazione di materia le radioatti-
"'o
'6
~
• vo in una catena polipeptidica nascen-
te. I dettagli dell'esperim ento sono
spiegati nel testo .
• (a) Distribuzione del materiale radioat-
ti vo (in blu) nelle catene complete do-
• po una marcatura breve .
(b) Grafico della distribuzione del ma-
teriale rad iottivo come funzione della
COOH posizione del peptide marcato all'inter-
posizione del peptide no della cat ena completa.
38 / Parte prima • Chimica e genetica Cl 88-08-17890-0

re è contenuta nei peptidi più amminoterminali, mentre quella maggiore è


presente nei peptidi derivaci dalla regione carbossirerminale. La conclusione,
quindi, è che la direzione della sintesi proteica è dall'amminoterminale al car-
bossiterminale. In altre Earole, il primo amminoacido ad essere incor orato
nella nascente ca rena polipeptidica durante la sintesi proteica è quello al
~cremicaamminica, men ere l'ultimo è quello alJ'esrremirà carbo~siJjg. -

I segnali di inizio e di terminazione (stop) sono anch'essi


codificati nel DNA
Inizialmente si pensava che la traduzione di una molecola di mRNA comin-
ciasse ad una esrremirà e finisse quando l'intero messaggio deJJ'mRNA fosse
stato tradotto in amminoacidi. Di fatto, però, la traduzione inizia e finisce in
posizioni interne ali' RNA messaggero. Perciò devono esistere segnali di inizio
e di terminazione della traduzione all'interno del DNA (e nel suo prodorro,
l'mRNA). _!!primo segn~e ad essere riconosciuto fu quello d~ stop ~ermina­
zione). Tre codoni'Cliversi (UM, UAG e UGA), conosciuti come codoni
nonsense, ~On Stabiliscono l'aggiunta di aJcun amminoacido AJ~o ntrario7
questi codoni funzionano da segnali di sr~_per la traduzione (qualche volta
v engono chiamaci codoni di stop) . Il modo in cui il segnale d'i nizio viene c~­
difìcaro è un po' più complesso. L'amminoacidO metionina si trova all'inizio
d1 tutte e catehe polipeptidiche, ma la tripletta (AUG), che determina questa
metionina iniziale, codifica anche per le mecionine interne. I codoni AUG
da cui cominciano le catene polipeptidiche, sono P-!!ceduti da !!!!_grup_po di
nucleotidi ricchi di purine, che serve per l'aggancio dell'mRNA_ai ribosomi
- (vedi il Capi rolo 14).

I L' era della genomica


In seguito all'enunciazione del dogma centrale, a metà degli anni '60 fu ab-
bastanza chiaro come la mappa genetica contenuta nella sequenza nucleoti-
dica potesse determinare il fenotipo. Ciò significava che una comprensione
profonda della natura degli esseri viventi e della loro evoluzione poteva essere
ottenuta anraverso la sequenza del DNA. In anni più recenti, lo sviluppo di
metodi per il sequenziamento rapido ed automatico del DNA ha portato al
completamento della sequenza dei genomi di una grande varietà di organi-
smi. Anche il genoma umano, di cui un singolo esemplare è composro da ere
miliardi di coppie di basi, è stato sequenziaco e sembra contenere più di
30 000 geni. Negli anni a venire saranno disponibili molci più genomi com-
pletamente sequenziati, appartenenti ad un largo ventaglio di organismi, com-
presi i pioppi, le spugne, le meduse, i crostacei, i ricci di mare, le rane e i cani.
In futuro, sarà possibile estendere l'interpretazione delle sequenze dei geno-
mi al di là dell'identificazione dei geni e delle proteine da loro codificare. Al-
tre classi di sequenze di DNA regolano la replicazione,_l'appaiamento dei
cromosomi, la ricombinazione e la regolazione dei geni. E possibile immagi-
nare che un giorno l'analisi comparativa delle sequenze del DNA porterà alla
comprensione dei meccanismi alla base dei comportamenti complessi dell'es-
sere umano, come l'acquisizione del linguaggio, e della diversità evolutiva de-
gli esseri viventi.
Lo scopo di questi capitoli introduttivi è di fornire solide basi per capire co-
me il DNA funzioni da stampo per la complessità biologica. I restanti capi-
toli della Parte 1 passano in rassegna i principi base di chimica e biologia, im-
portanti per i temi principali trattati in questo libro. La Parte 2 (La manuten-
zione del genoma) descrive la struttura del materiale genetico e la sua fedele
2. Gli acidi nucleici trasmettono l'informazione genetica I 39

--? licaz..ione. La Pane 3 (L'espressione del genoma) mostra come le istruzioni


-·enure nel O A siano convertite in proteine. La Parte 4 (La regolazione)
:lve le trategie per l'attività differenziale dei geni, utilizzate per generare
.:omples ità all ' interno degli organism i (ad esempio, l'embriogenesi) e la
"e4iL1 era gli organismi (ad esempio, l'evoluzione). Infine, la Parte 5 (I me-
. des rive le varie tecniche di laboracorio, gli approcci bioinformatici e i
~-ru modello comunemente utilizzati nella ricerca biologica.

Sommario
h. ·operra che il DNA è il materiale generico viene fatta scuna doppia elica si separano durame ogni ciclo di replica-
re agli esperi menti di Griffich, il quale dimosrrò che i zione del DNA e (b) dalla scoperta da parre di Kornberg di
- _pi non virulenti di ba n eri porevan o essere uasformari un enzima che usa un singolo filamento d i DNA come
=- eticamente mediante una sosranza derivata da un ceppo scampo per la sintesi di un filame nto complementare.
=~eno ucciso col calore. Avery, McCarry e MacLeod di- Abbia mo visto che, secondo il dogma cemrale, l'informa-
uarono, in seguito, che la sostanza rrasformanre era il zione Auisce dal DNA, all'RNA ed alle proteine. Quesra
D.·.\. Ulrerio ri prove che il DNA fosse il mareriale generi- rrasformazione avviene in due scadi. Primo, il D NA viene
- aeri\•arono dagli esperimenti con i baneriofagi marcaci era.serino in un RNA intermedio (!'RNA messaggero) e, se-
Her hey e C hase. G razie alla regola di C hargaff e agli condo, !'RNA viene rradorco in proteine. La traduzione
a.di cli diffrazio ne ai raggi X di FrankJin e Willci ns, War- dell'mRNA richiede molecole adarracrici di RNA, chiamare
son e Crick proposero la srrunura a doppia el ica del D NA. cRNA. La caratteristica fondamentale del codice generico è
In questo modello due carene polinucleoridiche anciparal- che ogni codone triplerra viene riconosciuto da un singolo
fde sono avvolre una artorno all'altra a fo rmare· una doppia cRNA, che si associa con un amminoacido corrispondente.
dica regolare. Le due carene all' interno della doppia elica Di 64 codoni possibili (4 X 4 X 4), 6 1 sono utilizzaci per
no unire mediante legami idrogeno rra coppie cli basi. specificare i 20 amminoacidi che cosricuiscono le proteine,
Ladenina si associa semp re con la cimina e la guanina con mentre 3 vengono usaci come segnali di terminazione. La
..i cirosina. L:esisrenza dell'accoppia.memo delle basi signi- conoscenza del codice genetico ci permene di prevedere la
-ca che la sequenza dei nucleotidi lungo le d ue carene non sequenza d i una proteina dalla sequenza del suo DNA co-
e idemica, ma complementare. La scoperca d i questa rel a- dificante. Lo sviluppo dei metodi cli sequenziamento rapi-
zione uggerì un meccanismo d i replicazione del DNA in do del DNA ha aperto la nuova era della genomica, in cui
cui ogni filamento funziona da scampo per il suo comple- vengono (e verranno) determinare le sequenze genomiche
mentare. La dimosrrazio ne d i questa iporesi derivò (a) dal- compiere di un numero sempre cresceme di organism i, in-
ro erva.zione cli Meselson e Srahl che i due fi lamenti di eia- cluso l' uomo.

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(}PITOLO
Limportanza dei legami
deboli nelle interazioni
fra molecole

e macromolecole prevalentemente trattate in questo volume, cioè quelle • Caratteristiche dei


che maggiormente interessano i biologi, sono le proteine e gli acidi nu- legami chimici
cleici. Queste sono costituite, rispettivamente, da ammin oacidi e nu-
• Il concetto di energia
eoridi. In entrambi i casi, i precursori sono unici da legami covalenti a for-
libera
mare catene polipeptidiche (le proteine) e polinucleotidiche (gli acidi nu-
cleici). I legami covalenti sono legami forti, stabili, che nei sistemi biologici • I legami deboli nei
'ffic ilmente si rompono spontaneamente. Esistono, inoltre, legami più de- sistemi biologici
~li , che sono essenziali per la vita della cellula, in parre perché possono es-
-~re formati o eliminaci in condizioni fisiologiche. I legami deboli mediano
!'interazione fra gli enzimi e i loro substrati e fra le m'1:cromolecole in gene-
rale, per esempio fra le proteine e il DNA o fra le proteine ed al ere proteine,
come vedremo nei capitoli successivi. Ugualmente imporranti sono i legami
deboli che mediano le interazioni fra diverse parti della stessa macromoleco-
la. determinandone così la struttura e, quindi, la loro funzione biologica.
Perciò, sebbene una proteina sia formata da una catena lin eare di amminoa-
cidi covalentemente legati, la sua forma e funzione sono determ inare dalla
suuccura spaziale da essa adottata. Tale struttura è determinata dal gran nu-
mero di legami deboli che si formano fra gli amminoacidi. Analogamente
accade per i legami non covalenti che tengono unite le due catene nucleoti-
diche del DNA.
In questo capitolo considereremo la natura dei legami chim ici, in particolar
modo quei legami deboli essenziali per un corretto funzionam ento delle
macromolecole biologiche. In particolare, cercheremo di descrivere quali
o no le forze ch e permettono la formazione dei legami deboli. Essi inclu-
dono i legami di van der Waals, i legami idrofobici, i legami idrogeno e
q uelli ionici.

I Caratteristiche dei legami chimici


Un legame chimico rappresenta una forza d'attrazione che tiene uniti gli aro-
mi. Aggregati atom ici di dimensioni definite vengono chiamati molecole.
Originariamente si pensava che soltanto i legami covalenti potessero tenere
uniti gli atomi per formare le molecole; in seguito, è staro visto che le forze
attrattive deboli sono molto imporranti per la formazione di complessi costi-
tuiti da più macromolecole. Per esempio, le quattro subunità che compongo-
no l'emoglobina sono tenute insieme dall'azione combinata di alcuni legami
deboli. Comunque è ora consuetudine definire come legami chimici le inte-
razioni deboli anche non sufficientemente forti, quando prese singolarmente,
da legare stabilmente tra loro due aromi.
I legami chimici possono essere definiti in modi diversi. Un'evidente caratte-
ristica del legame è la sua forza. I legami forti non vengono quasi mai distrut-
ti alle temperature fisiologiche. Questa è la ragione per cui gli aromi uniti da
legami covalenti fanno sempre parte di un' unica molecola. I legami deboli
vengono rotti facilmente ed hanno una vira molto breve se il loro numero è
42 I Parte prima • Chimica e genetica 0 88-08-17890·0

Figura 3.1 a b e
Rotazione attorno al legame CS-C6
del glucosio. Questo legame carbonio· H
carbonio è un legame singolo e può H, I _...... OH
permettere le tre configurazioni (a), (b) e
o (c). I

HO
k~~H OH
o
e-
H
L
e OH
I I
H OH

esiguo. Questi legami diventano stabili soltanto quando sono numerosi e di-
sposti in gruppi ordinati. La fo~a di un legame è inversamente proporziona-
le alla sua lunghezza, così che due ato mi uniti da legami forti sono sempre
più vicini degli stessi atomi tenuti insieme da legami deboli. Per esempio, due
aromi di idrogeno legati da un legame covalente, per formare una molecola
di idrogeno (H:H), sono distanti 0,74 A, mentre gli stessi due aromi tenuti
insieme da forze di van der Waals sono distanti 1,2 A.
Un'altra importante caratteristica è il numero massimo di legami che un dato
aromo può formare. Q uesro numero è chiamaro valenza. I.:oss igeno, per
esempio, ha una valenza di due e non può formare più di due legami cova-
lenti. Esiste una variabilità più ampia nel caso dei legami di van der Waals,
per i quali il fatto re limitante è puramente sterico. Infatti, il numero di lega-
mi possibili è limitato soltanto dal numero degli atomi che possiedo no una
disposizione nello spazio tale da poter interagire simultaneam ente. La forma-
zione di legami idrogeno, invece, è soggetta ad un maggior numero di restri-
zioni. Un aromo di idrogeno covalentemente legaro ad un altro aromo nor-
malmente partecipa alla formazione di un solo legame idrogeno, mentre un
atomo di ossigeno può partecipare alla formazione di legami idrogeno in nu-
mero anche superiore a due.
I.: angolo che si forma fra due legami convergenti su un singolo aromo è chia-
mato angolo di legame. I.:angolo fra due legami covalenti è approssimativa-
mente sempre lo stesso, come ad esempio nel caso in cui un aromo di carbo-
o nio forma quattro legami covalenti, nel metano, con una disposizione tetrae-
Il drica (angolo di legam e = 109°). Al contrario, gli angoli formati dai legami
-..... _,...e deboli posso no essere molto più variabili.
N
I I legami differiscono anche per la loro libertà di rotazione: i legami covalen-
H
ti singoli permettono una libera rotazione dei due atomi legati (Figura 3.1),
mentre i legami doppi o tripli sono molto rigidi. Anche le m olecole che pre-
sentano doppi legam i parziali, come il legame peptidico, sono caratterizzare
da una certa rigidità. Per questa ragione, il gruppo carbonilico (C = O) e
Figura 3.2 quello imminico (N = C), uniti dal legame peptidico, sono su uno stesso pia-
La forma planare del legame peptidi- no (Figura 3.2). I legami ionici più deboli, invece, non impongono restrizio-
co. Nella figura è mostrat a parte di una
catena polipeptidica. Attorno al lega-
ni nell'orientamento negli atomi legati .
me peptidico non è possibile alcun ti-
po di rotazione, poiché esso ha la ca-
ratte ristica di essere un parziale doppio I legami chimici possono essere spiegati in termini di
legame (vedi il disegno intermedio).
Tutti gli atomi presenti nell'area om- meccanica quantistica
breggiata devono trovarsi su uno stes-
so piano. Una rotazio ne è comunque La natura delle fo rze, sia forti che deboli, che permette la formazione di lega-
possibile attorno ai due rimanenti lega-
m i rappresentò un mistero per i chimici fìno a quando venne sviluppata, nel
mi che sono presenti nel peptide. (Fon-
te: adattata da Pauling L. 1960. The na- 1920, la teoria quantistica dell'atomo (meccanica quantistica). Dopo questa
ture of the chemical band and the d ata, le varie leggi empiriche sui legami chimici furono riformulate su basi
structure of molecules and crystals: an teoriche e permisero di asserire che rutti i legami chimici, sia deboli che fo rti,
introduction to modem structural che-
m istry, 3• edizione, p . 495. Copyright
sono basati su forze elettrostatiche. La meccanica quantistica ha permesso di
© 1960 Cornell University. Riprodotta spiegare il fatto che i legami covalenti si formano mediante la condivisione di
con l'autorizzazione dell'editore.) elettroni e può alrresì spiegare la formaz ione dei legami deboli.
e ss.os-11s90-0 3. L'importanza dei legami deboli nelle interazioni fra molecole I 43

La formazione dei le~ami chimici implica cambiamenti


della forma di energia
La formazione spontanea del legame fra due atomi implica sempre il rilascio
di parte dell'energia interna, contenura negli atomi non legati, e la sua con-
versione in una diversa forma di energia. Più forte è il legam e, maggiore è la
quantità di energia ceduta durante la sua formazione. La formazione di un le-
game fra i due aromi A e B può essere descritta nel modo seguente

A + B ~ AB + energia [Equazione 3.1)

dove AB rappresenta i due atomi legati. La velocità della reazione è diretta-


mente proporzionale alla frequenza delle collisioni fra A e B. runirà più fre-
quentemente utilizzata per misurare l'energia è la caloria, cioè la quantità di
energia richiesta per portare la temperatura di un grammo di acqua da 14,5
a 15,5 °C. Poiché la rom.ira di una mole di legami chimici normalmente co-
involge migliaia di calorie, nella maggior parte dei casi i cambiamenti ener-
getici che una reazione chimica comporta vengono espressi in kilocalorie per
mole (kcal/ mo!).
Malgrado ciò, l'un ione di atomi mediante legami chimici non è petmanente.
Esistono, infatti, forze capaci di rompere questi legami: l'energia termica è
una fra le più importanti. Collisioni tra molecole o atomi che si muovono
molto velocemente (questo movimento aumenta con l'aumentare della tem-
peratura) possono rompere questi legami. Durante una collisione, parte del-
1'energia cinetica di una molecola in movimento può essere impiegata -per se-
parare due atomi legati. Più una molecola si muove velocemente (e ciò può
essere ottenuta aumentando la temperatura), maggiore è la possibilità che, a
causa di una collisione, un legame venga rotto. Pertanto, nel momento in cui
la temperatura di un certo numero di molecole viene aumentata, la stabilirà
dei legami diminuisce. La rottura di un legame può essere descritta dalla se-
guente formula:

AB + energia ~ A + B [Equazione 3.2]

La quantità di energia che deve essere aggiunta per rompere un legame è esat-
tamente pari a quella dissipata nella formazione del legame. stesso. Questa
equivalenza è in accordo con la prima legge della termodinamica, che affer-
ma che l'energia non può né essere creata né distrutta.

Esiste un equilibrio fra i legami creati e quelli distrutti


Ciascun legame è il risultato di un'azione combinata tra forze che fo rmano e
rorze che rompono i legami stessi. Quando, in un sistema chiuso, si crea un
equilibrio, il numero di legami che si formano in un certo periodo di tempo
sarà uguale al numero di legami che si rompo no nello stesso periodo di tem-
po. La quantità di legami che si formano potrà essere ricavata dalla seguente
fo rm ula, che indica l'azione di massa:

conc AB
K = ------ [Equazione 3.3]
eq conc A X conc 8

dove K è la costante di equilibrio e concA, concB e concAB sono, rispettiva-


mente,1e concentrazioni di A, B e AB, espresse in moli per litro. Quindi
avendo inizialmente soltanto A e B liberi o la sola molecola AB o una misce-
la di AB più A e B liberi, il rapporto ali' equilibrio di A, B e AB sarà determi-
nato da Kcq·
44 I Parte prima• Chimica e genetica e sa-os-11s9o-o

1 11 concetto di energia libera


Ogni qualvolta viene modificata la quantità di atomi legaci, in base alla co-
stante di equilibrio, avviene sempre un cambiamento dei livelli energetici del
sistema. Il modo più comunemente usato per esprimere questo cambiamen-
to, dal punto di vista biologico, è attraverso il concetto chimico-fisico di
energia libera, rappresentata dal simbolo G, in onore del fisico Josiah Gibbs
che operò nel XIX secolo. In questo cesto non si vuole dare una rigorosa defi-
nizione dell'energia libera, né si vuole mostrare come essa differisca da altre
forme di energia. Per approfondire questo argomento, il lettore dovrebbe
consultare testi di chimica e/o di fisica, che trattano la seconda legge della ter-
modinamica. Ci sembra sufficiente affermare che si definisce libera quell'ener-
gia in grado di compiere lavoro.
La seconda legge della termodinamica asserisce che nelle reazion i spontanee
avviene sempre una diminuzione della quantità di energia libera (il valore di
t1G è negativo). Quando si raggiunge l'equilibrio della reazione non si osser-
va più alcuna variazione di cale energia (t1G = O).'Lo stato di equilibrio di una
reazione in cui sono coinvolti un cerco numero di atomi è quello che contie-
ne la più bassa quantità di energia libera.
I..:energia libera che si perde per il raggiungimento dell'equilibrio vien e tra-
sformata in calore o utilizzata per aumentare la quantità di entropia. Anche
in questo caso non cercheremo di definire cosa sia lentropia, salvo dire che
essa misura la quantità di disordine del sistema. Maggiore è il disordine, mag-
giore è l'entropia. I..:esiscenza di entropia vuol dire che molte reazioni chimi-
che spontanee (cioè quelle· con una netta diminuzione dell'energia libera)
non necessitano dell'aggiunta di energia termica. Per esempio, quando il clo-
ruro di sodio (NaCl) viene sciolto in acqua si verifica un assorbimento di ca-
lore e non una cessione. Malgrado ciò, si ha una diminuzione netta dell'ener-
gia libera, poiché, passando dallo stato solido a quello in soluzione, ha luogo
un aumento del disordine degli ioni sodio e cloro.

Keq è correlata al ~G in modo esponenziale

Chiaramente, più forti sono i legami, e quindi maggiore è la variazione in


energia libera (t1G) che accompagna la loro formazione, più grande è la
quantità di atomi presenti in forma legata. Questo concetto è espresso, in
modo quantitativo, dalla formula
t1G = - RTln K.q o K.q = e - tl C!RT [Equazione 3.4)
dove R è la costante universale dei gas, Tè la temperatura assoluta, In è il lo-
garitmo (di K.q) in base e, K.q è la costante di equilibrio ed e è pari a 2,718.
Tabella 3.1 Inserendo gli appropriaci valori di R (1 ,987 cal/deg-mol) e T (298 a 25 °C),
dall'equazione si estrapola che bassi valori di t1G, incorno alle 2 kcal/mol,
La relazione numerica tra possono porcare praticamente alla formazione di tutti i possibili legami fra i
la costante di equilibrio e ~G reagenti, ammettendo che questi ultimi siano presenti in concentrazioni
a 25 °C equimolari (Tabella 3.1).
K.,q ~G. kcal/mol

0,001 4,089 I legami covalenti sono molto forti


0,01 2,726
0,1 1,363 I valori di t1G che accompagnano la form azion e di legami covalenti fra ato-
1,0 o mi liberi, come l'idrogeno o l'ossigeno, sono molto grandi e di segno negati-
10,0 -1 ,363 vo, normalmente da - 50 a -110 kcal/mol. I..:Equazione 3.4 ci dice che la K.
100,0 - 2,726 della reazione sarà proporzionalmente grande e che le quantità di idrogeno ed
1000,0 -4,089
ossigeno che non hanno preso parte alla reazione saranno molto piccole. Per
esempio, se all'inizio della reazione abbiamo 1 mol/litro di atomi reattivi, con
'3>. \:\m\)o\"\ani.a òe\ \egam\ òe'oo\\ ne\\e \n\e1ai1on\ \rn mo\ec.o\e \

un D.G di 100 kcal/mol soltanto uno di questi atomi su 1040 rimarrà non le-
garo al raggiungimenro dell'equilibrio della reazione.

1 1legami deboli nei sistemi biologici


I legami deboli più rilevanti per i sistemi biologici sono: i legami di van der
Waals, i legami idrofobici, i legami idrogeno e quelli ionici. A volte, come potre-
mo vedere, la distinzione fra un legame idrogeno e un legame ionico è arbitraria.

I legami deboli possiedono un'energia compresa


fra 1 e 7 kcal/mol

I legam i più d eboli sono quelli di van der Waals. Essi possiedono un'energia
(da 1 a 2 kcal/mol) solo leggermente superiore all'energia cinetica dei movi-
menri termici, menrre l'energia dei legami ionici e idrogeno è compresa fra 3
e kcal/ mol.
In soluzione, quasi mete le molecole formano un numero di legam i deboli
m olto vicino al numero degli atomi che le compongono. Tutte le molecole
ono in grado di formare legami di van der Waals, mentre i legami idrogeno
e quelli ionici possono essere formati soltanto fra molecole che sono fornite
di una carica netta (ioni), o sulle quali la carica non è uniformem ente distri-
buita. Le molecole hanno quindi la capacità di formare diversi tipi d i legami
deboli. Co nsiderazio ni di tipo energetico ci suggeriscono che le molecole
hanno sempre la tendenza a formare i legami più forti possibili.

Alle temperature fisiologiche i legami deboli si formano


e si rompono continuamente

. ell'ambito dei legami deboli l'energia contenuta può, al massimo, essere di


dieci volte maggiore rispetto a quella determinata dai movimenti cinetici che
i crean o ad una temperatura di 25 °C (0,6 kcal/mol). Alle temperature fi-
siologiche, quindi, esiste u na così grande dispersione di energia sufficiente a
rompere una serie di legami deboli anche quelli fra i più forti .

La distinzione fra molecole polari e non polari

Tutte le interazioni deboli sono basate su attrazioni fra cariche elettriche. La


separazione delle cariche elettriche può essere permanente o temporanea. Ciò
dipende dalle cariche coinvolte. Per esempio, nella mo lecola di ossigeno
(0:0) i due atomi condivisi hanno una dis tribuzione simmetrica, così che
ciascuno di essi n on appare carico. Al contrario, nella molecola d'acqua
(H:O:H) non vi è una distribuzione uniforme di cariche, infatti gli elettroni
sono co ndivisi in modo ineguale (Figura 3.3) . Essi sono attrarti più fone-
menre dal!' atom o di ossigeno, che, di conseguenza, ha una carica negativa
piuttosto elevata, mentre la stessa carica (in questo caso positiva) è posseduta
dai due atomi di idrogeno, quando presi complessivam en te. Se il centro del-
la carica positiva non si sovrappone a quello della carica negativa, ci troviamo
di fronte ad una si tuazione ch e viene indicata com e dipolo elettrico. Una
condivisione non uniforme degli elettroni riflecce una diversa affinità degli
atomi per gli elettroni stessi. Gli atomi che hanno la tendenza ad attrarre elet-
troni vengono detti atomi elettronegativi, mentre quelli che preferenzial- Figura 3.3
mente li cedono son o gli atomi elettropositivi. La struttura della molecola d 'acqua.
46 I Parte prima • Chim ica e genetica e 88-08-17890-o

Figura 3.4 10À


Variazione della forza di van der Waals
in.funzione della distanza. Gli ato mi
mostrati in questo d isegno schematico
sono q uelli del gas raro a rgo n. (Fonte :
ad att ata da Pauling L. 1953. Genera/ attrazione debole
chemistry, 2• edizione, p . 322. Copy- d el legame d i van der Waa ls
right 1953 by W. H. Fre eman . Riprodot-
to con autorizzazione.)

Tabella 3.2
I raggi di van der Waals degli attrazione molto fo rte
atomi nelle molecole d el legame
d i va n d er Waals
biologièhe
Atomo Raggio di
van der Waals

H 1,2
N 1,5
o 1,4 l'attrazione d i van der Waals
p 1,9 è bilanciata d a forze repulsive,
s 1,85 d eterminate dalla impossibilità
d i sovrapposizione d ello

Gru ppo CH3 2,0 strato esterno di el ettroni
Metà spessore 1,7
d i una molecola
arom at ica

Molecole (come H 2 0 ) che hanno le caratteristiche del dipolo vengono chia-


mate molecole polari. Le molecole non polari sono quelle che non presenta-
no tale caratteristica. Nel metano, per esempio, il carbonio e gli atomi di
idrogeno hanno un'affinità simile per gli elettroni che mettono in comune,
così che né il carbonio né l'idrogeno risultano significativamente carichi: sia-
acetato mo quindi in presenza di una molecola non polare.
In una molecola, la distribuzione della carica può essere influenzata dalle mo-
lecole adiacenti, specialmente se queste sono polari. Ceffetto può essere quel-
lo di conferire una certa polarità a molecole non polari. Anche se la seconda
molecola non fosse polare, essa determinerà comunque una fluttuazione nel-
la distribuzione della carica sulla prima molecola. Questi effetti indotti pro-
durranno una separazione di carica di gran lunga inferiore rispetto a quella
presente sulle m olecole polari, e ciò determina la possibilità di formare inte-
g licina razioni più deboli.

Forze di van der Waals


I legami di van der Waals sono determinati da forze di attrazione non speci-
fiche, che si creano quando due atomi si avvicinano l'uno all'altro. Essi non
sono basati su una separazione permanente di carica, ma piuttosto sulle flut-
tuazioni di carica indotte dalla vicinanza reciproca fra molecole diverse. Que-
ste interazioni si possono creare in tutti i tipi di molecole, sia polari che non
guanina polari, e dipendono dalla distanza reciproca; l'energia di legame, infatti, è in-
versamente proporzionale alla distanza (Figura 3.4).
Figura 3.5 Le forze di van der Waals possono essere anche repulsive e si creano quando
Struttura di alcune molecole contorna-
te dai raggi di van der Waals,
due molecole sono troppo vicine. La repulsione è dovuta alla sovrapposizione
con gli atomi colorati in violetto, blu degli elettroni del guscio più esterno, appartenenti agli atomi coinvolti nel le-
e arancio. game. Pertanto, le forze di van der Waals, sia attrattive che repulsive, bilan-
e '3&-08-1 7890-0 3. L'importanza dei legami deboli nelle interazioni fra molecole I 47

ciano la distanza fra i due aromi e possono variare in funzione delle molecole
coinvolte. Questa distanza è chiamata raggio di van der Waals (Tabella 3,2 e
Figura 3.5). renergia di legame delle forze di van der Waals fra due atomi au-
menta in funzione della grandezza degli aromi interagenti. Per due determi-
nati aromi, essa potrebbe essere soltanto di 1 kcal/mol, che è poco più alta
della quantità di energia termica presente in una molecola alla temperatura
ambiente (0,6 kcal/mol).
Questo significa che, alle temperature fisiologiche, le forze di van der Waals
rappresentano un'effettiva forza di legame soli:anto quando un numero suffi-
ientemente elevato di aromi di una data molecola interagisce con altrettanti
aromi di un'altra molecola. Ciò avviene quando l'energia complessiva d 'inte-
razione è assai più grande della ~endenza alla dissociazione determinata dai
Figura 3.6
movimenti termici casuali. Perché ci possa essere un'effettiva interazione fra La posizione delle molecole in una se-
gli aromi di due molecole, o di due parti della stessa molecola, esse devono as- zione di un cristallo formato dall'am-
umere conformazioni steriche ben precise, in modo che le distanze fra gli minoacido glicina. La compatt azione
aromi non siano molto diverse dal raggio di van der Waals (Figura 3.6). La delle molecole è determ inata dai raggi
di van der Waals dei vari gruppi chimi-
fo rza d'interazione tende allo zero quando la distanza fra gli atomi è maggio- ci, con l'eccezione dei contatt i N-H O ,
re rispetto al raggio di van der Waals. Le interazioni più forti si ottengono che.formano legami id rogeno. (Fonte:
quando una molecola farnia una cavità stericamente complementare alla pro- adattat a da Pauling L. 1960. The nature
rrusione presente su un'altra molecola, com'è il caso di un antigene per il suo of the chemicaf bond and the structure
of mo/ecu/es and crysta/s: an introduc-
anticorpo specifico (Figura 3.7). In questo caso, l'energia di legame può arri- tion to modem structuraf chemistry, 3•
\•are a 20-30 kcal/mol, cos) che il complesso antigene-anticorpo può conside- edizione, p . 262. Copyright 1960 Cor-
rarsi una struttura sufficientemente stabile. Comunque il legame esistente fra nei! University. Riprodotta con l'autoriz-
zazione dell'editore.)
molecole polari è determinato raramente dalle sole interazioni di van der
Waals, poiché normalmente entrano in gioco altri tipi di legami deboli.

Legami idrogeno

Un legame idrogeno si forma tra un atomo di idrogeno donatore, covalente-


mente legato ad un altro atomo, avente carica positiva ed un atomo di idro-
geno accettore, covalentemente legato ad un altro atomo , carico negativa-

b
Figura 3.7
Interazioni anticorpo-antigene. Le
strutture, rappresent ate come spazi
p ieni (a) e come frecce (b), mostrano il
complesso formato d a Fab D 1,3 e il li-
sozima (in violetto). (Fischmann T. O ..
Bentley G.A .. Bhat T.N., Boulot G .. Ma-
riuzza RA, Phillips S.E.. Tello D .. e Pol-
jak R.J ., 1991. J.Bio/. Chem . 266:12915.)
Immagine p reparata con MolScript,
BobScript e Raster 3D.
48 I Parte prima • Chimica e genetica e 00.oa-1 1090-0

Lunghezza approssimativa di legame in legami


abella 3.3 idrogeno biologicamente importanti

Lunghezza approssimativa
Legame di legame H (À)

legame idrogeno 0 -H l l Hll l o 2,70:tO,10


fra gruppi peptidici
0-H 1111111 o- 2,63 :t 0,10
0 -H ....,.. N 2,88:tO,1 3
1111111 0 --
N-H 11 111 1 1 0 3,04 :t 0,13
N.,.-H 1111 1 1 1 0 2,93:t0,10

legame idrogeno
o N-H '"'"' N 3,10 :t 0,13

fra due gruppi idrossilici

mente (Figura 3.8). Per esempio, gli aromi di idrogeno del gruppo ammino
(- NH 2) so no attratti dal l'ossigeno del gruppo carbonilico ( > C = O ) cari-
co negativamente. A volte, gli aromi idrogeno coinvolti nel legame apparten-
gono a gruppi che possiedono una carica positiva o negativa, come, ad esem-
pio, i gruppi NH3 o COO-; in altri casi, sia gli aromi idrogeno donatori che
gli atomi accettori negativi pqsseggono cariche parziali.
I legami idrogeno biologicamente più importanti sono rappresentati da atomi di
legame idrogeno fra un gruppo idrogeno covalentemente legati ad atomi di ossigeno (O - H ) o ad atomi di azo-
carbossilico carico ed un gruppo to (N - H ).Gli aromi accettori, carichi negativamente, sono usualmente l'azoto
idrossilico della glicina
e l'ossigeno. La Tabella 3.3 elenca alcuni dei legami idrogeno più importanti.
In assenza di molecole d'acqua circostanti, l'energia dei legami idrogeno è com-
presa fra 3 e 7 kcal/mol, quindi, pur appartenendo alla categoria dei legami de-
boli, sono sufficientemente forti, in quanto vi è una notevole differenza di carica
o fra atomi donatori e accettori. In ogni caso, i legami idrogeno sono più deboli
dei legami covalenti, anche se considerevolmente più forti di quelli di van der
legame idrogeno fra un gruppo Waals. In un legame idrogeno, quindi, la distanza tra due aromi è inferiore ri-
amminico carico ed un gruppo spetto al raggio di van der Waals, ma superiore a quella dei legami covalenti.
carbossilico carico
I legami idrogeno, a differenza di quelli di van der Waals, sono fortemente
orientati. Nei legam i idrogeno più forti, l'atomo d' idrogeno giace in linea ret-
ta con l'atomo accettare (Figura 3.9); se invece forma un angolo superiore ai
30°, l'energia di legame diminuisce notevolmente. Inoltre, i legami idrogeno
Figura 3.8 sono molto più specifici rispetto a quelli di van der Waals, infatti richiedono
Esempi di legami idrogeno fra mole- l'esistenza di molecole con gruppi accettori e corrispondenti gruppi donatori.
cole b iologiche.

Alcuni legami ionici sono legami idrogeno


a
Molte molecole organiche possiedono gruppi ionici che contengono uno o
o... . .. più cariche nette positive o negative. I mononucleotidi, per esempio, hanno
un a carica netta negativa, in quanto posseggono un gruppo fosfato, mentre
gli amminoacidi (eccetto la prolina) hanno sia una carica netta negativa sul
gruppo carbossilico (COO- ) che una carica netta positiva sul gruppo ammi-
b
nico (NH3). Queste cariche sono generalmente neutralizza te da gruppi do-
tati di una carica opposta e che si trovano nelle vicinanze. Le forze elettrosta-
tiche che agiscono fra gruppi aventi carica opposta formano i legami ionici.
La loro energia di legame, in soluzione acquosa, è dj circa 5 kcal/ mol.
In molti casi, sia i cationi inorganici, come a-, K- o.Mg2+ , o gli anioni, come
Figura 3.9 C l- , o SO~- neutralizzano la carica delle mofecole organiche ionizzate. Se ciò
Proprietà direzionali dei legami idro-
geno. (a) li vettore lungo il legame co-
accade in soluzione acquosa, gli ioni neutralizzanti no n assumono posizioni fis-
valente 0 -H giace sulla stessa retta se, poiché sono rivestiti da uno strato di molecole d'acqua che non permette di
formata con l'ossigeno accettore; ciò legare direrramente i gruppi aventi carica oppo ta. Pertanto, in soluzione ac-
permette la formazione d i un legame quosa, i legami elemostatici formati con cationi o anion i inorganici non sono
forte. (b) li vettore forma un angolo con
l'atomo di ossigeno accettore; il risu l- di primaria importanza nel determinare la truttura delle molecole organiche.
t ante legame è molto p!ù debole. D 'altro canto, i legamj risultano più pe ifìci quando è possibile instaurare le-
3. L'importanza dei legami deboli nelle interazioni fra molecole I 49

_ ~ · idrogeno fra gruppi di carica opposta. Per esempio, COO- e NH! so-
ipeSSO tenuti insieme da legami idrogeno. Poiché questi legami sono più
- -.i di quelli formati fra gruppi aventi solo una carica parziale, essi sono con-
~...:.ememente più corti. Inoltre, un legame idrogeno più forte si può forma-
- :";a un gruppo avente una carica unitaria ed un gruppo avente solo una ca-
- · parziale: per esempio, un atomo di idrogeno appartenente ad un gruppo
~ico (NH 2) si lega fortemente ad un atomo di ossigeno di un gruppo
~~ ilico (COO- ).

e interazioni deboli richiedono superfici complementari


: .::garni deboli si creano soltanto quando le superfici interagenti possono av-
:.cinarsi l'una all'altra. Ciò è possibile quando le superfici delle molecole pos-
,q:gono una struttura complementare, così che un gruppo sporgente di una
- fecola (carica positiva) si adatta ad una cavità presente su un'altra molecola
~:arica negativa). Cioè, le molecole interagenti devono avere una relazione
rrurale tipo chiave-serratura. Nelle cellule, questo fenomeno determina
ndizioni per cui molecole dello stesso tipo difficilmente interagiscono fra lo-
. poiché normalmente non presentano strutture intramolecolari comple-
.::iemari. Per esempio, alcune molecole polari contengono atomi di idrogeno
c:ie porrebbero essere condivisi, ma non contengono adeguati atomi accettori,
raenue alcre molecole, pur potendo formare legami idrogeno, non posseggono
iromi di idrogeno da cedere. D 'altro canto, ci sono altre molecole che posseg-
~no un'adeguata simmetria da permettere la formazione di interazioni forti
con molecole uguali. [acqua è uno degli esempi più importanti.

Le molecole d'acqua formano legami idrogeno

:.n condizioni fisiologiche, le molecole d'acqua raramente formano ioni H + e


O H -, mentre esistono come molecole polari H -0-H, formando legami
:6-ogeno molto forti fra gli atomi di idrogeno di una molecola e lossigeno di
un'al tra. In ciascuna molecola d'acqua, l'atomo di ossigeno può legarsi a due
.uomi di idrogeno appartenenti ad altre due molecole, mentre ciascun atomo
G.i idrogeno può legarsi ad un atomo di ossigeno di una molecola adiacente.
Questi legami formano un tetraedro (Figura 3. 10), così che, sia in forma li-

..,,,,,,
Figura 3.10
tetraedro Rappresentazione di un ret icolo for·
mato da molecole d 'acqua. L'energia
ricavata dalla formazione d i legami
idrogeno specifici fra molecole d'ac-
qua favorisce la disposizione delle mo-
V ' ", , lecole in tetraedri adiacent i. G li atomi
di ossigeno sono indicati dalle sfere
più grandi, quelli di idrogeno dalle sfe-

J. . . . re più piccole. Nonostante la rigidità


della struttura dipenda dalla tempera-
tura, la struttura illustrata è presente sia
allo stato liquido che nel ghiaccio.
o (Fonte: adattata da Pauling L. 1960.
The nature of the chemical bond and
Oo
8,..'"'o the structure of molecules and crystals:
an introduction to modem structural
chemistry, 3• edizione, p. 262. Copy-
~~ right© 1960 Corner! University. Ripro-
cn -
o -V dotta con l'autorizzazione dell'editore.)
50 I Parte prima • Chimica e genetica e 88-08-17890-0

quida che in quella solida (ghiaccio), una singola molecola d'acqua tende .ad
averne aJtre quattro vicine, ciascuna delle quaJi si trova agli apici del tetrae-
dro. Nel ghiaccio, questi legami sono molto rigidi e bloccano le molecole; aJ
di sopra della temperatura di fusione (O 0 C), l'energia termica è sufficiente
per rompere questi legami idrogeno e permettere ad una molecola d'acqua di
cambiare continuam ente le molecole d 'interazione. In ogni caso, anche aJlo
stato liquido ed in un dato intervaJlo di tempo, la maggior parte delle mole-
cole sono legate mediante quattro legami idrogeno a molecole circostanti.

L'unicità delle forme molecolari ed il concetto di adattament o


Box 3.1
strutturale selettivo

Anche se la maggior parte delle molecole presenti nelle gli enzimi sono specifici per gli L-amminoacidi. Se un L-
cellu le sono costitu ite da un piccolo numero di gruppi amminoacido è in grado di associarsi ad un enzima, il suo
chimici, come OH, NH 2 e CH 3, esiste una grande specifi- stereoisomero non è in grado di farlo.
cità nel modo in cui le molecole interagiscono tra loro. La maggior parte delle molecole biologiche può formare
Ciò avviene perché ciascuna molecola ha possibilità uni- legami biologicamente significativi soltanto con un pic-
voche d i legame. Una dimostrazione molto chiara viene colo numero di altre molecole, in parte perché le mole-
dalla specificità degli stereoisomeri . Per esempio, le pro- cole p resenti nei sistemi biologici sono in un ambiente
teine sono sempre format e da L-amminoacidi e mai dai acquoso. La formazione di legami fra molecole, in una
loro stereoisome ri, o-am minoacidi (Box 3.1 Figura 1). cellu la, non dipende soltanto dalla compatibilità struttu-
Sebbene i D- e gli L- amminoacidi contengano legami co- rale delle molecole, ma anche dal la preferenza che que-
valent i identici, la loro capacità di legare molecole asim- ste molecole mostrano nel legarsi fra loro, piuttosto che
metriche è molto diversa. Pertanto la maggior parte de- con le molecole d'acqua circostanti.

L-alanina

o-alanina

Box 3.1Figura1 I due steroisomeri dell'amminoacido alanina. 1960 Cornell University. Riprodotta con l'autoriuazione
{Fonte: adattata da Pauling L. 1960. The nature of the chemical dell'editore. E da Pauling L. 1953. Genera/ chemistry, 2• edizione,
bond and the structure of molecules and crystals: an introduction p. 498. Copyright 1953 W.H. Freeman. Riprodotta con
to modem strvctural chemistry, 3• edizione, p. 465. Copyright© autoriuazione.)
o 88-08- 17890-0 3. L:importanza dei legami deboli nelle interazioni fra molecole I 51

Legami deboli fra molecole in soluzione acquosa

La quantità di energia contenuta in un legame secondario, sebbene molto in-


feriore rispetro a quella di un legame covalente, è sufficientemente alta da as-
sicurare che la maggior parte delle molecole in soluzione acquosa possa for-
mare legami secondari con altre molecole. La proporzione fra le molecole le-
gate e quelle non legate è data dall' Equazione 3.4, corretta in modo tale da
tenere in considerazione l'elevato numero di molecole che si trovano in solu-
zione. E~sa afferma che, alle temperature fisiologiche, una bassa energia di in-
terazione (2-3 kcal/mol) è sufficiente per formare il massimo numero di lega-
mi secondari.
La struttura specifica d'i una soluzione, in un daro momento, è fortemente in-
fluenzata dalle molecole presenti, non soltanto perché esse posseggono una
specifica forma, ma anche perché le molecole differiscono per il tipo di lega-
mi secondari che possono instaurare. In questo modo, una molecola tenderà
ad instaurare interazioni con le molecole con cui può formare il massimo nu-
mero di legami forti.
Le soluzioni, ovviamente, non sono statiche. La configurazione specifica di
una soluzione cambia continuamente, da un arrangiamento ad un altro, a
causa della temperatura che .tende a rompere i legami deboli, mantenendo
però, approssimativamente, lo stesso contenuto energetico. Altrettanto im-
portante, nei sistemi biologici, è il metàbolismo, che trasforma continua-
mente una molecola in un'al tra, cambiando così, auromaticamente, la natura
dei legami secondari che si possono formare. La struttura della soluzione di
una cellula quindi cambia in continuazione, non solo a causa dei movimenti
termici, ma anche a causa delle continue trasformazioni metaboliche a cui le
cellule sono sottoposte.

Le molecole organiche che tendono a formare legami


idrogeno sono idrosolubili

L'energi a dei legami idrogeno è molro più elevata di quella dei legami di van
der Waals, così che le molecole formeranno preferenzialmente legami idroge-
no piuttosro che interazioni di van der Waals. Per esempio, se proviamo a mi-
scelare l'acqua con un composto che non forma legami idrogeno, come il
benzene, le molecole d'acqua e quelle di benzene rapidamente si separeranno
l' una dall'altra: le molecole d 'acqua formeranno legami idrogeno le une con
le altre, mentre quelle di benzene rimarranno associate mediante interazioni
di van der Waals. Non è quindi possibile miscelare molecole organiche che
non formano legami idrogeno con le molecole d'acqua.
Invece, molecole polari, come il glucosio ed il piruvaro, che contengono un
gran numero di gruppi in grado di formare legami idrogeno molto forti (co-
me =O od OH) sono solubili in acqua (sono composti idrofilici e, quindi,
co n caratteristiche opposte ai composti idrofobici). Infatti, quando queste
molecole si inseriscono nel reticolo formaro dalle molecole d'acqua, si forma-
no immediatamente legam i idrogeno fra le molecole organiche polari e l'ac-
qua stessa. Questa distribuzione, comunque, non è così favorita dal punto di
vista energetico, rispetto alle interazioni fra molecole d'acqua, così che anche
le molecole che presentano un'elevata polarità possiedono una solubilità li-
mitata.
Quindi, quasi tutte le molecole contenute nelle cellule, siano esse di origine
endogena che assunte dall'esterno sono, almeno in parte, insolubili in acqua.
A causa dei loro continui movimenti termici, esse casualmente collidono con
altre molecole, trovando, prima o poi, una molecola con una superficie com-
plementare a cui legarsi liberando le molecole d'acqua che porranno dar luo-
go ad altre interazioni acqua-acqua.
52 I Parte prima • Chimica e genetica o 88-08-17890-0

I legami idrofobici stabilizzano le macromolecole

La forte tendenza dell'acqua ad escludere i grupp i non polari è indicata co-


me legame idrofobico. Alcuni chimici sono portati a con siderare tutti i le-
gami fra gruppi non polari, in un ambiente acquoso come legami idrofo-
bici (Figura 3.11). In un certo senso ciò non è propriamente corretto, per-
ché viene più che altro enfatizzata l'assenza di legame, piuttosro che la sua
presenza (le interazioni che tendono a formarsi fra i gruppi non polari sono
semplicemente dovute a forze di van der Waals) . D 'altra parte, il termine
legame idrofobico è largamente usato, poiché mette in risalro il fatto che i
gruppi non polari cercano di combinarsi l'uno con l'altro, in modo da
escludere contatti con l'acqua. I legami idrofobici sono molto importanti
sia per stabilizzare la struttura delle proteine, che per la formazione di com-
plessi fra proteine ed altre molecole, inoltre sono anche importanti per l'ar-
chitettura delle membrane dove le proteine devono coesistere ed interagire
con il doppio srraro lipidico. Tali legami sono responsabili di almeno il
50% dell'energia impiegata per la formazione ed il mantenimento delle
strutture proteiche.
Consideriamo, per esempio, le differenti quantità di energia generata quan-
do gli amminoacidi alanina e glicina sono legati, in soluzione acquosa, ad una
terza molecola, dotata di una superficie complementare all'alanina. Sull'ala-
nina è presente un gruppo metilico, assente sulla glicina. Quando l' alanina è
legata alla molecola di interazione, i legami di van der Waals, che si formano
acromo al gruppo metilico, cedono una quantità d'energia pari al kcal/mol,
mentre ciò non avviene quando è la glicina ad essere legata. Dall'Equazione
3.4 sappiamo che questa piccola quantità di energia, da sola, determina una
differenza energetica circa 6 volte superiore a quella esistente fra il legame del-
1'alanina e quello della glicina. Questi calcoli non tengono però in considera-
zione il fatto che l'acqua tende maggiormente ad escludere l'alanina rispetto
alla glicina. La presenza del gruppo CH3 sull'alanina disturba il reticolo for-
mato dall'acqua più di quanto possa fare la glicina. Al momento, è ancora
Figura 3.11 difficile prevedere quanto grande debba essere questo fanore di correzione. È
Esempi di legami di van der Waals
(idrofobici) fra gruppi non polari degli
verosimile che l'acqua, interagendo con il ligando, tenda ad escludere l'alani-
amminoacidi. Gli ato mi d i idrogeno na con una forza approssimativamente di 2-3 kcal/mol maggiore di quella
non sono indicati individualmente. Per che tende ad escludere la glicina.
chiarezza, i raggi di van der Waals sono Possiamo concludere che le differenze energetiche esistenti fra molecole simi-
ridotti del 20%. Le formule poste vici -
no alle figure tridimensionali indicano li nel formare legami con una terza molecola (quando la differenza fra le mo-
la posizione degli atomi. (a) Legame lecole simili consiste nella presenza di gruppi non polari) è di almeno 2-3
feni lalanina-leucina_ (b) Legame fenila- kcal/ mol maggiore all'interno di un ambiente acquoso, come la cellula, piut-
lan ina-fenila lanina. (Fonte: adattata da
tosto che in un ambiente privo d'acqua. Spesso, la differenza d'energia è pari
Scheraga H.A, The proteins, 2• edizio-
ne, p. 527. Copyright© Harold Schera- a 3-4 kcal/mol, quando le molecole coinvolte contengono gruppi polari che
ga. Riprodotta con autorizzazione.) possono formare legami idrogeno.

a b
C N
\ /
CH
I
CH2

75
e- .
e 88-08-1 7890-0 3. L'importanza dei legami deboli nelle interazioni fra molecole / 53

Il vantaggio di un ~G compreso fra 2 e 5 kcal/mol


Abbiamo visco ch e l'energia implicata n ella formazione dei legami deboli
(2-5 kcal/mol) è sufficiente ad assicurare che una molecola si leghi preferen-
zialmente a gruppi di molecole piuttosro che ad altri. Questi livelli energetici,
comunque, non sono cali da determinare la formazione di complessi talmen-
te stabili da dar luogo, nella cellula, alla formazione di criscalli, come porreb-
be avvenire a livelli energetici più elevaci. Livel li energetici più alti potrebbe-
ro porcare ad una difficile rottura dei legami deboli e quindi ad una minore
possibilità di diffusione delle molecole, una condizione incompatibile con la
VlCa.

I legami deboli permettono la formazione di complessi


enzima-substrato

I legami deboli sono il mezzo necessario affinché gli enzimi si leghino al loro
substraro. G li enzim i non legano indjscriminatamente tutte le molecole, ma
sol canto quelle per le quali hanno una specifica affinità.
Poiché gli enzimi catalizzano una reazione chimica in entrambe le direzioni,
essi devono avere un'elevata affinità per entrambi i gruppi di molecole reagen-
ti. In alcuni casi, è possibile misurare la costante di equiljbrio per il legame di
un enzima ad uno dei suoi substrati (Equazione 3.4); ciò consente ·di calcola-
re il D.G della reazione. Questa stima ci permette di capire quale ci po di lega-
me si sia formato. Per valori di D.G compresi fra 5-10 kcal/mol, possiamo dire
di essere in presenza di interazioni enzima-substrato specifiche. In ogni caso,
questi valori non sono mai così alci da impedire la separazione dei complessi
enzima-subscraro causata dalle oscillazion i termiche del sistema. Ciò spiega
l'elevata velocità di funzionamento degli enzimi, che possono reagire anche
106 volte al secondo. Se gli enzimi fossero cratcenuci, mediante alcuni legami,
in un complesso con il substrato o, peggio, con il prodotto della reazione, la
loro velocità di reazione sarebbe molto più bassa.

I legami deboli mediano la maggior parte delle interazio-


ni proteina:DNA e proteina:proteina

Come vedremo più avanti nel testo, le interazioni fra proteine e DNA e fra
proteine e proteine ci faranno comprendere come le cellule recepiscono i se-
gnali e ad essi rispondono, come esprimono i geni, come replicano, riparano
e ricombinano il loro DNA e ci permetteranno anch e di capire il modo in cui
queste reazioni sono regolare. Si ricordi che queste interazioni vengono me-
diare dai legami deboli precedentemente descritti e che, sebbene individual-
mente abbiano una bassa energia di legarne, quando combinaci e presenti in
numero sufficiente divengono essenziali per la corretta stabilità dell' intera-
zione di due o più molecole.
Nel Capitolo 5 rirorneremo su questo argomento, tenendo in particolare
considerazione il modo in cui le proteine vengono costruite, come esse adot-
tino particolari strutture, come si leghino al DNA e come si leghino le une al-
le altre.
54 I Parte prima • Chimica e genetica e as-oa-11s90-0

Sommario -------------------------------~
AJl' imerno della cellula, gran parte degli evenci chimici non Le molecole che posseggono gruppi polari (carichi) intera-
prevedono la formazione o la rottura d i legam i covalenti . La giscono in modo differente rispetto alle mo lecole che pos-
localizzazione di molte mo lecole è in funzio ne della presen- seggono gruppi non polari (in cui le cariche sono equa-
za di forze deboli: attrattive o repulsive. In aggiunta, i legami mem e distribuite). Le molecole polari possono formare le-
deboli sono importami nel determinare la fo rma di molte gami idrogeno, mentre le molecole non polari possono for-
mo lecole, specialmente di quelle ad alto peso mol ecolare. I mare soltanto legami di van der Waals. La molecola po lare
pili im portanti fra q uesti legami secondari sono i legami più importante è l'acqua. Ogni molecola d'acq ua può for-
idrogeno, le imerazioni di van der Waals, i legami idrofobici mare quattro legami idrogeno con altrettante molecole
e quelli ionici. Anche se tali legami sono relativamente de- d 'acqua. M entre le molecole polari sono solubili in acqua
boli, essi sono sufficientemem e forti da assicurare una cor- (anche se con differemi gradi di solubilità), le moleco le non
retta interazione fra le molecole o fra gruppi di aro mi. Per polari, non potendo fo rmare legami idrogeno con l'acqua,
esempio, la superficie di un enzima è strutturata in modo ta- sono inso lubili in questo elemento.
le da poter legare specificameme il proprio substrato. Ciascuna molecola è dotata di una struttura unica e speci-
La formazione di tutti i legami chimici, sia quelli deboli che fica; tale co nformazio ne restringe il numero di molecole
quelli covalenti, è regolata dalle leggi della termodinamica. con le quali può interagire media me legami secondari. La
Un legame tende a formarsi quando il risul tato di tale even- formazione di legami secondari forti richiede sia una com-
to determina il rilascio d i energia libera (L'iG negativo). Per- plem emarità strutturale (chiave-serratura) fra le superfici
ché il legame possa essere rotto, deve essere fornita la stessa interagenti, sia il coinvolgimento di mo lti aromi. Se le mo-
q uantità d 'energia. Poiché nella formazione d i legan1i cova- lecole dovessero essere legate soltanto da uno o due legam i
lemi è co involto un L'iG negativo molto grande, essi non debo li esse potrebbero sepa rarsi freq uentememe, m entre la
potranno quasi mai idrolizzarsi spo ntaneamem e; al contra- formazion e di aggregati più stabili prevede la presenza di
rio, i valo ri di L'iG che accompagnano la formazione di le- molt i di questi legam i. Il fat to che la doppia elica del D NA
gami deboli sono d i poco superiori all'energia termica alla non si separi m ai spomaneamem e dimostra la grande stabi-
quale si trovano esposte le molecole in condizio ni fisiologi- lità degli aggregati quando sono presemi molti legam i se-
che. All' interno delle cellule, i singoli legami deboli vengo- condari.
no formati o rotti mo lte volte.

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(}.PITOLO

L'importanza
dei legami forti

el precedente capitolo abbiamo considerato la formazione dei legami • Le molecole che

JU deboli da un punto di vista termodinamico. Ogni qualvolta è stato pre-


so in considerazione un possibile legame debole ci si è chiesti se la sua
formazione portasse al guadagno o alla perdita di energia libera. A questo
cedono energia sono
termodinamicamente
instabili
proposito ricordiamo che solo quando il liG è negativo l'equilibrio termodi-
• Nelle reazioni
namico favorisce la reazione. Lo stesso assunto è valido per i legami covalenti.
biochimiche gli enzimi
Infatti, l'esigenza di un liG negativo non viene in alcun modo modificata dal
abbassano l'energia
fatto che gli enzimi siano responsabili della formazione o della rottura di un
di attivazione
legame covalente.
Un'analisi del tutto superficiale ci fa credere che nelle cell ule la formazione di • L'energia libera nelle
molti legami covalenti, di grande importanza biologica, avvenga in contrasto biomolecole
alle leggi della termodinamica; questo è vero, in particolare, se si considerano
• I legami ad alta energia
quei legami che, unendo covalentemente tra loro piccole molecole, hanno
nelle reazioni
come conseguenza la formazione di grandi molecole polimeriche. Infatti, la
biosintetiche
formazione di questi legami porca ad un aumento dell'energia libera. Per que-
sto motivo alcuni studiosi ipotizzarono che le cellule fossero dotate della sin- • L'attivazione dei
golare capacità di operare in contrapposizione ai principi della termodinami- p recursori nelle reazioni
ca e che il vero "segreto della vita" risiedesse proprio in questa capacità. di trasferimento di
Oggi, invece, è ben chiaro che questi processi biosintetici non violano le leg- gruppo
gi della termodinamica, ma piuttosto avvengono mediante reazioni diverse
da quelle originariamente ipotizzate. G li acidi nucleici, per esempio, non si
formano mediante condensazione di nucleosidi fosfato ed il glicogeno non
viene sintetizzato direttamente da residui di glucosio, oppure, ancora, le pro-
teine non sono direttamente prodotte dall'unione d i diversi amminoacidi.
Viceversa, i precursori monomerici, utilizzando l'energia presente nell'ATP,
vengono inizialmente convertici in precursori "attivaci" ad alto contenuto
energetico che sono quindi unici covalencemente (con l'ausilio di specifici en-
zimi) per dare origine a molecole più complesse.
In questo capitolo illustreremo questi principi, prendendo in considerazione
la termodinamica dei legami peptidici e quella dei legami fosfod iesterici, re-
sponsabili, rispettivamente, della formazione delle proteine e degli acidi nu-
cleici. Inizialmente, però, riassumeremo le proprietà termodinamiche gene-
ra:li che sottendono la formazione dei legami covalenti.

I Le molecole che cedono energia sono


termodinamicamente instabili
Ogni specifica molecola è caratterizzata da una propria energia libera, che
può differire in modo significativo da quella posseduta da un'altra molecola.
Questa disparità è data dal fatto che i legami covalenti hanno diverse energie
di legame. Per esempio, il legame covalente che si forma tra l'ossigeno e l' i-
drogeno è significativamente più forte del legame che unisce due atomi di
idrogeno o due di ossigeno. Di conseguenza, la formazione di un legame
0-H al posto di un legame 0-0 o di un legame H-H porra al rilascio
56 I Parte prima • Chimica e genetica @ 88-08-17890-0

di energia. Questo ci permette di capire come una miscela sufficientemente


concentrata di ossigeno e idrogeno si trasformi in acqua.
Quindi, una molecola formata da legami covalenti deboli possiede una mag-
giore quantità di energia libera di una costituita dalla presenza di legami for-
ti. Questo ragionamento sembra a prima vista del rutto paradossale, perché
significa che più forte è il legame, minore è l'energia libera che questo può ri-
lasciare. D 'altro canto, lo stesso ragionamento appare sensato se si considera
che un atomo che ha formato un legame molto forte ha già speso, in questo
processo, gran parte della propria energia libera. Ne deriva che le migliori
fonti di energia sono molecole caratterizzate da legami covalenti deboli ter-
modinamicamente instabili.
Per esempio, il glucosio è un'eccellente fonte di energia, perché quando viene
ossidato dall'ossigeno, a dare biossido di carbonio (anidride carbonica) e acqua,
si ha una significativa diminuzione dell'energia libera. Al contrario, l'anidride
carbonica, caratterizzata da forti legami doppi (i legami carhonilici) che uni-
scono il carbonio e lossigeno, non rappresenta una fonte di energia per gli ani-
mali. Infatti, in assenza del donatore di energia ATP, l'anidride carbonica non
può essere trasformata in molecole organiche più complesse, neppure con l'au-
silio di specifici enzimi. Nelle piante, invece, l'anidride carbonica può essere
usata come fonte primaria di carbonio solamente perché l'energia fornita dai
quanti di luce, durante il processo di fotosintes i, porta alla formazione di ATP.
E ora importante considerare il morivo per cui le reazioni chimiche, mediante
le quali molecole biologiche sono trasformate in altre molecole caratterizzate
da un contenuto di energia libera minore, non possono avvenire in maniera
sufficientemente veloce,.alle normali temperature fisiologiche, in assenza di un
processo di catalisi. Ciò è dovuto al fatto che un legame covalente, seppur de-
bole, è in realtà molto forte e le semplici variazioni termiche che hanno luogo
in una cellula molto raramente lo rompono. Se un legame covalente deve esse-
re rotto in assenza di un catalizzatore, infatti, è necessario fornire una quantità
di energia utile ad allontanare gli atomi tra loro legati. Solo quando gli atomi
sono parzialmente separati possono associarsi co n i nuovi partner per formare
legami più forti. In questo processo di associazione, l'energia rilasciata è data
dalla somma dell'energia libera fornita per rompere il vecchio legame e dalla
differenza in energia libera tra il vecchio e il nuovo legame (Figura 4.1).
Si definisce energia di attivazione quella che, durante una trasformazione
molecolare, deve essere fornita per rompere il vecchio legame covalente. Ge-
neralmente l'energia di attivazione è minore dell'energia contenuta nel lega-
me originale e questo perché, solitamente, i riarrangiamenti molecolari non
portano alla formazione di atomi completamente liberi. Al contrario, la rea-
zione chimica richiede inizialmente una collisione tra le due molecole che
reagiscono, seguita dalla formazione di un complesso molecolare transitorio,
che viene definito stato attivato. Nello stato attivato, l'immediata vicinanza
delle due molecole rende i legami di entrambe più labili e questo fa sì che l'e-

energia
di attivazione

Figura 4.1 t.G


L'.energia di attivazione di una reazio- della reazione
ne chimica:
(A-B) + (C-D)---. (A-D) + (C-B).
(A- D) - (C-B)
Questa reazione è accompagnata da
una diminuzione dell'energia libera. andamento della reazione
e as.oa.11a90.o 4. 1..'.importanza dei legami forti I 57

nergia necessaria per rompere un legame sia minore di quella necessaria a Tabella 4.1
rompere il medesimo legame presente su una molecola libera.
Di conseguenza, nelle cellule la maggior parte delle reazioni che coinvolgono Relazione tra Keq
i legami covalenti è descritta mediante la seguente equazione: e LiG (LiG = - RT In l<eq)

(A-B) + (C-D) ~ (A-D) + (C-B) [Equazione 4.1] K,,q ~G (kcal/mol)

Lespressione dell'azione di massa di questa reazione è: 10-6 8,2


concA-D X concC-B 10-s 6,8
[Equazione 4.2] 10- 4 5,1
concA- B X conce-o
10- 3 4,1
10- 2 2,7
dove concA-B, conce- o e così via, rappresentano la concentrazione dei si n-
10- 1 1,4
goli rèagenti espressa in moli per litro. Inoltre, in questa equazione, il valore
100 0,0
della Keq dipende dal valore di !iG secondo l'Equazione 4.3 (vedi anche la Ta-
10 1 - 1,4
bella 4.1).
102 - 2,7
!iG = - RTln Keq o Keq = e-!:>GIRT [Equazione 4 .3] 103 -4,1
Dato che l'energia di attivazione è generalmente tra le 20 e le 30 kcal/mol, gli
stati attivati non vengono, in pratica, mai raggiunti alle normali temperature
fisiologiche. Se ne deduce che l'alta energia di attivazione costituisce una bar-
riera energetica che impedisce qualunque alterazione spontanea dei legami
covalenti presenti nelle cellule.
Questa barriera è di estrema importanza, a tal punto che la vita non sarebbe
possibile se essa non fosse presente e se tutti gli atomi fossero nello stato di mi-
nore energia possibile. Non vi sarebbe, infatti, alcuna possibilità di immagaz-
zinare, in maniera transitoria, l'energia utile a svolgere le funzioni successive.
D 'altra parte, la vita sarebbe altrettanto impossibile se non fossero state trova-
te soluzioni utili ad abbassare l'energia di attivazione di specifiche reazioni in
maniera selettiva. Questo abbassamento dell'energia di attivazione è, inoltre,
di fondamentale importanza per consentire la crescita cellulare ad una velocità
sufficientemente elevata da non lasciare il tempo a forze casuali e distruttive,
quali le radiazioni ionizzanti o ultraviolette, di arrecare danni rilevanti.

I Nelle reazioni biochimiche gli enzimi


abbassano l'energia di attivazione
Gli enzimi sono molecole assolutamente necessarie alla vira; la loro funzione
consiste nelf accelerare la velocità delle reazioni chimiche essenziali per la cellu-
la. In particolare, l'energia di attivazione di specifici riarrangiamenti molecolari
viene abbassata dagli enzimi a valori che possono essere raggiunti mediante .l'e-
nergia cinetica corrispondente al calore prodotto dai movimenti molecolari (Fi-
gura 4.2). La presenza di uno specifico enzima porta all'eliminazione di questa
barriera energetica che, altrimenti, impedirebbe la rapida formazione di pro-
dotti, caratterizzati da un contenuto inferiore di energia libera. Gli enzimi non
influenzano mai l'equilibrio di una reazione; si limitano, semplicemente, ad ac-
celerare la velocità con cui l'equilibrio viene raggiunto. Di conseguenza, se l'e-
quilibrio termodinamico è sfavorevole alla formazione di una molecola, la pre-
senza di un enzima non può in alcun modo permetterne l'accumulo.
Poiché gli enzimi catalizzano tutte le reazioni molecolari che avvengono nelle
nostre cellule, la conoscenza del contenuto di energia libera delle molecole
coinvolte non ci permette di affermare con certezza che una reazione, energe-
ticamente favorita, possa avvenire. Infatti, è sempre necessario prendere in
considerazione la velocità della reazione stessa, la quale, a sua volta, assume
un'importanza biologica solo se la cellula possiede un enzima deputato a
quella specifica reazione.
58 I Parte prima • Chimica e genetica C> 88-08-1 7890-0

Figura 4 .2 .
Gli enzimi (curva viola) abbassano l'e-
nergia di attivazione e per questo ac- energia
celerano la velocità della reazione. O s- di attivazione
serva che il t.G della reazione non cam- dell a reazione
b ia perché il punt o d i equ ilibrio resta non catalizzata
inalterat o .

and amento della reazione

I L'energia libera nelle biomolecole


La termodinamica insegna che tutte le vie biochi miche devono essere caratte-
rizzate da una diminuzione del!' energia libera. Questo è quello che chiaramen-
te avviene nei processi degradativi, in cui molecole assume come cibo, termo-
dinamicamente instabili, sono convertite in molecole più stabili, come l'an i-
dride carbonica e l'acqua, con la conseguenre liberazione di calore. Tucri i pro-
cessi degradativi hanno principalmente due scopi: (1) la produzione di piccoli
frammenti organici ch e servono da precursori per la sinresi di altre molecole
organiche di dimensioni maggiori; (2) la conservazione di una buona percen-
tuale dell'energia libera della molecola che è stata degradata in una forma raie
da essere utilizzata per svolgere attività cellulari. Quest'ulcimo scopo viene rag-
giunro accoppiando alcuni passaggi della degradazione con la formazione di
molecole ad alta energia, come l'AT P, capaci di immagazzinare l'energia libera.
È importante osservare com e l'energia libera di una m olecola, soggetta a de-
gradazio ne, non venga completamente convertita nell'en ergia libera imma-
gazzinata nelle molecole ad alto conrenuto energetico. Se così non fosse, in-
fatti, un processo degradarivo non sarebbe caraccerizzaro da una diminuzione
dell'energia libera, e, di conseguenza, non vi sarebbe la possibilità di po rtarlo
a termine. In realtà, sappiamo ch e in cucci i processi degradativi almeno la
mecà dell'energia libera, contenuta nella molecola che è scata demolita, è con-
vertita in calore o entropia. Per esempio, è stato stimato che, nelle cellule, cir-
ca il 40% dell 'energia libera del glucosio viene usato per la formazione di
nuovi composti ad alta energia, menrre il resranre 60% viene dissipato socco
fo rma di calore ed enrropia.

L'idrolisi dei legami ad alta energia porta ad un ~G


significativamente negativo
U na molecola ad alta energia è caratterizzata da uno o più legami la cui rot-
tura mediata dall'acqua, la così detta idrolisi, è accompagnata da una grande
diminuzione dell'energia libera (5 kcal/mol). In particolare, i legami la cui
idrolisi porca ad elevati valori negacivi di D..G sono detti legami ad alta ener-
gia, un termine che può gen erare confusione perché non è il legame che pos-
siede un'alta energia, ma è l'idrolisi di quel legame che produce un'elevata
energia libera. Tuttavia, il termine legame ad afta energia viene largamente im-
piegato e, per questo m otivo, continueremo ad usarlo e indicheremo i legami
ad alta energia con il simbolo ,.., .
Lenergia di un tipico legame ad alta en ergia (7 kcal/ mol) è molto inferiore al-
l'energia che si libererebbe se una molecola di glucosio venisse completamen-
te degradata in un uni co passaggio (688 kcal/ mol) . D 'altra parte, la degrada-
zione di una molecola di glucosio in un singolo passaggio sarebbe molto inef-
ficiente per la formazione di legami ad alca energia. Questa è senza dubbio la
ragi6ne per cui, nelle cellule, il glucosio viene degradaro tramite numerosi
IO 88-08-17890-0 4. L'importanza dei legami forti I 59

passaggi. Solamente in questo modo, infatti, la quantità di energia rilasciata


ad ogni passaggio degradativo è dello stesso ordine di grandezza dell'en ergia
libera ottenuta dall'idrolisi di un legame ad alta energia.
L'ATP rappresenta la molecola ad alta energia di maggiore importanza biolo-
gica. Esso viene sintetizzato a partire da ADP e fosfato inorganico G, usando
l'energia che deriva dalle reazioni di degradazione, o dal sole, attraverso la fo-
tosintesi. Oltre all'ATP, esistono altri composti ad alta energia molto impor-
tanti. Alcuni si formano direttamente nel corso dei processi di degradazione;
altri sono sintetizzati u tilizzando una parte dell'energia libera dell'ATP. Nella
Tabella 4.2 sono elencati i più importanti legami ad alta enèrgia, tutti formati,
come si può vedere, da atomi di fosfato o di zolfo . Il pirofosfato, il legame ad
alta energia presente nell'ATP, deriva dall'unione di gruppi fosfato (G~ G).
Esso, però, non è l'unico legame contenente fosfato ad alta energia; infatti,
l'attacco di un gruppo fosfato ad un atomo di ossigeno, a sua volta apparte-
nente ad un gruppo carbossilico, porta alla formazione d i un legame acilico

Tabella 4.2 Importanti classi di legami ad alta energia lo-------------------~


LiG della reazione,
Classe Esempio molecolare Reazione kcal/ mol

Pirofosfato G-G pirofosfato òG= - 6

Nucleoside difosfato adenosina --G - G ADP ~ AMP+ G òG= - 6


(ADP)

Nucleoside trifosfato adenosina --G - G - G ATP ~ ADP+ G òG = -7


(ATP)
ATP ~ AD P +G - G òG= - 8

Enoi-fosfat i o- O fosfoenolpiruvato
"--e!' (PEP)
PEP ~ piruvato + G t.G= -12
I
c- o - G
Il
CH2

Amminoaci l adenilati adenosina

·-o" o~
~C-C- NH3 II
H
AMP-AA ~ AMP + AA t.G = -7

~o
HC-C~
N12 " 0-
t.G -8
Guanidinio fosfati creatina - P ~ creatina + P =
/ "-. .H A
H3C C- N - w
Il
NH
creatin -fosfato

~o
Tioesteri H C - C~ acetil-CoA CoA-SH + acet ato t.G = -8
3 '"
S-CoA
acetil-CoA
60 IParte prima •Chimica e geneti ca C SS-08-17890-0

ad alca energia. Oggi è ben chiaro che i legami ad alca energia contenenti ato-
mi di zolfo giocano un ruolo nel metabolismo energetico di importanza para-
gonabile a quelli che coinvolgono il fosforo. :Cacecil-CoA è certamente la mo-
lecola più imporrante era quelle caratterizzate da un legame carbonio-zolfo
ad alta energia. Questo legarne, infatti, è la principale fonte di energia per la
biosintesi degli acidi grassi.
La grande differenza nei valori di t::.G dei legami ad alca energia (vedi la Ta-
bella 4.2) mette in risalto come la definizione di legarne ad "alca energia" sia,
talvolta, piuttosto arbitraria. Per questo, generalmente, si definisce legame ad
alta energia quel legame la cui idrolisi può essere accoppiata ad un'altra rea-
zione utile per un importante processo biosintetico. Per esempio, il t::.G nega-
tivo che accompagna l'idrolisi del glucosio-6-fosfato è di circa 3-4 kcal/mol.
Dato che questo t::.G non è sufficiente per la sintesi di un legame peptidico, il
legarne estere-fosfato tipico del glucosio-6-fosfato non viene incluso era i le-
gami ad elevata energia.

I I legami ad alta energia nelle reazioni


biosintetiche
La sintesi di grandi molecole a partire da subunicà più piccole richiede, spes-
so, l'apporto di energia libera. Nondimeno, canto un processo biosintetico,
quanto uno di degradazione, non potrebbero esistere se non fossero caratte-
rizzaci da una netta diminuzione di energia libera. Ciò significa che molti
processi biosintetici richiedono una fonte esterna di energia libera che deriva
dai composti ad alta energia. Di conseguenza, la formazione di molci legami
biosintetici è associata alla rottura di un legame ad alca energia, in modo tale
che il t::.G netto sia sempre negativo. Per questo motivo, nelle cellule, i legami
ad alca energia sono generalmente caratterizzati da una vira media molto bre-
ve; quasi immediatamente dopo la loro formazione, avvenuta in una reazione
degradativa, essi vengono rotti per via enzimatica, allo scopo di fornire
l'energia necessaria al completamento di un'altra reazione.
È importante osservare come, generalmente, non rutti i passaggi di un pro-
cesso biosintetico richiedano la rottura di legami ad alca energia; spesso que-
sta è una caratteristica tipica solamente di uno o due passaggi. Talvolta questo
è dato dal fatto che il t::..G è favorevole, anche in assenza di una fonte esterna
di energia; in altri casi invece il t::..G è pari a zero o addirittura leggermente po-
sitivo. Questi piccoli valori positivi nelle variazioni di energia libera non so-
a; no, però, significativi, se accompagnaci da una reazione caratterizzata dall' i-
"O
~ non favorevole
drolisi di un legame ad alta energia. Ciò che conta veramente, come indicato
~ A---... B in Figura 4.3, è la somma di tutte le variazioni di energia libera che caratteriz-
"'e - o zano l'intero processo biosintetico. Per esempio non è importante che la K,,q
·ei molto favorevole
:g s - c di uno specifico passaggio biosintetico sia leggermente in favore della degra-
"' o -E E dazione (80:20) se la medesima costante, nel passaggio successivo, è cento
andamento della reazione volte più favorevo le alla biosintesi.
Figura 4.3
Allo stesso modo, in un processo degradativo non tutti i passaggi sono utili
Variazioni di energia libera in una via alla formazione di legami ad alca energia. Per esempio, nel lungo processo gli-
metabolica caratterizzata da moltepli- colicico che caratterizza l'idrolisi del glucosio (Embden-Meyerhof), solo due
ci passaggi, A --+ B --+ C--+ D --+ E. passaggi generano ATP. Vi sono, inoltre, m olci processi degradativi che ri-
I due passaggi (A --+ B e C--+ O) non fa-
voriscono la reazione d a A ad E, poiché chiedono, in uno o due passaggi, la rottura di un legame ad alta energia. An-
caratterizzati da un p iccolo valo re posi- che in questo caso la degradazione del glucosio, caratterizza ta dall'urilizzo di
tivo di t.G . Tuttavia, essi risultano tra- due molecole di ATP ogni quattro molecole neosintecizzate, sembra rappre-
scurabili grazie al significativo valore
negativo d i t. G che accompagna i d ue
sentare un_ottimo esempio. È comunque evidenre che, in questo processo,
passaggi B _,. C e D --+ E. Ne consegue c~sl co~e t? q_ualunque altro pro~esso degradativo che porca alla produzione
che la reazione, nel suo insieme, vede d1 energia, il n sulrato finale consiste nella produzione di un numero di lega-
favorita la conversione di A in E. mi ad alta energia maggiore di quelli consumaci.
:E •7890-0 4. l'importanza dei legami forti I 61

egami peptidici si idrolizzano spontaneamente

'-2 fo rmazione di un dipeptide e di una molecola d'acqua, a partire da due


i=:.mi noacidi, è caratterizzata da un l!l.G che oscilla tra 1 e 4 kcal/mol, a se-
- -nda di quali amminoacidi sono stati uniti. Queste variazioni positive in
-=-~a libera ci indicano, immediatamente, come una carena polipeptidica
- .;J si possa formare a partire dagli amminoacidi liberi. È importante, inol-

-=- osservare come in una cellula le molecole d'acqua siano di gran lunga più
hondanti (oltre cento volte) di ogni altra molecola; per questo motivo l'e-
_::ilib rio di qualunque reazione in cui partecipa l'acqua è fortemente sposta-
,-erso il consumo di una molecola così largamente in eccesso. Questo è evi-
c..-me nella definizione delle costanti di equilibrio. Per esempio, la reazione
:::::ie porta alla formazione di un di peptide
amminoacido (A) + amminoacido (B)-------+ dipeptide (A-B) + H 20
[Equazione 4.3]
-:.ene descritta dalla seguente costante di equilibrio:
concA-B X concHP
l<eq = [Equazione 4.4]
concA X concB

.:o\-e le concentrazioni so no espresse in moli per litro. Se ne deduce che,


.::aro uno specifico valore di f<eq (valore legato al l!l.G secondo la formula
-'lG= -RTln f<eq), una concentrazione significativamente maggiore di ac-
qua implica una corrispondente minore concentrazione di dipeptide. Per-
tanto, le concentrazioni relative sono particolarmente importanti; infatti,
un semplice calcolo permette di dimostrare come spesso l'idrolisi possa
?recedere spontaneamente anche quando il l!l.G della reazione non idroliti-
ca è pari a -3 kcal/mol.
Perciò, e solo teoricamente, le proteine sono molecole instabili, che, in un pe-
riodo di tempo opportuno, saranno soggette alla spontanea degradazione ad
amminoacidi liberi. D 'altra parte, in assenza di specifici enzimi, questa idro-
lisi spontanea avviene così lentamente da non costituire alcun problema per il
metabolismo cellulare. In altre parole, una volta sintetizzata, una proteina è
srnbile, a meno che non intervenga un processo di degradazione catalizzato
da uno specifico enzima.

Un ~G positivo viene accoppiato ad uno negativo

Per permettere la sintesi di proteine è necessario aggiungere del!' energia libe-


ra agli amminoacidi; questo meccanismo è diventato chiaro quando si è sco-
perto il ruolo fondamentale dell'ATP come donatore di energia. L'ATP è ca-
ract~rizzato da tre S!uppi fosfato, legati ad u!1a mol~cola di ad_eno~ina (ade-
nosma-0-@ -Q) . Quando uno o due dei gruppi -G termmal1 vengono
scissi mediante idrolisi, si assiste ad una brusca diminuzione del!' energia li-
bera.

Adenosina-0-G - G - G + H 20-----+ Adenosina- 0 -G - G + G


(LiG = -7 kcal/mol) [Equazione 4.5]

Adenosina-0-G - G - G + H 2 0----7 Adenosina- O -@ + G- G


(LiG = - 8 kcal/mol) [Equazione 4.6]

Adenosina- 0 -G - G + H 20----? Adenosina-O- @ + G


(LiG = -6 kcal/mol) [Equazione 4.7]
62 IParte prima • Chimica e genetica e 88-08-17890-0

Tutti questi processi di idrolisi hanno un valore di /)..G considerevolmente più


negativo, in valore assoluto (valore numerico indipendente dal segno), rispet-
to alle variazioni positive di energia libera che accompagnano la sintesi di po-
limeri, a partire dalle subunità monomeriche.
I.: accorgimento che caratterizza rutti questi processi biosintetici, che di per sé
hanno un /)..G positivo, è quello di essere accoppiaci all' idrolisi di legami ad
alta energia, caratterizzati da un /)..G negativo con un valore assoluto maggio-
re. Perciò, durante la sintesi proteica, la formazione di ogni legame peptidico
(/),_G = +0,5 kcal/mol) è associata alla rottura dell'ATP che dà AMP e piro-
fosfato, reazione caratterizzata da un /)..G pari a -8 kcal/ mol (vedi l'Equazio-
ne 4 .6). Questo processo porca ad un /)..G netto di - 7,5 kcal/mol, un valore
negativo più che sufficiente ad assicurare che l'equilibrio della reazione sia
spostato verso la sintesi della proteina piuttosto che verso la sua degradazione.

I L'attivazione dei precursori nelle reazioni


di trasferimento di gruppo

Quando l'ATP è idrolizzato ad ADP e fosfato, la m aggior parte dell'energia


libera viene rilasciata so rto forma d i calore. Dal momento che il calore non
può essere usato per la formazione di legami covalenti, una reazione accop-
piata non può derivare da due reazioni completamente separate, una con un
/)..G positivo e l'altra con uno negativo. Invece, una reazione accoppiata può
essere ottenuta in due o più reazioni successive. Queste sono semp re reazioni
di trasferimento di gruppo, ovvero reazioni in cui le molecole si scambiano
gruppi funzionali. Questo tipo d i reazione non comp rende quelle di riduzio-
ne e di ossidazione. G li enzimi che catalizzano questi trasferimenti sono det-
ti transferasi. Si consideri la reazione
(A-X) + (B-Y) ~ (A-B) + (X- Y) [Equazione 4 .8]
In questo esempio il gruppo X è scambiato con la molecola B. Le reazioni d i
trasferimento sono arbitrariamente definite, escludendo l'acqua come parte-
cipante. Infatti, quando l'acqua è coinvolta
(A-B) + (H-OH) ~ (A- OH) + (B- H) [Equazione 4.9]
la reazione viene chiamata idrolisi e gli enzimi coinvolti sono delle idrolasi.
Nel presence contesto, le reazioni di trasferimento di gruppo che ci interessa-
no sono quelle che coinvolgono i gruppi funzionali associaci a legami ad alta
energia. Un gruppo ad alto contenuto energetico è trasferito su un'appro-
priata molecola accettrice, formando un legame ad alta energia. In tal modo,
il uasferimento di gruppo permette di trasferire legami ad alta en ergia da una
molecola all'altra. Per esempio: le Equazion i 4.10 e 4.11 mostrano come l'e-
nergia presence nell'ATP venga trasferita alla molecola di GTP, uno dei pre-
cursori usati nella sintesi dell'RNA:
Adenosina-O-O-O + Guanosina-0 ~
Adenosina-O-O + Guanosina--0 -O [Equazione 4.10]

Adenosina- O-O-O + Guanosina- 0-0 ~


Adenosina-O - O + G uanosina--0-G-G [Equazione 4.11]

Il gruppo ad alta energia O- O del GTP gli permette di unirsi spontanea-


mente con un'altra molecola. Il GTP è quindi un tipico esempio di quella
che viene chiamata una molecola attivata; in modo simile, si definisce attiva-
zione di gruppo il processo che trasferisce un gruppo ad alta energia.
Q 88-08-17890-0 4. L'importanza dei legami forti I 63

ATP Figura 4.4


I t rasferimenti di gruppo più importan-
ti coinvolgono l'ATP.

R-0-0 -G + 0-°d A

AD P AMP
fi o
G-G +
"o-O-°d
R-C ::?' A

- AMP

La versatilità dell'ATP nel trasferimento di gruppo

La sintesi dell'ATP ha un ruolo fondamentale nell'accumulare l'energia delle


molecole che fungono da donatori. Sia nelle fosforilazioni fotosintetiche che
in quelle ossidative, per esempio, l'energia è usata per sintetizzare ATP, a par-
tire da ADP e fosfato:
Adenosina-O - G- G + energia~ Adenosina-G - G - G
[Equazione 4 .12]
Dal momento che l'ATP è la prima molecola che riceve gruppi ad alta ener-
gia, esso è il punto di partenza di un gran numero di reazioni in cui gruppi ad
elevato contenuto energetico vengono trasferiti a molecole a bassa energia, in
modo da dare loro la possibilità di reagire spontaneamente. Questo ruolo
fondamentale dell'ATP sfrutta la presenza, nella molecola, di due legami ad
alta energia, la cui rottura rilascia gruppi specifici. Questo è evidente nella Fi-
gura 4.4, in cui vengono illustrati i tre importanti gruppi chimici che deriva-
no dall'ATP: il gruppo_pirofosfato (@- 0 ), l'adenosin-monofosfato (-AMP)
e il gruppo fosfato (- Cl). È importante osservare che questi gruppi manten-
gono la loro caratteristica, l'elevata energia, solo quando trasferiti ad un'ap-
propriata molecola accettrice. Per esempio, sebbene il trasferimento di un
gruppo - G ad un COO- e_orti alla formazione di un acilfosfato ad alto con-
tenuto energetico (COO- U ), il trasferimento dello stesso gruppo al gruppo
idrossilico di uno zucchero (-C-OH) genera Un legame a bassa energia (ca-
ratterizzato da un !).G di idrolisi minore di 5 kcal/mol), come accade nella
formazione del glucosio-6-fosfato.

L'attivazione degli amminoacidi per mezzo del legame


con AMP
Come mostrato nell'Equazione 4.1 3, il trasferimento di un gruppo AMP dal-
l'ATP al gruppo COO- di un amminoacido porta all'attivazione dell'ammi-
noacido stesso:
64 I Parte prima • Chimica e genet ica e 88-08-1 7890-0

H R H R
I+ I ,,'i~0 I+ I ~o + G-G
H-N - e -e + Adenosina --G - G - G - H- N - C-C
I I "-0 - I I "-o -O-Adenosina
H H H H

[Equazione 4.13)

(in questa equazione R rappresenta lo specifico gruppo laterale dell'ammi-


noacido). Gli enzimi che catalizzano questo tipo di reazione sono detti am-
minoacil-sintetasi. Dal punto di vista termodinamico, un amminoacido
(M) può essere efficientemente utilizzato per la sintesi proteica solo dopo at-
tiva.zione. Malgrado ciò, i complessi M-AMP non sono i diretti precursori
delle proteine. Per ragioni che spiegheremo solamente nel Capitolo 14, è ne-
cessario che avvenga anche una seco nda reazione di trasferimento di gruppo,
in cui l'amminoacido, con il suo gruppo carbossilico arrivato, viene trasferito
all'estremità di una molecola di tRNA:
M-AMP + tRNA ~ M-tRNA + AMP [Equazione 4.14]
Il legame peptidico si forma, quindi , per condensazione dell'M-tRNA all'e-
suemità della catena polipeptidica che si sta formando:
M-tRNA + catena polipeptidica crescente (di n amminoacidi)~
tRNA +catena polipeptidica crescente (d i n + 1 amminoacidi)
[Equazione 4.15)
Il passaggio finale di questa "reazione accoppiata", cosl come quello di rurce
le altre reazioni dello stesso tipo, consiste necessariamente nella rimozione del
gruppo arrivante e nella co nversione di un legame ad alta energia in uno con
una minore energia libera di idrolisi. Questa è la fonte del D.G negativo, che
spinge la reazione verso la sintesi proteica.

I precursori degli acidi nucleici sono attivati dal G-G

Entrambi i tipi di acidi nucleici, !'RNA e il DNA, vengono sinterizzati a par-


tire da monomeri mononucleocidici, detti nucleosidi fosfati. Da un punto di
vista termodinamico, i mononucleoridi hanno ancora meno possibilità di
unirsi tra loro rispetto agli amminoacidi; questo perché i legami fosfodieste-
rici che li uniscono rilasciano una considerevole quantità di energia libera
(-6 kcal/mol), se idrolizzaci. Questo significa che gli acidi nucleici rendono
ad idrolizzarsi spontaneamente producendo dei mononucleocidi, anche se ciò
avviene lentamente. Se ne deduce che nella sintesi deglr acidi nucleici, ancor
più che in quella proteica, è di fondamentale importanza fare uso di precur-
. . .
son art1vat1.
Gli immediati precursori del DNA e dell'RNA sono i nucleosidi-5'-trifosfati.
Per il DNA essi sono rappresentati dal dATP, dGTP, dCTP e dTTP, dove d
indica deossi; per !'RNA i precursori sono l'ATP, il GTP, CTP e UTP. L:ATP,
quindi, non rappresenta soltanto la principale fonte dei gruppi ad alta energia
nelle reazioni di trasferimento di gruppo, ma è esso stesso un direrco precur-
sore dell'RNA. Gli altri tre precursori dell'RNA derivano da reazioni di tra-
sferimento di gruppo analoghe a quelle descritte nelle Equazioni 4. 1Oe 4.1 1.
I deossirrifosfaci sono formati sostanzialmente nello stesso modo: in seguito
alla sintesi dei deossimononucleoridi, essi vengono trasformati in rrifosfari da
un trasferimento di gruppo dall'ATP:

-, Deossinucleoside--G +ATP ~ Deossinucleoside--G-G + ADP


[Equazione 4. 16)
Deossinucleoside--G - G + ATP ~
D eossinucleoside--G-G --G + ADP [Equazione 4.17]
C> 88-08-1 7890-0 4. L'importanza dei legami forti I 65

Questi rrifosfati possono ora unirsi originando le catene polinucleotidiche,


unite da legami fosfodiesterici. In questa reazione di trasferimento di gruppo,
un legame pirofosfato viene rotto con la liberazione di un gruppo pirofosfato:
Deossinucleoside-G - G- G
+ una catena polinucleotidica nascente (di n nucleotidi) ~
G- G + una catena polinucleotidica n ascente (di n + 1 nucleotidi)
[Equazione 4.18]
Questa reazione, a differenza di quella che forma i legami peptidici, non è ca-
ratte!izzata da un !iG negativo, ma, piuttosto, da uno leggermente positivo,
di circa 0,5 kcal/mol. Tale osservazione porta immediatamente al seguente
interrogativo: qual è, in questo processo, la necessaria fonte di energia libera,
se il !iG è positivo e il prodotto finale è, comunque, la sintesi di una catena
polinucleotidica?

L'importanza del rilascio di G- G nella sintesi degli acidi


nucleici
l:energia necessaria alla sintesi degli acidi nucleici deriva dall'idrolisi del pi-
rofosfato, che avviene contemporaneamente alla formazione del legame fo-
sfodiesterico ad alta energia. Tutte le cellule contengono un enzima, la piro-
fosfatasi, che rompe le molecole di pirofosfato, immediatamente dopo la loro
sintesi:
G- G ~ 2 G (11G = - 7 kcal/mol) [Equazione 4.19]
l:elevato valore negativo del !iG rende questa reazione irreversibile; in altre
parole, una volta che il G- G è rotto, non si riforma più.
La formazione di un legame da parte di un nucleoside monofosfato (Equa-
zione 4 .1 6), accoppiata alla rottura di un gruppo pirofosfato (Equazione
4 .19), ha una costante di equilibrio data dalla somma dei valori di !iG delle
due reazioni: (0,5 kcal/mol) + (- 7 kcal/mol). Il valore risultante (!iG =
-6,5 kcal/mol) ci consente di comprendere perché la degradazione sponta-
nea deg_li ac~di nucleici nei loro precursori, i nucleosidi trifosfati, non avven-
ga quasi mai.
Questo è un esempio molto efficace del fatto che, spesso, è la variazione netta
(totale) in energia libera, che caratterizza un gruppo di reazioni, a determinare
se una singola reazione del gruppo possa avvenire. Reazioni con piccoli valori
positivi di !iG, che di per sé non potrebbero mai avvenire, fanno spesso parte
di importanti processi metabolici, in cui sono accompagnate da reazioni con
grandi decrementi di energia libera. Dobbiamo, perciò, sempre tenere a men-
te che una singola reazione (o addirittura una singola via metabolica) non av-
viene mai in modo isolato e che la natura dell'equilibrio della reazione viene
costantemente variata dall'aggiunta o dalla rimozione dei metaboliti.

La rottura del G ... G caratterizza la maggior parte


delle reazioni biosintetiche
La sintesi degli acidi nucleici non è l'unica reazione la cui direzione è deter-
minata dal rilascio e dalla successiva idrolisi del G- G . In sostanza, tutte le
reazioni biosintetiche sono caratterizzate da uno o più passaggi in cui avviene
la produzione di pirofosfato. Consideriamo, per esempio, l'attivazione di un
amminoacido attraverso il legame di AMP. Il trasferimento di un legame ad
alta energia dall'ATP al complesso AA-AMP ha un valore intrinseco di !iG
leggermente positivo. È la liberazione e la rottura del gruppo _pirofosfato ter-
minale dell'ATP a fornire il !iG negativo, necessario a dirigere la reazione.
Il grande vantaggio energetico ottenuto dall'idrolisi del pirofosfato è imme-
66 I Parte p rima • Chimica e genetica e 88-08-1 7890-0

+ o
fosfato
nucleoside
di fosfato

caten a in crescita
(lunga n nucleotid i)
catena in crescita
(lunga n + 1 nucleotidi))

+ + 0 -0 --- o+ o
pirofosfato fosfato
nucleoside ,,
,, ,,
,, ,,
trifosfato
,,
,, ,,
catena i n crescita ,, "
(lunga n nucleotidi) ,, ""
"" catena in crescita
,,, "'"' (lunga n + 1 nucleotidi)
,, ,,
"'

0-0-~ +
nucleoside 0 -0 --- O+O
piro fosfato fosfato
trifosfato

catena in crescita
(lunga n + 1 nucleotid i)
catena in crescita
(lunga n + 2 nucleotidi)

Figura 4.5 diatamente evidente, se si considerano i problemi cui andrebbe incontro una
Due scenari per la sintesi degli acidi cellula qualora cercasse di sintetizzare gli acidi nucleici a partire dai nucleosi-
nucleici. (a) Sintesi degli acidi nucleici a
partire dai nucleosidi difosfati. (b) Sin- di difosfati piunosto che dai rrifosfati (Figura 4.5). Una volta formato il lega-
tesi degli acidi nucleici per mezzo dei me fosfodiesterico verrebbe rilasciato fosfato, anziché pirofosfato. I legami fo-
nucleosidi trifosfati. sfodiesterici si formano senza una significativa diminuzione di energia libera
e, pertanto, non sono stabili in presenza di un'elevata quantità di fosfato. Di
conseguenza, la reazione biosintetica sarebbe facilmente reversibile; ovvero,
se si accumulasse fosfato, la reazione, in accordo con la legge dell'azione di
massa, sposterebbe il proprio equilibrio nella direzione della degradazione de-
gli acidi nucleici. Inoltre, una cellula non è in grado di rimuovere i gruppi fo-
sfato appena generati, poiché tutte le cellule necessitano di un elevato livello
di fosfato per crescere. Questa rimozione, però, è necessaria per impedire che
la reazione di sintesi degli acidi nucleici si o rienti verso la degradazione. Per
contro, una serie di reazioni che liberano pirofosfato, seguire dalla rapida de-
gradazione di quest' ultimo in due molecole di fosfa to, dissocia la liberazione
di fosfato dalla reazione di biosintesi degli acidi nucleici, impedendo, cosl,
l'inversione dell'equilibrio della reazione (Figura 4.5) . Di conseguenza, è
molto difficile che nella cellula si accumuli tanto fosfato da spostare l' equili-
brio di entrambe le reazioni nel senso della degradazione. È quindi evidente
e 88-08-11a90-0 4. L'importanza dei legami forti I 67

che l'uso di nucleosidi crifosfaci, quali precursori degli acidi nucleici, non è
affatto casuale.
Un ragionamento del cucco analogo è alla base del fatto che l'ATP, e non
l'ADP, sia il donatore di energia nelle cellule. Inizialmente questa scelta sem-
;:Ò ai biochimici coralmente arbitraria, ma ora comprendiamo come moire
~o ni , in cui l'ADP rappresenta la fonte di energia, potrebbero avvenire in-
- -=ferentemente in entrambe le direzioni.

Sommario _______________ ________________

.!.J una prima osservazione superficiale, la biosintesi di molecole in reazioni noce come reazioni di trasferimento di
::nolce molecole sembra violare il principio cermodinamico gruppo, e, in questo modo, permettono la formazione di
o ndo il quale una reazione spontanea è sempre cararce- nuovi composti ad alca energia. Queste ultime sono le m o-
= ta da una diminuzione dell'energia libera (tiG negaci- lecole che rappresen tano gli immediaà precursori di molti
'O • Per esempio , la sintesi delle proceine a panire ~fagli am- passaggi biosintetici.
:ninoacidi ha un tiG positivo. Questo apparente paradosso G li amminoacidi sono attivati attraverso il legame di un
puo essere faci lmente spiegato dall'osservazione che le rea- gruppo AMP, che deriva dall'ATP, per dare AA-AMP. L'e-
noni biosinreciche non procedo no nel modo teorico poscu- nergia contenuta nel legame ad alca energia dell'AA-AMP
bco secondo cui , per esempio, le proteine si formano a par- è simile a quella di un legame ad alca energia ·dell'ATP. C io-
ure dagli amminoacidi liberi. Al conrrario, i precursori ven- nonostante, la reazione di trasferimento di gruppo viene
go no enzimaticamenre trasformaci in molecole accivace, do- completata perché il G-G ad alto contenuto energetico,
u ce di un elevato conrenuto energetico, che, in presenza di formatosi quando viene sintetizzato AA- AMP, viene idro-
specifici enzimi, si uniscono spo ntaneamente dando o rigi- lizzato dalla pirofosfatasi in gruppi a basso contenuto ener-
ne al prodotto biosintetico desiderato. getico. Per questo motivo la reazione inversa, G- G +
Pertanto, molti processi biosintetici sono il risultato di rea- AA-AMP ~ ATP + AA non può avvenire.
zio ni "accoppiate", delle quali la prima fornisce la quantità Tutte le reazio ni biosintetiche, di fatto, portano al rilascio
sufficiente di energia, che, a sua volta, rende possibile che la di G-G. Immediatamente dopo la sua formazione, que-
econda reazio ne avvenga in modo spontaneo. La principa- sta molecola viene enzimaticamente scissa in due moleco-
le fonte di energia nelle cellule è l'ATP, che deriva dall'ag- le di fosfato, rendendo in questo modo impossibile inver-
giunta di fosfato inorganico all'ADP, processo che avviene tire la direzione della reazione biosintetica. L'idrolisi del
sia durante i processi degradativi (come la fermentazione e G - G rappresenta un grande vantaggio energetico e ci
la respirazione) che durante la fotosintesi. CATP co nriene fo rnisce una spiegazione del perché l'ATP, e non l'ADP, sia
diversi legami ad alca energia la cui idrolisi è caratterizzata la principale fo nte di energia. L'ADP, infatti, non è in gra-
da valori di tiG fortemente negativi. I gruppi formaci da le- do di trasferire gruppi ad alca energia e, nello stesso tem-
gami ad alca energia sono denominati, per l'appunto, grup- po, portare al rilascio di gruppi G- G come prodotti se-
pi ad alca energia. Questi possono essere trasferiti ad altre condari.

Bibliografia - -- - - - -- - - - - -- - - - - -- -- - -- - -- -
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·Purich D .L. (ed.) 2002. Methods in enzymology: Enzyme ki- cedente) Zanichelli, Bologna 200 1.)
(}.PITOLO
I legami deboli e forti
determinano la struttura
delle macromolecole

• Le strutture di ordine 1 DNA, l'RNA e le proteine sono tutti polimeri formati da elementi più
superiore sono
determinate da
interazioni
J semplici. Come si è visto nel Capitolo 4, la sintesi di questi polimeri di-
pende da una catalisi controllata, che permette la giunzione di questi ele-
menti: i nucleotidi per il DNA e l'RNA (vedi la Figura 2. 11), e i 20 ammi-
intramoleco lari noacidi, con il loro specifico rRNA trasportatore, per le proteine. Lassemblag-
e intermolecolari gio di queste carene richiede la rottura di una quantità di legami altamente
energetici. Per tutte queste molecole, l'ordine in cui vengono polimerizzati i
• La formazione di legam i
componenti di base determina la loro funzione generica e biochimica.
idrogeno determina la
Sebbene la sequenza degli elementi di base determini l' informazione primaria
conformazione specifica
dell'RNA, del DNA e delle proteine, i legami deboli giocano tuttavia un ruo-
delle proteine
lo critico nel determinare la struttura e la funzione di questi polimeri; infatti
• La maggior parte delle essi assum ono la conformazione che permette una specifica funzione soltanto
proteine ha una dopo la formazione di un buon numero di legami secondari .
struttu ra modulare, I legami idrogeno, ionici, idrofobici e le interazioni di van der Waals, descrit-
contenente due o tre ti nel Capitolo 3, inducono le proteine a formare siti di legame con altre mo-
domini lecole e il DNA ad assumere la sua caratteristica struttura a doppia elica. In-
fatti, la rottura di queste interazioni (per esempio, per mezzo del calore o di
• I legami deboli
detergenti) distrugge l'attività di quasi tutte le molecole biologiche, anche
permettono un corretto
senza l'idrolisi di legami covalenti. In questo capitolo descriveremo breve-
posizionamento delle
mente la struttura delle macromolecole biologiche e le forze che la controlla-
proteine su lle molecole
no. DNA ed RNA saranno qui discussi brevemente mentre lo saranno più
d i DNA e RNA
estensivamente nel Capitolo 6. Focalizzeremo, invece, la nostra attenzione
• L'allosteria, ovvero la sulle proteine. La parte finale del capitolo riguarderà, in particolare, le inte-
regolazione di una razioni fra proteine e acidi nucleici, un a funzione cruciale per molti processi
funzione proteica che incontreremo in questo libro, e infine il controllo allosrerico per la fun-
attraverso il zione delle proteine.
cambiamento di forma

I Le strutture di ordine superiore


sono determinate da interazioni
intramolecolari e intermolecolari
Il DNA può formare un'elica regolare
Le molecole di DNA normalmente hanno una configurazione ad elica rego-
lare. C iò dipende dal fatto che la maggior parte delle molecole di D NA sono
formate da due catene antiparallele di nucleotidi, che presentano un a strut-
tura complementare (per maggiori dettagli vedi il Capitolo 6). Legami non
covalenti, sia interni che esterni alla doppia elica, stabilizzano la struttura. I
due filamenti si avvolgono l'uno sull'altro, tenuti insieme da legami idrogeno
che si formano fra le coppie complementari di purine e pirimidine (Figura
5.1). Cadenina è sempre appaiata con la ti mina, mentre la guanina è appaia-
ta con la citosina. Ino ltre, tutti gli aromi del fosfato e dello zucchero, che
stanno sulla superficie esterna della doppia elica, formano legami con le mo-
lecole di acqua circostanti.
C SS-08-17890--0 5. I legami deboli e forti determinano la struttura delle macromolecole \ 69
Figura 5.1
I legami idrogeno fra coppie di basi
del DNA. La fig ura mostra la posizione
e la lunghezza dei legami idrogeno fra
ti mina coppie d i basi. Sono, inoltre, raffigurati
i legami covalenti fra gli atomi delle ba-
si, ma non sono d istinguibili quelli sin-
goli dai doppi (vedi la Figura 6.6).

11 ,1 A

e> I

citosina

10,SÀ
o
!
Le coppie di basi purine-pirimidine sono rivolte verso il centro della moleco-
la. Tali coppie hanno una superficie planare e questa struttura permette loro
di impilarsi l'una sull'altra, formando delle zone di elettroni condivisi (1t - rt) e
limitando il contatto con l'acqua. Questa disposizione, conosciuta come im-
pilamento delle basi, riveste una minor importanza per le molecole a singolo
fi lamento, dove la superficie idrofobica delle basi è esposta all'ambiente ac-
quoso circostante, una condizione energeticamente non favorevole. Invece,
poiché le pirimidine hanno un ingombro sterico inferiore rispetto alle puri-
ne, la complementarità delle basi, nella doppia elica, determina una struttura
molto regolare della molecola e ciò permette una limitata esposizione delle
basi all'ambiente.
Le molecole di DNA a doppia elica sono molto stabil i per due ragioni. Primo,
la rottura della doppia elica porterebbe le basi a contatto con l'acqua (evento
I \
molto poco favorevole). Secondo, il doppio filamento co ntiene un grandissi-
mo numero di legami deboli, disposti in modo tale che la maggior parte di essi
non può aprirsi , senza che se ne aprano simultaneamente molti altri. Così an-
che se le variazioni termiche dell'ambiente aprono in continuazione alcune
copp ie di basi, le due catene non si separano completamente per la presenza di
molti altri legami idrogeno che rimangono intani (Figura 5.2). Una volta che
un dato legame è rotto, l'evento successivo più probabile è quello del ripristino
dello stesso legame, in modo da ritornare alla configurazione originale, piut-
tosto che la rottura di ulteriori legami. A volte, ovviamente, il primo evento è,
statisticamente, seguito dalla rottura di altri legami e così via. Queste rotture
multiple sono, comunque, abbastanza rare, così che la doppia elica, anche nel Figura 5.2
La rottura dei legami idrogeno delle
caso in cui fosse molto corta (una decina di paia di basi), è una strutrura stabi- coppie di basi all'estremità di una mo-
le a temperatura ambiente. Quando, invece, i filamenti di DNA si separano lecola di DNA è determinata dalle va-
completamente, lo fanno sempre iniziando dalle estremità della molecola e riazioni termiche dell'ambiente. La fi-
procedendo verso l' interno. Ciò avviene perché le coppie di basi che si divido- gura mostra che, una volta che i legami
delle coppie terminali si sono rotti,
no hanno la doppia elica, che dovrebbe funzionare da stabilizzatore, soltanto possono riformarsi (in basso a sinistra)
da una parte. Cioè, la doppia elica è presente o a destra o a sinistra della zona o se ne possono rompere in numero
separata. Come verrà descritto con maggiori dettagli in seguito, lo stesso feno- maggiore.
70 I Parte prima • Chimica e genetica e BS-08· i1a90.o

meno, cioè la formazione di legami deboli multipli, determina e regola an che


la stabifoà delle proteine.
I legami secondari divengono sempre più instabili con l'aumentare della tem-
peratura. Frequentemente, a temperature molto elevate, si ha la rottura con-
temporanea di un significativo numero di questi legami, per cui una moleco-
la, di solito, perde la sua forma originale (evento indicato come processo di
~enaturazione) ed assume una configurazione inatàva o denaturata.

L'RNA forma una grande varietà di strutture

La regolarità strutturale della doppia elica del DNA contrasta con quella del-
!' RNA, che è normalmente formato da una molecola a singolo filamento. Al-
cune molecole di RNA (come gli RNA messaggeri che funzionano come por-
tatori transitari dell' informazione genetica) sono costantemente associate a
proteine e, quindi, non hanno una struttura terziaria indipendente. Altre
molecole di RNA si ripiegano invece su se stesse, formando strutture terziarie
stabili. QueStç sono determinate da interazioni intramolecolari, che portano
alla formazione di strutture secondarie, che, a loro volta, interagiscono l'una
con l'altra, determinando appunto la struttura terziaria della molecola. Que-
ste strutture sono stabilizzate dai classici appaiamenti di Watson-Crick fra le
basi, dalla presenza di basi non usuali che si trovano soltanto nell'RNA e/o
dalle forze d' impilamento idrofobiche che si stabiliscono fra le basi stesse.
L'RNA differisce, dal punto di vista chimico, dal DNA per la presenza di un
gruppo ossidrilico in posizione 2' nello zucchero. Nella struttura ripiegata
delle molecole di RNA, questo gruppo ossidrilico partecipa ad interazioni
che permettono la stabilizzazione della struttura della molecola. Inoltre il le-
game di ioni bivalenti (come M g2+, Mn2+ e Ca2 +) all'RNA è cruciale per la
formazione di una conformazione stabile, poiché questi ioni possono ma-
scherare le cariche negative dello scheletro dell'RNA, permettendo alle regio-
ni della molecola di avvolgersi strettamente su se stesse.
Nella Figura 14. 16 è illustrato un tRNA (molecola che partecipa alla sintesi
proteica) come esempio di uno specifico ripiegamento, ch e porca ad una
struttura terziaria. Questa molecola mostra com e le forze di impilamenro fra
le basi giochino un ruolo importante nella conformazione dell'RNA; infatti,
72 delle 76 basi che compongono il tRNA sono coinvolte in interazioni reci-
proche di questo àpo. Come nel doppio filamento del DNA, l' impilamenro
delle basi nell'RNA è energeticamente favorito. Per questa ragione, con i trat-
ti di doppio filamento possono aggregarsi per formare delle lunghe regioni, a
doppia elica, anche se discontinua. Queste parti di molecola interagendo tra
loro creano delle strutture terziarie. Fino ad ora abbiamo brevemente descrit-
to la struttura del DNA e dell'RNA, nel Capitolo 6 illustreremo con maggio-
ri dettagli le interazioni che governano le strutture di queste importanti mo-
lecole biologiche.
Nella parte rimanente di questo capitolo ci concentreremo sulle forze e sui le-
gami che determinano la struttura delle proteine.

H H La struttura chimica degli elementi base che formano


I I
H-N+- c - c
-f'0 le proteine
I la "-o- Al contrario dei quattro nucleotidi presenti nel DNA o nell' RNA, i 20 am-
~ R l_.l
gruppo caten a gruppo
minoacidi ch e vanno a costituire le proteine sono molto diversi l' uno dall'al-
amminico laterale carbossilico tro. L'elemento comune a tutti è il carbonio in posizione centrale (Ccx) che è
legato ad un idrogeno, ad un gruppo ammini co primario e ad un gruppo
Figura 5 .3 carbossilico (Figura 5.3). Il quarto legame è formato con una catena laterale
La struttura elementare degli ammi- a struttura chimica variabile: il gruppo R. Quest' ultimo può essere caratte-
noacid i. rizzato dalla sua grandezza, forma e co mposizione chimica (Figura 5 .4) . I
5. I legami deboli e forti determinano la struttura delle macromolecole I 71

~ oacidi neutri-non polari amminoacidi acidi amminoacidi basici


g 1cina alanina acido aspartico acido glutammico lisina arginina istidina
Gly,G) (Ala, A) (Asp, D) (Glu, E) (Lys, Kl (Arg, R) (His, H)
H H H H H H H H H H H H H
0 0
I -fo I I ,q 0 I I ,q I I ,q I I I ,q 0
I .fo H-N--C-C~ I I ,f-0
- - ·, - e - e H - w - c - c~ H -N' -C-C~ H - w - c - c~ H- W - C-C H- N· - c- c ·
I '-o- I I '-0 _ I I ." o- I I " o- I I '-0 - I I '-0 - I I '-0 -
H H CH 3 H CH
I 2 H IH' H CH 2
I
H CH 2
I
H CH2
I
/C~ CH2 CH 2 CH 2 HC = C
-o o I I
CH2
I
CH2
I \
/e~ I
N:::,,_ /NH'
-o o I ~e
CH 2 NH H
I I
NHì
-f'c'-
H2N ~ NH 2

amminoacidi neutri-po lari

valina isoleucina serina treonina t irosina asparagina glutammina


(Val, V) (lleu, I) (Ser, S) (Thr,n (Tyr, Y) (Asn, N) (Gln,0)
H H H H H H H H H H H H H H
I I ,q 0 I I .fo I I ,q 0 I I ,q 0 I I ,q
I I -fo H - N' 0
I I ,f0
~ -w - c - c~ H - N'-C - C H-N'-C-C~ H - N' -C -C~ H-w-c-c - C - C~ H- N' - C- C
I I "o- I I '-0 - I I '-0 _ I I '-0 - I I '-0 _ I I '-0 - I I "o-

"9
H CH H CH H CH 2 H CH 2 H CH2 H CH2
H3C
/'-.
CH 3
/'-.
H3C CH3 I I I I
OH /C - CH3 CH2
/ -f'c'- I
H3C H I o NH2
OH
-f'c'-
OH o NH2

tt
triptofano fenilalanina prolina metionina leucina cisteina
(Trp, W) (Phe, F) (Pro, P) (Met, M) (Leu, L) (Cys, C)
H H H H H H H H H H H H
I
H - N' -C - C~
I ,q 0 I I -fo I I -fo I I ,q0 I I -f'o I I ,qO
H-N'-C-C H- N' - C-C H - N·-c-c~ H- N' - C- C H - N' -C -C~
H
I I '-0 -
CH2
I
H
I
CH
"o- I
H2C'-..._ / CH 2
\ "o- I
H
I '-0 -
CH 2
I
H
I '-0 -
CH2 H
I I
CH2
'-0 -
I I I I
~e,..~H
N
H
6 CH2 CH 2
I
s
I
CH 3
H3C
/'-.
CH
CH3
SH

ef ,;
Figura 5.4
+
I 20 different i amminoacidi p resenti nelle proteine. Le abbreviazioni, incluse q uelle a singola lettera, sono messe in parentesi.
72 I Parte prima • Chimica e genetica e sa-0a-11a90-0

gruppi R possono essere distinti in quattro categorie, caratterizzate da diffe-


renti proprietà chimiche: neutri-non polari, neutri-polari, acidi e basici. I
gruppi laterali non-polari sono formati da catene semplici di carbonio o da
H R, H H
anelli aromatici e stabiliscono, principalmente, contatti idrofobici. Quelli
+I I I I -:?o neutri-polari includono gruppi ossidrilici, sulfìdrilici, ammidici ed imidazo-
H- N-Ca-c-N-c - c . . . _,_ lici e formano, principalmente, legami idrogeno. Le catene laterali cariche
I
H
I OIl \
H
I"
R2
o- (acide o basiche) includono ammine primarie e secondarie e gruppi carbossi-
legame peptidico
lici che possono formare interazioni mediante legami ionici ed idrogeno.
Tutti i gruppi R partecipano alla creazione di legami di van der Waals, la cui

\ formazione dipende dalla vicinanza fra gli atomi , piuttosto che dalla loro
specificità chimica.

Il legame peptidico
Figura 5.5 Il legame covalente che unisce gli amminoacidi nelle proteine è il legame
li legame peptidico. Le parentesi qua- peptidico (Figura 5.5). Questo legame si forma quando il gruppo ammini-
dre indicano i residui amm inoacidici
co primario di un amminoacido si unisce in modo covalente con il gruppo
unit i da legame peptidico.
carbossilico di un secondo amminoacido. Questa unione forma un parziale
doppio legame, poiché coinvolge più di una coppia di elettroni: ciò com-
porta una limitata rotazione attorno al legame stesso. Una rotazione com-
pletamente libera è possibile solamente quando gli atomi sono uniti da un
legame singolo. Per esempio, i gruppi metilici nell'erano (H3C-CH3) pos-
sono ruotare liberamente_attorno al legame carbonio-carbonio. N contra-
rio del legame peptidico, rutti gli altri atomi presenti in due o più ammi-
noacidi polimeri zzaci formano legami singoli e, quindi, possono ruotare li-
beramente l'uno rispetto all'altro. Teoricamente questi legami potrebbero
dare origine ad un infinito numero di conformazioni, ma, nel contesto del-
la molecola proteica, le interferenze sterich e fra i gruppi lacerali di peptidi
adiacenti limitano queste rotazioni. L'orientamento di legami peptidici pla-
nari adiacenti può essere definito dai due angoli di legame: <I> (phi) e \f
(psi) (Figura 5.6) . Nl'interno delle proteine, questi angoli sono imposti
dalla necessità di ottimizzare la formazione di legami secondari fra i gruppi
funzionali dell'ossatura fondamentale della molecola e dalla necessità di
minimizzare le interferenze steriche.

Esistono quattro livelli strutturali nelle proteine

[1a sequenza degli amminoacidi lungo la carena polipeptidica determina la


struttura tridimensionale della molecola. I vari livelli strutturali che una pro-

Figura 5.6
<I> e 'I' sono gli angoli di rotazione at-
torno ai legami C11-N e C11-C. Le aree
ombreggiate rappresentano i p iani do-
ve g iacciono i legami peptid ici. (Fonte:
disegno, lrving Geis. Diritti dell'Howard
Hughes Medicai lnst itute. No n riprodu-
cibile senza autorizzazione.)
e ss-06-11s90-0 5. I legami deboli e forti determinano la struttura delle macromolecole I 73

primaria secondaria
.---- terziaria quaternaria

--
-- ... ~.,.,.,
j
'I

Figura 5 .7
I quattro livelli strutturali delle p rotei-
ne. (Fonte: adattata da Branden C. e
ToozeJ. 1999. /ntroduction toprotein
structure, 2• edizione, p. 3, fig. 1.1.)

teina può assumere possono essere raggruppati in quattro categorie (Figura


5.7). La sequenza lineare degli amminoacidi, in una catena polipeptidica, de-
termina la struttura primaria. Amminoacidi adiacenti possono interagire tra
loro mediante legami secondari per formare la struttura secondaria. Questa
struttura viene normalmente ottenura attraverso interazioni fra quelle parti
degli amminoacidi che costituisco no la struttura fondamentale della catena
amminoacidica, piurcosco che tra le catene laterali R. Come vedremo più
avanti le a eliche e i foglietti ~ sono gli elementi delle strutture secondarie.
Q uesti elementi possono interagire per generare la struttura terziaria del po-
lipeptide che è la struttura globale di una singola catena amminoacidica.
Molte p roteine sono composte da più catene polipeptidiche: le subunità. Il
modo in cui queste subunità si associano l'una con l'altra darà origine alla
struttura quaternarià.f
Le informazioni co~ure nella struttura primaria sono quasi sempre suffi-
cienti a determinare le strutture secondaria e terziaria di un polipeptide. Que-
sro fu dimostrato in un classico esperimento in cui l'enzima ribonucleasi , for-
mato da un singolo polipeptide, veniva sottoposto a condizioni canto energi-
che da eliminare tutti i legami idrogeno e le interazioni deboli fino ad una
completa denaturazione (linearizzazione) della proteina. Quando la moleco-
la veniva riportata alle condizioni in cui i legami deboli potevano essere rifor-
maci, la proteina riacquistava rapidamente non solo la sua struttura tridi-
mensionale, ma anch e la sua attività enzimatica. Per una descrizione delle tec-
niche di studio della struttura delle proteine vedi il Box 5.1 , Determinazione
della struttura delle proteine.

a eliche e foglietti ~ sono forme comuni di struttura


secondaria
La forma più stabile assunta dall'ossatura fondamentale di un oli e cide_è
l 'a e 1ca. uesca è un'elica destrogira co n unasso di \ ! __(Figura 5.8). Si
tratta di una struttura energeu camente avorita, poiché gli angoli che si for-
mano fra gli atomi dell'ossatura fondamentale del peptide assumono valori di
<I> e di qJ ch e consentono la formazion e di legami idrogeno, regolarmente di-
74 I Parte prima • Chimica e genetica 0 88-08-17890-0

Box 5.1 Determinazione della struttura delle proteine

Esistono due metodi principali per determinare la strut- della struttura de lle proteine a partire dalla loro sequenza
tura tridimensiona le delle proteine. Il primo ad essere svi- amminoacidica, la completa determinazione dell'energia
luppato è stato la cristallografia ai raggi X. Questo meto- racchiusa in una particolare sequenza deve essere ancora
do si basa sulla formazione di cristalli, formati da moleco- pienamente rea lizzata. Ciononostante, la previsione di al-
le altamente ordinate della p roteina pura. Come per il cune strutture secondarie (come l'a elica) sta diventando
DNA, l'irradiazione di cristalli di proteine con raggi X ad sempre più attendibile.
alta energia determina diffrazioni correlabili alla struttura L'.aumentare del numero di strutture determinate per via
della molecola. sperimentale ha fornito un importante contributo nella
Più recentemente, sono state sviluppate tecniche d i riso- previsione della struttura delle proteine, basata sulla se-
nanza magnetica che permettono di studiare la conforma- quenza amminoacidica. A livello atomico sono state de-
zione di proteine a basso peso molecolare. Questa tecni- finite famiglie d i sequenze amminoacidiche i cu i membri
ca sfrutta le proprietà magnetiche di alcuni atomi (come condividono la stessa struttura tridimensionale. Compa-
1H) per studiare il modo in cui atomi vicini si influenzano rando la sequenza amminoacid ica di una proteina a
l'un l'altro. Questa informazione può essere utilizzata per struttura sconosciuta con quella di proteine a struttu ra
determinare la posizione relativa di specifici atomi all'in- nota è stato possibile fare delle prevision i basate sulle si-
terno del polipeptide: queste distanze permettono di pre- militudini di sequenza. Combinando questa informazio-
vedere la struttura della proteina (Figura 5.7). ne con algoritmi computerizzati per la previsione di
In teoria, dovrebbe essere possibile prevedere anche la strutture secondarie risu lta evidente come questo sia un
struttura tridimensionale, a partire dalla sequenza ammi - potente metodo per comprendere come le proteine sia-
noacidica. Come già detto, la sequenza amminoacidica è no strutturate nello spazio. La speranza è che questi si-
la premessa per la determinazione dei livelli strutturali se- stemi permettano nel prossimo futuro la previsione, al-
condari e terziari della proteina . meno per approssimazione, della struttura di queste ma-
Sebbene molti progressi siano stati fatti nella previsione cromolecole.

o o

Figura 5.8
Una catena polipeptidica avvolta in
una conformazione ad cc elica. (Fonte:
struttura molecolare adattata da Pau-
ling L. 1960. The nature of the chem ical
bond and the structure of molecules
and crystals: An introduction to mo-
dem structural chemistry, 3• edizione,
p. 500. Copyright© 1960 Cornei!
University. Riprodotta con autorizzazio-
ne dell'editore.)
<Cl 88-08-17890-0 5. I legami deboli e forti determinano la struttura delle macromolecole I 75

a vista dall'alto b vista laterale

Figura 5.9 emergono alternativamente sopra o sotto il piano del foglietto .


I foglietti p sono tenuti assieme da legami idrogeno. (a) Un fo- (Fonte: struttura molecolare adattata da Pauling L. 1960. The na-
p
glietto è mostrato dall'alto. Da notare che tutti gli atomi di ossi- ture of the chemical bond and the structure of mo/ecu/es and
geno e di azoto dell'ossatura fondamentale sono impegnati nella crysta/s: An introduction to modem structura/ chemistry, 3• edi-
fo rmazione di legami idrogeno. (b) Un fogl ietto p visto di lato. In zione, p . 501. Copyright© 1960 Cornell University. Riprodotta
questo caso si p uò~osservare la posizione dei gruppi laterali che con autorizzazione dell'editore .)

sposti fra i gruppi carboniV~ amminici della stessa catena. Il potenziale de-
terminato da questi ~ am~ro eno è interamente' utilizzato 12er st bilizzar.e_
tale struttura. Di conseguenza, la molecola assume una P,recisa g~metria io
cui ciascun giro dell'ex elica contien~ 3,6 amminoacidi. ~e, per esempio, vi
fossero 4 amminoacidi per giro d'elica, i legami idrogeno non potrebbero for-
marsi in modo così preciso poiché gli aromi interessati sarebbero posti a di-
stanze non ottimali l'uno rispetto agli altri e quindi la struttura risulterebbe
instabile.}
Molte sequenze amminoacidiche possono assumere stff11.tn\ra ad ex elica. Ciò
avviene perché la struttura dell'ex elica è stabilizzata da ~tti fra aro i adia-
centi dei ~f>i amminici e carbonilici della catena amm1_noaci ica. Il solo
amminoacicfocne non può parteciparecome onarore di legami idrogeno, in
grado di stabilizzare lelica, è la pralina: ciò dipende dalla sua struttura ciclica.
Pertanto, la presenza di una pralina determina l'interruzione di una struttura
ad ex elica. Invece la glicina, la tirosina e la ser{na pur no - pedendo la for-
mazione di ex eliche, raramente ne fanno part)I Un'altra c uen el fatto
che le ex eliche sono formare dagli atomi che stanno sull'ossatura fondamenta-
le del polipeptide è che le catene laterali spor ono dal!' elica stessa. Ciò mette
queste catene laterali in posizione ottimale per incera ire con altre re~iuni_deh
lo stesso oli e ride, con al!.:_e rocei ~oE_gli aci~eici.
Un'altra struttura secondaria è rappresentata dai foglkui..~_(Figura 5.9). Al
contrario delle ex eliche, i foglietti ~ sono delFe'foime molto appiattite, co-
stituite dal!' ossatura fondamentale del polipeptide. La stabilirà del foglietc
di ende dall'allineamento di~egion..!_del poli e _çide in una conformazio-
ne a iaccita: allineamento mantenuto dai le ami idrogeno che si fo~a120
_fraj_gru pi caroomlicia 1 un fì.lam{!Eto ~gruppi amminici (fel~nto
aaiacence._pi norma una regione a foglietto ~ è composta da quattro a sei
tratti separati di polipeptidi (filamenti~), ognuno formato da un numero di
amminoacidi variabile era sei ed otto. Nel foglietto ~' gli amminoacidi adia-
centi sono ruotati l' uno rispetto alralu:o di f8D 0 e, quind C iDò.ronspetrw
76 I Parte prima • Chimica e genetica e 88-08-1 1s90-0

a b
N N N N N e N e
\ \ \ \ I \ I \
O= C
la O =C
la O= C
la la Ca
\
C= O •uH -N
I
Ca Ca
\
C = O .. ,, H -N
I
Ca

O= C
\ ...........
\ ............
\ ...........
\ I \ I \
N-H N-H N-H N-H H -N C= O u•H - N C= O
I I I I \ I \ I
c\ c\ c\ Ca Ca Ca Ca
c\
/ \ I \
C=O C=O c= o C= O O=C N - H•mO= C N -H
......,,, ,
I I I
............... ...............
I \ I \ I
H-N 'H-N H -N H -N N - Hm•O = C N-H .... O = C
\ \ \ \ I \ I \
cn Ca Ca Ca Ca Ca Ca Ca
I I I I \ I \ I
o= c O= C O= C C=O ·"H-N C = O'"' H- N
\ ............
\ ,..,......
\ .......,....o = c
\ I \ I \
N-H N- H N- H N- H H-N C = O mH - N C= O
I I I I \ I \ I
c\ c\ c\ c\ /a C\ /a C\
C=O C= O C= O C= c5 O =C N-H.... O= C N-H
I ,
.............
I ..............
I ...............
I \ , I \ I
H- N H- N H- N H -N N - H,.,,O = C N - H,,,, O = C
\ \ \ \ I \ I \
I
Cu
la l" la Ca
\ I
Ca Ca
\ I
Ca

c e e e e N e N

Figura 5.10 q uesto caso, il comp lesso d ei leg ami idrogeno; d a notare che la
Due tipi di foglietti p. (a) Foglietto Pparallelo: il d isegno mqstra maggior p arte d egli atom i NH e O p resenti nel fog lietto p sono le-
schematicamente il comp lesso d ei legam i idro geno; da notal-e che g at i l'uno all'altro da legami idrogeno . (Fonte: adattat a da Bran-
le catene corrono tutte in direzione amm ino -carb ossile. (b ) Fogliet- den C. e Tooze J. 1999. lntrod uction to protein structure, 2• edizio-
to pantiparallelo: il disegno mostra schematicamente, anche in ne, p. 19, fig . 2.6a e p. 18, fig . 2.Sb.)

g!:_uppo laterale_§porge alternativamente sopra e sorro il foglietto stesso (vedi


la Figura 5.9b).
I foglietti~ posso no presentarsi in due forme, che differiscono per l'orien-
tamento relativo delle loro carene (Figura 5. 1O). n un le catene adiacenti
corrono nella stessa di.~zione del la carena ammin'Oaci-dica e formano un fo-
glierro parallelo . . el l'alrr<0 le ca rene adiacenti corrono in direzione oppo-
sta, l' una rispetto all'a:hrn, formando un fogl ietto antiparallelo. Sebbene
m eno comuni, esisto no anche fogliett i ~ che contengono filamenti dispo-
st i sia in modo parallelo che antiparallelo. In entramb.i i casi, tutti i gruppi
peptidici so no disposti approssimativamente su un singolo piano. Studi
strutturali hanno messo in evidenza che, normalmente, le singole catene
che compongono il foglietto~ tendono a ruotare lungo il loro asse longitu-
•dinale in modo destrogiro (Figu ra 5.1 1). Quindi , invece di possed ere una
strurrura piatta, il fogl i e tto ~ tende a curvarsi, in modo tale da formare una
l struttu ra cilindrica.
Perché una proteina possa ripiegarsi correttamente, è necessario che sia I'os-
satura fond amentale che i gruppi laterali degli amminoacidi possano formare
il maggior numero possibile di legami secondari. L'a elica ed il fogl ietto ~so­
no entrambi conformazio ni molto stabili , ma per consentire che ciascun
e gruppo laterale possa formare il massimo dei legam i secondari, la proteina
Flg ura 5.1 1 deve potersi adattare al maggior numero possibile di con fo rmazioni. Quindi,
I fog lietti p ruotano in direzione de- la struttura tridimensionale delle catene polipeptidich e è un compromesso fra
strogira lungo il loro asse longitudina-
la tendenza dell'ossatura fo ndamentale a formare a eliche e foglietti ~ e la
le. Lo schema m ostra la com plessa
struttura d ella tioredoxina d i E.coli. I fo- tendenza dei gruppi laterali a far ruotare I ossatura fondamentale in confor-
glietti p sono ra p presentati com e frec- mazioni meno regolari, in modo raie da massimizzare l'energia di legame for-
ce con un orientam ento ammino-car- nita dai legami secon dari che i grupp i laterali sre si sono in grado di formare
boss1 terminale. (Fonte: adattata da
Branden C. e Tooze J. 1999.
(Figura 5. 12).
inrroduction to protein structure, 2• Come si vedrà con maggior dettaglio pi ù avanti, una delle prin cipal i cause
ed.z1one, p. 20, fig. 2.7a.) del ripiegamento del le protei ne p uò essere attribuita al concentrarsi di ammi-
5. I legami deboli e forti determinano la struttura delle macromolecole I 77

- ;)acidi idrofobici (non-polari) al centro della molecola. È facilmente iporiz-


ile che, in soluzione acquosa, le proteine contenenti un grande numero d i
z;-i::ppi laterali non polari rendano a mantenere queste parti della molecola al
::::nrro della struttura, aumentando la stabilirà della struttura stessa. Se dena-
-.....riamo una molecola polare, la cui struttura è determinata anche da un cer-
- numero di legami idrogeno posti all'interno della molecola, la diminuzio-
-e di energia libera è piunosro limitata, in quanto i gruppi polari possono, in
~rerna riva , formare legami idrogeno con le molecole d'acqua circostanti. In-
ece, quando vengono denaturate molecole che contengono molti gruppi
~on polari, si verifica una grossa perdita di energia libera, poiché questi grup-
:-i dovranno necessariamente venire a contatto con molecole di acqua presen-
• nell'ambiente e questa è una situazione altamente sfavorita.

Figura 5.12
Conformazioni regolari ed irregolari
La formazione di legami idrogeno presenti in una proteina. La conforma·
zione irregolare dell'ossatura fonda-
determina la conformazione specifica mentale del polipeptide (in verde) per-
mette il collegamento d i strutture se-
delle proteine condarie (foglietti ~ in viola e a eliche
in turchese). La struttura mostra la pro-
teina del papillomavirus E1. (Enemark
.\1entre una parte dell'energia che stabilizza la struttura di una proteina di- E.J., Chen G. , Vaughn D.E., Stenlund
pende dalle interazioni idrofobiche, la conformazio ne specifica della stessa A., e Joshua-Tor L. 2000. Mo/. Ce// 6:
proteina è condizionata dai legami idrogeno che si possono formare. L ener- 149.) L'immagine è stata preparata con
MolScript, BobScript, e Raster 3D.
gia associata alle interazioni idrofobiche non ha componenti direzionali,
mentre i legami idrogeno impongono precise distanze ed angolazioni (vedi la
Figura 3.9 e la Tabella 3.3). In generale, tutti gli aromi accettori e donatori,
che formano legami idrogeno all'interno della proteina, hanno un preciso e
pecifico atomo di riferimento con cui interagire. La mancata formazione di
u n legame idrogeno, all'interno di una proteina, ha un costo energetico di al-
cune kilocalorie. La formazione di legami idrogeno ha, quindi, la prerogativa
di destabilizzare le strutture non energeticamente favorire e di stabilizzare
q uelle con un contenuto inferiore di energia libera.
La necessità di formare il maggior numero possibile dì legami idrogeno sullo
scheletro fondamentale della proteina (due per residuo) porta alla fç rmazione
di una grande quantità dì a eliche e foglietti ~- Il solo modo che un polipep-
tide ha di attraversare un ambiente idrofobico, come a volte si rende necessa-
rio, è quello di formare strutture secondarie regolari. I gruppi · laterali non
hanno sufficienti atomi donatori e accettori di legami idrogeno per soddisfa-
re questa esigenza. Per questo motivo, tutte le proteine di ~randi dimensioni
contengono una quantità elevata di a eliche, di foglietti jj o di entrambe le
conformazioni.
A differenza del basso numero di strutture secondarie contenute n egli am-
minoacidi, le proteine, una volta sintetizzate, possono presentare una grande
varierà di forme. Anche proteine che sono interamente costituire da fogliet-
ti ~ o da a eliche possono assumere un elevato numero di conformazioni
(Figura 5. 13). Perché ciò avvenga, alcune parti del polipeptide devono pre-
sentare strutture meno regolari, in modo tale da permettere ripiegam enti
(turn) fra le parti strutturare ad a elica e foglietti~- Questi ripiegamenti so-
no rappresentati da anse (loop), formate da amminoacidi che congiungono
a eliche e fo glietti ~ e non presentano strutture secondarie ben definite. Le
anse possono variare in lunghezza da pochi amminoacidi a segmenti note-
volmente più lunghi. Essi sono, comunque, generalmente corri, in modo da
poter minimizzare il numero dì legami idrogeno che permettono la loro for-
mazione (Figura 5.14). ·
Inoltre, le parti meno regolari del polipeptide sono molto importanti perch é
rappresentano siti preferenziali di legame per piccole molecole o i siti attivi
78 IParte prima • Chimica e genetica o 88-08-1 7890-0

Figura 5.13 a
Ripiegamento di una catena peptidica.
(a) Proteine formate da a eliche: mio-
globina e dominio N-terminale del re-
pressore À. (b) Proteine formate da fo-
glietti p: la p roteina Green Fluorescent
(GFP) e il cristallino gamma. (c) Compa-
raz ione del dominio N-t erminale del
repressore À fo rmato da a eliche con il
dominio ( -terminale del repressore À
formato da foglietti p. (a) Vojtechovsky
J., Berendzen J., Chu K., Schlichting I., e
Sweet R.M. e Beamer l.J. e Pabo C.O.
1992. J. Mo/. Biol. 227: 177. (b) Orma
M., Cubitt A B., Kallio K., Gross LA , b
Tsien R.Y., e Remington S.J. 1996. Scien-
ce 273: 1392 e Chirgadze Y.N., Driessen
H.P.C., W right G., Slingsby C., Hay R.E.,
e Lindley P.F. 1996. Acta Crysta//ogra-
pher D. Biol. Crysta//ogr. 52: 712. (c)
Beamer L.J. e Pabo C.O. 1992. J. Mo/.
Biol. 227 : 177 e Beli C. E., Frescura P., e
Hochschi ld A 2000. Ce// 101 : 801.) Tutte
le immagini sono preparate con Mol-
Script, BobScript , e Rast er 3D.

a struttura a forcina
/: per capelli

degli enzimi e anche superfici di contatto nelle interazioni proteina-proteina.


Tutto ciò verrà evidenziato ancora di più chiaramente nella parre rimanente
di questo capitolo e ancora più avanti nel resto.

Le a eliche si avvolgono l'una sull'altra formando


strutture "coiled-coil"
filamento ~ 1 filamento ~2 Molti polipeptidi interagiscono fra loro mediante supersrrutture formate da
a eliche che si avvolgono l'una sull'altra. Di norma, questo può avvenire sol-
Figura 5.14 tanto quando le catene laterali non polari, che si trovano lungo le a eliche,
Filamenti p adiacenti sono uniti da sono disposte in modo tale da venire a contatto con altre a eliche. I..: avvolgi-
strutture conformate come forcine per
capelli (hairpin /oops). La parte om-
mento delle eliche l'una sull'altra riflette la regolarità strutturale (3,6 residui
breggiata mostra un hairpin loop for- amminoacidici per giro) dell'a elica, che permette a.i gruppi laterali di unirsi
mato da due residui amminoacidici. soltanto quando le eliche convergono con un angolo di 18°. Se le eliche fos-
5. I legami deboli e forti determinano la struttura delle macromolecole I 79

Figura 5.1 5
La cerniera di leucine del fattore tra-
scrizionale di lievito Gcn4. La cerniera
d i leucine è un esempio di struttura
coiled-coil (vedi il testo). Qui mostria-
mo due immagini di una leucine
zipper. di lato (a sinistra), dall'alto (a
destra). (Ellenberger T.E., Brandi C.J.,
Struh l K., and Harrison S.C. 1992. Celi
71: 1223.) L'immagine è stata preparata
con MolScript, BobScript , e Raster 30.

sero molto rigide, i contatti si formerebbero soltanto tra pochi residui . Inve-
e, avvolgendosi l'una all'altra con un andamento levogiro, esse si associano
in modo molto stabile, formarido strutture coiled-coil (Figura 5 .15).
Un esempio di conformazione coiled-coil si uova in una famiglia di proteine
che ha come struttura comune una cerniera (zipper) di leucine. Questi fatto-
ri proteici, che legano il DNA, sono formati da due subunità che si avvolgo-
no l' una sull'altra per m ezzo, appunto, di una regione coiled-coil. Questa re-
gione è chiamata cerniera di leucine, per la presenza di un certo numero di
leucine, o di altro amminoacido caratterizzato da un gruppo laterale alifati-
co, come la valina o la isoleucina, ripetute e disposte in modo sequenziale. Se
consideriamo due giri di un'elica, essi conterranno approssimativamente set-
te amminoacidi. Gli amminoacidi alifatici sono disposti, nel segmento pepti-
dico, in posizione uno e quattro. Queste posizioni conferiscono ad un lato
dell'elica una caratteristica alifatica. Quando queste superfici appartengono a
due polipeptidi differenti, permettono l'interazione delle due proteine, esclu-
dendo le molecole d'acqua circostanti.

I La maggior parte delle proteine ha una


struttura modulare, contenente due o tre
domini
Le subunità delle proteine solubili hanno dimensioni molto variabili com-
prese tra meno di 100 a più di 2000 amminoacidi. I più piccoli polipeptidi
in grado di assumere una corretta conformazione proteica hanno un peso
molecolare di circa 11 000 dalton (corrispondente all'incirca a 100 residui),
ma la maggior parte d elle singole subunità proteiche sono comprese tra i
20 000 e i 70 000 dalton.
Le proteine di dimensioni superiori ai 20 000 dalton sono spesso costituite da
due o più domini (Figura 5.16; vedi anche il Box 5.2, Le grandi proteine sono
spesso formate da diverse catene polipeptidiche più piccole). Con il termine domi- ì
nio si definisce una parte della struttura proteica che potrebbe, teoricamente,
essere separata dal resto, come se in soluzione fosse stabile anche quando è iso-
lata dal contesto dell'intera proteina; in effetti questo è quello che molto spes-
80 I Parte prima • Chimica e genetica e 88-08-17890-0

Figura 5.16
La piruvato chinasi è formata da domi-
ni distinti. I domini preponderanti del-
1'enzima sono mostrati in turchese, vio-
la e rosso. (Allen S.C., e Muirhea d H.
1996. A cta Crystallogr. D. Biol.
Crystallgr. 52: 499). L:immagine è stata
preparata con Mo lScript, BobScript, e
Raster 3D.

so succede. In genere, un singolo dominio è formato da una sequenza


amminoacidica continua, piuttosto che da porzioni di sequenza disperse lun-
go la catena polipeptidica, un'osservazione particolarmente importante quan-
do si co nsidera l'evoluzione di proteine caratterizzate da più domini.
-
Le grandi proteine sono spesso formate da diverse catene
BoxS.2 polipeptidiche più piccole

La maggior parte delle proteine volum inose sono aggre- Ora consideriamo che durante il processo di costruzione
gati regolari di diverse catene polipeptidiche più piccole. ogni tanto vengono fatti degli errori, inserendo un atomo
Si definisce struttura quaternaria quel l'unione tra le cate- sbagliato, ogni 100 000. Assumiamo, inoltre, che ogni er-
ne polipeptidiche che porta al la formazione della specifi- rore porti ad un prodotto finale non funzionale.
ca proteina. Per esempio, i complessi macromolecola ri Nel p rocesso costruttivo del primo tipo, ogni molecola
responsabi li della sintesi de ll 'RNA (l'RNA polimerasi) e conte rrà, in media, dieci atomi sbagliati e, di conseguen-
delle proteine (i ribosomi) sono entrambi dovuti all'unio- za, non verranno sintetizzati prodotti corretti . Nel secon-
ne di molteplici subun ità. Questi complessi, delle dimen- do schema, invece, gli errori colpiranno solo 1'1 % delle
sioni, rispettivamente, di 500 000 e 2 500 000 da lton, non subunità. Se esiste un meccanismo per scartare le sub-
includono nessuna subunità superiore ai 200 000 dalton. unità errate, allora si può facilmente costruire un prodot-
Il ribosoma è formato da subunità proteiche e da RNA; to finale funzionante e la cel lula, praticamente, non risen-
un complesso siffatto viene detto ribonucleoproteina . t irà dell'occasionale sintesi d i subunità non funzionanti.
Perché i grossi complessi proteici sono dati dall'unione di Questa è la stessa strategia di costruzione alla base della
più subunità, piuttosto che da un'unica grande subunità? catena di montaggio, nella quale vengono costruiti com-
L'uso di molteplici subunità per formare grossi complessi plicati prodotti industriali, come radio e automobil i. Ad
p roteici riflette un principio architettonico applicabile a ogni passaggio dell'assemblaggio ci sono dei meccani-
tutte le strutture complesse, viventi e non viventi. Questo smi atti ad eliminare le subunità difettose. Agli albori d i
princip io si basa sul concetto che è molto più semplice ri- questo tipo di processo industriale gli errori venivano ri-
durre l'impatto di errori di costruzione se le singole sub- mossi d irettamente dall'uomo; ora l'automazione ha
unità difettose possono essere scartate prima di essere in- spesso sostituito il control lo manuale. N elle cellu le, gl i
corporate nel p rodotto finale. Per esempio, consideriamo errori sono talvolta controllati tramite la specificità degli
due modi alternativi di costruire una molecola costituita enzimi. Se una subun ità monomerica è assemblata in
da un milione di atomi. Nel primo approccio costruiamo la modo errato, in genere non viene riconosciuta da lla poli-
struttura atomo per atomo; nel secondo costruiamo dap- merasi e, qu indi, non viene incorporata nella macromole-
prima un migliaio di piccole unità, ciascuna formata da un cola . In altri casi, le subunità difettose vengono eliminate
mig liaio di atomi, e solo successivamente uniamo le sub- in quanto incapaci d i entrare spontaneamente a fare par-
unità per ottenere il prodotto finale di un milione di atomi. te di aggregati molecolari stabili.
iC) 88-08- 17890-0 5. I legami deboli e forti determinano la struttura delle macromolecole I 81

Figura 5.17
Gli enzimi che legano l'ATP. Le frecce
rosse indicano le molecole di ATP lega-
te ad ogni struttura.(a) RecA (b) DnaA
[(a) Story R.M ., e Steitz T.A.. 1992. Natu-
re 355: 374. (b) Erzberger J.P., Pirruccel-
lo M.M., e Berger J.M. 2002. EMBO J.
21: 4763-73.] Le immagini sono state
preparate con MolScript, BobScript, e
Raster 3D.

Le proteine sono formate combinando un numero


straordinariamente piccolo di motivi strutturali
La caratterizzazione della prima dozzina di strutture proteiche ha portato al-
l' identificazione di una grande varierà di motivi conformazionali che, a sua
volta, ha indotto a formulare l' ipotesi dell 'esistenza di un infinito numero di
strutture proteiche. Ma con la successiva determinazione della struttura tri-
dimensionale di migliaia di diverse proteine, ci si è resi conto che un numero
relativamente piccolo di domini partecipa alla formazione della maggior par-
te delle diverse strutture proteiche. Benché non sia possibile una stima preci-
sa, si ritiene che il numero di domini strutturali "unici" sia di alcuni ordini di
grandezza più piccolo del numero delle diverse proteine esistenti.
Molto spesso, specifiche attività proteiche si associano a specifici motivi strut-
turali; così, per esempio, negli enzimi che legano l'ATP si riscontra molto
spesso il motivo detro dinucleotide fold (Figura 5 .17). Questo dominio lega
l'ATP mediante un foglietto Bcentrale con due a eliche parallele disposte su
entrambi i lari; il sito di legame del nucleotide si trova all'estremità carbossi-
terminale dei filamenti organizzati come foglietto B. Quello che varia tra una
proteina e l'altra è il numero e la disposizione delle a eliche e, in misura mi-
nore, l'ordine dei foglietti B. Riassumendo, possiamo affermare che domini
corre~ati e strutturalmente simili svolgono la medesima funzione in diverse
proreme.

Le diverse funzioni proteiche derivano dalla


combinazione di diversi domini
Le diverse proprietà funzionali delle proteine sembrano derivare dalla loro co-
struzione a moduli, esattamente come è possibile assemblare computer, dora-
ci di diverse capacità compurazionali, unendo le appropriate unirà modulari
di hardware. In natura esisrono, per esempio, diverse deidrogenasi, che si dif-
ferenziano per lo specifico substraro utilizzaro. Ognuno di questi enzimi è ca-
ratterizzato dalla presenza di due domini: un dominio di legame ai dinucleo-
ridi, comune a rutti questi enzimi e imporrante per légare il NAD +, ed un al-
tro, dorato del sito catalitico, capace di legare il substrato. Le varie deidroge-
nasi differiscono per la strutrura di quest' ultimo dominio.
Gli attivarori e i repressori rrascrizionali forniscono un altro buon esempio
82 IParte prima • Chimica e genetica e 88-08-17890-0

Figura 5.18
Il CAP complessato con il cAMP inte-
ragisce con il DNA ripiegato. Il domi-
nio di maggiori dimensioni del CAP,
rappresentato in turchese, lega l'AMP
ciclico, mostrato in giallo e rosso al
centro del dominio. Il dominio di lega-
me al DNA, più piccolo (e mostrato in
viola), riconosce specifiche sequenze di
DNA (la doppia elica è mostrata in ros-
so e grigio). (Schultz S.C., Shields G .C ..
e Steitz T.A. 1991 . Science 253: 1001 .)
L'immagine è stata preparata con Mol-
Script, BobScript, e Raster 30.

della costruzione a moduli delle proteine. Cosl, in E. coli, il repressore Lac e la


proteina attivata da catabolica (Catabolite-Activated Protein, CAP) sono en-
trambe caratterizzate dalla presenza di domini multipli. La struttura ai raggi
X di CAP mostra, in fatti, due domini: uno più grande, che lega al suo inter-
no una molecola di AMP ciclico, ed uno di dimensioni minori, che serve per
il legame a specifiche sequenze di D NA (Figura 5.18). La presenza di ampie
similitudini tra il dominio di legame al cAMP del CAP e la subunità regola-
trice delle chinasi dipendenti da cAMP, in termini di sequenza amminoacidi-
ca, suggerisce che il dominio di legame al cAMP di entrambe le proteine si sia
evoluto da un precursore comune. Nella proteina CAP, questo dominio è
unito ad un dominio di legame al DNA e le variazioni nella concentrazione
di AMP ciclico portano a modificazioni dei livelli trascrizionali. Nella china-
si, il dominio di legame al cAMP regola l'attività di quello che rappresenta il
primo enzima facente parte di una cascata di enzimi, coinvolti nella degrada-
zione del glicogeno.

1 1legami deboli permettono un corretto


posizionamento delle proteine sulle molecole
di DNA e RNA
Le proteine capaci di legare il DNA (DNA -bindingproteins) sono di impor-
tanza fondamentale per molti processi biologici. G li stessi tipi di legami de-
boli che permettono alle protei ne, al DNA, e all'RNA di assumere la propria
specifica configurazion e tridimensionale, sono anche responsabili del con -
tatto tra le proteine che legano il DNA e la doppia elica. Tra queste, le più
abbond anti hanno il ruolo struttu rale di condensare l'eno rme quantità di
DNA contenuta in ciascuna cellula in strutture regolari che, a loro volta,
vengono ulteriormente compattate. Per esempio, il nucleo di una cellula
umana, pur avendo un diametro di soli 1O µm (l Q-5 m), contiene circa due
metri di DNA.
Le proteine possono riconoscere il DNA in diversi modi. Alcune interazioni
proteina-DNA sono determinate dalla presenza di specifich e sequenze di
D NA, altre da specifiche conformazioni della doppia elica. Per esempio, il
D NA a singola elica che si forma nella cellula quando il DNA si apre nel cor-
so del processo di replicazione o di ricombin azione è rapidamente legato da
e aa-OS-1 1s90-0 5. I legami deboli e forti determinano la struttura delle macromolecole I 83

proteine che legano il DNA a singolo filamento (single-stranded DNA bin-


ding proteins, SSB). Queste proteine hanno un'alca specificità per la singola
elica piurcosro che per quella doppia, mentre hanno scarsa specificità per la
sequenza. Questo tipo di affinità è innanzitutto mediato dalla formazione di
legami ionici e idrogeno era le proteine SSB ed il DNA denacuraco; questi le-
gami si formano o con i fosfati dello scheletro del DNA o attraverso le carene
laterali degli amminoacidi, dotate di anelli aromatici (come per esempio la
Tyr e il Trp), che si intercalano era le basi (Figura 5.19) .
La maggior parte delle proteine che legano il DNA che prenderemo in consi-
derazione in questo libro riconoscono sequenze specifiche della doppia elica,
che serviranno, in seguito, come origini di replicazione, punti di partenza per Figura 5.19
la trascrizione o per altre attività del DNA. In accordo con ciò, il 2-3% delle L'interazione tra la proteina e il DNA a
singolo filamento per la single-stran-
proteine procariotiche ed il 6-7% di quelle eucariotiche sono proteine che le- ded DNA-binding protein (SSB). La
gano il DNA a sequenza specifica accertata o ipotetica. Fino ad o'ggi, il mec- SSB è mostrata in g rigio con d ue cate-
canismo più usato per il riconoscimento di una specifica sequenza di DNA ne laterali aromatiche in viola e il DNA
consiste nell'inserimento di un' a elica nel cosi detto solco maggiore del DNA a singola elica in rosso. (Raghumathan
S., Kozlov A.G ., Lohman T.M., e Wak-
(Figura 5.20). Come si evince dalla Figura 5.2 e, ancor più chiaramente, dal- sman G. 20CXJ. Nature Struetural Bio-
la Figura 6.1 , la struttura della doppia elica è caratterizzata da un ampio sol- /ogy, 8: 648.) L'immagine è stata prepa-
co, noto come solco maggiore, ed uno più stretto, o solco minore. I.:inseri- rata con Mo lScript, BobScript, e Raster
mento di un' a elica nel solco maggiore rende il riconoscimento di una speci- 30 .
fica sequenza vantaggioso per molte ragioni.

@La profondità e la grandcrYh'\e! wJc;:E iw.,ggiore si adattano molto bene al-


le dimensioni dell'a elid.;ip'é'rili.'étte'hcM~fa''f6rmazione di interazioni de-
boli era il DNA e circa metà della superficie dell'a elica.
@ Nel solco maggiore, all'estremità delle basi, si trovano molti accettori e
donatori di legami idrogeno (vedi la Figura 6 . 1O), e, ancor più impor-
rante, ciascuna coppia di basi è caratterizzata da una propria specifica di-
sposizione degli elementi disponibili alla formazione di legami idrogeno.
Questo fa sì che la disposizione degli accettori e dei donatori di legami
costituisca un codice intrinseco alla sequenza del DNA, allo stesso modo
in cui la formazione di legami idrogeno era le basi assicura l'appropriato
appaiamento di sequenze complementari di DNA durante l'ibridazione
, degli acidi nucleici. Turco questo è evidente osservando lo schema della
disposizione, per ogni coppia di basi, dei donatori ed accettori di legami
idrogeno nel solco maggiore (vedi la Figura 6 . 10). È importante notare s· 3·
come non solo l'appaiamento G:C possa essere facilmente distinto da
quello A:T, ma anche A:T da T :A e G :C da C:G. Al contrario, la dis osi-
zione delle basi nel solco minore è caratterizzata da un inferiore contenu-
to di informazione e, in genere, permette solo di distinguere la coppia
A:T da G:Cf,da;;> vcftve ?t.ot
@ Le a elichd'possiedono un momento di dipolo che rende la loro estremità
N-rerminale carica positivamente; questa carica porta spesso alla forma-
zione di legami deboli con i fosfati dello scheletro del DNA, adiacenti al
solco maggiore.

Il motivo strutturale elica-ansa-elica (helix-turn-helix, HTH), capace di me-


diare legami sequenza-specifici, è stato il primo ad essere identificato. Esso è
composto da due a eliche adiacenti separate da una breve ansa (Figura 5.21). 3· s·
Una delle due eliche, detta elica di riconoscimento, è responsabile del rico-
noscimento del DNA; l'altra è orientata in modo pressoché perpendicolare Figura 5.20 Rappresentazione sche-
matica dell'interazione tra l'elica di ri-
alla prima. Nonostante queste due eliche costituiscano il nucleo centrale del conoscimento del repressore mono-
motivo di riconoscimento del DNA, altre regioni, poste nelle immediate vi- merico di À. ed il solco maggiore del-
cinanze del morivo elica-ansa-elica, spesso stabilizzano la collocazione di que- 1'operatore. (Fonte: adattata, con auto-
ste due a eliche ed il loro contatto con il DNA. Sovente, altri morivi di lega- rizzazione, da Jordan S.R., e Pabo C.O.
1988. Structure of the lambda complex
me al DNA inseriscono delle strutture ad a elica nel solco maggiore, come at 2.5 A resolution. Science 242: 893-
nel caso dei motivi di legame denominaci dita di zinco (zinc finger) e cerniera 899. Copyright© American Assoc iation
di leucine (leucine zipper) (come verrà discusso nel Capi colo 17) . for the Advancement of Science.)
84 I Parte prima • Chimica e genetica e 88-08-17890-0

Anche se nella maggior parte dei casi il riconoscimento del DNA avviene me-
diante una a elica, alcune proteine usano delle strategie diverse. Un esempio
estremo è fornito dalla proteina che lega la sequenza TATA (TATA-binding
protein, TBP), responsabile, in molti promotori eucariotici, dell'inizio della
nascrizione (vedi il Capitolo 12). TBP usa un'estesa regione a foglietto~ per
riconoscere il solco minore della sequenza denominata TATA-box (Figura
5.22). Quindi, in questo caso, assistiamo all'utilizzo di un foglietto~, anziché
di una a elica, e all'interazione con il solco minore al posto di quello maggio-
re (per una discussione dettagliata sull'argomento vedi il Capitolo 12).

Le proteine scorrono lungo il DNA per trovare


uno specifico sito di legame
Molte proteine che legano il DNA prendono contatto sia con lo scheletro del
DNA che con le specifiche coppie di basi che formano il sito di riconoscimen-
to. Nella formazione dei contatti con l'ossatura del DNA sono, in genere, co-
involte piccole regioni ricche in amminoacidi carichi positivamente, situati nel-
le immediate vicinanze dei punti di contatto base-specifici. Queste interazioni
si basano principalmente sull'attrazione elettrosratica tra le regioni cariche po-
sitivamente ed i fosfati dello scheletro del DNA carichi negativamente. Dal
momento che il DNA, indipendentemente dalla propria sequenza, ha una su-
perficie esterna carica negativamente, queste interazioni proteina-ossatura del
DNA partecipano sia: al legame specifico di una proteina al DNA, che a quello
Figura 5.21 non specifico. Perciò, anche una proteina che lega il DNA con un'elevata speci-
Geometria del complesso repressore
di À -operatore. Lo schema rappresen-
ficità di sequenza avrà una considerevole affinità per il DNA in generale.
ta due monomeri del represso re di À Per esempio, l'affinità di alcuni regolatori dell'espressione genica (come il re-
legati all'operatore. Le eliche di cia- pressore lattosio) per le loro sequenze di riconoscimento è circa 1Q5 volte su-
scun monomero sono numerate da 1 a periore all'affinità generale per sequenze non specifiche di DNA. Ne conse-
5. L'elica numero 3 si inserisce nel solco
maggiore, come mostrato in Figura gue che, nella cellula, queste proteine sono generalmenre legare non solo alle
5.20. (Fonte: adattata, con autorizzazio- proprie sequenze bersaglio ma anche ad un certo numero di siti non specifici.
ne, da Jordan 5.R., e Pabo C.O. 1988. Questo è dovuto al numero significarivamenre maggiore di siti non specifici
Structure of the lambda complex at 2,5
rispetto a quelli specifici. Ogni nucleotide nel genoma, infatti, può essere
A resolution. Science 242: 893-899, fig.
2b, p . 895. Copyright © American As- considerato come l'inizio di un potenziale sito di legame (spesso non specifi-
sociation fo r the Advancement of co). Perciò in E. coli, che ha un genoma circolare lungo approssimativamente
Science.) 5 X 106 bp, ci saran no circa 5 X 1Q6 siti di legame non specifici. Ne consegue
ch e il valore del rapporto era il numero di siti non specifici e quelli specifici è

Figura 5.22
Struttura del complesso TBP-TATA
box. Lo scheletro di TBP è mostrato in
viola nella parte superiore della figura;
la doppia elica del DNA è mostrata in
basso, in grigio. (Niko lov D.B., Chen H.,
Halay E.D., Usheva A .A., Hisatake K.,
Lee D.K., Roeder R.G., e Burley S.K.
1995. Nature 377: 119.). L'immagine è
stata preparata con MolScript, Bob-
Script, e Raster 3D. Il DNA che si esten-
de ad entrambe le estremità dell' im-
magine è stato simulato al computer
da Leemor Joshua-Tor.
Cl 88-08-1 7890-0 5. I legami deboli e forti determinano la struttura delle macromolecole I 85

perfino maggiore (5 X I 06), anche se il rapporto tra l'affinità di legame per


siti specifici e quella per siti non specifici è piuttosto alto (105). Queste diffe-
renze numeriche spiegano perché una cellula debba contenere più copie del
repressore per potere garantire la continua occupazione dei siti di legame al
DNA specifici che svolgono una funzione regolatrice. In queste condizioni,
infatti, la maggior parte del repressore sarà legato a sequenze non specifiche.
Le interazioni aspecifiche DNA-proteina non sono solamente l'inevitabile con-
seguenza dell'utilizzo della carica negativa dello scheletro del DNA per il rico-
noscimento della doppia elica da parte delle proteine che legano il DNA. Si
pensa, infarti, che tali interazioni siano necessarie per accelerare la velocità con
cui una data proteina regolatrice trova il proprio bersaglio. Grazie alle loro in-
terazioni elettrostatiche le proteine che formano legami sequenza-specifici sono
inclini a scorrere lungo il DNA, piurcosto che a venire a contatto con un mec-
canismo di tipo formazione del legame-distacco. Questo movimento per dif-
fusione permerce a una proteina che lega il DNA di esplorare il DNA in modo
del rurro casuale "alla ricerca" di uno specifico sito di legame. Essendo costret-
te a compiere movimenti lineari, le proteine troveranno le proprie sequenze
bersaglio più velocemente che se fossero libere di diffondere nella cellula.
Esiste, inoltre, una piccola frazione di proteine che legano il DNA che non
scivola semplicemente lungo la doppia elica, ma piuttosto viaggia attivamen-
te su di essa. Queste proteine utilizzano movimenti direzionali sul DNA per
svolgere funzioni essenziali durante la replicazione, la riparazione o la ricom-
binazione del DNA (vedi i Capitoli 8, 9 e 10). Questo tipo di movimento di-
rezionale richiede energia; di conseguenza, queste proteine idrolizzano l'ATP
per cambiare il proprio legame al DNA.

Le proteine usano strategie diverse per riconoscere l'RNA

Come precedentemente descritto, l'RNA è strutturalmente diverso dal DNA.


Le proteine che legano !'RNA (RNA-binding proteins) possono svolgere di-
versi ruoli che vanno dallo stabilizzare la molecola di RNA al processarla per
via enzimatica. Lanalisi strutturale di diverse proteine che legano !'RNA, le-
gate alle loro molecole bersaglio, rivela l'esistenza di diverse strategie per il ri-
conoscimento dell' RNA da parte della proteina. Alcune di esse interagiscono
specificamente con !'RNA a doppio filamento. In questi casi, le proteine ri-
conoscono alcune caratteristiche che distinguono l'RNA dalla doppia elica di
DNA. Per esempio, la presenza nel ribosio del gruppo ·idrossilico, in posizio-
ne 2' è una caratteristica che contraddistingue !'RNA, come risulta dal farro
che esso forma principalmente un'elica di tipo A, caratterizzata da solchi più
profondi e più stretti di quelli presenti nell'elica B (vedi il Capitolo 6). A dif-
ferenza delle proteine che legano il DNA, analizzare precedentemente, queste
proteine non interagiscono con l'acido nucleico inserendo regioni con strut-
tura ad a elica nei solchi dell'RNA.
Diverse importanti proteine che legano !'RNA legano molecole di RNA che
non si rrovano in una conformazione ad elica regolare. Tra esse possiamo an-
noverare le proteine che interagiscono con le molecole di RNA messaggero
durante la trascrizione ed il successivo processamento dell'RNA. Allo stesso
modo, i co mplessi molecolari depurati allo splicing e alla traduzione del-
l'RNA sono costituiti da subunirà contenenti RNA associato a proteine. li
morivo proteina ribonucleare (ribonuclear protein, RNP) è uno dei più co- Figura 5.23
Struttura del complesso di splicing,
muni morivi proteici specificamente depurato a formare contatti specifici formato da proteine e RNA: U1A lega
con !'RNA. Questo dominio di 80 residui ha una conformazione mista a/~ la struttura stelo-ansa Il dell'snRNA
foglietto (Figura 5.23) e si lega a strutture dell'RNA del tipo stelo-ansa (stem- U1. La proteina è mostrata in grigio; il
loop), come è evidente dall'analisi del complesso formato dalla proteina dello piccolo RNA nucleare U1 è mostrato in
verde. (Oubridge C., lto N., Evans P.R.,
spliceosoma UlA (vedi il Capitolo 13) e dal piccolo RNA nucleare Ul (Fi- Teo C.H., e Nagai K. 1994. Nature 372:
gura 5.23). La forma della superficie di legame all'RNA è chiaramente speci- 432.) 1..'.immagine è stata preparata con
fica per quel particolare morivo strutturale, presente nella molecola di RNA. MolScript, BobScript, e Raster 30.
86 I Parte prima • Chimica e genetica Cl 88·08-1 7 890-0

Figura 5.24 a
Regolazione allost erica dell'attivit à en- regolatore substrato
zimatica. Nella parte (a), contro llo posi-
t ivo dell'attività enzimatica. li legame
I I
del regolatore modifica la conforma-
zione dell'enzima, così che esso possa
legare il substrato. Nella parte (b), con-
trollo negativo dell 'attività enzimatica.
In questo caso, il legame del regolato-
re blocca l'enzima in una conformazio-
ne che non può legare il substrato.
complesso
enzima-substrato

L'allosteria, ovvero la regolazione


di una funzione proteica attraverso
il cambiamento di forma
Il legame sia di piccole che di grandi molecole (ligandi) ad una proteina può
causarne un sostanziale cambiamento conformazionale. Tale variazione strut-
turale può portare a svariati effetti, quali per esempio un incremento nell'af-
finità della proteina per un secondo ligando o l'avvio o l'interruzione dell'at-
tività enzimatica. Questo meccanismo, noto come regolazio ne allosterica,
rappresenta uno dei principali meccan ismi di controllo nei sistemi biologici.
"AJJosteria" significa "forma diversa" e funziona sostanzialmente in questo
modo: il legame di un ligando ad un sito della proteina modifica la forma
della stessa protei na. Il risultato di questo cambiamento è che un sito attivo, o
un altro sito di legame, localizzato in un'altra regione della proteina, viene al-
terato in m an iera tale da aumentare o diminuire la propria attività (Figura
5.24). Esempi di proteine regolate in questo modo vanno dagli enzimi meta-
bolici ai fattori crascrizionali.
Molto spesso il ligando (l'effettore allosterico) è una piccola molecola, quale
per esempio uno zucchero o un amminoacido. Inoltre, la regolazione alloste-
rica di una data proteina può anche essere m ediata dal legame di un'altra pro-
teina, mentre un effetto molto simile può essere dovuto, in alcuni casi, alla
modificazione enzimatica di un solo residuo amminoacidico della proteina
regolata. In questa sezione vedremo esempi di regolazione allosterica mediata
da tutti e tre questi meccanismi.

Esempi di regolazione allosterica mediata da piccoli li-


gandi, da interazioni proteina-proteina e da modificazio-
ni post-traduzionali
Consideriamo ora in dettaglio la base strutturale di tre casi d i regolazione al-
losterica. Nel primo l'attività di legame al O A di un fatto re trascrizionale è
controllata attraverso il legame di una piccola molecola. Negli altri due casi
vedremo come un'interazione proteina-proteina ed un evento di fosforilazio-
ne possano portare alla regolazione allosterica d i un enzima, coinvolto nella
divisione cellulare.
e 88-08-1 7890-0 5. I legami deboli e forti determinano la st ruttura delle macromolecole I 87

Un piccolo effettore: l'allolattosio regola il repressore Lac Il gene a


facl di E. coli codifica per il repressore lattosio (Lac) . Questa proteina (che
impareremo a conoscere meglio nel Capitolo 16) è controllata allosterica-
mente - in efferri, è stato uno dei primi esempi ben definiti di proteina che
lega il DNA regolata in questo modo. Questa proteina regola l'espressione
genica e, quando legata al DNA, impedisce la trascrizione dei geni necessari
alla cellula per utilizzare lo zucchero lattosio come fonte di carbonio. Quando
il larrosio è presente nel terreno di crescita, una specifica forma dello zucche-
ro (il ~-1-6-allolattosio) induce l'espressione dei geni per il metabolismo del
lattosio. I..:indurrore allolattosio funziona legando direttamente il repressore
Lac e destabilizzandone l'interazione con il DNA.
I.:analisi scrucrurale mostra che il repressore Lac cambia forma dopo avere le-
induttore !
gato l' indurrore. (Questi studi strutturali si sono avvalsi dell' indurrore artifi-
ciale isopropil-~-D-tiogalattoside [IPTG]). Questo cambiamento conforma-
zionale spiega perché l'attività di legame della proteina al DNA viene indebo-
b
lita. Il repressore Lac è una grossa proteina (un tetramero di 155 kDa) e con-
tiene domini distinti, coinvolti nel legame al DNA, nella mulcimerizzazione e
nel legame dell'induttore. La regione più ammino-cerminale della proteina
(comprendente gli amminoacidi 1-49) è un motivo elica-ansa-elica che lega
specificatamente, nel solco maggiore, il DNA della regione di controllo del
promotore, in modo simile a quanto già visto per il repressore À. Adiacente a
questa regione vi è un'altra elica, nota come elica hinge (elica cerniera), che
prende contatto con il solco minore. La casca in cui si lega l'induttore, invece,
è al centro dell'ampio dominio centrale (dato dai residui 62-333).
li confronto tra la strurrura di Lacl legato al DNA e quella libera in soluzione
(e legata all'indurrore) ci fornisce una spiegazione del morivo per cui questi
due stati siano, in pratica, mutualmente esclusivi. Il legame dell' indurrore
causa una distorsione nella configurazione della metà ammino-cerminale del
Figura 5.25
grande dominio centrale. Questo cambiamento conformazionale, a sua vol- Cambiamenti allosterici del repressore
ta, distrugge la scrurrura della cerniera, con il conseguente indebolimento del Lac. Ogni parte della figura mostra un
legame al DNA; anche la strurrura del dominio elica-giro-elica adiacente di- d imero del repressore Lac. (a) La figura
venta più flessibile, un cambiamento che, probabilmente, diminuisce l'affini- rappresenta il dimero del complesso
induttore-repressore Lac. li legame del-
tà della proteina per il suo specifico sito di legame sul DNA (Figura 5.25). l'induttore porta ad un cambiamento
La modificazione alloscerica dell'enzima asparrato trans-carbamilasi mediata della st ruttura che riduce l'affinit à del
dal legame del CTP fornisce un altro esempio di piccola molecola che fun- rep ressore per l'operat ore. (b) Il p an-
ziona da efferrore (Figura 5.26). In questo caso il ligando induce una varia- nello mostra il dimero in assenza del-
l'induttore. In questo caso, si formano
zione ben definita della strurrura terziaria della proteina. le eliche hinge (elica cerniera) ed il do-
minio N-termi nale viene a contatto con
Un ejfett01·e proteico: l'attivazione di CDK da parte della ciclina la sequenza dell'operatore. (Fo nte:
Ora analizziamo un esempio di regolazione alloscerica di un enzima, mediata adattata, con autorizzazione, da Lewis
et al. 1996. Science 271: 6, fig. 12.
dalla sua interazione con una proteina regolatrice. I.:enzima (detto Cdk2) fa Copyright © American Association for
parte di una famiglia di chinasi, noce come chinasi ciclina-dipendenti (Cdk), the Advancement of Science.)

O polipeptide catalitico substrato

• polipeptide regolatore CTP (inibitore)

Figura 5.26
\
sito per l'inib itore siti attivi
La modificazione allosterica dell'aspar-
tato transcarbamilasi (ATCasi) indotta
allosterico dalCTP.
88 I Parte prima • Chimica e genetica C88-08-1 7890·0

co involte nella regolazione della progressione del ciclo cellulare. Cdk2 è inat-
tivo fino a quando non forma un complesso con una proteina regolatrice,
chiamata ciclina. Il legame di questa proteina induce un cambiamenro con-
formazionale dell'enzima, che porta ad un'alterazione della struttura in pros-
sim ità del siro attivo, attivando ne, in parte, la funzionalità. Un' ulteriore atti-
vazione dell'enzima viene ottenuta attraverso un secondo cambiamento con-
formazionale, indotto dalla fosforilazione di uno specifico residuo di rreoni-
na, anch'esso posizionaro vicino al sito catalitico (vedi più avanti).
I dettagli strutturali dell 'evenro allosterico indotto dal legame della ciclina
sono stati definiti. La struttura di Cdk2, non legato alla ciclina, è molto simi-
le a quella di qualunque altra chinasi. Due elementi della struttura dell'enzima
sono essenziali per la sua regolazione: un' a elica, nota come elica PSTAIRE,
ed un'ansa flessibile, detta T loop. Entrambi questi elementi sono posti nelle
vicinanze del sito attivo della chinasi.
Il legame da parte della ciclina induce un cambiamento allosterico sia del T
loop che dell'elica PSTAIRE di Cdk2 (Figura 5.27). In assenza di legame del-
la ciclina, l'ansa blocca l'accesso al sito catalitico e l'elica è piuttosto distante
da quest' ultimo. In quesca conformazione, un residuo di glutammato, essen-
ziale per la catalisi, si mantiene all'esterno del siro attivo. II legame della cicli-
na porta allo spostamento dell'el ica all'interno del sito catalitico, permetten-

Figura 5.27
Variazioni conformazionali di Cdk indotte dalla ciclina.
(a) La struttura monomerica della chinasi, mostrata in
turchese, è inattiva. La posizione dell'elica PSTAIRE
mant iene un resid uo fondamentale (glutammato) fuori
dal sito catalitico, dov'è localizzato l'ATP; il T loop
blocca l'accesso al substrato della proteina (non mo-
strato). (b) La struttura mostra il riposizionament o de l-
l'elica in seguito al legame da parte della ciclina (mo-
strata in viola) e l'al lontanamento dell'ansa dall'ingres-
so del sito attivo. Questo complesso è parzialmente
attivo. (c) In seguito a fosforilazione del T loop (mostra-
to in rosso). il complesso Cdk-ciclina diventa comple-
tamente attivo. (Schulze-Gahmen U., De Bondt H.L., e
Kim S. H. 1996. J Med Chem 39: 4540; Jeffrey P.D., Rus-
so A.A., Polyak K., Gibbs E., Hurwitz J., Massague J ., e
Pavletich N .P. 1995. Nature 376: 313. Russo A.A., Jef-
frey P.D., e Paveltich N.P. 1996. Nat Struct Biol 3: 696.)
Le immagini sono state preparate con MolScript, Bob-
Script, e Raster 3D.
IC> 88-08-17890-0 5. I legami deboli e forti determinano la struttura delle macromolecole I 89

do, quindi, al residuo di glutammato di prendere parte alla reazio ne. Il lega-
me della ciclina, inoltre, allo ntan a l ansa dall'imbocco del sito arcivo, consen-
tendo al substrato di entrarvi.

La fosforilazione come effettore: l'attivazione di Cdk da parte di


CAK Com e abbiamo appena visto, le proteine del tipo C dk sono arrivate
dal legam e delle cicline. La completa attivazio ne di C dk richiede un secondo
cambiamento allosrerico dell'enzima, mediato dalla fosfo rilazione di un resi-
duo di treonina posto nel T loop. Questa modificazione post-traduzio nale
po rta, infatti, ad un'ulterio re rio rganizzazione del sito attivo di Cdk. Una vol-
ta avvenuta la modificazione, il gruppo fosfato è legato da tre arginine, cia-
scuna situata in una regio ne diversa intorno al sito catalitico. Queste intera-
zioni stabilizzano la conformazione del sito catalitico favo revole ad un'elevata
attività.
La fosforilazione è dovuta all'attività di un'altra chinasi (detta CAK) . Molte
chinasi sono attivate attraverso un meccanismo di fosfo rilazione sim ile. I due
eventi che nel lo ro insieme attivano le proteine C dk - il legame della ciclina e
la fosforilazio ne - avvengono in questo p reciso o rdine, e questo è dovuto al
facto che non solo il legame della ciclina aumenta l'attività enzimatica, ma
rende il T loop accessibile alla fosfo rilazio ne da parte di CAK.

Non tutta la regolazione proteica avviene mediante


eventi allosterici

Alcune proteine sono controllare con m eccanismi diversi dall'allosteria. Per


esempio, una proteina può reclutarne un'altra, in particolari distretti cellula-
ri o su determinati substrati, dirigendo, in questo modo, la specificità dell'a-
zione catalitica della proteina reclutata. Quando discuteremo la regolazio ne
dell 'RNA polimerasi (l'enzima che trascrive i geni in m RNA), ved remo ch e,
in quel caso, il termine "regolazion e" assumerà il significato di scelta, in ogni
momento, del gene da trascrivere. Ques ta regolazio ne è resa poss ibile dalla
presenza di proteine regolatrici, ch e, da una parte, legano il D NA e dall'al-
tra entrano in co ntatto co n l'enzi ma stesso. Queste interazio ni fa nno sì che
!'RNA polimerasi venga portata sul gene (o sui geni) che presentano gli ap-
propriati siti di legame per quello specifico regolatore. Q uesto è un esempio
di legame cooperativo di proteine al DNA.
90 I Parte prima • Chimica e genetica e 88-08-17890-0

Sommario -----------------------~-----------,
DNA, RNA e proteine sono polimeri , dari dall' unione, possano dissociare, un elevato numero di questi legami de-
mediante legami covalenti, di una definita serie di subuni- boli può generare un complesso piuttosto stabile. li farro
rà. Pe r esempio, il DNA è costituito da una carena di nu- che la doppia elica del D NA non si separi spontaneamente
cleotidi, mentre le proteine sono formare da una carena di nei d ue filamenti costituenti dimostra chiaramente quanto
amminoacidi. La forma tridimensionale di ciascuno d i que- questi complessi possano essere stabili. Inoltre, sebbene i
sti polimeri è determinata da molteplici interazioni deboli, com plessi uniti da molteplici legam i debol i no n si separino
o secondarie, tra le subunirà componenti. Cosl, nel caso del spontaneamente, il loro assemblaggio può avveni re sponta-
DNA, la configurazione a doppia elica è dovuta alla forma- neamente, ed i correrti legami si formano in modo sequen-
zione di legami idrogeno tra nucleotidi giustapposti e posi- ziale (questo è il principio dell' auro-assemblaggio) .
zionati su eliche diverse ed alle interazioni che si formano Anche il legame d i specifiche proteine a determinare se-
tra le basi dei nucleotidi disposti uno sopra l'altro sulla stes- quenze lungo la molecola del DNA avviene attraverso la
sa elica. Allo stesso modo, la stabilirà della struttura tridi- formazio ne di legami deboli, rappresentati in genere dai le-
mensio nale di una proteina è data da molteplici interazio ni gami idrogeno che si formano tra le basi del DNA e appro-
deboli tra gli amminoacidi (non adiacenti), appartenenti priati g ruppi accettori, o donatori, presenti sulle proteine.
alla medesim a caren a polipeptidica. Abbiamo discusso la La m aggior pane dei farro ri rrascrizionali usa un' a elica per
natura di questi legami deboli nel Capitolo 3; in questo ca- riconoscere specifiche sequenze di DNA. Questa "elica di
pirolo abbiamo srudiaro come queste interazioni deboli de- riconoscimen to" si inserisce nel solco maggiore del D NA e
terminino la forma delle mo lecole e le interazio ni intermo- gli amminoacidi dell' elica entrano in contatto con le estre-
lecolari, specialmente tra proteine (la struttura del DNA e mità delle basi in modo sequenza-specifico. Q uesti con ratti
dell'RNA verrà a nalizzata in maggiore dettaglio nel Cap ito- sono stabilizzati dall'energia di legame delle specifiche inte-
lo 6). razioni . Le proteine che legano il DNA contengono, inol-
Lorganizzazione strutturale di una proteina è determinata tre, alcune regioni che possono generare un legame non
da molteplici livell i di interazione. La struttura primaria è specifico con lo scheletro del DNA. Q ueste interazioni non
data dall' iniziale legame covalente degli amminoacidi. specifiche permettono la diffusione lineare delle proteine
Ogni amminoacido è uni to al successivo mediante un lega- lungo il D NA, un movimento che rende più veloce il rag-
me peptidico. La struttura secondaria è resa possibile d al- giungimento, da pane della m o lecola proteica, della pro-
l' interazione tra amminoacidi, in genere situati piuttosto pria sequenza bersaglio. Un numero piuttosto ridotto di
vicini uno all 'altro nella struttura primaria della proteina. proteine utilizza i foglietti ~(piuttosto che a eliche) per ri-
t..:a elica e i foglietti ~ sono due esempi di elementi tipici conoscere specifi che sequenze di D NA e l' interazione av-
della struttura secondaria. La struttura terziaria rappresenta viene a Livello del solco mi nore.
la confo rmazione rridiinensionale fin ale di una carena po li- Le proteine svolgono varie funzioni, quali, per esempio, la
peptidica ed è conferita dalla disposizio ne, in modo energe- catal isi o il legam e al DNA. Queste attività sono spesso re-
ticamente favorevole, dei diversi elementi seco ndari. Per golare dal legame, alla proteina in questione, di piccoli li-
moire proteine esiste un ulteriore livello organizzativo - la gandi o di altre proteine o attraverso la modificazione enzi-
struttura quaternaria. Questa consiste nella m ulrimerizza- matica di specifici residui appartenenti alla proteina sogget-
zione di singole carene polipeptidich e che formano dimeri, ta a regolazione. Questi ligandi, o modificazioni, spesso re-
o strutture d 'ordine superio re. Moire proteine, infa rti, ope- golano la funzio ne pro teica attraverso il fenom eno dell'al-
rano com e mulrimeri - per esempio, l'emoglobina è un te- losreria. In altre parole, il ligando lega (o la modificazione
tramero, e diverse proteine che legano il DNA (DNA-bin- avviene su) una regione della proteina separata da quella
ding protein) fu nzio nano come dimeri. che svo lge la funzione principale (il siro catalitico di un en-
Moire proteine native sono caratterizzare dalla presenza d i zima, il dominio di legan1e al DNA, eccetera). Questo lega-
dive rse regioni con una propria conformazione (i domini), me, o la modificazione, induce un cambiamento con for-
che risulta stabile di per sé e deriva da una sequenza ammi- mazionale della proteina, che porta ad un aumento, o ad
noacidica continua. La diversa combinazione di questi do- una diminuzio ne, dell'attività del sito attivo, o del dominio
mini giustifica l'esistenza di una grande varierà d i proteine. di legame al DNA, sostanzial mente innescando o disinne-
U numero di dom ini realmente unici non supera, probabil- scando la specifica funzione.
mente, le poche centinaia. Inoltre, ciascun dominio è spes- In altri casi, una proteina può venire regolata mediante la
so associato ad una specifica attività funzionale, quale, per modificazione o il legame d i una seconda proteina, a ttra-
esempio , il legame al D NA. verso, però, un meccanismo diverso dall'allosreria. Per
La forma specifica di o gni macromolecola limita il numero esempio, la m odificazione porta alla formazione, sulla pro-
delle molecole con cui essa può interagire. Interazioni se- teina, di un sito che è riconosciuto da un secondo fattore
co ndarie forri tra molecole richiedo no che le superfici di le- proteico. Queste interazio ni proteina- proteina sono in gra-
game sian o complementari (come la chiave e la serratura) e do di m ediare il reclutamento di un polipeptide in partico-
preved o no il coinvolgimento di molti aromi . Sebbene le lari disu etti cellulari, o su specifici substrati, regolandone in
moleco le unire da uno o d ue legami secondari, in genere, si questo modo la specificità d' azione.
o 88-08-1 7890-0 5. I legami deboli e forti determinano la struttura delle macromolecole I 91

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Parte seconda

La mutabilità
e fa riparazione
del DNA
94 I Parte seconda • Manutenzione del genoma <C> 88-08-17890-0

a Parte 2 è dedicata alla struttura del DNA e ai processi che permettono


di trasmettere, mantenere e modificare questa molecola da una genera-
___J zione all'altra. Nei capitoli che vanno dal sesto all'undicesimo, esamine-
remo il DNA e la molecola affine RNA e cercheremo di rispondere alle se-
guenti domande.
• Come possono le strutture del DNA e dell'RNA determinare le loro fun -
zioni?
• Come possono essere contenute all'interno del nucleo le molecole del
DNA, che sono straordinariamente lunghe se comparate con le dimen-
sioni della cellula?
• Come viene replicato il DNA in modo così accurato e completo durante
il ciclo cellulare e come viene sintetizzato con una così alta fedeltà?
• Come viene protetto il DNA da danneggiamenti spontanei o provocati
dall'ambiente e come vengono riparati questi danni una volta avvenuti?
• Come vengono scambiate le sequenze di DNA fra i cromosomi durante i
processi conosciuti come ricombinazione e trasposizione?
Nel rispondere a queste domande, vedremo che la molecola del DNA è sot-
toposta sia a processi conservativi, che operano per mantenerlo inalterato di
generazione in generazione, sia a fenomeni che provocano profondi cambia-
menti nel materiale genetico che aiutano il processo evolutivo. Nella cellula,
il DNA è sottoposto a forze che dividono i due filamenti, lo contorcono in
strutture topologicamente definite, lo avvolgono attorno e attraverso protei-
ne che gli impongono specifiche strutture e che rompono e richiudono la sua
impalcatura fondamentale. Tutte queste manipolazioni sono mediate da una

Foto dagli archivi di Cold Spring Harbor Laboratory

Barbara McClintock e Robin Holliday, simposio del


1984 sulla ricombinazione del DNA. McClintock pro-
pose l'esistenza dei t rasposoni in seguito ai risultati
ottenuti dagli studi genetici sul mais negli anni '40
(Capitolo 11); il premio Nobel come riconoscimento
per questo lavoro le venne conferito trent'anni più
tardi, nel 1983. Holliday propose il modello fonda-
mentale della ricombinazione omologa che porta il
suo nome (Capitolo 10).

Reiji Okazaki, simposio del 1968 sulla replicazione del DNA


nei micro rganismi. Okazaki aveva, giusto in questo periodo,
dimostrato come, durante la replicazione del DNA, uno dei
due nuovi filamenti veniva sintetizzato in corti frammenti che
solo successivamente venivano uniti l'uno all'altro. I.: esistenza
dei "frammenti di Okazaki" spiega come un enzima che sin-
tetizza il DNA in una sola direzione può cionondimeno sinte-
tizzare, simultaneamente, due filamenti di opposta polarità.
e 88-08-17890-0 Parte seconda • Manutenzione del genoma I 95

quantità d i enzimi e apparati molecolari che permettono la propagazione, il


mantenimento e la modificazione del materiale genetico.
Il Capitolo 6 esplora la struttura del DNA a Livello atomico, dalla chimica del-
le basi che lo compongono e della sua impalcatura fo ndamentale, all'interazio-
ne fra le coppie di basi e le altre forze che tengono i due filamenti insieme. Il
D NA è spesso topologicam ente costretto e il Capitolo 6 considera gli effetti
biologici di queste costrizioni assieme agli enzimi che modificano la topologia
della molecola. Questo capitolo inoltre esplora la struttura dell' RNA. Non-
ostante la somiglianza strutturale che questa molecola ha con il DNA, !'RNA
ha distintive caratteristiche strutturali e differenti proprietà chimiche, compre-
se La importante capacità di avere attività catalitica in alcuni processi cellulari.
Com e vedremo nel Capitolo 7, il D NA, nelle cellule, non è nudo. Al contrario,
esso è impaccato, con proteine specializzate, in una struttura chiamata cromati-
na. Q uesto impaccamento permette a questa lunga molecola di D NA di essere
accomodata nella cellula e di essere correttamente segregata durante la divisione
cellulare. La cromatina può essere modificata aumentando o diminuendo l'ac-
cessibilità del D NA. Questi cambiamenti contribuiscono ad assicurare la sua re-
plicazione, ricombinazione e trascrizione negli appropriaci siti e tempi. Il Capi-
tolo 7 ci fa conoscere le proteine istoniche e i componenti non istonici presenti
nella cromatina, la sua struttura e gli enzimi che ne mediano le modificazioni.
La struttura del DNA ha offerto un possibile meccanismo di duplicazione del
materiale genetico. Il C apitolo 8 descrive questo meccanismo in dettaglio: la
natura semiconservativa della replicazione del DNA e la complessa collezione
di enzim i e altre p roteine che intervengono in questa reazione.
Il meccanismo di replicazione però non è infallibile. In ciascun ciclo di repli-

Paul Modrick, simposio del 1993 su DNA e


cromosomi. Un pioniere nel campo della ripa-
razione del DNA (Capitolo 9), Modrick elabo-
rò molti dei meccanismi del riparo mismatch.

Arthur Kornberg, simposio del 1978 sulla replicazione e ricombinazio-


ne del DNA. L'esteso contributo di Kornberg allo studio della replicazio-
ne del DNA (Capitolo 8) iniziò con la purificazione di un enzima che era
in grado di sintetizzare il DNA, una DNA polimerasi estratta da E.coli. I
suoi esperimenti mostravano che era richiesto, per la sintesi di una nuo-
va molecola di DNA, uno stampo, confermando la previsione del mo-
dello replicativo postulata da Watson e Crick. Per questo lavoro Korn-
berg ebbe il premio Nobel per la medicina nel 1959.
96 I Parte seconda • Manutenzione del genoma o 88-08-1 7890-0

cazione si possono produrre degli errori, che se non correrci potrebbero dar
origine, nelle cellule fìglie, a molecole di DNA mutate. In aggiunta, il DNA è
una molecola fragile che può essere danneggiata da eventi spontanei o da ra-
diazioni e da moleco le chimiche. Questi danni possono essere rilevati e ripa-
rati dalla cellula affinché il materiale genetico non accumuli un'inaccettabi le
quantità di mutazioni. Il Capitolo 9 è dedicato ai meccanismi che rilevano e
riparano i danni del DNA. Gli organismi, dai batteri all'uomo, utilizzano,
per preservare l'integrità del loro DNA, meccanismi simili e molto spesso
conservati nell'evoluzione. Disfunzioni di questi sistemi possono avere con-
seguenze catasrrofìche, come per esempio il can cro.
I due ultimi capitoli della Parre 2 riguardano un aspetto complementare del
metabolismo del DNA. A differenza dei processi conservativi riguardanti la
replicazione e la riparazione, che cercano di preservare il materiale generico
con la quantità minima di alterazioni, i processi considerati in questi capitoli
riguardano la formazione di nuove sequenze di DNA. U Capitolo 10 descrive
il fenomeno della ricombinazione omologa - i processi di rottura e riunione
mediante i quali i cromosomi simili (omologhi) si scambiano segmenti equi-
valenti di DNA. La ricom binazione omologa permette la diversità generica e
anche il rimpiazzo di sequenze mancanti o danneggiate. Vengono descritti
due modelli di ricombinazione omologa e inoltre gli interessanti motori mo-
lecolari che ricercano le sequenze omologhe fra le molecole di DNA e quindi
creano e risolvono gli intermedi previsti dai modelli.
Infìne il Capitolo 11 introduce due tipi specializzati di ricombinazione cono-
sciuti come ricombinazione sito-specifica e trasposizione. Questi processi
portano a un vasto accumulo di alcune sequenze nel genoma di molti orga-
nismi. Discuteremo i meccanismi molecolari e le conseguenze biologiche de-
rivare da questi scambi genetici.

Foto dagli archivi di Cold Spring Harbor Laboratory

Matthew Meselson, simposio del 1968 sulla replicazione


del DNA nei microrganismi. Mese lson, assieme a Franklin
St ahl, d imostrò che il DNA è replicato mediante un meccani-
smo semiconservativo. Ouesto esperimento fu allora defini-
to "il più elegante esperimento della biologia" (Capitolo 2).

Franklin Stahl e Max Delbriick, simposio del


1958 sullo scambio di materiale genetico:
meccanismo e conseguenze. Stahl fu compagno
di Meselson nell'elaborazione dell'esperimento
descritto sopra, successivamente contribuì alla
comprensione del la ricombinazione omologa
(Capitolo 10). Delbriick fu un importante
cofondatore del così detto phage group- un
gruppo di scienziati che utilizzarono i
batteriofagi come primo sistema modello di
biologia molecolare (Capito lo 21 ).
APITQLO'

La struttura
del DNA e dell'RNA _ ____.

I a scoperca che il DNA è la più importante molecola nella quale risiedono


tutte le informazioni genetiche, ha immediatamente richiamato l'atten-
___J zione sulla sua struttura, la cui conoscenza poteva rivelare con quale mec-


La struttura del DNA
La topologia del DNA
canismo- il DNA porta i messaggi genetici che vengono trasmessi nel momen- • La struttura dell'RNA
to in cui i cromosomi si dividono per produrre due identiche copie di se stessi.
Alla fine degli anni '40 , primi anni '50, alcuni gruppi di ricerca operanti negli
Stati Uniti ed in Europa si impegnarono (a volte collaborando altre volte in
competizione) per comprendere come gli atomi che compongono il DNA so-
no legati assieme da legami covalenti e quale conformazione assumono, nello
spazio, le risultanti molecole. Inizialmente vennero formulate ipotesi che de-
scrivevano il DNA come una molecola costituita da strutture complicate ed
anche bizzarre che lo diversificavano radicalmente da un gene all'altro. Grande
soddisfazione, se non addirittura generale esaltazione, fu espressa quando ven-
ne scoperto che la struttura fondamentale del DNA era la doppia elica. Questa
struttura ci permetteva di asserire che tutti i geni hanno fondamentalmente la
stessa forma tridimensionale e che le differenze fra due geni risiedono sempli-
cemente nell'ordine e nel numero dei quattro nucleotidi che rappresentano gli
elementi di base che costituiscono i due filamenti complementari.
Ora, cinquanta anni dopo la scoperta della doppia elica, questa semplice de-
scrizione della struttura del materiale genetico è ancora attuale e non è più
stata sostanzialmente modificata da nuove osservazioni che ne mettessero in
dubbio la veridici tà. Ci si è però resi conto che la struttura del DNA non è
cos) uniforme come si pensava. Per esempio, i cromosomi di alcuni piccoli vi-
rus sono formati da molecole di DNA a singolo filamento e non a doppia eli-
ca. Inoltre, la dettagliata orientazione delle coppie di basi varia leggermente
da coppia a coppia poiché viene influenzata dalla locale sequenza del DNA.
Alcune sequenze di DNA permettono anche alla doppia elica di avvolgersi in
senso levogiro, al contrario cioè della rotazione d estrogira, originariamente
formulata per tutte le molecole di DNA. E mentre alcune molecole di DNA
sono lineari, altre sono circolari. Altre variazioni strutturali sono conseguenza
della superelicità (una ulteriore torsione) della doppia elica o spesso dall'arro-
tolarsi del DNA attorno a proteine che lo legano.
Similmente, ora ci rendiamo conto che l'RNA, che a prima vista appare esse-
re molto simile al DNA, ha delle caratteristiche intrinseche che lo caratteriz-
zano. È stato trovato, nella maggior parre dei casi, come molecola a singolo
filamento. È anche vero, però, che a causa della presenza di basi complemen-
tari poste sullo stesso filamento , si possono creare dei tratti a doppia elica ed
inoltre esso è in grado di ripiegarsi in modo tale da formare differenti strut-
ture terziarie. Queste strutture presentano molte anomalie, come la possibi-
lità di appaiamenti di basi non canoniche, oppure interazioni fra le bas i e
l'impalcatura fondamentale zucchero-fosfato e la formazione di nodi. La più
importante di tutte, visto il suo profondo significato evolutivo, è l'esistenza
di alcune molecole di RNA che presentano attività enzimatica: questa carat-
teristica risulta fondamentale viste le informazioni che fornisce riguardo al
trasferimento di funzioni fra gli acidi nucleici e le proteine.
Chiaramente, le strutture del DNA e dell'RNA sono più co mplesse di quello
che possiamo immaginare a prima vista. In verità, non esiste una struttura ca-
98 I Parte seconda • Manutenzione del genoma e ea-OS-11a90-0

a 3' 5' nonica né per quanro riguarda il DNA né per !'RNA. Come vedremo in que-
'in sro capirolo, ci sono, infatti, variazioni strutturali che dipendono dalle pro-
"'
_!)
prietà fisiche, chimiche e topologiche della catena polinucleotidica.
'6
"'
' jij
- - impalcatura
a.
U") zucchero-fosfato
ò
I
Il
-<t
I La struttura del DNA
~
Il DNA è formato da catene polinucleotidiche
"'
,!,!
a;
>o La caratteristica più importante del DNA è quella di essere normalmente for-
e
·c;, maro a ue catene olinucleoticlicne, avvo te l'una swla!tra- nella forma a
do ia elica (Figura 6.1). La parte superiore e a figura (a) rappresenta la
struttura della doppia elica mostrara in forma schematica. Da notare che se
ruotata di 180° (per esempio girando quesro libro sottosopra), la doppia eli-
ca appare a prima vista identica: ciò è dovuro alla natura complementare dei
3' 5' due filamenti di DNA. Il modello della doppia elica, rappresentata nella par-
te inferiore della figura (b), mostra i componenti della molecola del DNA e
20A (2 nm)
le loro relative posizioni nella str:'uttura dell'elica. I.: impalcatura di ciascun fi-
lamento del!' elica è composta di zuccheri alternati a residui fosforici; le basi si
p.roiettan? all'interno ma possono essere accessibili attraverso i solchi mag-
g10re e mmore.
Per prima cosa, volendo studiare la struttura del DNA, consideriamo lana-
tura del nucle_otide, il costituente fondamentale di questa macromolecola.
Un nucleotiddconsiste di un fosfaro legaro ad uno zucchero, il 2'-deossiri-
os10, a cui è attaccata una base. Il fosfato e lo zucchero hanno la struttura
mostrata nella Figura 6.2. Lo zucchero è detto 2'-deossiribosio poiché manca
di un gruppo ossidrilico in posizione 2' dove sono presenti, invece, soltanto
due atomi di idrogeno. Da notare che le posizioni sul ribosio sono d istinte
con un indice (primo) per distinguerle dalle posizioni degli atomi sulle basi
(vedi la discussione più avanti).
Una base si unisce al 2'-deossiribosio rimuovendo una molecola di acqua fra
lossidrile del carbonio dello zucchero in posizione 1' e la base stessa per for-
mare un legame glicosidico (Figura 6 .2). Lo zucchero unico alla sola base for-
ma il nucleoside. Invece, il legame di un fosfato al 2'-deossiribosio ottenuto
eliminando una molecola di acqua tra il fosfato e l'ossidrile in posizione 5' dà
un fosfomonoestere. Aggiungendo un fosfaro (o più di uno) ad un nucleosi-
H O C nei fosfati della Ce N P de si ottiene il nucleotide. Questa molecola è prodotta, quindi, mediante la
catena esterica nelle basi

Figur a 6.1
La struttura ad elica del DNA. (a) Mo-
dello schemat ico della doppia elica. Un
g iro d'elica (34 A o 3.4 nm) contiene
approssimativamente 10,5 paia di basi.
(b) Modello della doppia elica dove
l'ingombro degli atomi è rappresenta-
to da sfere. Gli atomi degli zuccheri e
dei fosfati di ciascun fi lamento, che for-
mano l'i mpalcatura fon damentale, so-
no rappresentati dallè sfere gialle, viola
e rosse. La loro d isposizione mostra
l'andamento ad elica della molecola.
Le basi sono rivolte verso l'interno e
sono accessibili attraverso il solco mag-
giore e quello minore.

Figura 6.2
Formazione del nucleotide mediante
eliminazione di acqua. Le posizioni de-
g li atomi d i carbonio nel 2'-deossiribo-
sio sono ind icate in rosso. nucleotide (dAMP)
6. La struttura del DNA e de li' RNA I 99

Adenina e molecole derivate ------------~

Nucleotide
Base Nucleoside 2' deossiadenosina
adenina 2' deossiadenosina 5'-fosfato

Srruttura NH2

NH2 Ò~) o
IlP -
,;~o~ 1
Cx>
-o- OCH2
I ~Adenina
OH H H
N
~ OH H
H
OH H
H

Peso 135,1 251,2 331,2


molecolare

formazione di un legame glicosidico fra la base e lo zucchero ed un legame fo-


sfoesterico fra la base e l'acido fosforico (Tabella 6.1).
I nucleotidi sono , a loro volta, legati l'un l'altro in catene polinucleotidiche
per mezzo dell'ossidrile presence in posizione 3' del 2'-deossiribosio di un nu-
cleotide ed il fosfato attaccato al carbonio 5' di un altro nucleotide (Figura
6.3). Questo è un legame fosfodiestere (o fosfodiesterico)in cui il fosforo fra i
due nucleoèidi è unito ad uno zucchero esterificato mediante l'ossidrile al 3'

o Figura 6.3
Struttura dettagliata del polinucleoti-
de. La struttura mostra l'appaiamento
delle basi fra le purine (in b lu) e le piri-
midine (in g iallo). e i legami fosfod ie-
sterici dell'impalcatura. (Fonte: adatta-
ta da Dickerson R.E. 1983. Scientific
American 249: 94. Illustrazione, lrving
Geis. lrving Geis Collection/Howard
Hughes Medicai lnstitution. Non ripro-
s· ducibile senza autorizzazione.)
100 I Parte seconda • Manutenzione del genoma e 88·08· i1a90.o

ed un secondo zucchero esterificato mediante l'ossidrile in posizione 5'. Il le-


. NH
adenina
2 game fosfodiesterico crea un'impalcatura ripetitiva zucchero-fosfato, che è
una caratteristica strutturale costante del DNA. Al contrario, lordine delle
e
é

H
-t01
NJlAH N
basi, lungo la catena polinucleocidica, è casuale. Questa casualità che persiste
per tutta la lunghezza del polimero è, come vedremo, alla base dell'enorme
quantità di informazione contenuta nel DNA.
I
a
purina 1.

H~-f:t
I legami fosfodiesterici conferiscono una ben definita polarità alla carena del
DNA. Questa polarità è stabilita dalla asimmetria dei nucleotidi e dal modo e
con cui essi so no legaci. Le catene di DNA hanno un 5'-fosfato libero o un
N--l AH
H
3
N
5'-ossidrile libero a una estremità e un 3'-fosfato libero o un 3'-ossidrile libe-
ro all'altra. Per convenzione le sequenze di DNA vengono scritte e lette sem-
guanina
o pre a partire dalla terminazione 5' (da sinistra) verso la terminazione 3', ge-
neralmente con un fosfato al 5' ed un ossidrile al 3'.
H

Ciascuna base si trova nella sua forma


tautomerica preferita
citosina
Le basi del DNA appartengono a due differenti categorie: le purine e le piri-
midine. Alle purine appartengono ladenina e la guanina mentre le pirimidi-
ne sono la citosina e la timina. Le purine derivano dalla struttura a doppio
pirimidina
anello mostrata nella Figura 6.4. [adenina e la guanina condividono questa

H:e~N
struttura di base ma hanno legati differenti gruppi. Parimenti, la citosina e la
cimina (mostrate nella Figura 6.4) sono variazioni di una struttura a singolo
H 1AH15
6
N
3
anello. La figura mostra anche la numerazione delle posizioni degli atomi ne-
gli anelli purinici e pirimidinici. Le basi sono attaccate al deossiribosio me-
diante un legame glicosidico all'Nl delle pirimidine o all'N9 delle purine.
Ciascuna base esiste in due conformazioni tautomeriche alternative, che so-
no in equilibrio fra loro. Nella Figura 6.4 sono convenzionalmente rappre-
sentate le forme necessarie per l'appaiamento delle basi. G li atomi di azoto at-
taccaci agli anelli purinici e pirimidinici sono in forma amminica nella mag-
gior parte dei casi e soltanto raramente ass umono la conformazione immini-
Figura 6.4 ca. Allo stesso modo , gli atomi di ossigeno attaccaci alla guanina e alla cimina
Purine e pirimidine. Le linee tratteggia- sono n ella maggior parte dei casi in forma cheto e solo raramente assumono
te indican o i sit i di attacco delle basi al-
lo zucchero. Per semplicità gli idrogeni
la configurazione enolica. Per esempio, la Figura 6.5 mostra la tautomerizza-
sono stati omessi d agli zuccheri e dalle zione della citosina nella forma imminica (a) e la guanina nella forma enolica
basi, eccetto d ove necessari. (b). Come vedremo, la capacità di formare un tautomero alternativo è causa
di errori durante la sintesi del DNA.

a ammine immlno

' H'-..
N
/H °" N
/H

,l~ O N
~l~ O N
I I
b cheto enolo

"' o °" o /H

.. Figura 6.5
Conformazioni tautomeriche delle ba-
si. Tautom eria ammina!:::;: immi no e
cheto !:::;: enolo. (a) La citosina si t rova
' H'-..
N N
' H'-..
N N
normalmente nella forma ammina, rara -
mente nella configurazione immino. (b)
I I
H H
_a guanina si trova normalmente nel la
'orma cheto, anche se rara mente può
assumere la configurazione enolo.
' H-donatore di legame °" H-accettore di legame
e aa.os-11s90-o 6. La struttura del DNA e dell'RNA I 1O1
I due filamenti della doppia elica sono tenuti assieme
dall'appaiamento delle basi con un'orientazione
antiparallela

La doppia elica è composta da due catene polinucleotidiche che sono tenute


assieme da deboli legam i non covalenti che si instaurano fra le coppie di basi,
come mostrato nella Figura 6.3. I.:adenina di una carena è sempre appaiata
con la timina che si trova sull'altra catena e, parallelamente, la guanina è sem-
pre appaiata con la citosina. I due filamenti hanno la stessa geometria nel for-
mare l'elica, ma le basi formano le coppie con una polarità opposta. C ioè, la H . CH
base al terminale 5' di un filamento è appaiata con la base al term inale 3' del- '\N- H"""'O~ 3
~ ~
(~N"'"H-N~N
l'altro filamento. Si dice che i due filamenti hanno un'orientazione antiparal- 4

lela. Questa orientazione antiparallela è una_conseguenza stereoch imica del-


l'accoppiamento adenina:cimina e guan ina:citosina. I
zucchero
\:J_"H
- O
Il '\
zucchero

Le due catene della doppia elica hanno Figura 6.6


Le coppie d i basi A:T e G:C. La figura
sequenze complementari mostra i legami idrogeno fra le coppie
di basi.
La formazione delle coppie fra ad enina e cimina e fra guanina e citosina de-
term ina una relazione complementare fra la sequenza di basi delle due care-
ne interagenti dando alla molecola del DNA un ca rattere auro-codificante.
Per esempio, se prendiamo la sequenza 5'-ATGTC-3' di una catena, la catena
opposta ha una sequenza complementare 3'-TACAG-5'.
La precisione nell'applicazione della regola di Wacson-Crick nell'appaiamen-
to delle bas[·è imposta sia dalla fo rma sterica delle basi che dalla possibili tà di
formare legami idrogeno fra adenina e cimina e fra guanina e citosina (Figura
6.6). I.:adenina e la cimina si accoppiano in modo cale da formare un legame
idrogeno fra il gruppo ammino esociclico sul C6 dell'adenin a ed il gruppo
carbonilico sul C4 della cimina; e parimenti si form a un legame idrogen o fra
Nl dell'adenina e N3 della cimina. Un arrangiamento corrispondente si ot-
tiene fra la guanina e la citosina. Una coppia G:C possiede tre legami idroge-
no, poiché il gruppo esociclico N H 2 del C2 della guanina può formare un le-
game idrogeno con un gruppo carbonilico in posizione C2 della citosina. Al-
lo stesso modo, un legame idrogeno si può formare .fra N 1 della guanina e
N3 della citosina e fra il gruppo carbonilico in C6 della guanina con J'N H 2
esociclico in C4 della citosina. I.:appaiamento delle basi secondo Wacson e
C rick richiede, però , che le basi siano nella corretta forma rauromerica.
Un'importante caratteristica della doppia elica è che le due coppie di basi ab-
biano esattamente lo stesso ingombro trasversale: infatti le coppie A:T e G:C
presentano gli zuccheri posizionaci in modo cale da avere una distanza non
dissimile nelle due coppie. La stessa cosa accade per le coppie T:A e C:G. In
altre parole, esiste approssimativam ente un doppio asse di simmetria che
mette in relazione i due zuccheri e quindi tutte e quamo le coppie di basi
possono essere posizionate nella doppia elica senza che si abbiano distorsioni
molto evidenti della struttura complessiva del DNA. In aggiunta le cop pie di
basi possono impilarsi l' una sull'altra rimanendo all'interno dell'impalcatura
degl.i zuccheri-fosfati.

Il legame idrogeno è importante nel determinare


la specificità delle coppie di basi

I legami idrogeno fra le basi complem entari sono una caratteristica fonda-
mentale della doppia elica, contribuendo alla stabilirà termodinamica dell'e-
lica ed alla specificità delle coppie di basi. A prima vista, si potrebbe pensare
che il legame idrogeno non debba contribuire in modo sostanziale alla stabi-
lirà del DNA per i morivi che esporremo qui di segui to. U na molecola orga-
102 IParte seconda • Manutenzione del genoma e aa-0a-1 1s90.o e

nica presente in un solvente costituito da molecole d'acq ua ha tutti i siti, che


possono formare legami idrogeno, impegnati con le molecole d'acqua circo-
stanti. Questi legami si formano e si distruggono molto rapidamente. Nel
DNA, per ogni legame idrogeno che si forma fra le coppie d i basi deve essere
eliminato un preesistente legame idrogeno con una molecola d'acqua. Il con-
tributo energetico netto dei legami idrogeno per mantenere la stabilità della
doppia elica sembrerebbe, quindi, modesto. Peraltro quando i filamenti po-
linucleotidici sono separati, le molecole d'acqua si attaccano alle basi; vice-
Figura 6.7 versa quando i filamenti si incontrano per formare la doppia elica, un grande
Incompatibilità della coppia A:C. La numero di molecole d'acqua sono allontanate dalle basi con un aumento glo-
struttura mostra l'impossibili tà dell'a-
bale del disordine del sistema e un conseguente aumento dell'entropia che
denina di formare appropriati legami
idrogeno con la citosina. La copp ia fra stabilizza quindi la doppia elica. I legami idrogeno, comunque, non sono le
queste basi risult a instabile. sole forze che stabilizzano la doppia elica. Un secondo importante contributo
proviene dalle interazioni di impilamento fra le basi. Le basi hanno una strut-
tura planare, e sono molecole relativamente insolubili in acqua, per cui esse
tendono ad impilarsi l' una sull'altra perpendicolarmente all'asse longitudina-
le della doppia elica. Le interazioni fra le nuvole elettroniche (7t-7t) che si for-
mano fra le basi impilare contribuiscono significativamente alla stabilità del-
la doppia elica.
I legami idrogeno sono anche importanti per la specificità dell'appaiamento
delle basi. Supponendo di voler appaiare una adenina con una citosina, do-
vremmo avere un accettore (N l dell'adenina) di legame idrogeno posto di
fronte ad un altro accettore di legame idrogeno (N3 della citosina). Per ragio-
ni steriche sarebbe però impossibile frapporre fra questi due accettori una
molecola d'acqua necessaria per soddisfare le esigenze dei due accettori (Figu-
ra 6.7). Allo stesso modo due idrogeni legati a donatori, i gruppi NH 2 al C6
dell'adenina e C4 della citosina, dovrebbero stare di fronte l'uno rispetto al-
i'altro. Per cui, la coppia di basi A:C risulterebbe instabile poiché le molecole
d'acqua verrebbero allontanate e quindi non vi sarebbe più la possibilità di ri-
formare legami idrogeno.

Le basi possono ruotar~ all'esterno della doppia elica

Come abbiamo visto, i livelli energetici della doppia elica favoriscono l'ap-
paiamento di ciascuna base di un filamento con la base complementare del-
l'altro filamento. A volte però, singole basi possono protrudere dalla doppia .
elica mediante un interessante fenomeno conosciuto come rotazione della
base (base flipping), mostrato nella Figura 6.8. Come vedremo nel Capitolo
9 , certi enzimi che metilano le basi o rimuovono basi danneggiate provocano
questo fenomeno di rotazione. Ciò è reso necessario dal fatto che se la base ri-
manesse in posizione, l'enzima non potrebbe, per ragioni steriche, alloggiare
la base nel suo sito catalitico. Altri enzimi coinvolti nella ricombinazione
omologa e nella riparazione del DNA sembra che funzionino "scandaglian-
do" il DNA per controllare l'omologia delle basi o cercare danni ruotando
una base dopo l'altra. Questo fenomeno non è energeticamente dispendioso
poiché viene ruotata soltanto una base per volta. Tutto ciò dimostra che il
DNA mostra una flessibilità di struttura più grande di quanto possa sembra-
re ad una valutazione superficiale.

Figura 6.8
Rotazione delle basi. Struttura del
DNA isolato dopo attivi tà della metila-
Il DNA è normalmente una doppia elica destrogira
si. Viene mostrata la citosina ruotata
\'erso l'esterno del l'elica e la piccola d i- Applicando la regola della direzione delle mani, possiamo vedere che ciascuna
storsione delle coppie d i basi adiacen- delle catene polinucleotidiche della doppia elica gira in senso des.trogiro. Im-
(Fonte: Klimasauskas S., Kumar S.,
Roberts R.J., e Cheng X. 1994. Ce// 76:
maginiamo la nostra mano destra vicino alla molecola del DNA, come mo-
357. Immag ine preparata con Bob- strato in Figura 6.9, tenendo il pollice rivolto verso l'alto, parallelo all'asse
Scr•pt, MolScript, e Raster 30.) longitudinale della doppia elica e le dita che seguono i solchi dell'elica. Se-
e 88-08-17890-o 6. La struttura del DNA e dell'RNA I 103

3' 5' 5' 3' Figura 6.9


Eliche levogire e destrogire. Le due
catene polinucleotidiche si avvolgono,
nella doppia el ica in modo destrogiro.

3' 3'
destrogiro levogiro

guite la direzione, lungo un filamento dell'elica, indicata dal pollice: così fa-
cendo state scorrendo 1ungo lelica nella stessa direzione indicata dalla posi.-
zio ne delle dita. Questo non accade usando la mano sinistra.
Una conseguenza della struttura generale della molecola del DNA è la sua pe-
riodicità. Ciascun paio di basi è ruotato rispetto al precedente di circa 36°.
Mediante analisi ai raggi X dei cristalli del DNA è stata riscontrata la presen-
za di 10 paia di basi per ogni giro d 'elica (360°) (vedi la Figura 6.la). Per ul-
teriori chiarimenti si rimanda al Box 6.1 , Il DNA ha, in soluzione, 1Opaia di
basi per giro d'elica: l'esperimento con la mica.

Il DNA ha, in soluzione, 10 paia di basi per giro d'elica: l'esperimento


Box 6.1
con la mica

Il numero di 10 paia d i basi per giro varia a seconda de lle menti lunghi migrano più lentamente di quelli corti. Con-
condizioni. Un classico esperimento fatto nel 1970 d imo- clusa l'elettroforesi, osserverem o una serie d i frammenti
strò che il DNA adeso ad un supporto presenta più di 10 di DNA aventi una grandezza media di 1O e 11 , 21 , 31 e
paia di basi per giro d'elica. Corti framm enti di DNA ven- 32 paia d i basi e così via, in termini di multipli di 10,5, che
nero deposti su una superficie di mica. La presenza dei è il numero d elle basi per ogni g iro d'elica. Questo risul-
fosfati 5'-terminali delle due catene determinano una tat o è in accordo con i risultat i ottenuti da altri esperi-
particolare o rientazione delle molecole adese. Le mole- m enti in cui il DNA veniva mantenuto in soluzione (ved i
cole d i DNA legate alla mica vennero poi trattate con più avanti il paragrafo La doppia elica esiste in conforma-
DNasi I, un enzima (u na d eossiribonucleasi) che t aglia i zioni multiple). Gli esperimenti di DNAsi, utilizzati per ve-
legami fosfodiesterici dell'impalcatura del DNA. Poiché rificare la struttu ra della doppia elica, sono ora uti lizzati
l'enzima ha un ingombro considerevole, è in grado d i per stud iare le int erazioni dei complessi proteina-DNA

e
idrolizzare soltanto i legami che stanno dalla parte oppo- (vedi il Capitolo 17).
sta al foglio di mica (pensiamo al DNA come ad un cilin-
dro appoggiato su una superficie piatta), in quanto non ' à à8
83
mica

3 3
bp
può per ragioni steriche raggiungere que lli che sta nno
più vicini al supporto. Per cui i frammenti di DNA che de- C./
rivano dalla digestione riflettono la periodicità del DNA:
cioè il numero di paia di basi per giro d'elica.
Dopo la deposizione del DNA sulla mica venne ag- -
giunta la DNasi e dopo la reazione i frammenti risul- 388• =:388 388
;::

tanti furono separati per elettroforesi in un gel d i poliacri-


lammid e (Box 6.1 Figura 1; ved i anche il Capitolo 20 per
la spiegazione del l'elettroforesi su gel). Poiché il DNA è
caricato negativamente, migra attraverso il gel verso il
3 3--:: 3 22
21
20

8 8 8
polo positivo del cam po elettrico. La matrice del gel cer- 11
ca d i impedire il movimento dei framment i in modo che 10

I• loco m;gc.,;ooe d;peode d•ll• loco luoghemo; fr•m- ~ ~ ~

Box 6.1 Figura 1 L'esperimento con la mica.


104 I Parte seconda • Manutenzione del genoma C SS-06-1 7890-0

La doppia e\ica presenta un so\co maggiore


ed un soko minore

li risulrato del fatto che il DNA è formato da due catene che assumono la for-
ma ad elica è che ci troviamo di fronre ad un lungo polimero che presenra due
solchi con dimensioni differenri l' uno risperco all'altro. Qual è la ragione della
presenza di un solco più grande ed uno pit1 piccolo? Quesco è la semplice con-
seguenza della geometria della coppia di basi. I..: angolo formaco dalla pr._otrusio-
ne dei due zuccheri dalle coppie di basi (che è, di fatto, l'angolo formato fra i
legami glicosidici) è di circa 120° (per l'angolo più piccolo) e di 240° (per l'an-
golo p it1 ampio) (vedi le Figure 6.1b e6.6). Come risultato di tutto ciò, quando
moltissime basi si impilano l'una sull'altra, l'angolo meno ampio che si forma
fra gli zuccheri da una parre della coppia genera il solco minore menrre l'ango-
lo più grande presenre dall'altra parre della coppia crea il solco maggiore. (Se
gli zuccheri guardassero in senso opposto su una linea retta, cioè fossero ruota-
ti perfettamente di 180°, i due solch i dovrebbero essere della stessa dimensione
e quindi non esisterebbero più un solco maggiore ed uno minore.)

Il solco maggiore fornisce molte informazioni


di tipo chimico

I bordi di ciascun paio di basi si affacciano nei solchi maggiore e minore,


creando un sistema di donatori e accettori di legami idrogeno e slij)èrfìci di
van der Waals che permettono di specificare la coppia di basi (Figura 6. 10). I
bordi della copp ia di basi A:T presentano nell'ordine i seguenti gruppi chimi-

solco maggiore solco maggio re

D D

A H H H H A
A I \ A
O"'"" H
-N

H
H~N-H""'"O

~e /
N- H1"'''rf:ìt-N ~-;{~"'""H-~ " " '" "" · -.,
N-H"""O "\ / 0 ......,H_N
A I A A \ A
H H
D D

solco minore solco minore

solco maggiore solco maggiore

D A M M A D
CH H A

Figura 6.10
fj:·~.
N \\
:..~~~~
\~3 )-N
Gruppi chimici esposti nei solchi mag- / O H -N \
giore e minore formati dai bordi delle
coppie di basi. Le lettere in rosso iden- A H A
tificano gli accettori di legami idrogeno
(A), donatori di legami idrogeno (D),
drogeni non polari (G), e gruppi metili-
c1 (M). solco minore solco minore
C> 88-08-17890-0 6. La struttura del DNA e dell'RNA I 105

ci nel solco maggiore: un accettore di legame idrogeno (l'N7 dell'adenina) , un


donatQre di legam e idrogeno (il gruppo ammin ico esociclico sul e6 de!J'ade-
nina), un accettore di legam e idrogeno (il gruppo carbonilico sul e4 della ci-
mina) e una superficie idrofob ica (il gruppo metilico sul es della rimina) .
Analogamente, i bo rdi della coppia di basi G:e mostran o la presenza, nel sol-
co maggiore, dei seguenti gruppi: un accettore di legame idrogeno (l'N7 della
guanina), un accettore di legame idrogeno (il gruppo carbonili co sul e6 della
guanina) , un don atore di legame idrogen o (il gruppo amminico esociclico sul
e4 della citosina), un idrogeno non polare (l' idrogeno in es della citosina).
Quindi, vi sono situazioni caratteri stiche per quanto riguarda la possibilità d i
formare legami idrogeno e struccure che sono esposte nel solco maggio{e, che
e,ermerton o di distinguere una coppia A:T da quella G:e ma anche una cop-
pia A:T da quella T:A e G :e da quella C:G. Possiamo pensare a queste pro-
prietà come ad un codice in cui A rappresenta un accettore di legame idro-
geno, D un donatore di legame idrogeno, M un gruppo metilico ed H un
idrogeno non polare. In questo codice, A DA M posto nel solco maggiore
rappresenta una coppia di basi A:T, e A AD H sta per una coppia G :e; allo
stesso m odo M A D A rappresenta la coppi a T:A m entre H D A A quella
C:G . In ogni caso, questo codice fo rmato da gruppi ch imi ci messi all' interno
del solco m aggiore identifi can o in modo specifico le coppie di basi. Queste
situazioni sono imporranti g,oiché p ermettono alle proteine di riconoscere
senza ambiguità specifiche sequenze di D NA senza che sia necessario aprire o
ro mpere la doppia elica. In verità, come vedremo( un imporrante m eccani-
smo di decodifi cazio ne delle in fo rmazioni fo rnice dal D N A è rappresentato
dalla capacità delle carene laterali degli amminoacidi di sporgere nel solco -i./\) _.\>(h... \ I
maggiore e riconoscere e legare specifiche sequenze di D N A,>.::-
U solco minore non è così ricco di inform azio ni e qualsiasi informazione pos- ~ 0 '\tir Jo~ '(.
sa orn ire è meno utilizzabile per distinguere le coppie di basi. La piccola di-
mensio ne del solco è meno utilizzabile per accogliere i gruppi lacerali degli
amminoacidi. Le coppie di basi A: T e T:A e quelle G:e e C:G son o, viste dal
~oleo minore, simili l' una all'altra. La coppia A:T ha un accettore di legame
idrogen o (l'N3 dell'adenina), un idrogeno non polare (sulJ'N2 dell'adenina)
ed un accettore di legame id rogeno (il gruppo carbonilico sul e2 della timi-
n a). Il suo codice, quindi , sarà AH A. Questo codice risul ta essere lo stesso
se lecco nella direzione opposta, in fatti la coppia A:T non appare molto di -
versa da quella T:A dal punto di vista delle proprietà di legame (formazione
di legam i idrogeno)~er una p ro teina ch e inserisce le sue catene lacerali all'in-
~eLsolco mino re. In modo similare, la coppia G:ç: mostra un accettore
di legam e idrogeno (sull'N3 della guanina), un donatore di legam e idrogeno
Df gruppo amminico esociclico in e2 della guanina) e un accettore di legame
idrogeno (il gruppo carbonilico sul e2 della ci cosina): in codice AD A. D al
E!:lnto di vista dell a capacità di fo rmare legam i idrogeno la cop pia C:G e
_g:i~:e non.si comportano in mod o m olto diverso l'una rispetto all'alrra.
Il solco minore sembra, quindi , di fferente se consideriam o le coppie A:T e
G:C, ma quelle G:e e e:G e quell e A:T e T:A non possono essere facilmente
discinte (Figura 6. 10).

La doppia elica esiste in conformazioni multiple

I primi scudi di diffrazio ne ai raggi X, eseguici su soluzioni concentrare d i -+-


DNA (praticamente fìbre di D NA) , rivelarono due tipi differenti di struttu-
re: le form e B ed A (Figura 6. 11). La forma B, che è osservata quando il D NA
si trova in una soluzione ad alto grado di umidità, è quella che più si avvicina
alla struttura fisiologica: contiene I O paia d i basi per giro d 'elica, ha un ampio
solco maggiore ed un solco mino re più chiuso. La forma A, ch e si ottiene da
una soluzione a più basso contenu to d 'acqua, ha 11 paia di basi per giro d'e-
lica, il suo solco maggiore è più stretto rispetto alla fo rma B mentre q uello
106 IParte seconda • Manutenzione del genoma Cl 88·08·17890-0 C!

Figura 6.11 a DNAB b DNAA


Modelli del DNA in forma B, A , e Z.
cr
L'impalcatura zucchero-fosfato di cia- ra
scuna catena (una viola, l'altra verde) si E
trova nella parte esterna di tutte le for- ]~ p
me mentre le basi (in argento) sono ri- ò
volte verso l' interno. La parte superiore d
della figura mostra una visione longitu- e
dinale della molecola mentre la parte u
inferiore mostra la sezione trasversale.
(a) La forma B del DNA è quella che
normalmente si trova nella cellula ed è E
e
caratterizzata da 1O paia di basi ogni <:t 11
rr)
giro d'elica (3,4 nm); le coppie di basi
adiacenti distano 0,34 nm l'una dall'al-
tra. Sono anche visibili il solco maggio-
l
[
re e quello minore. (b) La forma più
compatta del DNA (forma A) contiene r
11 paia di basi per giro d'elica e pre-
senta le· coppie più inclinate rispetto al- ~
l'asse longitudinale della molecola. In
aggiunta, nella forma A è presente un
foro centra le (figura in basso). Questo
tipo di forma è adottata dalle eliche
formate da RNA-DNA e RNA-RNA.
(c) Il DNA Z è un'elica levogira ed ha
l'impalcatura con andamento a zig-zag
(da cui il nome "Z"). (Fonte: per gentile
concessione di C. Kielkopf e P.B. Der-
van.)

minore è più aperto. La maggior parte del DNA presente nella cellula è nella

j forma B mentre la forma A si trova specialmente in corrispondenza di com-


plessi con proteine. Inoltre, come vedremo, la forma A è simile alla forma del
doppio filamento di RNA.
La forma B rappresenta una struttura ideale che differisce in due parametri ri-
spetto a quella esistente in natura. Per prima cosa il DNA in soluzione, come
vedremo, è molto spesso più avvolto di quanto lo sia nella forma B poiché con-
tiene circa 10,5 paia di basi per giro d'elica. In secondo luogo la forma B è una
struttura che in realtà non si presenta perfettamente regolare ma mostra irrego-
larità a seconda della sequenza delle basi. Questo è stato osservato comparando
le strutture di cristalli di DNA aventi sequenze diverse. Per esempio, le due ba-
si di una stessa coppia non sempre giacciono su uno stesso piano, ma possono
mostrare una rotazione l'una rispetto all'altra (propeller twist), attorno all'asse

a
I

Figura 6.12
La torsione delle coppie di basi purine
e pirimidine in un'elica destrogira.
(a) La struttura mostra una sequenza di
tre coppie consecutive di basi A:T nella
normale conformazione di Watson e
Crick. (b) Una torsione della doppia eli-
ca causa una rotazione attorno all'asse
longitudinale della molecola. (Fonte:
adattata da Aggaarwal et a/. 1988.
Science 242: 899-907, fig. Sb. Copy-
•ight © 1988 American Association for
rhe Adva ncement of Science. Usata
con autorizzazione.)
e 88-08-17890-0 6. La struttura del DNA e dell'RNA I 107

trasversale della coppia di basi, rendendo il turco una strurcura dinamica (Figu-
ra 6.12). Questo tipo di rotazione non è, però, costante per cui l'ampiezza dei
solchi maggiore e minore può variare localmente. Quindi la doppia elica non si posizione anti della guanina
presenta come una strurcura perfettamente regolare, ma la sua conformazione
dipende dalla presenza delle coppie di basi in quel punto (A:T, T:A, G:C, C:G)
e anche dalle coppie di basi circostanti. Comunque la forma B è, per molti casi,
una buona approssimazione della struttura del DNA nella cellula.

Il DNA alcune volte può formare un'elica levogira


deossiguanosina nel DNA in forma B

Il DNA contenente residui di purine e pirimidine alternate può avvolgersi in +


posizione sin della guanina
modo tale da formare eliche levogire come eliche destrogire. Per comprende-
re come il DNA possa formare eliche levogire, è necessario considerare il le-
game glicosidico che lega la base sulla posizione 1' del 2'-deossiribosio. Que-
sto legame può presentarsi in una delle due conformazioni chiamate sin e an-
ti (Figura 6.13). Nella conformazione destrogira il legame glicosidico è sem-
pre nella forma anti, mentre nella forma levogira, vi sono delle fondamentali
ripetizioni di dinucleotidi purine-pirimidine che presentano il legame glico-
sidico nella forma anti sui residui pirimidinici e nella forma sin sui residui pu-
rinici. È questa forma sin che è responsabile dell'avvolgimento in senso levo- deossiguanosina nel DNA in forma Z
giro dell'elica. La forma sin presente sul residuo purinico alternata ad una for- Figura 6.13
ma anti-sin determina la caratteristica conformazione a zig-zag del DNA le- Posizioni sin e anti della guanina nelle
vogiro (da cui il nome di DNA Z; vedi la Figura 6.11), che lo distingue dalle forme della doppia elica B e Z. Nel
DNA destrogiro in forma B il legame
forme di DNA destrogiro. La rotazione necessaria per passare dalla forma an- glicosidico (in rosso) che unisce la base
ti a quella sin impone un cambiamento di posizione anche al ribosio; infatti, al deossiribosio è sempre in una posi-
come si può osservare nella Figura 6.13, C3' e C2' possono scambiarsi la po- zione anti, mentre nel DNA levogiro in
sizione. In soluzione purine e pirimidine alternate assumono una conforma- forma Z questo legame ruota in direzio-
ne della freccia dando una conforma-
zione levogira soltanto in presenza di elevate concentrazioni di ioni carichi zione sin alla purina (in questo caso la
positivamente (per esempio Na+) che bloccano le cariche negative dei gruppi guanina). ciò non accade per le pirimi-
fosfato. A concentrazioni saline più basse, quelle sequenze formano una tipi- dine, dove non awiene la rotazione e
ca doppia elica destrogira. Il significato fisiologico del DNA Z è incerto e si che quindi rimangono nella conforma-
zione anti. (Fonte: adattata da Wang A.
trova sicuramente in piccola quantità rispetto al resto del DNA presente nel- J. H. et al. 1982. CSHSOB 47: 41 . Copy-
la cellula. U lteriori dettagli sul DNA A, B, e Z sono forniti nella Tabella 6.2. right© 1982 Cold Spring Harbor Labo-
ratory Press. Usata con autorizzazione.)

Co m parazio ni d e lle propriet à strutturali del DNA A, B, e Z studiato mediante ana lisi
t abella 6.2 dei cristalli ai raggi X

Tipo di elica

A B z
Struttura generale corta e larga allungata e sottile allungata e sottile
Distanza fra le coppie di basi 2,3À 3,32À 3,8À
Diametro dell'elica 25,5À 23.7 A 18,4À
Senso di rotazione dell'elica destrogira destrogira levogira
Numero d i pb per ripetizione 1 1 2
Numero d i pb per giro d'elica - 11 -1 0 12
Rotazione delle coppie d i basi 33,6° 35,9° -60° ogni 2 pb
Lunghezza del passo dell'elica 24,6À 33,2À 45,6À
Inclinazione delle basi + 19° - 1,2° _90
Propeller twist per pb +18° +16° - oo
Disposizione dell'asse dell'elica solco maggiore attraverso le coppie d i b asi solco minore
Dimensioni del solco maggiore molto stretto ma profondo largo e d i media profondità piatto sporgente
d alla superficie dell'elica
Dimensioni del solco minore molto largo ma poco profondo stretto e di media profondit à molto stretto ma molto profondo
Conformazione del legame anti anti anti sulla C, sin sulla G
glicosidico

Fonte: adattata da Dickerson R.E. et.al. 1982. CSHSQB 47:1 4. Copyright© 1982 Cold Spring Harbor Laboratory Press. Usata con autorizzazione.
108 I Parte seconda • Manutenzione del genoma ~ 88-08-17890-0

Figura 6.1 4 Le due catene del DNA possono separarsi


Rinaturazione e ibridazione. Una misce- (denaturazione) e riassociarsi ·
la di due molecole di DNA a doppio fila-
mento identiche sa lvo per la mancanza,
in una delle due molecole, di una picco- Poiché i due filamenti della doppia elica sono tenuti assieme mediante legami
la sequenza (la regione a segnata in ros- (non-covalenti) relativamente deboli, possiamo aspettarci che i due filamenti
sol vengono denaturate per mezzo di
un 'innalzamento della temperatura. Le
d · ·d · f ·1 I f · 1 d 11 d ·
possano 1~1 ~rs1 ac1 mente. n atti, a st~uttura e a. oppia e 1ca suggensce
r ·
m oleco le denaturate vengono riportate che la rephcaz10ne del DNA possa avvemre appunto m questo modo. I fila-
in seguito in condizioni rinaturariti. Oue~ menti complementari della doppia elica possono anche essere separati _g~-
sto trattamento porta_ alla formazion~ d (J \.i o una soluzione di DNA viene scaldata sopra la temperatura fisiol_Qgica (vi-
due t1p1d1 molecole nnatu rate. Uno e
composto da molecole completament z_ /:._
1~0 a
100 oc) -=- - -d · · · d' l'.-1.
I? re;
o posta con 1z10m 1 e evato ~ · questo p~ocesso c?no-
è ...
ri naturate che comprendono sia q uelle sc1uto come denaturaz10ne. Comunq~ la se araz1one dei fìlamenn del
contenenti la sequenza a sia quelle de- DNA è un processo reversibile. Quando la temperatura della soluzione di
~ete. L.:altro tipo è formato da molecole DNA denaturato viene abbassata lentamente, i singoli filamenti spesso in-
1b nde composte da filamenti con e sen- . . .e · . . .
za la sequenza a. Queste ultime presen- contrano quelli complementan e nrormano una regolare doppia elica (Figura
tano una corta regione di basi non ap- 6.14). La possibilità di rinaturare filamenti di DNA complementari, denatu-
p aiate (la regione a) che sporgono dalla rati, permette la formazione di molecole ibride artificiali semplicemente ab-
doppia elica. bassando la temperatura di una miscela di DNA denaturato proveniente da

DNA contenente molecola d i DNA


molecole d i DNA denat urate col calore
la regione a ~-----------~ mancante della regione a

----- . ....
a
..... ........ ........ ..... .......... ................ ...

raffreddamento lento e inizio


della rinaturazione

rinaturazione termi nata


l
'I
e 88-0S-11e90-0 6. La struttura del DNA e dell'RNA f 109

Figura 6.15
Curva di denaturazione del DNA.

singolo filamento

doppio filamento

40 60 Tm 100
temperatura (0 C)

N&$1
fonti diverse. Allo stesso modo ossiamo formare ibridi mescolando filamen-
ti complementari di DNAed RNA. Come vedremo nel Capitolo 20, la capa-
cità di formare ibridi fra due singoli polimeri di acidi nucleici (reazione di
ibridazione) è la base di alcune tecniche fondamentali in biologia molecolare
come la tecnica del Southern blot (vedi il Capitolo 20) e l'analisi dei mi-
croarray (vedi il Capitolo 18, Box 18.1).
Un' importante conseguenza derivante dalle proprietà della doppia elica è sta-
ta messa in evidenza mediante classici es erimenti eseguiti nel }950 in cui la
denaturazione del DNA veniva eseguita in una varietà di condizioni. In que-
- sti esperimenti, a enacurazione del DNA fu monitorata misuraµdo l'assor ~ )
bimento di raggi ultravioletti da p(lrte di una soluzione di DNA/ Il DNA ha
un massimo diassorbimento aella luce ultravioletta a 260 nm: le asi sono le
principali responsabili di questo assorbimento. Quan-do la temperatura di
""""lillasoluzione di DNA è portata vicino al punto di ebollizione dell'acqua, la
densità ottica, assorbanza, misurata a 260 nm , aumenta in modo considere-
vole. Questo fenomeno è conosciuto come ipercromicità della molecola del
__!)NA;.::_La spiegazione di questo aumento è che la doppia elica assorbe u11~
quantità di luce ultravioletta più bassa di circa il 40% rispetto al singolo fila-
mento. Questa ipocromicità è dovuta all'impilamento delle basi che essendQ.
schermate dagli zuccheri-fosfato dell'impalcatura della doppia elica sono me-_
noesposte e quindi assorbono meno luce ultravioletta)
- Se mettiamo in grafico l'assorbanza in funzione della temperatura, osser-

I viamo che l'aumento della luce assorbita avviene ad una ben determinata
temperatura seguendo un andamento sigmoidale. Il punto di flesso di que-
sta curva è il punto di fusione o Tm (Figura 6.15) della molecola. Come il
ghiaccio, il DNA fonde e va incontro ad una transizione che lo porca da
una struttura a doppia elica altamente ordinata ad una struttura molto me-
oA- )

no ordinata: il singolo filamento. La rapidità dell'aumento dell'assorbanza


alla temperatura di fusione ci dice che la denaturazione o la rinaturazione
di filamenti di DNA complementari è altamente cooperativa, paragonabile
ad un processo di apertura o chiusura di una cerniera lampo. La rinacura-
zione probabilmente avviene come conseguenza di un !eneo processo di nu-
cleazione in cui tratti relativam ente piccoli di nucleotidi di un filamento
trovano altrettanti tratti complementari sull'altro filamento (pannello in-
termedio della Figura 6.14) . Le parti rimanenti dei due filamenti si rinatu-
rano rapidamente mediante un sistema a cerniera lampo a partire dai siti di
nucleazione formando una doppia elica completa (riquadro in basso della
Figura 6.14). -
11 O I Parte seconda • Manutenzio ne del g enoma e ss-0a-11890-0

Figura 6.16
Dipendenza della denaturazione del
100 . ....·. ......··.
...
DNA dal suo contenuto di G + C e dal-
la concentrazione salina. Più elevato è
... .
.....
il contenuto di G + C più alta è la tem-
peratura necessaria per denaturare il
DNA. Il DNA proveniente da diversi o r-
80 .. ..
ganismi è disciolto in due solventi di- ~
versi. L'.uno a bassa concentrazione sali- o
na (grafico rosso) l'altro ad elevata con- .s"' 60
e
centrazio ne salina (grafico ve rde) ad un
-~
p H di 7,0. I punti rappresentano le tem-
·o
p eratu re a cui il DNA d enatura in fun- +
zione del contenuto di G + C. (Fo nte: "'
dati d a M armu r J . e Doty P. 1962. Jour- ·E 40
"'Ol
..
:i
na/ of M o /ecu/ar Bio/ogy 5: 120. Copy-
right© 1962, co n autorizzazione d i El-
sevier Science.)
20
................:.··
0 -1-~--~.;.-~~~~~~~~~~~~~~~-.-1

60 70 80 90 100 110

n
La temperatura di fusione è caratteristica per ciascun DNA ed è largamente de-
erminata dal contenuro di G:C e dalla foria ionici della soluzione. Più alta è la
percentuale di coppie di basi G:C (e quindi più basso il contenuro di A:T) più
alta è la temperatura di fusione (Figura 6.16) . Allo stesso modo, maggiore è la
concentrazione salina della soluzione, più alta è la temperatura a cui il DNA
denatura. Come può essere spiegaro questo fenomeno? Le coppie G:C contri-
buiscono ad aumentare la stabilità della doppia elica rispetto alle coppie A:T
visco l'elevatOnil"m ero di legami idrogeno esistenti nei tratti ricchi in G:C (tre
per la coppia G:C e soltant0 due per la coppia A:T); altrettanto importanti, nel
determinare questO fenomeno, sono però anche le interazioni di impilamento
delle coppie G:C con le coppie adiacenti che sono molro più favorite rispetto a
quelle esistenti fra le coppie A:T e quelle adiacenti. I..:effeno della..fo.rza ionica
riflette un'altra importante caratteristica della doppia elica. I..:impalcatura dei
due filamenti del DNA contiene gruppi fosforici che portano cariche negative.
Queste cariche negative presenti sui filamenti sono abbastanza vicine da causa-
r~_se non schermate, la repulsione tra i filamenti e quindi la loro separazi.Q.n e.
Ad alta forza ionica, le cariche negative sono protette dai cationi e ciò permet-
te di stabilizzare la doppia elica. '{iceversa a bassa forza ionica le cariche negati-
ve non sono protette e quindi la doppia elica risulta più instabile.

Alcune molecole di DNA sono circolari

Inizialmente si pensava che tutte le molecole di DNA fossero lineari ed aves-


sero due terminazioni libere. Infatti, ciascun cromosoma delle cellule euca-
riotiche contiene una singola molecola (estremamente lunga) di DNA. Ora
però sappiamo che alcune molecole di DNA sono circolari. Per esempio, il
cromosoma del piccolo virus delle cellule di scimmia SV40 è una molecola
circolare a doppia elica di circa 5000 paia di basi. Inoltre, la maggior parte
(ma non tutti) dei cromosomi batterici sono circolari; E. coli ha un cromoso-
ma circolare di circa 5 milioni di paia di basi. In aggiunta, molti batteri con-
tengono piccoli elementi genetici che si replicano in modo auronomo chia-
mati plasmidi che sono generalmente molecole circolari.
In alcuni casi vi sono molecole di DNA che sono a volte lineari a volte circo-
lari. I..: esempio meglio conosciuto è quello del batteriofago À di E. coli. Il ge-
noma del fago À è, all'interno della particella fagica, una molecola lineare a
e 88-08-17890-0 6. La struttura del DNA e dell'RNA J 111

doppio filamento, ma quando questo DNA viene iniettato in una cellula di


E. coli, durante l'infezione, diviene circolare. Ciò avviene grazie alle regioni a
singolo filamento che protrudono agli estremi della molecola e che hanno se-
quenze complementari (estremità appiccicose o sticky ends).

La topologia del DNA


Il DNA è una molecola flessibile, i parametri strutturali che lo caratterizzano
sono in funzione sia delle condizioni ioniche dell 'ambiente sia della natura
delle proteine che interagiscono con esso per formare dei complessi nucleo-
proteici. Nelle molecole lineari di DNA, poiché le terminazioni sono libere, il
numero di avvolgimenti di un filamento attorno all'altro filamento può esse-
re variato mediante la rotazione reciproca. Ma se le estremità della molecola
sono legate covalentemente l'una all'altra a formare una struttura circolare e
se non esistono interruzioni nei legami zucchero-fosfato dell'i mpalcatura, il
numero di volte che un filamento gira attorno all'altro filamento non può
cambiare. Questo DNA circolare covalentemente chiuso viene indicato come
una struttura topologicamente definita. Anche le molecole di DNA lineari
presenti n~i cromosomi eucariotici sono sottoposte a costrizioni ropologiche
per via dell'estrema lunghezza della molecola che viene ridotta attraverso la
formazione della cromatina e l'interazione con altri componenti cellulari (ve-
di il Capitolo 7). Nonostante questi vincoli, il DNA partecipa a numerosi
processi dinamici che riguardano la cellula. Per esempio, i due filamenti della
doppia elica, che sono avvolti l' uno atrorno all'altro, devono rapidamente se-
pararsi in modo tale da permettere al DNA di essere replicato o trascritto in
RNA. Quindi la comprensione della topologia del DNA e di come la cellula
possa aggiustare ed utilizzare a proprio vantaggio i vincoli topologici durante
la replicazione, trascrizione ed altre reazioni che riguardano il cromosoma, è
di fondamentale importanza in biologia molecolare.

Il numero di legame topologico (linking number)


è una proprietà non variabile del DNA circolare covalen-
temente chiuso
Consideriamo le proprietà topologiche dei DNA circolari covalentemente
chiusi (cccDNA). Dato che non ci sono interruzioni dei legami fosfodiesteri-
ci in entrambe le catene polinucleotidiche, i due filamenti di cccDNA non
possono essere separati. Se invece si vogliono separare i due filamenti circola-
ri è necessario interrompere transitoriamente almeno un legame fosfodieste-
rico e passare un filamento attraverso l'interruzione dell'altro filamento (in-
contreremo più avan ti un enzima in grado di mediare questa operazione). Il
numero di volte che un filamento deve essere passato attraverso l'altro affin-
ché le due catene possano separarsi l' una dall'altra viene indicato come nu-
mero di legame topologico (linking number, Figura 6 . 17). Il linking num-
ber, che è sempre un numero intero, è una proprietà topologica invariante del
cccDNA, qualunque sia la struttura geometrica della molecola.

Il legame topologico comprende due componenti:


il twist ed il writhe
Il linking number è la somma di due componenti geometriche, il twist ed il
writhe. Consideriamo per primo il twist. Esso è sempli cemente il numero di
volte che un filamento gira intorno all'altro filamento. Se consideriamo un
cccDNA con struttura planare, cioè che giace su un piano, il linking number
112 J Parte seconda • Manutenzione del genoma e 88-08-, 7890-0

a b e

topoisomerasi

\
20

bp: 360 bp: 360 bp: 360


Lk: 36 Lk: 32 Lk: 32
Tw: 36 Tw: 36 Tw: 32
Wr: o Wr: -4 Wr: O

Figura 6.17 è uguale al twist. In quesro caso il numero di twist può essere facilmente de-
Conformazioni topologiche di un DNA termjnato contando il numero di volte che i due filamenti incrociano su se
circolare covalentemente chiuso
stessi (Figura 6. l 7a). Il modo in cui i due filamenti si incrociano (twist) in
(cccDNA). La figura mostra la conver-
sione d i un DNA in forma ri lassata (a) in una doppia elica destrogira è definito positivo: in quesro caso il linking num-
forma superavvolta negativamente (b) ber avrà un valore positivo.
o con una parte della doppia elica Però i cccDNA normalmente non hanno un a conformazione planare, ma
aperta in singolo filamento (c). [Adatta-
ta da un diagramma del Dr. M . Gellert]
presentano generalmente delle tensioni rorsionali che impongono all'asse
(Fonte: modificata da Kornberg A. e longitudinale della doppia elica di incrociarsi su se stessa, a volte an che ripe-
Baker T.A. 1992. DNA replication, I tutamente, determinando così una struttura tridimensionale (Figura 6. l 7b).
1-21, p. 32. © 1992 W. H. Freeman and Quesro incrocio viene definito writhe. Per visual izzare le distorsioni causate
Company. Usata con autorizzazione.)
dallo stress torsionale basta pensare ad un filo del telefono che si presenta
normalmente superavvolto.
Il writhe può presentarsi in due forme diverse: una, la così detta interwound
o writhe plectonemico, in cui l'asse longitudinale della doppia elica è avvolto
su se stesso (come_mostrato nella Figura 6.1 7b e nella Figura 6. 18a); laltra
forma è un toroide o spirale in cui l'asse longitudinale è avvolto come atror-
no ad un cil indro e normalmente si ha quando il DNA si avvolge attorno ad

Figura 6.18
Due forme di writhe di DNA superav-
volto. La figura mostra una stessa mo-
lecola di cccDNA nella conformazione
superavvolta (a) o toroidale (b). La con-
fo rmazione superavvolta o plectonemi-
ca è formata da una molecola d i DNA a
doppio fi lamento avvolta attorno al suo
asse longitudinale, come mostrato nel
riquadro in basso. (b) Il superavvolgi-
mento toroidale o spirale appare come
una struttura cilindrica, come mostrato
nel riquadro in b asso. (Fonte: modifica-
ta da Kornberg A. e Baker T.A. 1992.
DNA replication, 11-22, p. 33. © 1992
W. H. Freemàn and Company. Usata
con autorizzazione del Dr. Nicholas
Cozzarelli.)
CSS-08-17890-0 6. La struttura del DNA e dell'RNA I 113

una proteina (Figura 6. 18b). Il numero di writhe ( Wr) rappresenta il nume-


ro di incroci dell'asse longi tudinale su se stesso e/o il numero di spirali nel
cccDNA. Per esempio, la molecola mostrata nella Figura 6.1 ? b ha un nume-
ro di writhing di quattro.
Gli incroci dell'asse della doppia elica e le spirali sono topologicamente equi-
valenti e sono proprietà geometriche interconvertibili. Una moleco la di
cccDNA può essere sottoposta a distorsioni che convertono la sua fo rm a
twist in forma writhe o viceversa senza che avvengano rotture di legam i cova-
lenti. La sola limitazione è che la somma del numero di twist ( Tw) e del nu-
mero di writhing ( Wr) deve sempre essere uguale al linking number (Lk).
Questa limitazione è espressa dalla seguente equazione:

Lk = Tw + Wr

LkO è il linking number di un cccDNA completamente ri-


lassato in condizioni fisiologiche

Se consideriamo un cccD NA privo di superavvolgimenti (che abbiamo defi-


nito rilassato) il suo twist corrisponde a quell o di un DNA in forma B in
condizioni fisiologiche (circa 10,5 paia di basi per giro d 'elica). Il linking
number (Lk) di questo DNA è indicato dal simbolo L/il. Lftl per questo
DNA è pari al numero delle paia di bas i contenute nel DNA d iviso 10,5. Per
un cccDNA di 10 500 paia di basi Lk sarà uguale a+ 1000. (Il segno è positi-
vo poiché il DNA è avvolto in senso destrogiro.) U n modo per visualizzare
quanto detto è quello di immaginare di costringere un filamento di cccDNA
in una forma planare: in questo caso l'altro filamento dovrebbe incrociare il
filamento planare I 000 volte.
C ome possono essere rimossi gli eventuali'superavvolgimenci da un cccDNA
non rilassato? Un metodo è quello di trattare il DNA con l'enzima DNasi I
in modo da idrolizzare uno, o pochi, legami fosfodiesterici in ciascuna mole-
cola. Una volta che il DNA è stato interrotto , ovvero si forma un nick (per
nick si intende l'interruzione di un legame fosfod iesterico su un solo filamen-
to della doppia elica) esso non è più topologicamente costretto e i due fila-
menti possono liberamente ruotare l'uno rispetto all'altro (Figura 6 .1 9). Se il
nick viene riparato, il cccDNA sarà rilassato ed avrà un Lk uguale a Lftl. (Poi-
ché il DNA è sottoposto, nel momento in cu i il nick viene riparato, a flut-
tuazioni rotazionali, alcune molecole di cccDNA del campione avranno un
Lk più grande di Lf/J e altrettante molecole avranno un valore di Lk più pic-
colo di LflJ. Infatti la reazione di rilassamento genera uno stretto spettro di
molecole di cccDNA con un Lk medio pari a Lf/J) .

Figura 6.19
Rilassamento del DNA mediant e
la DNasi I.
114 I Parte seconda • Manutenzione del genoma e 88-08-1 7890-0

Il DNA nelle cellule è superavvolto negativamente

La quancirà di superavvolgimenci di un cccDNA è come la differenza esisren-


te fra Lk e L/!J: questa differenza viene chiamata differenza linking:
t!.Lk = Lk - LftJ
Se il Mk di un cccDNA è signifìcarivamence diverso da zero la molecola è
sottoposta a torsione e quindi si presenca superavvolta. Se Lk < LftJ e Mk < O, si
dice che il DNA è "superavvolto negativamence". Al contrario, se Lk >Lf!J e
!:!Lk > O il DNA è "superavvolto positivamente". Per esempio, la molecola
mostrata nella Figura 6. l 7b è superavvolta negativamence ed ha un Mk di -4
poiché il suo Lk (32) è di quattro unità più piccolo di 36 che è il valore di Lk
(Lf!J) del DNA rilassato mostrato nella Figura 6 . l 7a.
Poiché !:!Lk e Lf!J sono dipendenti dalla lunghezza del DNA, è più semplice
esprimere il superavvolgimento della molecola come densità di superelica a
cui viene assegnato il simbolo a ed è definita come:
a = !:!Lk I Lf!J .
Le molecole di DNA circolari sia batteriche c;he eucariotiche sono normal-
mente superavvolte negativamente con un valore di a di circa -0,06. L'im-
magine ottenuta al microscopio elettronico, mostrata in Figura 6.20, raffron-
ta le strutture del DNA di un batteriofago nella sua forma rilassata ed in quel-
la superavvolta.
Che significato ha, dal punto di vista biologico, la densità di superelica? I su-
peravvolgimenti negativi possono essere considerati come un meccanismo di
immagazzinamento dell'energia libera che aiuta quei processi che richiedono
una separazione·dei due filamenti della tloppia elica, come nella reazione di
replicazione del DNA o nella trascrizione. Poiché Lk = Tw + Wr, i superav-
volgimenti negativi possono essere convertiti in tratti di DNA a singolo fila-
mento (comparare la Figura 6. l 7a con la 6 . l 7b). Le regioni di DNA supe-
ravvolto negativamente hanno la tendenza ad eliminare localmente la doppia
elica, per cui la separazione dei due filamenti è più favorita nel DNA supe-
ravvolto negativamence piuttosto che nel DNA rilassato.
Figura 6.20 I soli organismi dove fino ad ora è stato trovato DNA superavvolto positiva-
Micrografia elettronica di un DNA su- mence sono alcuni batteri termofili, microrganismi che vivono in condizioni
peravvolto. La parte superiore della fi-
gura mostra la molecola d i DNA rilas-
estreme di alta temperatura, come nelle sorgenti termali. In questo caso, i su-
sata (non superavvolta) del batteriofa- peravvolgimenti positivi possono essere considerati come magazzini di ener-
go PM2. La parte inferiore mostra il gia libera che permette di preservare il DNA dalla denaturazione che si po-
DNA dello stesso fago in una confor- trebbe avere a temperature cosl elevate. In queste situazioni ì superavvolgi-
mazione superavvolta . (Fonte: micro-
grafia elettronica per gentile conces-
m enti positivi possono essere convertiti in una maggior quantità di giri d 'eli-
sione di Wang J .C. 1982. Scientific ca (un DNA superavvolto positivamente può essere equiparato ad una dop-
American 247:97.) pia elica più avvolta rispetto al DNA in forma B): nei termofili quindi, la se-
parazione dei due filam enti richiede una maggior quantità di energia rispetto
al DNA superavvolto negativamente, come dire che la doppia elica è più sta-
bile rispetto a quella di un DNA rilassato.

I nucleosomi introducono superavvolgimenti negativi


nel DNA degli eucarioti
Come vedremo nel prossimo capitolo, il D N A, nel nucleo delle cellule euca-
riotiche, è compattato in piccole particelle conosciute come nucleosomi in
cui la doppia elica è avvolta per circa due giri attorno ad un nucleo proteico.
Questo tipo di avvolgimento non è altro, dal punto di vista geometrico,_che
un toroide o una spirale che si avvolge con un andamento levogiro. (Per com-
prendere quest' ultima affermazione basta applicare la regola che è illustrata e
spiegata nel Capitolo 7, Figura 7 .18). Questa regola dice che gli avvolgimen-
ti levogiri di una spirale equivalgono a superavvo lgimenti negativi, da cu i si
C 88-08-17890-0 6. La struttura del DNA e dell'RNA I 11 5

Figura 6.21
Schema del cambiamento del numero
di legame topologico mediante lato-
poisomerasi Il. La topoisomerasi Il si
lega al DNA, crea un taglio nella dop-
pia elica, permette il passaggio del
DNA non tagliato a'ttraverso l'interru-
zione, poi risalda il taglio .

taglio della passaggio della doppia taglio


doppia elica elica attraverso il taglio risaldato

deduce che l'impaccamento del DNA nei nucleosomi introduce una densità
di superelica negativa.

Le topoisomerasi possono rilassare il DNA superavvolto

Come abbiamo visto il linking number è una proprietà invariante dei DNA
topologicamente definiti. Esso può essere cambiato solamente provocando
una interruzione dei legami fosfodiescerici di almeno una delle due carene del
DNA Una categoria di enzimi, conosciuti come topoisomerasi, sono in gra-
do di introdurre una rottura del singolo o del doppio filamento del DNA in
modo temporaneo.
Le topoisom erasi possono essere ascritte a due classi principali. Le topoiso-
merasi II permercono di cambiare il numero di legami topologici di due uni-
rà per volta. Esse determinano una rottura temporanea dei due filamenti del
DNA attraverso la quale può passare un trarco di elica integra, prima che il
caglio venga risaldato. Questo tipo di reazione è mostrato schematicamente
nella Figura 6.21. Le topoisomerasi II richiedono l'e nergia di idrolisi del-
l'ATP perché possano funzionare. Le copoisomerasi I, invece, permettono di
cambiare il numero di legame topologico di un'unità per volta. Esse produ-
cono una rottura sul singolo filamento della doppia elica, permettendo in
questo modo al filamento integro di passare attraverso la rottura dell'altro
prima che il nick venga eliminato (Figura 6.22). Al contrario delle topoiso-
merasi II, non richiedono, per il loro funzionamento, ATP. Come le ropoiso-
m erasi possano rilassare il DNA e promuovere altre reazioni correlate verrà
spiegato più avanti.

nick passaggio Figura 6.22


di un filamento Schema del meccanismo d 'azione della
integro attraverso topoisomerasi I. L'enzima taglia un sin-
il nick e saldatura golo fi lamento della doppia elica, per-
del nick mette il passaggio del filamento non ta-
gliato attraverso il taglio, successiva-
mente richiude il taglio. Il processo fa
aumentare il numero t opologico d i una
Lk = n Lk = n+ l unità.
116 I Parte seconda • Manutenzione del genoma IC> 88-08-17890-0

I procarioti posseggono speciali topoisomerasi


che introducono superavvolgimenti nelle molecole
di DNA

Sia i procarioti che gli eucarioti posseggono topoisomerasi I e II che sono in


grado di rimuovere i superavvolgimenti presenti sulle molecole di D NA. In
aggiunta, i procarioti posseggono una speciale topoisomerasi II conosciuta
come DNA girasi che introduce, invece di rimuovere, superavvolgimenti ne-
gativi. La DNA girasi è responsabile del superavvolgimento negativo dei cro-
m osomi dei procarioti. Questo superavvolgimenro negarivo facilita lo svolgi-
mento (denaturazione) della doppia elica necessario per l'arruazione di moire
reazioni che coinvolgono il DNA, inclusi l'inizio della trascrizione e la repli-
cazione del DNA.

Le topoisomerasi permettono anche l'eliminazione


di nodi e la separazione di molecole di DNA
Olrre alla reazione di rilassamento del DNA, le topoisomerasi promuovono
al tre imporranti reazioni per il mantenimento di una co rretta struttura del
cromosoma all'interno della cellula. Questi enzimi utilizzano ancora un nick
temporaneo ed il passaggio di un filam ento integro attraverso questa rotrura.
Le ropoisomerasi possono concatenare o decatenace molecole circolari di
DNA. Due molecolé di DNA circolare vengono dette concatenare quando
passano una dentro l'altra come due anelli di una carena (Figura 6.23a). Fra

a topoisomerasi Il

concatenazione ,

decatenazione

b topoisomerasi I

concatenazione ,

decatenazione

Figura 6.23
Le topoisomerasi decatenano, d istri-
cano e snodano il DNA. (a) Le topoiso-
merasi Il possono concatenare e deca- e topo isomerasi Il
tenare DNA ci rcolari covalentemente
chiusi introducendo una rottura del
doppio fi lamento di una molecola e
pa ssando un'altra molecola attraverso
il taglio. (b) Le topoisomerasi I possono
concatenare e decatenare molecole d i
DNA a patto che un fi lamento di una
molecola presenti un nick o un tratto di
singola elica (gap). Ouesto perché tali
enzimi tagliano soltanto un filamento d topoisomerasi Il
p er volta. (c) Lunghe m olecole di DNA
intricate, generate per esempio duran-
te la replicazione dei cromosomi euca-
riotici, possono essere districate dalle
topo1somerasi. (d) DNA annodati pos-
sono essere snodati dall'azione delle
topo1someras1.
e 88-08-17890-0 6. La struttura del DNA e dell'RNA I 117

queste due attività mediate dalle copoiso merasi, quella della decacenazione ri-
veste una cerca im portanza biologica. Come ved remo nel Capito lo 8, mole-
cole di D NA concatenare vengono co munemente prodotte alla fine d i ogni
ciclo repl icativo (vedi la Figura 8.33). Le copoisomerasi giocano un ruolo es-
senziale nel decacenare queste m olecole di DNA permettendone così la sepa-
razione e la sudd ivisione nelle cellule figlie. La decacenazio ne d i due moleco-
le di D NA circolari covalencem ence chiuse richiede il passaggio dei due fi la-
menti di una molecola attraverso una rottura del doppio fi lamento dell'altra
molecola. Questa reazione è topoisomerasi II dipendente. Ciò spiega perché
le ropoisomerasi II sono enzimi essenziali per la vira della cell ula. D obbiamo
però cenere presence che anche la copo isomerasi I p uò effettuare una reazione
di decacenazione a pacco che una delle due molecole d i DNA presenti uno o
più nick o gap (tratti di si ngolo filamento in una m olecola di DNA a doppia
el ica; Figura 6 .23b).
Sebbene fin o a quesco momento abbiamo considerato, riguardo alla topologia
del D NA, solcanto m olecole circolari, bisogna ricordare che anche le moleco-
le lineari molto lunghe sono sottoposte a problemi topologici. Per esempio, al-
la fine di ogni ciclo d i replicazione, le due molecole figlie si presentano attor-
cigliate l' una con l'altra (Figura 6.23c). Questi siti di legame, come per le mo-
lecole circolari covalentemente ch iuse concatenate, bloccano la separazione dei
cro mosomi fratelli durante la micosi. La risoluzione di queste strutture, gene-
ral mente catalizzata dalle copoisomerasi II, è necessaria, negli eucarioti, affin-
ché possa verificarsi il successivo ciclo di replicazione e la divisione cellulare.
Occasionalmente, una molecola d i DNA può formare dei nod i (Figura
6.23d). Per esempio, alcune reazioni d i ricombinazione sito-specifica, che di-
scuterem o in dettaglio nel Capicolo 11, possono dare come prodotto delle
m olecole di D NA annodare. Ancora una volca, le copoiso merasi II possono
eliminare queste strutture. D 'altro canco questo lavoro può essere svolto an-
che dalle copoisomerasi I a condizion e che la molecola d i D NA presenti u n
nick o un gap.

Le topoisomerasi usano un legame covalente


proteina-DNA per tagliare e successivamente risaldare
i filamenti del DNA
Per compiere la loro funzione, le copoisomerasi devo no cagliare uno o tu tti e
d ue i fi lamenti e poi risaldare il filamento o i filamenti cagliaci. Le copo iso-
merasi sono in grado di promuovere entrambe le reazioni senza che debbano
intervenire altre protei ne o cofattori produttori di energia (per esempio, ATP;
vedi anche p iù avanti) poiché esse usano un meccanismo che prevede la for-
mazione di un legame covalente. Il caglio della molecola di D NA avviene
quando un resid uo di tirosina presence nel sito catalitico d ell'enzima attacca
un legame fosfodiescerico dell'impalcatura della molecola di D NA bersagli o
(Figura 6.24). Q uesto attacco causa una rottura nel DNA in seguico alla for-
mazione di un legame covalente era la cop oisomerasi e un terminale fosfato
del nick e la tirosina. L altra estremità del nick, che termina con un gruppo
O H , è tenuta molco saldamente dall'enzima, come vedremo in seguito.
Il legame fosfo-cirosina conserva l' energia che viene liberata dall' idrolisi del
legame fosfodiescerico. Di conseguenza, il D NA può essere risaldaco sempli-
cemente com ando ind ietro nella reazione: il gruppo OH esistente al termina-
le del n ick attacca il legame fosfo-cirosina riformando il legame fosfodiesceri-
co del D NA. Q uesta reazione ripristina l'incegricà del filamento del DNA e
rilascia la copoisomerasi che corna ad essere disponibile per un altro ciclo. Co-
me abbiamo accennaco precedentemente la topo isomerasi II richiede, per il
suo funzionam ento, l' idrolisi dell 'ATP; ma l'energia rilasciata da questa idro-
lisi è utilizzata per p romuovere cambiamenti nella conformazione del com-
plesso copoisomerasi- D NA e non per cagliare e risaldare il filamento.
118 I Parte seconda • Manutenzione del genoma @88-08-17890-0

a b

5·---------------------~ 3·

5' ..___ _ _ _ _ ___, 3'0H -------~) 3'


.- t~H
20. base

3'

~ ;,
5' ._0_ _ _ _ _ __ ~) 3'0H o--G-t~------~) 3'

s·-----------~---------~ 3·
l """"'JJ
~ O,y

Figura 6 .24
Le topoisomerasi tagliano i l DNA usando come intermedio una siano richieste due subunit à, una per ciascun filamento di DNA.
tirosina covalentemente legat a al DNA. (a) Schema del taglio e Le topoisomerasi a volte t agliano lasci ando il fosfato al term inale
sua eliminazione . Per semplicità è mostrato soltant o un singolo 5' a volte al terminale 3'. (b) Vedut a particolareggiata dell'inter-
fi lamento. Vedi la Figura 6.25 per uno schema p iù realistico. Lo medio covalente fosfo-tirosina.
stesso mecca nismo è uti lizzat o dalla topoìsomerasi Il sebbene

Le topoisomerasi formano un ponte sul nick


e permettono il passaggio di un filamento
di DNA attraverso l'altro

Nel momento in cui il DNA è staro ragliato e prima della sua richiusura, la
topoisomerasi promuove il passaggio di un altro tratto di DNA attraverso il
taglio. La funzione della ropoisomerasi quindi richiede una rottura del DNA,
il passaggio del fil amento attraverso il tagl io e la richiusura del DNA: tutto
ciò avviene in maniera altamente coordinata.
La conoscenza della struttura di alcune ropoisomerasi ha permesso di com-
prendere il loro meccanismo d'azione. Qui cercheremo di spiegare un mo-
dello per comprendere come la topoisomerasi I possa rilassare il DNA.
lnizialmente la ropoisomerasi si lega ad un tracco di DNA dove la doppia eli-
ca presenta una locale denatÙrazione (Figura 6.25a). La separazione dei due
filamenti è favorita dall'alta densità di superavvolgimenti negativi della mo-
lecola (vedi sopra): questo tipo di D NA è un ottimo substrato per il rilassa-
mento. Uno dei due filamenti denaturati del D A si lega in un distretto del-
!' enzima che lo pone vicino alla tirosina (Figura 6.25 b). Perché la reazione
possa avere successo è necessario che l'altro terminale del raglio sia cenuro sai-
Q 88-08-17890-0 6. La struttura del DNA e dell'RNA I 119

3'

~ ~
taglio e apertura passagg io
del taglio del filament o

5'

a b e

risaldatura ~
del filamento
tag liato

rilascio
del DNA

e d

damente dal!'enzima. Dopo aver effettuato il taglio, la topoisomerasi è sotto- Figura 6.25
posta ad un grande cambiamento strutturale che crea un'apertura sul fila- Rappresentazione della reazione cata-
lizzata dalla topoisomerasi I. La f igura
mento tagliato, con lenzima che si pone a ponte sull'interruzione. Il secon- mostra una serie d i fasi che portano al-
do filamento di DNA non tagliato passa quindi attraverso l'apertura e si lega la eliminazione di una superelica di un
ad un sito interno simile ad un incavo della proteina (Figura 6.25c). Avvenu- DNA plasmidico. I due fi lament i del
to il passaggio, si ha un secondo cambiamento di struttura a carico del com- DNA sono rappresent at i da due tratti
scuri (e non sono in scala). Nel pannello
plesso topoisomerasi-DNA che porta indietro le estremità del filamento in- sono evidenziati i quattro domini della
terrotto (Figura 6.25d). La saldatura del filamento avviene con l'intervento p rot eina (a). Il p rimo dom inio è colora-
del gruppo OH sul legame fosfo-tirosina (vedi sopra). Dopo questa reazione, to in rosso, il secondo in b lu, il terzo in
l'enzima può aprirsi un' ultima volta per rilasciare il DNA (Figura 6.25e). verde ed il quarto in arancione. (Fonte:
adattat a da Champoux J. 2001 . DNA -
Questo DNA è identico al DNA che avevamo prima della reazione eccetto topoisomerases. Annua/ Review of
per il fatto che il numero topologico è variato di uno. Biochemistry 70: 369-413. Copyright ©
Questo meccanismo generale, dove lenzima determina una struttura a ponte 2001 Annua l Reviews. www.annualre-
views.org.)
durante la reazione di passaggio del filamento integro attraverso l'interruzio-
ne d ell'altro filamento, può essere applicato anche alla r~azione mediata dalle
topoisomerasi II. Questi enzimi hanno peraltro una struttura quaternaria
formata da due o quattro polipeptidi. Due subunità, con i loro siti attivi con-
tenenti i residui di tirosina, sono richieste pa tagliare i due filamenti e pro-
durre l'interruzione della doppia elica che è una condizione essenziale del
meccanismo d'azione delle topoisomerasi II.

I topoisomeri di DNA possono essere separati mediante


elettroforesi

Le molecole di DNA circolari covalentemente chiuse aventi la stessa lun-


ghezza ma linking number differente sono chiamare topoisomeri. Anche se i
topoisomeri hanno la stessa grandezza molecolare possono essere separati l'u-
no dal!' altro per elettroforesi su gel di agarosio (vedi il Capitolo 20 per avere
una spiegazione dell'elettroforesi su gel). La base d i questa separazione è ch e
120 J Parte seconda • Manutenzione del genoma e 88-08-17890-0

A B C D
Dimost razione che il DNA ha una periodicità
--0 Box 6.2
dell'elica di 10,5 paia di basi per giro
utilizzando le proprietà topologiche
di un DNA circolare

L'osservazione che i topoisomeri possono essere separat i l'uno dall'altro me-


- -or-va diante elettroforesi è la base per la conduzione di un semplice esperimento
che dimostra che il DNA ha una periodicità, in soluzione·, di circa 10,5 pa ia di
basi per giro d'elica. Consideriamo 3 cccDNA aventi una ·lunghezza di 3990,
3995 e 4011 paia di basi, rilassati comp letamente per mezzo della topoisome-
rasi I. Quando sottoposti ad elettroforesi, il DNA d i 3990 e quel lo di 4011 mo-
stra no essenzialmente la stessa mob ilità. A causa delle fluttuazioni termiche, il
- - - oooco trattamento con topoisomerasi genera, in effetti, uno stretto spettro d i topo-
isomeri, ma per sempl icità considereremo soltanto la mobilità del topoisomero
quantitativamente più rappresentato (che corrisponde al cccDNA che è nella
Figura 6 .26 forma più rilassat a). La differenza di mobilità del le m olecole lunghe 3990 e 4011
Schema che descrive la separazione di paia di basi non è distinguibile poiché 21 pb non sono influenti in una corsa
topoisomeri mediante elettroforesi. elettroforetica. Il DNA da 3995 pb migra invece più rapidamente degli altri due
Nel campione A è rappresentato il
DNA rilassat o o DNA circolare non co- sebbene sia soltanto 5 pb più g rande d i quello d i 3990. Quale può essere la
valentemente chiuso, nel campione B il spiegazione d i q uest a anomalia? I DNA da 3990 e 4011 pb nella loro forma più
DNA lineare, nel campione C è rappre- rilassata hanno un legame topologico (li nking_number) uguale a LkO, rispettiva-
sentato il campione cccDNA altamente
mente di 380 (dividendo la lunghezza della molecola per 10,5) e d i 382. Po iché
sup eravvolto e nel campione Duna
scala di riferimenti di topoisomeri. Lk è uguale a LkO, la differenza (L1Lk = Lk - LkO) in entrambi i casi è zero e quin-
di non c'è torsione della molecola. Poiché il linking number può essere solo un
numero intero, il DNA di 3995 pb rilassato dovrebbe essere formato da due to-
poisomeri possedendo un linkin g number di 380 o 381. Tuttavia, LkO per il DNA
d i 3995 pb è d i 380,5. Per cui, anche nella conformazione più rilassata, questo
DNA dovrebbe presentare metà di una unità di superelica (la differenza nel lin-
king dovrebbe essere di 0,5) e qu indi migrare più rapidamente degli altri due
DNA. In altre parole, per spiegare come mai i DNA circolari ch e differiscono in
lunghezza per 21 paia di basi (due g iri d 'elica) hanno la stessa mobilità, mentre
un DNA ch e differisce soltanto di 5 paia di basi (circa metà d i un giro d 'el ica)
mostra una mobilità diversa, dobbiamo concludere che il DNA in soluzione ha
una periodicità di circa 10,5 pa_ i a d i basi per g iro d'elica.

più elevato è il numero di writhe piu compatta è la struttura del cccD NA: co-
me se fosse un cavo telefonico. Più compatta è la molecola, più veloce è la sua
migrazione attraverso la matrice del gel (Figura 6.26). Di conseguenza, un
cccDNA completamente rilassato migra molto più lentamente cli un suo to-
poisomero fortemente superavvolto. La Figura 6.27 mostra una serie di to-
poisomeri di DNA risolti mediante elettroforesi su gel. Le molecole che mi-
grano nelle bande acliacenti della serie differiscono l'una dall'altra di un solo
legame topologico. Ovviamente la mobilità elemoforetica è altamente sensi-
bile alle condizioni topologiche del D NA (vedi il Box 6.2, Dimostrazione che
il DNA ha una periodicità dell'elica di circa I 0,5 paia di basi per giro utiliz-
Figura 6.27 zando le proprietà topologiche di un DNA circolare).
Separazione di DNA rilassato e su-
peravvolto mediante elettroforesi su
gel. I t opoisomeri di DNA rilassato o
superavvolto p ossono essere separati L'etidio causa uno srotolamento della doppia elica
m ediante elettroforesi su gel di agaro- del DNA
sio . La velocità con cui le molecole mi-
grano aumenta in funzione dell'aumen-
are del numero dei superavvolgimenti L'eticlio è un catione formato da più anelli aromatici con truttura appiattita.
della molecola. (Fonte: per gentile con- La sua forma planare lo rende capace di scivolare, o intercalare, fra le coppie
cessione di J.C. Wang.) cli basi impilate l'una sull'altra (Figura 6.2 ). Poiché esso è fluorescente quan-
e 88-08-17890-0 6. La struttura del DNA e dell'RNA I 121
Figura 6.28
Intercalazione del bromuro d i etidio
nel DNA. L'.etidio espande lo spazio
NH 2 esistente fra le coppie di basi adiacen-
ti, d istorce il regolare andamento del-
l'impalcatura del DNA e fa dim inuire il
grado di avvolgimento dell'elica.
etid10

molecola
intercalata

do esposto alla luce ultravioletta, e poiché la sua fluorescenza aumenta mol-


tissimo quando intercalato, I' etidio viene utilizzato come colorante per visua-
lizzare il DNA
Quando lo ione etidio si intercala fra due coppie di basi, causa al DNA uno
srotolamento della doppia elica di 26°, riducendo la normale rotazione delle
coppie di basi da circa 36° a circa 10°. In altre parole, l'etidio diminuisce il
twist del DNA Se immaginiamo il caso in cui una molecola di DNA ha in-
tercalato una molecola di etidio ogni coppia di basi, invece di avere una dop-
pia elica con IO paia di basi per giro d'elica ne avremo una con 36. Quando
l'ecidio si intercala ad una molecola di DNA lineare o ad un DNA circolare
non covalentemente chiuso, aumenta semplicemente la lunghezza del passo
dell'elica. Consideriamo invece cosa succede quando l'etidio si lega ad un
DNA circolare covalentemente chiuso; il linking number non cambia (non è
stato tagliato e risaldato alcun legame covalente), m a il twist diminuisce di
26° ogni molecola di etidio intercalata nel DNA Poiché Lk = Tw + WJ-, la
diminuzione del Tw dovrebbe essere compensata da un corrispondente au-
mento del Wr. Se il DNA circolare è inizialmente superavvolto negativamen-
te (come avviene normalmente per il D NA estratto dalle cellule), dopo l'ag-
giunta dell'etidio avremo un aumento del Wr: In altre parole, all'aggiunta
dell'intercalante avremo un DNA più rilassato. Se la quantità di etidio au-
menta, il numero di superavvolgimenti potrà raggiungere lo zero; aum entan-
do ancora la quantità di etidio Wr diventerà maggiore di zero ed il D NA con-
seguentemente diventerà superavvolto positivamente.
Poiché I' eti dio determina un aumento del Wr, la sua presenza cambierà in
modo significativo la migrazione del cccDNA durante l'elettroforesi su gel.
In presenza di quantità non saturanti di etidio, i D NA superavvolti negativa-
mente presenteranno un minor numero di superavvolgimenti e migreranno
più lentamente, mentre i DNA originariamente rilassati assumeranno supe-
ravvolgimenti positivi e migreranno più velocemente nel gel.

I La struttura dell'RNA
L'RNA contiene il ribosio e l'uracile ed è normalmente
a singolo filamento
Parleremo ora dell'RNA, che differisce dal DNA per tre differenti caratteri-
stiche (Figura 6 .29). Primo, l'impalcatura fo ndamentale contiene il ribosio
122 I Parte seconda • Manutenzione del genoma e sa-0a-11s90-0

Figura 6.29 estremità 5'


Caratteristiche strutturali dell'RNA. La o-
figu ra mostra la struttura dell'impalca-
1

q
tu ra dell' RNA, composta da zu ccheri e
O=P - O- CH 6 G

~-
fosfati alternati. Le caratteristiche che
distinguono l'RNA da l DNA sono se-
gnate in rosso.
O OH
I
O= P-

~-
O-

q
CH

O
O U

OH
I
O= P -O-CH O A

~- ~
O OH
I
o=P - O -

~- q
CH o

OH OH
e

estremità 3'

invece del 2'-deossiribosio. Il ribosio ha un gruppo ossidrilico in posizione 2'.


Secondo, !' RNA contiene l'uracile al posto della timina. I.: uracile ha lo stessa
struttura con un singolo anello aromatico come la timina ma manca del
a gruppo metilico in posizione 5. In effetti la timina è un 5 metil-uracile. Ter-
zo, !'RNA è normalmente una singola catena polinucleotidica. Eccetto il caso
di alcuni virus, !'RNA non rappresenta il materiale generico e non viene uti-
lizzaro come stampo per la sua propria replicazione come accade per il DNA.
Invece !'RNA funziona come intermediario, in forma di mRNA, fra il gene e
la sintesi delle proteine. Un'altra funzione dell'RNA è quella di raccordo, co-
me tRNA, fra i codoni presenti sull'mRNA e gli amminoacidi. I.:RNA può
anche giocare un ruolo strutturale come nel caso degli RNA che costituisco-
no il ribosoma. U n altro ruolo rivestito dall'RNA è quello di regolatore, e si
esplica con la presenza di RNA complementari alla sequenza di alcuni
mRNA interferendo con la loro traduzione. Infine, alcuni RNA (incluso un
RNA con funzione strutturale nel ribosoma) sono enzimi che catalizzano rea-
zioni fondamentali nella cellula. In tutti questi casi l'RNA è sinterizzato co-
me copia di un solo filamento del DNA e il suo complementare non esiste.
Comunque !' RNA è in grado di formare lunghe doppie eliche, ma normal-
mente queste strutture non sono molro frequenti in natura.

Le catene di RNA si ripiegano su se stesse per formare


e
brevi tratti a doppia elica simili al DNA di forma A
Nonosranre !'RNA sia un singolo filamento, spesso può presentare dei trarci a
doppia elica (Figura 6.30). Questo dipende dal farro che quesro polimero
molto spesso si ripiega su se stesso per formare coppie di basi fra sequenze
complementari. Se i due tratti di sequenze complementari si trovano vicine
Figura 6.30
l'una all'altra, l'RNA può assumere una delle varie strutture a stem-loop in
Le caratteristiche della doppia elica d ì cui la parte di polimero non complementare che i trova in mezzo ai due trat-
RNA. In una molecola d i RNA avente ti complementari sporge fuori dalla zona a doppia elica. for mando strutture a
tratti con sequenze complementari, le "forcina per capelli", a "gemma", ad "ansa semplice~ wop) .
sequenze inframmezzate (non comple-
mentari) formano le strutture illustrate
La stabilirà di queste strutture viene in alcuni casi aumentata dalle speciali
in figura. (a) Struttura a fo rcina per ca- proprietà del loop. Per esempio, la presenza di quamo loop formati dalla se-
pelli (b) gemma (c) ansa. quenza UUCG è inaspettatamente molto cabile e iò dipende dalle panico-
e as-oa-1 1a90-0 6. La struttura del DNA e del I' RNA I 123

Figura 6.31
Tetra-loop. t.:interazi one di impilamen-
to fra le b asi promuove e stabilizza la
struttura a t et ra-loop. I circo li g rigi fra
gli zuccheri, co lorati in vio la, rappre-
sentano i fosfat i dell'impalcat ura del-
l'RNA. Le linee orizzontali vog liono raf-
fi g urare le int erazioni di impilamento.

C(UUCG)G Tet ra-loop

lari interazioni di impilamento che si determinano fra queste basi (Figura


6.31). l:appaiamento di basi può anche avvenire fra sequenze che non sono
contigue formando così strutture molto complesse dette pseudo-nodi (Figu-
ra 6 .32). Le regioni delle molecole di RNA contenenti basi complementari
possono formare doppie eliche regolari o presentare discontinuità come basi
non complementari che sporgono fuori dalla doppia elica come delle gemme.
Un'ulteriore caratteristica dell'RNA è la sua propensione a formare strutture
a doppia elica utilizzando un appaiamento delle basi diverso da quello di
Wastson e Crick: per esempio, la coppia G:U tenuta assieme da legami idro-
geno fra N3 dell' uracile ed il gruppo tarbonilico sul C6 della guanina e fra il
gruppo carbonilico sul C2 dell' uracile ed Nl della guanina (Figura 6 .33).
Poiché la coppia G:U può formarsi con la facilità con cui si formano le cop-
pie canoniche di Watson e Crick, l'RNA possiede quindi una maggior capa-
cità di formare doppie eliche intramolecolari, anche se normalmente non
molto lunghe. ·
La presenza dell'ossidrile in 2' impedisce all'RNA di assumere nelle zone
complementari una struttura a doppia elica di tipo B, mentre invece viene fa-
vorita la forma A in cui il solco minore è più ampio e quindi più accessibile:
dobbiamo comunque ricordare che tale solco offre un minor numero di in-
formazioni sequenza-specifiche rispetto al solco maggiore. Viceversa, il solco
maggiore è così stretto e profondo che risulta di difficile accesso alle catene la-
terali delle proteine che interagiscono con il DNA. Quindi, la doppia elica
formata dall'RNA si distingue da quella del DNA per i dettagli atomici che
la caratterizzano rendendola meno disposta alle interazioni sequenza-specifi-
che con le proteine (anche se in alcuni casi ciò avviene) .

. o

, ,,
,,
, ,,
,,
___ ..
N O"""H-N~
/~ N-H"""0t--\
,, ,,
' ,,
, ,,
,, .
I
I
,
,,
I
I
I N nbos10
I
I
I
I
,, ribosio
I I NH2
t t t
S' 3'
Figura 6.33
Appaiamento fra le basi G e U. La
Figura 6.32 st ruttura m ostra i legami idrogeno che
Pseudo-nodi. Gli pseudo-nodi sono strutture formate da app aiamento d i b asi fra sequenze permettono l'appaiamento fra la gua-
complementari no n cont igue. nina e l'uracile.
124 I Parte seconda • Manutenzione del genoma e 88-0S.17890-0

Figura 6.34
La tripletta di basi U:A:U. La struttura
mostra un esempio dei legami idroge-
no che permettono la formazione non
convenzionale d i una tripletta d i basi.

trip letta di basi U:A:U

L'RNA può ripiegarsi per formare complesse


strutture terziarie

Non dovendo formare lunghe eliche regolari, l'RNA è libero di ripiegarsi nel-
le più diverse strutture terziarie. Ciò può avvenire poiché l'RNA ha la possi-
bilità di ruotare molto facilmente attorno ai legami fosfodiesterici dei tratti
che non formano doppia elica. In queste zone !'RNA può ripiegarsi e forma-
re strutture complesse specialmente in corrispondenza della presenza, nel po-
limero, di basi non convenzionali. Queste strutture comprendono la forma-
zione di legami fra tre basi contemporaneamente e interazioni fra basi e l'im-
palcatura del polimero (interazioni presenti nei tRNA; vedi la tripletta di ba-
si nella Figura 6.34). Alcune proteine possono contribuire alla formazione di
strutture terziarie dell'RNA come nelle grandi molecole di RNA che si trova-
no nei ribosomi. Queste proteine neutralizzano le cariche negative dei fosfati
che altrimenti destabilizzerebbero la conformazione del polinucleotide.
Gli scienziati hanno sfruttato la complessità strutturale dell'RNA per genera-
re artificialmente nuove molecole di RNA (che non si trovano in natura) con
particolari caratteristiche. Sintetizzando molecole di RNA a sequenza casuale,
è possibile generare miscele di oligonucleotidi che rappresentano una gran-
dissima diversità di sequenze. Per esempio, una miscela di oligonucleotidi
lunghi 20 nucleotidi formati ciascuno dalla combinazione di quattro nucleo-
tidi diversi dà o rigine ad una potenziale complessità di 4 20 (come dire 10 12)
sequenze. Da una miscela di diversi oligonucleotidi, possono essere selezio-
nate con metodi biochimici molecole di RNA con particolari caratteristiche,
come, per esempio, quelle con una specifica affinità per piccole molecole.

Alcuni RNA sono enzimi

Per molti anni è staro generalmente ritenuto che soltanto le proteine potesse-
.,. ro avere funzione enzimatica. Un enzima deve essere in grado di legare il sub-
strato, mediare una reazione c'lìimica, rilasciare il prodotto di reazione e ripe-
tere questa sequenza di eventi moire volte. Le proteine sono particolarmente
adatte per questo lavoro poiché sono composte di molti tipi differenti di am-
minoacidi (20) e possono ripiegarsi in strutture terziarie complesse che for-
mano rasche specifiche per accogliere il substrato e piccole molecole aventi
funzione di cofattori e siti arrivi per la catalisi. O ra sappiamo che alcuni RNA
possono assumere strutture terziare e posso no essere biologicamente attivi nel
mediare reazioni enzimatiche. Questi RNA so no conosciuri come ribozimi
e posseggono moire delle caratteristiche degli enzimi rappresentati da protei-
ne, come il sito attivo, il sito di legame per il substrato e quello per i cofattori
come, ad esempio, uno ione metallico.
Uno dei primi ribozimi ad essere scoperto è stara la RNAsi P una ribonu-
cleasi coinvolta nella formazione dei rRNA a parti re da precursori di RNA di
grandezza superiore rispetto alla molecola matura. La RNAsi P è composta
sia da RNA che proteine: in questo complesso nucleoproteico l'attività catali-
e 88-08-11s90-0 6. La struttura del DNA e dell'RNA I 125
1

tica risiede sull'RNA. La parte proteica dell'enzima ha il compito di facilitare


la reazione mascherando le cariche negative dell'RNA in modo tale che esso

J possa effettivamente legarsi al substrato che ovviamente ha anch'esso una ca-


rica globale negativa. La parte dell'enzima ra presentata dall' RNA è in grado
di catalizzare il taglio del tRNA precurso~nche
in assenza della parte pro-
teica, se nella reazione sono presenti ioni positivi come quelli forniti dalla
spermidina, che bloccano le cariche negative presenti sull'RNA. Altri ribozi- I a
mi possono catalizzare reazioni di trans-esterificazione coinvolte nella rimo-
zione di sequenze conosciute come introni da alcuni precursori di mRNA,
tRNA e di RNA ribosomiali mediante un processo conosciuto come splicing 1 b raccio [[}
dell'RNA (vedi il Capitolo 13). taglio

e~ ~ ~ ~:
A"'•U /
A A14 X,,
e,-~-
~-~ ~-:-.._)
13

Il ribozima hammerhead taglia l'RNA attraverso


braccio Il GaN7 G U4 braccio I
la formazione di un fosfato ciclico 2',3' A6 s

Prima di concludere la nostra discussione sull'RNA, guardiamo in maggior


dettaglio la struttura e la funzione di un particolare ribozima: l'hammerhead. b
I.:hammerhead è una ribonucleasi sequenza-specifica che è stata trovata nei
cosl detti viroidi, agenti che infettano le cellule vegetali costituiti da RNA e
che per la loro propagazione utilizzano un meccanismo di auto-idrolisi.
Quando il viroide si replica produce copie multiple del suo genoma sotto for-
ma di una lunga molecola di RNA indivisa. Ogni singolo viroide si forma
mediante un taglio specifico di questo precursore: tale reazione è catalizzata
dai tratti di RNA che si trovano immediatamente a ridosso del punto di ta-
glio. Ognuna di queste sequenze viene chiamata hammerhead dalla forma se-
condaria che assume e che consiste in tre strutture a braccio formate da tre
coppie di basi (braccio I, II e III) impiantate su una zona centrale di basi non
appaiate e che ha attività catalitica (Figura 6.35). La struttura terziaria del-
l'hammerhead assomiglia complessivamente a una forcella (Figura 6.36).
Per capire come l' hammerhead lavora, bisogna prima comprendere come
l'RNA viene idrolizzato in condizioni alcaline. A pH molto basico, l'ossidri- Figura 6.35
le in 2' del ribosio presente nell'impalcatura dell'RNA può essere deprotona- La stuttura secondaria del ribozima
hammerhead. La molecola è mostrata
con le due met à di ciascun braccio uni-
t e da una struttura circolare a singolo fi-
lamento anche se questa parte non è
necessaria: infatti nel viroide le due me-
tà del braccio lii non sono unite da alcu-
na struttura circolare. (a) La figura mo-
stra l'ipotetica struttura secondaria del
ribozima hammerhead. Le interazioni
fra le coppie di basi secondo Watson e
Crick sono colorate in rosso; il legame
idrolizzabile è indicato da una freccia
rossa; i fi lamenti che rappresentano il
substrato sono colorati d i blu; (U) uraci-
le; (A) adenina; (C) citosina; (G) guanina.
(b) La reazione mediata dal ribozima
hammerhead comprende un passaggio
intermedio durante il quale l'Mg(OH)
complessato con il ribozima (mostrato
in verde) agisce come una base in gra-
do di catalizzare la rimozione di un pro-
tone dall'ossidri le 2' del sito attivo della
citosina (mostrata in posizione 17 nella
parte (a) della figura), ed inizia la reazio-
ne d i taglio sul legame fosfodiestere
Figura 6.36 del sito attivo. [Fonte: (a) Ridisegnato
La struttura terziaria del ribozima hammerhead. La struttura del ribozima hammerhead da McKaym D. B., e Wedekind J. E.
mostra le basi conservate del braccio lii così come le tre coppie di b asi che uniscono il 1999. In The RNA World, 2• edizione
braccio Il (in alto a sinistra) alla zona a singolo filamento del braccio lii (in basso) colorato in (ed. R. F. G esteland et a/.) p. 267, fig. 1,
azzurro; il giro CUGA uridina è mostrato in rosso ed il sito attivo della citosina (posizione 17 parte A. Cold Spring Harbor, NY. (b) Ri-
del sito di idrolisi) in verde. (Scott W.G., Finch J.T., e Klug A. 1995. Ce// 81: 991. Immagine disegnato da Scott W. G. et al. 1995.
p reparata con MolScript, BobScript, e Raster 30.) Ce// 81 : 99, p. 992, fig. 1, parte B.)
126 I Parte seconda • Manutenzione del genoma e sa-0a-11a90-0

to e la risultante carica positiva che si viene a trovare sull'ossigeno può attac-


care il fosfato che si trova in posizione 3' dello stesso ribosio e che forma il le-
game fosfodiesterico. Questa reazione rompe la catena dell'RNA producen-
do un fosfato ciclico 2', 3' ed un ossidrile libero 5'. Ciascun ribosio presente
in una catena di RNA può andare incontro a questa reazione demolendo
quindi a singoli nucleotidi l'intero polimero di RNA. (Per quale ragione le
molecole di DNA non sono suscettibili di idrolisi alcalina?) Moire ribonu-
cleasi proteiche possono tagliare !'RNA attraverso la formazione di un fosfato
ciclico 2', 3'. Lavorando ad un pH fisiologico, questi enzimi utilizzano uno
ione metallico, legato al loro sito attivo, per attivare l'ossidrile 2' dell'RNA.
1.:hammerhead è una ribonucleasi sequenza-specifica che taglia la molecola di
RNA attraverso la formazione di un fosfato ciclico 2', 3'. Il taglio mediato da
hammerhead coinvolge un Mg++ legato al ribozima che deprocona l'ossidri-
le 2' ad un pH neutro con il risultato di un attacco nucleofìlico al fosfato del
legame fosfodiesterico (Figura 6.35b).
Poiché la reazione canonica dell'hammerhead è quella dell'auto-idrolisi, que-
sta non può essere configurata come una reale catalisi; ciascuna molecola nor-
malmente promuove un unico ciclo reattivo con un turnover pari ad uno.
Ma l'hammerhead può essere immaginato come un vero ribozima, infatti la
molecola può essere divisa in due porzioni - una, il ribozima, che contiene il
core catalitico e l'altra il substrato che contiene il sito di taglio. Il substrato si
lega ai bracci I e III (Figura 6.35 a). Dopo il taglio, il substrato viene rilascia-
to e rimpiazzato da un nuovo substrato non ancora processato e si ripete così
un nuovo ciclo.

Gli RNA hanno avuto una parte importante


nell'evoluzione biologica?
La scoperta dei ribozimi ha profondamente modificato la visione dell'evolu-
zione biologica. Possiamo immaginare che esisteva una forma primitiva di vita
basata interam.ente sull'RNA. In questo mondo, !'RNA avrebbe funzionato
come materiale genecico e come complesso enzimatico. Questo RNA avrebbe
preceduto, in termini evolutivi, la vira come noi ora la immaginiamo in cui il
trasferimento dell'informazione è basato su DNA, RNA e proteine. Un indi-
zio sul fatto che le proteine potessero derivare da un mondo a RNA è stato da-
to dalla scoperta che il componente del ribosoma responsabile della formazio-
ne del legame peptidico, la pepcidil transferasi, è una molecola di RNA (vedi il
Capitolo 14). A differenza della RNAsi P, dell'hammerhead e di altri ribozimi
che agiscono sul fosfato, le peptidi! transferasi hanno come punto di riferi-
mento il carbonio per formare il legame peptidico. Questo lega la chimica del-
l'RNA alla più importante reazione nel mondo delle proteine, la formazione
del legame peptidico. 1.:ipotesi è che i ribozimi possano essere un relitto di una
primiciva forma di vita in cui rutti gli enzimi erano formati da RNA.
l
' 7890-0 6. La struttura del DNA e dell'RNA I 127

li D A è normalmenre rappresenrato da una struttura a giustare le variazioni dei giri di un filamento attorno all'al-
doppia elica con un andamenro destrogiro. Le eliche sono tro filamento. Il DNA è topologicamenre coscretto quando
o rmate da due carene polinucleocidiche. Ciascuna carena è è sottoforma di un circolo covalentemente chiuso o quan-
un polimero in cui si alcernano uno zucchero deossiribosio do è strutturato in cromatina. Il linking number è una pro-
con un gruppo fosfaco, unici l'uno con l'alcro mediance un prietà topologica invariante dei DNA circolari e rappresen-
legame fosfodiestere. Le quattro basi, due purine, adenina ta il numero di volce che un filamento deve passare attra-
e guanina e due pirimidine, timina e cicosina, sporgono verso l'alcro filamento prima che i due singoli fi_lamenti
dallo zucchero. Mencre l' impalcatura decerminata dagli possano separarsi l'uno dall'altro. Il linking number è la
zuccheri fosfati è una struttura regolare, l'o rdine delle basi somma di due propriecà geomecriche interconvertibili: il
è casuale e ciò è responsabile delle informazioni conrenuce rwisc, che rappresenta il numero di volte che un filamento
nel DNA. Ciascuna catena ha una polarità che va dal 5' al gira attorno all'alao filamento ed il writhe che è il numero
3' e le due catene della doppia elica sono orienrate in modo di volce che l'asse lo ngitudinale della molecola incrocia se
anriparallelo, come dire che esse corrono in direzione op- scesso nello spazio. Si dice che il DNA è rilassato, in condi-
posta. zioni fisiologiche, quando per ogni giro d'elica ci sono circa
Cappaiamenro delle basi, che permette di tenere i due fila- I 0,5 paia di basi e quando la molecola è libera di ruotare
menti assieme, è mediaco da legami idrogeno ed è specifi- attorno al suo asse longitudinale. Se il linking number vie-
co: l'adenina di una catena è sempre appaiata con una cimi- ne abbassato, il DNA è torsionalmente srressato e si dice
na presente sull'altra catena, mentre la guanina è sempre che è superavvolto negativamenre. Nelle cellule, il DNA è
appaiata con la cicosina. Quesco appaiamenro specifico de- generalmente superavvolto negacivamente per un valore di
termina una disposizione di legami idrogeno fra le basi pu- circa il 6%.
riniche e pirimidiniche che è specifica del DNA. L'adenina Il DNA, negli eucarioti, avvolto attorno al nucleosoma con
e la cicosina quasi sempre esiscono nella forma caucomerica andamento levogiro assume superavvolgimenti negativi .
amminica piutcosco che in forma imminica, menrre la gua- Nei procarioti, dove mancano gli istoni, l'enzima DNA gi-
nina e la cim ina esiscono quasi sempre nella forma checoni- rasi è responsabile della presenza di supereliche negative. La
ca piuttosco che in quella enolica. La complementarietà fra DNA girasi appartiene alla famiglia delle topoisomerasi Il.
le basi dei due filamenti determina il carattere auro-codifi- Questi enzimi cambiano il numero di linking di due in due
cante del DNA. formando delle interruzioni transienti sulla doppia elica e
I due filamenti della doppia elica possono dividersi (dena- passando la doppia elica attraverso questa interruzione. Al-
turazione) se esposti ad alca temperatura, pH molco elevaco cune topoisomerasi II rilassano il DNA superavvolco, men-
o a qualsiasi agente che causi rottura dei legami idrogeno. tre la girasi genera superavvolgimento. Anche le topoiso-
Un ricorno alle condizioni fisiologiche permette una speci- merasi I rilassano il DNA, ma lo fanno eliminando un su-
fica riassociazione della doppia elica ed il ripristino delle ca- peravvolgimento per volta facendo passare il filamento in-
pacità biologiche della molecola (rinaturazione o riavvolgi- tegro attraverso un'interruzione (nick) fatta dall'enzima sul-
mento). l'altro fìlamenro.
11 DNA in soluzione ha una periodicità di circa 10,5 paia di I.:RNA differisce dal DNA per le seguenti caratteristiche: la
basi per giro d'elica. L'impilamento delle coppie di basi l'una sua impalcacura conciene il ribosio invece del 2'-deossiribo-
sull'altra determina un'elica con due solchi. Poiché gli zuc- sio; conàene la pirimidina uracile al posto della timina; ed
cheri protrudono ali'esterno rispetco alle basi con un angolo esiste normalmenre come singola catena polinucleocidica,
di circa 120°, i solchi hanno grandezza ineguale. I bordi di cioè senza la sua catena complementare. Come conseguen-
ciascuna coppia di basi sono esposti nei solchi formando una za del fatto che è a singolo filamento, !'RNA può ripiegarsi
serie di donacori o accetcori di legami idrogeno e di intera- su se stesso per formare dei corà tratti di doppia elica fra se-
zioni di van der Waals che identificano le coppie. Il solco più quenze complementari. CRNA permette, rispetto al DNA,
ampio - o maggiore - è più ricco di informazioni chimiche una più vasca possibilicà nel formare le coppie di basi, infat-
rispetco a quello più strerco- o minore- ed è più importante ti olcre alle coppie A:U e G:C, con alcrenanca facilità U può
per la sua capacità di permettere il riconoscimento di specifi- appaiarsi con G. Questa capacità di formare coppie di basi
che sequenze di basi da parte di proteine che legano il DNA. diverse da q uelle di Watson e C rick fa aum entare la possi-
Quasi cucci i DNA cellulari sono formati da molecole mol- bilicà dell'RNA d i formare tratti a doppia elica. Poiché
co lunghe, uniche per ogni cromosoma. Le cellule eucario- !'RNA non è costretto a formare la doppia elica utilizzando
ciche, nella maggior parre dei casi, scrutcurano quesce lun- un polimero complementare, esso è in grado di ripiegarsi
ghe molecole avvolgendole attorno a particelle proteiche dando origine a strutture terziarie anche molco complesse,
conosciuce come nucleosomi. La maggior parre delle mole- che sono anche decerminace da interazioni fra le basi e l'im-
cole di DNA sono lineari, mentre alcune sono circolari co- palcatura degli zuccheri-fosfati.
me avviene spesso nelle cellule procariotiche o per alcun i Alcuni RNA funzionano come enzimi che catalizzano rea-
genomi presemi in certi virus. zioni chimiche sia in vivo che in vitro. Questi enzimi for-
Il DNA è una molecola Aessibile: a meno che non sia copo- maci da molecole di RNA sono conosci uri come ribozimi.
logicamence costretta, essa può liberamence ruotare per ag- La maggior parte dei ribozimi agisce su un gruppo fosfori-
128 IParte seconda • Manutenzione del genoma e aa-0a-1 1s90.o

co, come nel caso della ribonucleasi RNAsi P, ed è compo- Questo ribozima, che è responsabile della formazione del
sta da proteine ed RNA (è quest'ultimo che contiene il sito legame peptidico è rappresentato da uno degli RNA com-
cacalicico). I..:hammerhead è un ribozima auco-cacalicico, po nenti del ribosoma. La scoperca dei ribozi mi che posso-
che caglia l'impalcatura dell'RNA accraverso la formazione no agire su un gruppo fosforico o su un carbonio suggeri-
di un 2', 3' fosfato ciclico in una reazione che coinvolge sce che la vita biologica potrebbe essersi evoluta da una for-
uno ione Mg++ legato all' RNA. Un altro esempio d i ribo- ma primitiva in cui l'RNA funzionava come materiale ge-
zima è la pepcidil cransferasi che agisce su un carbonio. nerico e come apparato enzimatico.

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Cromosomi,
croma.tina
e nucleosoma

JJ
el Capitolo 6, abbiamo considerato la struttura del DNA studiandone, • La sequenza
fuori dal contesto cellulare, le caratteristiche chimico-strutturali. Al- del cromosoma
l'interno della cellula, il DNA è associato con proteine in un complesso e la diversità
chiamato cromosoma. Questa organizzazione generale si ha sia nelle cellule
• Duplicazione
procariotiche che eucariotiche ed anche nei virus. Il compattamento del
del cromosoma
DNA nei cromosomi è essenziale per alcune importanti funzioni. Il cromo-
e segregazione
soma è un sistema di condensazione per il DNA che deve essere contenuto
nella cellula e che permette di proteggere il DNA stesso da possibili danni. • Il nucleosoma
Molecole di DNA completamente nude sono, nella cellula, relativamente in-
• Strutture di o rdine
stabili. Al contrario, il DNA organizzato nel cromosoma è molto stabile e ciò
superiore
permette all'informazione contenuta nella molecola di essere correttamente
della cromatina
espressa; inoltre soltanto il DNA compattato nel cromosoma può essere tra-
smesso efficientemente a entrambe le cellule figlie ad ogni evento di divisione • Regolazione
cellulare. Per ultimo, il cromosoma conferisce, a ciascuna molecola di DNA, della struttura
un'organizzazione strutturale di ordine superiore. Questa organizzazione fa- della cromatina
cilita l'espressione genica, così come la ricombinazione fra cromosomi paren-
• Assemblaggio
tali, reazione che genera la diversità osservata fra i diversi individui di una po- dei nucleosomi
polazione.
Un cromosoma eucariotico è costituito per metà da proteine. Nelle cellule
eucariotiche, l'associazione del DNA con alcune di queste proteine forma
una struttura chiamata cromatina. La maggior parte di queste proteine, gli
istoni, sono di piccole dimensioni ed hanno caratteristiche basiche. Sebbene
non così abbondanti come gli istoni, esistono altre proteine associate al cro-
mosoma: le proteine non istoniche. Molte di queste proteine legano il DNA
e regolano le reazioni di trascrizione, replicazione, riparazione e ricombina-
zione del DNA. Ciascuna di queste reazioni verrà discussa in c;lettaglio nei
prossimi cinque capitoli.
Le proteine della cromatina svolgono -l'importante funzione di condensazio-
ne del DNA. Il seguente calcolo sottolinea l'importanza di quanto detto: una
cellula umana aploide contiene circa 3 X 109 bp; lo spazio occupato da cia-
scuna coppia di basi è di 3,4 A, quindi mettendo i vari cromosomi l'uno die-
tro l'altro, la lunghezza del DNA dovrebbe essere approssimativamente di cir-
ca 10 10 A, pari ad 1 metro. In una cellula diploide, come lo sono general-
mente le cellule umane, questa lunghezza dovrebbe arrivare a circa 2 metri.
Poiché il diametro di un nucleo di una cellula umana è soltanto di 10-15 µm
risulta ovvio il fatto che il DNA debba essere compattato di molti ordini di
grandezza per riuscire a stare in uno spazio così piccolo. Come può essere
soddisfatta questa esigenza?
La gran parte del compattamento del DNA nelle cellule umane (e in tutte le
altre cellule eucariotiche) è il risultato di una regolare associazione del poli-
mero con gli istoni a formare una struttura che viene chiamata nucleosoma.
La formazione dei nucleosomi è il primo stadio di un processo che permette
al DNA di essere ripiegato in una struttura più compatta che ne riduce la
lunghezza lineare di circa 10 000 volte. Il compattamento del DNA non av-
viene però senza costi: l'associazione del DNA con gli istoni ed altre proteine
che permettono di aumentare la condensazione della molecola riduce la pos-
sibilità di accedere al DNA. Questa ridotta accessibilità può interferire con le
130 / Parte seconda • Manutenzione del genoma e aa-0a-17s90-0

proteine che mediano le reazioni di replicazione, riparazione, ricombinazione


e, più significativamente, quella di trascrizione del DNA. Infatti, il compat-
tamento del DNA eucariotico determina una globale riduzione del suo me-
tabolismo e porta all'impossibilità, per alcuni enzimi, come la DNA polime-
rasi o la RNA polimerasi, di accedere ad esso.
La necessità, apparentemente conflittuale, di compattare e di accedere al DNA
ha attirato l'attenzione degli scienziati sugli eventi che portano al complesso
fenomeno della regolazione della struttura cromatinica. :t: chiaro che cambia-
menti strutturali dei singoli nucleosomi, mediati da enzimi che li modificano
e rimodellano, permettono a specifiche regioni del DNA cromosomico di in-
teragire con altre proteine. Questi processi, che generalmente riguardano bre-
vi tratti del cromosoma, sono però dinamici e permerrono agli enzimi e alle
proteine regolatrici l'accesso a differenti regioni del cromosoma Ìn tempi di-
versi. La comprensione della struttura del nucleosoma e della dinamica della
sua formazione è quindi necessaria per chiarire la regolazione della maggior
parre degli eventi che coinvolgono il DNA delle cellule eucariotiche.
Anche se le cellule procariotiche possiedono di norma un genoma più picco-
lo rispetto a quello degli eucarioti, la necessità di compattare il loro DNA è
sostanzialmente la stessa, per esempio E. coli deve ridurre necessariamente
l'ingombro del suo cromosoma, approssimativamente lungo 1 mm, per esse-
re contenuto in una cellula che è lunga soltanto 1 µm . Come il cromosoma
procariotico venga condensato è ancora poco chiaro: i batteri non contengo-
no istoni o nucleosom i, ma piccole proteine basiche che possono avere una
funzione similare. In questo capitolo affronteremo la più nota struttura del
cromosoma e quella della cromatina delle cellule eucariotiche.
Per prima cosa verranno considerate le differenti sequenze del DNA conte-
nuro nei diversi organismi, soffermandoci in particolare sulle variazioni del
genoma codificante per le proteine. Discuteremo in seguito i meccanismi che
assicurano un'accurata trasmissione dei cromosomi nelle cellule in divisione.
Infine porremo l'attenzione su struttura e regolazione della cromatina euca-
riotica e sul suo elemento strutturale fondamentale: il nucleosoma.

I La sequenza del cromosoma e la diversità


Prima di discutere in dettaglio la struttura del cromosoma, è importante co-
noscere le caratteristiche della molecola del DNA in quanto fondamento di
quella struttura. Il recente sequenziamento del genoma di numerosi organi-
smi h a procurato una ricchezza di informazioni concernenti la composizione
del DNA cromosomico e come le sue caratteristiche siano cambiate co n l'au-
mentare della complessità degli organismi.

Il cromosoma può essere circolare o lineare

Tradizionalmente è risaputo che le cellule procariotiche posseggono un uni-


co cromosoma circolare mentre quelle eucariotiche contengono più cromo-
somi lineari (Tabella 7. 1). Poiché recentemente sono stati studiati un nume-
ro sempre crescente di organismi procariotici, questa affermazione non ri-
sulra più cosl vera. Infatti sebbene i procarioti più studiati (come E. coli e B..
subtilis) abbiano in verità un unico cromosoma circolare, esistono ora nu-
merosi esempi di cellule procariotiche che posseggono più cromosomi linea-
ri o anche entrambi i ripi. Al contrario, turre le cellule eucariotiche hanno
cromosomi multipli e lineari. A seconda degli organ ismi, il numero dei cro-
mosomi può variare da 2 a meno di 50, ma in alcuni rari casi il numero può
arrivare a migliaia (per esempio nel macronucleo del protozoo Tetrahymena,
Tabella 7 .1).
o 88-08-17890-0 7. Cromosomi, cromat ina e nucleosoma I 131

'Tabella 7.1 Variazioni delle caratteristiche dei cromosomi in differenti organismi ;---------~
Numero Numero di copie Forma Grandezza
Specie di cromosomi di cromosomi del cromosoma del genoma (Mb)

PROCARIOTI
Mycoplasma genitalium circolare 0,58
Escherichia coli K-12 circolare 4,6
Agrobacterium 4 3 circolari 5,67
tumefaciens 1 lineare
Sinorhizobium meliloti 3 circolare 6,7

EUCARIOTI
Saccharomyces cerevisiae (lievito che
si riproduce per gemmazione) 16 1 o2 lineare 12,1
Schizosaccharomyces 3 1o2 lineare 12,5
pombe (lievito che si riproduce
per fissione)
C. elegans (vermi tondi) 6 2 lineare 97
Arabidopsis thaliana (vegetali) 5 2 lineare 125
Drosophila melanogaster 4 2 lineare 180
(moscerino del la frutta)
Tetrahymena thermophilus micronucleo 5 micronucleo 2 lineare 220
(protozoo) macronucleo 225 macronucleo 10 -1O 000 (macronucleo)
Fugu rubripes (pesce) 22 2 lineare 365
Mus musculus (topo) 19 + Xe Y 2 lineare 2500
Homo sapiens 22 + Xe Y 2 lineare 2900

I cromosomi circolari e lineari pongono entrambi specifici problemi che de-


vono essere superati affinché il genoma possa essere conservato e replicato. I
cromosomi circolari richiedono attività topoisomerasiche.in modo tale che le
due molecole neosintetizzate possano essere separate dopo la loro replicazio-
ne; infatti, senza questi enzimi, le due molecole rimarrebbero legate o incate-
nate. Nei cromosomi lineari eucariotici, invece, le terminazioni del DNA de-
vono essere protette da quegli enzimi che normalmente degradano il DNA a
partire dalle estremità e presentano differenti gradi di difficoltà durante la re-
plicazione come vedremo nel Capitolo 8.

Ogni cellula mantiene un numero definito


di cromosomi
Le cellule procariotiche posseggono un'unica copia completa del/dei cromoso-
ma/i che è organizzato in una struttura chiamata nucleoide (Figura 7. lb).
Quando le cellule procariotiche sono in rapida divisione, però, alcune porzioni
del cromosoma che stanno attivamente replicandosi possono essere presenti in
due e qualche volta anche in quattro copie. I procarioti frequentemente posso-
no possedere anche uno o più DNA circolari di piccole dimensioni indipen-
denti chiamati plasmidi. A differenza del DNA cromosomico, i plasmidi non
sono normalmente essenziali per la crescita batterica. Normalmente essi porta-
no geni che conferiscono determinate caratteristiche al batterio, come ad esem-
pio la resistenza ad un antibiotico. I plasmidi si differenziano dal cromosoma
anche perché possono essere presenti in copie multiple per ciascuna cellula.
:...a maggior parte delle cellule eucariotiche è diploide, il che vuol dire che con-
:.=;igono due copie di ciascun cromosoma (Figura 7. l c): i cromosomi omolo-
ghi Ogni copia deriva da ciascun genitore. Ma non tutte le cellule negli orga-
::..smi eucariotici sono diploidi. Una certa quantità di cellule possono essere
.!?!oidio poliploidi. Le cellule aploidi contengono un'unica copia per ciascun
132 I Parte seconda • Manutenzione del genoma Q 88·08-1 7890-0

Fig ura 7 .1 b
Confronto fra una tipica cellula proca- batteria
riotica e una eucariotica. aploide
(a) Il d iametro di una tipica cellula eu-
cariotica è di circa 10 µm. Una tipica
cellula procariotica è lunga circa 1 µ m.
(b) Il DNA cromosomico procariotico è
localizzato nel nucleoide ed occupa
una porzione sostanziale della cellula . flagello
A differenza del nucleo presente nella
cellula eucariotica, il nucleoide non è cromosoma
sep arato mediante membrane dal a
resto della cell ula. In rosso è rappre-
cellula
sentato un DNA plasmidico. (c) I cro- procariotica
mosomi eucariotici sono localizzati nel cellula diploide
nucleo il cui involucro è formato da ........
u apparato
m embrane. Cellule aploidi (1 copia)~ 1µm di Golgi
diploidi (2 copie) si distinguono per nu-
m ero d i copie di ciascun crom osoma cellula
presenti nel nucleo. (Fonte: adattata da eucariotica

©
Brown T.A. 2002. Genomes, 2• edizio-
ne, p. 32, fig. 2.1. © 2002 BIOS Scienti-
fic Publishers. Usata con autorizzazio-
ne.)
L_____J

10 µm

cellula aploide

cromosoma e sono coinvolte nella riproduzione sessuale (per esempio gli sper-
macozoi e le uova sono cellule aploidi). Le cellule poliploidi contengono, inve-
ce, più di due copie di ogni cromosoma. Alcuni organismi mantengono la
maggior parte delle loro cellule in uno staro poliploide per tutta la vita. In casi
estremi possono esistere centinaia o anche migliaia di copie di cromosomi.
Questa sorta di amplificazione dell'incero genoma permette la sintesi di una più
grande quantità di RNA e quindi di proteine. Per esempio, i megacariociti sono
cellule poliploidi specializzate (circa 128 copie di ciascun cromosoma), che
producono migliaia di piastrine che, pur mancando di cromosomi, sono un
componente essenziale del sangue umano (vi sono circa 200 000 piastrine per
millilitro di sangue). Essendo poliploidi, i megacariociti possono mantenere un
livello metabolico molto alco e quindi produrre un elevato numero di piastri-
ne. La segregazione di un così elevato numero di cromosomi può creare molti
problemi, per cui la divisione di cellule poliploidi molco spesso risulta essere
bloccata. Indipendentemente dal numero, i cromosomi eucariotici sono sem-
pre contenuti in un organello delimitaco da membrane: il nucleo (Figura 7. lc).

La grandezza del genoma è correlata


alla complessità dell'organismo
La grandezza del genoma (la lunghezza del O A in un assecco cromosomico
aploide) varia sostanzialmente nei differenti o rgan ismi (Tabella 7.2). Poiché
e as.oe.11s90-0 7. Cromosomi, cromatina e nucleosoma I 133

sono necessari un numero molro elevaro di geni per dirigere la formazione di


organismi sempre più complessi (almeno quando compariamo batteri, euca-
rioti monocellulari ed eucarioti pluricellulari, vedi il Capitolo 19), non è so r-
prendente che la grandezza del genoma sia strettamente correlato con la com-
plessità del!' organismo. Quindi le cellule procariotiche hanno un genoma più
piccolo di 1O megabasi (Mb) . Il genoma di un eucariote monocellulare è
approssimativamente di 50 Mb, m entre i prorozoi più complessi possono
avere genomi più grandi di 200 Mb. Organismi multicellulari possono ave-
re genomi ancora più grandi e possono raggiungere dimensioni superiori
alle 100 000 Mb.
Sebbene vi sia una certa correlazione fra la grandezza del genoma e la com-
plessità dell'organismo ciò non è sempre vero. Molti organismi aventi una
complessità apparentemente simile hanno una grandezza del genoma molro
diversa: un moscerino della frutta ha un genoma approssimativamente 25
volte più piccolo di quello di una locusta e il genoma del riso è circa 40 volte
più piccolo di quello del grano (Tabella 7. 2). In questi esempi, sembra che sia
il numero dei geni, piurrosro che la grandezza del genoma, più direttamente
correlaro alla complessità dell'organismo. Ciò appare chiaro quando esami-
niamo la densità genica dei differenti genomi.

Comparazione della densità genica in genomi


T.abella 7.2 di differenti organismi

Grandezza Numero Densità


del genoma approssimativo genica
Specie (Mb) di geni (geni/Mb)
PROCARIOTI (battteri)
Mycoplasma genitalium 0,58 500 860
Streptococcus pneumonia 2,2 2300 1060
Escherichia coli K-12 4,6 4400 950
Agrobacterium tumefacie ns 5,7 5400 960
Sinorhizobium meliloti 6,7 6200 930
EUCARIOTI
Funghi
Saccharomyces cerevisiae 12 5800 480
Schizosaccharomyces pombe 12 4900 410
Protozoi
Tetrahymena thermophila 220 > 20000 > 90
Invertebrati
Caenorhabditis elegans 97 19000 200
Drosophila melanogaster 180 13700 80
Strongylocentrotus purpuratus 845 -22000 -26
l ocusta migratoria 5000 nd nd
Vertebrati
Fugu rubripes 365 > 31000 > 85
Homo sapiens 2900 27000 9,3
Mus musculus 2500 29000 12
Piante
Arabidopsis thaliana 125 25500 200
Oryza sativa (riso) 430 > 45000 > 100
Zea mays 2200 > 45000 > 20
Fritillaria assyriaca 1 (tulipano) 120000 nd nd
nd = non determinato
134 I Parte seconda • Manutenzione del genoma o 88-08-1 7890-0

. geni • introni sequenze ripetute • gene della RNA polimerasi O sequenza intergenica
Escherichia coli (57 geni)
l! I
Saccharomyces cerevisiae (31 geni)
I ! l ) 1m1 i ~ I
Drosophila melanogaster (9 geni)
L = lii l 111 ,i li Jj_ I 1111 fl j Il r: J I j

Uomo (2 geni)
I lo ~ Q !l!U.l[JCl.,.l!J!lt j@• I !;JU;fi
o 10000 20000 30000 40000 50000 60000

Figura 7.2 Il genoma di E. coli è formato quasi interamente da geni


Comparazione della densità genica in e
cromosomi di differenti organismi. La
La maggior parte del cromosoma del batterio E coli codifica per proteine o per
fig ura illustra una regione rappresenta-
tiva di 65 kb di DNA per ciascun orga- RNA strutturali (Figura 7.2). La maggior parte delle sequenze non codificanti è I
nismo. La regione che codifica per la adibita alla regolazione trascrizionale dei geni (come vedremo nel Capitolo 16). e
subunità maggiore della RNA polime- Poiché viene normalmente usato un sito specifico da cui parte l'evento trascri- 1
rasi (RNA Poi li per le cellule eucarioti-
che) è indicata in rosso. Da notare
zionale ed il controllo dell'espressione di alcuni geni, anche queste regioni sono
come il numero dei geni codificati al- ridotte al minimo nel genoma. In E coli è presente un elemento importante del \
l'interno di un tratto di DNA della stes- genoma che non fa parte dei geni: l'origine di replicazione del DNA. Questa
sa lunghezza diminuisce con l'aumen- piccola regione del cromosoma è utilizzata per dirigere l'assemblaggio della
tare della complessità dell'organismo.
macchina replicativa (come verrà discusso nel Capitolo 8). Nonostante questo
importante ruolo, questa regione è molto piccola occupando solo poche centi-
naia di basi delle 4,6 Mb del genoma di E coli.

Gli organismi più complessi hanno una minore


densità genica
Qual è la spiegazione della differenza, che a volte può essere anche molto gran-
de, nelle dimensioni del genoma di organismi che hanno una complessità ap-
parentemente simile (come il moscerino e la locusta)? Le differenze sono cor-
relate con la densità genica. Una semplice misura della densità genica è la
quantità di geni contenuti in una megabase di DNA genomico. Per cui, se un
organismo contiene 5000 geni ed un genoma di 50 Mb, la densità genica pre-
sente in questo organismo è di 100 geni/Mb. Quando viene comparata la den-
sità genica di differenti organismi è evidente che essi posseggono un potenzia-
le codificante differenziato. Esiste una correlazione inversa fra la complessità
dell'organismo e la densità genica; gli organismi meno complessi hanno una·
più alta densità genica. Per esempio, le densità geniche più alte si riscontrano
nei virus che utilizzano addirittura entrambi i filamenti del DNA per codifica-
re geni che in alcuni casi possono essere sovrapposti. Sebbene nei batteri i geni
sovrapposti siano rari, la loro densità genica può avvicinarsi ai 1000 geni/Mb.
La densità genica negli eucarioti è considerevolmente più bassa e più variabile
rispetto ai procarioti (vedi la Tabella 7.2). Fra gli eucarioti, c'è una tendenza ge-
nerale per cui la densità genica diminuisce con l'aumentare della complessità
dell'organismo. Il semplice eucariote unicellulare S. cerevisiae è caratterizzato da
una densità genica molto vicina a quella dei procarioti (circa 500 geni/Mb) . In
contrasto, è stato stimato che il genoma umano ha una densità genica 50 volte
più bassa. Nella Figura 7.2 è comparata la quantità di DNA dedicaéa alla codi-
fica di geni conservati nell'evoluzione (la subunità più grande presente nella
RNA polimerasi). Questo esempio permette di capire la grande differenza esi-
stente in termini di densità genica in organismi differenti. Organismi con un
genoma più grande di quello dell'uomo hanno una minore densità genica.
Qual è il fattore che induce questa riduzione della densità genica?
e sa-oo-11a90-o 7. Cromosomi, cromatina e nucleosoma I 135
Figura 7.3
introne 1 2
Schema della reazione di splicing del-
DNA l'RNA. La trascrizione d i un pre-m RNA
esone 1 2 3 è iniziata dal punto in cui è posta la

RNA
i2 3
freccia riportata sopra l'esone 1. Que-
sto trascritto primario viene quindi pro-
cessato (mediante splicing) per rimuo-
trascritto
prim ario
5'--==============--i:===============--3· vere gli introni non codificanti, p rodu-
cendo quindi l'mRNA maturo.

mRNA dopo lo spl icing


5·----·3·
I geni rappresentano soltanto una piccola porzione
del DNA cromosomico eucariotico
Esistono due fattori che contribuiscono alla diminuzione della densità geni-
ca osservata nelle cellule eucariotiche: l'aumento delle dimensioni dei geni e
l'aumento della quantità del DNA esistente fra i geni, ovvero le .s equenze in-
tergeniche. I geni sono più lunghi sostanzialmente per due ragioni. Primo,
visto il progressivo aumento della complessità degli organismi si verifica un
necessario e significativo aumento delle regioni di DNA utilizzate per diri-
gere e regolare la trascrizione, chiamate sequenze regolative. Secondo, i ge-
ni, negli eucarioti, frequentemente sono costituiti da regioni discontinue. Le
regioni non codificanti, intersperse all'interno delle sequenze codificanti,
chiamate introni, sono rimosse dall'RNA dopo la trascrizione con un pro-
cesso chiamato splicing dell'RNA (Figura 7.3); considereremo lo splicing in
dettaglio nel Capitolo 13. La presenza di introni può aumentare drastica-
mente la lunghezza di DNA richiesto per codificare un gene (Tabella 7 .3).
Per esempio, ~grandezza media di un g~mano è di circa 2 kb (ciò non
deve essere confuso con a densità genica) mentre la di_!llensione media di
_un~equenza codificante per una proteina è di circa 1,3 kb. Un semplice
calcolo rivela che soltanto il 5% del DNA di un _gene è ra resenrativo della
parre codificante la proteina, il rimanente 95% è fatto a introni. In accordo

Tabella 7.3 Contributo degli introni e delle sequenze ripetute nei differenti genomi lt-------~
Densità genica Numero medio Percentuale
Specie (geni/Mb) di introni per gene del DNA ripetuto

PROCARIOTI (batteri)
Escherichia coli K-12 950 o - <1
EUCARIOTI
Funghi
Saccharomyces cerevisiae 480 0,04 3,4
Invertebrati
Caenorhabditis elegans 200 5 6,3
Drosophila melanogaster 80 3 12
Vertebrati
Fugu rubripes 75 5 2.7
Homo sapiens 8,5 6 46
Piante
Arabidopsis thaliana 125 3 nd
Oryza sativa (riso) 470 nd 42
nd = non determinato
136 I Parte seconda • Manutenzione del genoma e 88-08-1789().()

Figura 7.4
L'organ izzazione e il contenuto del ge- uniche
noma umano. Il genoma umano è 510Mb
composto da molti tipi d i sequenze d if-
ferenti, la maggior parte delle quali altre regioni
non codificanti proteine. La figura mo-
stra la distribuzione e la quantità dei di-
intergeniche
600Mb
-
versi tipi di sequenza. (Fonte: adattata '
da Brown T.A. 2002. Genomes, 2• edi-
zione, p. 23, box 1.4. © 2002 BIOS
Scientific Publishers. Usat a con autoriz-
zazione. www.tandf.com.)
DNA intergenico
2000 Mb - microsatelliti
90Mb

sequenze
,_ altamente ripetute
1400 Mb

~
genoma
umano
3200 Mb int roni,
UTR

sequenze
,... correlate
11 52Mb
-- frammenti
genici

geni e sequenze
correlate ai geni I- pseudogeni
1200Mb

geni
48Mb

con la loro maggiore densità genica, gli eucarioti più semplici sono caratte-
rizzati da una bassa quantità di introni. Per esempio, nel lieviro S. cerevisiae
soltanto il 3,5% dei geni contiene introni e nessuno di questi è più grande
di l kb (Tabella 7 .3).
Il considerevole aumento della quantità delle sequenze intergeniche n egli or-
ganismi più complessi è responsabile della diminuzione della densità genica.
Il DNA intergenico è la porzione del genoma che non è associato con l'e-
spressione di proteine o di RNA strutturali. Più del 60% del genoma umano
è formato da sequenze intergeniche e la maggior parte di questo DNA non
ha funzioni cdnosciute (Figura 7.4). Vi sono due tipi di DNA intergenici: se-
quenze uniche e sequenze ripetute. C irca un quarto del DNA intergenico è a
sequ enza unica. Queste regioni comprendono molti relitti apparentemente

Figura 7.5
Gli pseudogeni provengono dall'inte-
grazione di prodotti retrotrascritti da DNA
O JDD TI ) / ,__ __ _ _
gene funzionale 1
~

mRNA. Quando nella cellula è presen-


te una trascrittasi inversa, molecole di
~ I

mRNA possono essere copiate in trascrizione/ splicing


dsDNA. Quest e molecole di DNA pos-
sono essere, anche se non molto fre- " ' - - - - - . RNA
quentemente, int egrate nel genoma
creando pseud ogeni . Poiché g li introni trascrizione
vengono rapidamente rimossi dag li inversa
RNA neotrascritti, q uest i pseudogeni
hanno la caratteristica comune di esse-
re privi d i introni. Questa caratteristica DNA
d istingue gli pseudogeni dalla copi a
del gene da cui provengono. In ag- reintegrazione
giunta gl i pseudogeni mancano del le
ap propriate sequenze promotrici ch e
permettono la loro trascrizione diretta,
poiché queste sequenze non fan no
parte dell'mRNA da cui derivano.
o) gene funzionale
/ --------~~~
) 11/,_
pseudogene
0 88-08-1 7890-0 7. Cromosomi, cromatina e nucleosoma I 137

non funzionali e includono geni mutati, frammenti di geni e pseudogeni. I


geni muraci e i frammenti possono essere il prodotto di mutazioni casuali o
di errori durame la ricombinazione del DNA. Gli pseudogeni sono il pro-
dotto dell'azione di un enzima che si chiama trascrittasi inversa (Figura 7.5 e
Capitolo 11). Questo enzima copia l'RNA formando un filamento di DNA
(il DNA copia o cDNA) ed è presence soltanto in cerci virus che lo utilizzano
per riprodursi. Come effetto collaterale dell'infezione da parte di questo vi-
rus, l'mRNA della cellula ospite può essere copiato in DNA e i risultami
frammenti di DNA reintegraci nel genoma con bassa efficienza. Queste copie
tuttavia non sono espresse in quanto mancanti delle appropriare sequenze re-
golative (sequenze che non fanno generalmente parte del gene strutturale, ve-
di il Capitolo 12).

La maggior parte delle sequenze intergeniche umane


è formata da DNA ripetuto
Quasi la metà del genoma umano è composto di sequenze di DNA che sono
ripetute molte volte. Ci sono generalmente due classi di DNA ripetuto:
DNA microsatellice e DNA altamente ripetuto. Il DNA microsatellite è for-
mato da sequenze molto corte (meno di 13 paia di basi) ripetute in tandem.
Il microsacellite più comune è un dinucleocide (per esempio CACACACA-
CACACACA). Queste ripetizioni originano dalla difficoltà dell'accuratezza
nel duplicare il DNA e rappresentano circa il 3% del genoma umano.
Le sequenze altamente ripetute sono molto più grandi rispetto ai microsacel-
lici. Ciascuna unità di ripetizione è maggiore di 100 paia di basi e in molti ca-
si anche più grande di 1 kb. Queste sequenze possono essere trovare sia come
singole copie disperse nel genoma o raggruppate in cluster. Comunque, esi-
stono numerose classi di queste ripetizioni; nei casi più comuni esse formano
eleme.n ti trasponibili.
Gli elementi trasponibili sono sequenze che possono spostarsi da una parte
all'altra del genoma. Nella trasposizione, come è chiamato questo evento, l'e-
lemento crasponibile può ritrovarsi in una nuova posizione del genoma pur
lasciando la copia originale nella posizione preesistente. Quindi, queste se-
quenze si moltiplicano e si accumulano nel genoma. Nelle cellule umane la
trasposizione è un evento relacivameme raro. Cionondimeno, nel lungo pe-
riodo di tempo, questi elementi sono stati così efficienti nell'autopropagazio-
ne da coprire approssimativamente il 45% del genoma. Nel Capitolo 11 con-
sidereremo il meccanismo mediante il quale gli elementi crasponibili si muo-
vono all' interno del genoma e come il loro movimento è controllato in modo
raie da prevenire danni al cromosoma.
Sebbene sia stata discussa la natura delle sequenze intergeniche nel contesto
del genoma umano, molti degli stessi problemi si trovano in altri organismi.
Per esempio, la comparazione delle sequenze conosciute presemi in alcune
piante con un genoma di grandi dimensioni (come il mais) indica che gli
elementi crasponibili possono coprire una parte ancora maggiore dell' incero
genoma. Analogamente, anche nei genomi compatti come quello di E. coli e
di S. cerevisiae, vi sono esempi di elementi trasponibili e microsarelliti (vedi
la Figura 7 .2). La differenza è che questi elementi hanno avuto meno suc-
esso nell'espandersi nel genoma di questi organismi più semplici. Questo
insuccesso dipende probabilmente dalla combinazione di una inefficiente
duplicazione e/o in una loro più efficiente eliminazione (sia mediante.even-
ti di riparazione o più drasticamente per eliminazione di quegli organismi in
cui la duplicazione è avvenuta). Sebbene si tenda a considerare il DNA ripe-
tuto come un DNA di scarto, il mantenim ento nel tempo di queste sequen-
ze per centinaia o migliaia di generazioni suggerisce che il DNA incergen ico
ha un si~nifìcato positivo (o conferisce un vantaggio selettivo) per l'organi-
mo ospite.
138 I Parte seconda • Manutenzione del genoma IO 88-08-17890-0

I Duplicazione del cromosoma


e segregazione
I cromosomi eucariotici per essere mantenuti durante la
divisione cellulare richiedono i centromeri,
i telomeri e le origini di replicazione

Esistono alcuni importanti elementi nei cromosomi eucariotici che non ap-
partengono alla categoria dei geni e che non sono coinvolti nella regolazione
·dell'espressione genica (Figura 7.6). Questi elementi includono le origini di
replicazione che permettono la duplicazione del DNA cromosomico, i cen-
tromeri che agiscono come "maniglie" per il movimento dei cromosomi ver-
so le cellule figlie e i telomeri che proteggono e permettono la replicazione dei
terminali dei cromosomi ·lineari. Tutte queste strutture sono essenziali per
una corretta duplicazione e segregazione dei cromosomi durante la divisione
cellulare. Studieremo ora ciascuno di questi elementi in maggiore dettaglio.
Le origini di replicazione sono i siti su cui il complesso proteico necessario
per la replicazione del DNA si assembla. Esse sono posizionate circa ogni 30-
40 kb lungo ciascun cromosoma eucariotico. Anche i cromosomi dei proca-
rioti richiedono un'origine di replicazione; ma a differenza degli eucarioti i
cromosomi procariotici contengono soltanto un singolo sito di inizio replica-
zione. In generale, le origini di replicazione sono posizionate nelle regioni
non codificanti. Le sequenze che sono riconosciute come origini di replica-
zione verranno discusse in dettaglio nel Capitolo 8.
I centromeri sono richiesti per una corretta segregazione dei cromosomi do-
po la replicazione. Le due copie di ciascun cromosoma replicato sono chia-
mate cromosomi figli e devono essere separate in modo tale da averne una co-
pia in ciascuna cellula figlia. Come l'origine di replicazione, i centromeri pro-
muovono la formazione di un elaborato complesso proteico che viene chia-
mato, in questo caso, cinetocore. Il cinetocore interagisce çon il complesso

telomero - - -

I
origi ne d i- - -
replicazione
\ I \ \ I \
-I I
membrana-
nucleare
I
centromero - -
- \
I \ I
fuscf
mitotico
J I
replicazione del DNA mitosi

Figura 7.6
I centromeri, le origini di replicazione e i telomeri sono indispen- mero che si t rova su ciascun cromosoma non è in una p osizione
sabili per il mantenimento dei cromosomi eucariotici. Ciascun definit a. Alcuni centromeri sono posizionat i nella parte med iana
cromosoma eucariotico cont iene due tel omeri, un centromero e del cromosoma mentre altri sono più vicini ai telomeri . Le orig ini di
più orig ini di rep licazione. I telomeri so no localizzati alle termina- replicazione sono localizzate su tutta la lunghezza del cromosoma
z oni del cromosom a. A differenza dei telomeri , il singolo centro- (approssimativamente, nel lievito S. cerevisiae, una ogni 30 kb).
e ss-0a-11a90-0 7. Cromosomi, cromatiria e nucleosoma I 139

a un centromero

un cromosoma per ciascuna cellula


b assenza di cent romeri

segregazione casuale dei cromosomi

e due centromeri

rottura dei cromosomi


(dovuta a p iù di un centromero)

Figura 7.7
L:assenza o la presenza di più di un centromero porta alla perdi- sualmente nelle cellule figlie. Ciò porta a frequenti eventi in cui
ta o alla rottura del cromosoma. (a) I cromosomi normali hanno una cellula porta due copie dello stesso cromosoma mentre l'al-
un solo centromero. Dopo la rep licazione del cromosoma ciascu- tra cellula ne è priva. (c) I cromosomi con due o più centromeri
na copia del centromero determina la fo rm azione del cinet ocore. vengono frequentemente rotti durante la segregazione; infatti se
Questi due cinetocori si legano ai poli opposti del fuso.mitotico un cromosoma contiene più di un centromero, può essere legato
e sono tirati verso i lati opposti d el la cellula prima che avvenga la simultaneamente ad entrambi i poli del fuso mitotico. Quando
divisione cellulare. (b) I cromosomi mancanti di centromero ven- inizia la segregazione, le forze create dal fuso, che tirano in senso
gono rapidamente perduti dalle cellule. In assenza del centrome- opposto, frequentemente spezzano il cromosoma attaccato ad
ro, i cromosomi non si attaccano al fuso e vengono distribuiti ca- ent rambi i poli.

che tira i cromosomi figli in due direzioni contrapposte verso le cellule figlie.
A differenza dell'esistenza di molte origini di replicazione, è fondamentale
che vi sia uno ed un solo centromero per ogni cromosoma (Figura 7.7a).
In assenza di un centromero i cromosomi segregano in modo casuale, deter-
minando frequentemente la perdita o il raddoppio di cromosomi (Figura
7.7b) nelle cellule figlie.
Se presenti in copie multiple, i centromeri potrebbero essere tirati in entram-
be le direzioni, verso le cellule figlie, provocando una possibile rottura del
cromosoma stesso (Figura 7.7c). I centromeri variano notevolmente in gran-
dezza. Nel lievito S. cerevisiae, i centromeri sono più corri di 200 bp. In con-
trasto, n ella maggior parre degli eucarioti, i centrom eri sono > 40 kb e con-
tengono una grande quantità di sequenze ripetute di DNA (Figura 7 .8).
I telomeri sono localizzati alle due estremità dei cromosomi lineari. Come le
origini di replicazione e i centromeri, i telomeri si legano ad un certo numero
di proteine. In questo caso, le proteine permettono due importanti funzioni ..
Primo, le proteine telomeriche proteggono le estremità dei cromosomi dalle
rotture o interruzioni del DNA che possono avvenire sul cromosoma. Nor-
140 IParte seconda • Manutenzione del genoma C 88-08-1789V

Figura 7.8 125 bp


La grandezza dei centromeri e la loro
composizione varia enormemente nei Il
differenti organismi. I centromeri di S. CDEl-111
cerevisiae sono piccoli e compost i da a 5. cerevisiae
sequenze non ripetute. Al contrario i
centromeri di altri organismi, come
quelli del moscerino della frutta, Dro-
sophila me/anogaster, e del lievito
Schizosaccharomyces pombe (eccet-
tuato quello di 4-7 kb) ed anche del-
l'uomo, sono molto più grandi e forma-
b S. pombe
_ . _.. cen 1....... .,_.
t i largamente da seq uenze rip etut e.

40-100 kb

e D. melanogaster

-400 kb

d Uomo

da 240 kb ad alcune Mb

mal mente, le terminazioni del DNA sono siti interessaci da frequenti eventi
di ricombinazione e degradazione. Le proteine che si assemblano ai celomeri,
formano strutture che sono resistenti ad entrambi gli eventi.
Secondo, i celomeri agiscono come origini di replicazione specializzate eh~
permettono alla cel lula di replicare la terminazione del cromosoma. Questa
reazione di replicazione è mediata da una particolare DNA polimerasi chia-
mata telomerasi.
Al contrario di quello che accade per la maggior parte del cromosoma, una
sostanziale porzione del celomero è mamenuca in una forma a singolo fila-
mento (Figura 7.9). La maggior parte dei celomeri presenta una semplice se-
quenza ripetuta che varia da organismo a organismo. Queste sequenze sono
tipicamente composte di coree ripetizioni ricche in TG. Per esempio, nei ce-
lomeri umani la sequenza ripetuta è 5'-TTAGGG-3'. Come vedremo nel Ca-
pitolo 8 la ripetitività delle sequenze celomeriche è conseguenza del partico-
lare metodo di replicazione di questo DNA.

La duplicazione del cromosoma eucariotico e la segrega-


zione avvengono in fasi separate del ciclo cellulare

Durante la divisione cellulare, i cromosomi dovrebbero essere duplicaci e


quindi segregaci nelle cellule figlie. Nei batteri questi due eventi avvengono
contemporaneamente. Infatti come il DNA viene replicato, le risultanti co-
pie vengono separate ai poli opposti della cellula. Sebbene sia evidente che
questi eventi sono sicuramente regolaci, i d ettagli di questa regolazione ap-
paiono, nei procarioti, ancora non del tutto chiari. Invece le cellule eucarioti-
Figura 7.9
La struttura di un tipico telomero. La
seq uenza ripetuta (in cellule umane) è
rappresentata nel riquadro. Da notare
che la regione di ssDNA alla termina-
zione 3' del cromosoma può essere
5' TTAGGG TAGGGTTAGGGTTA
AATCCC ATCCC .
f
GGGTTAGGG 3'
3'
unga cent inaia di basi.
Q 88-08- 17890-0 7. Cromosomi, cromat ina e nucleosoma I 141
Figura 7.10
preparazione segregazione Il ciclo mitotico delle cellule eucarioti-
per la segregazione cromosomica che. Esistono quattro fasi del ciclo mi-
cromosomica (mitosi) totico cellulare degli eucarioti. La repli -
cazione d ei cromosomi avviene duran-
te la fase S mentre la loro segregazione
avviene nella fase M . Fra queste due
fasi esist ono due intervalli di fase G 1 e
G2 in cui la cellula si prepara per gli
eventi successivi del ci clo . Per esem -
pio, molte cellule eucariotiche usano la
fase G 1 per stabilire che il livello di m o-
lecole presente è sufficientemente alto
da sopperire alle necessità richieste
per il completamento della d ivisione
s G1 cellulare.

replicazione preparazione per la


del DNA d ivisione cellulare

che duplicano e segregano i loro cromosomi in tempi diversi del ciclo cellula-
re. Focalizzeremo la nostra attenzione su questo argomento parlando ancora
d ei cromosomi.
Gli eventi richiesti per un singolo ciclo della divisione cel lulare vengono glo-
balmente conosciuti come ciclo cellulare. Durànte la maggior parte delle di-
visioni delle cellule eucariotiche il numero dei cromosomi , n elle cellule figl ie,
viene mantenuto ed è uguale al numero dei cromosomi della cellula parenta-
le. Questo tipo di divisione è indicata come divisione mitotica.
Il ciclo cellulare mitotico può essere diviso in quattro fas i: G 1, S, G2, M (Fi-
gura 7. 10). [evento chiave coinvolto nella propagazione cromosomica av-
viene in tempi distinti del ciclo cellulare. La sintesi del D NA avviene duran-
te la fase S e risuira nella duplicazione di ciascun cromosoma (Figura 7 .11).
C iascuna coppia di fil amen ti, risultanti dalla replicazione, vengono chiama-
ti cromatidi, e i due cromatidi di una data coppia so no conosci uti come

eventi chiave della fase S


~

coesina - ,
- ,
inizio
della
allungamento
- ,
replicazione
del DNA della replicazione - '
comparsa
della coesione - ' Figura 7.11
- '
Gli event i della fase S. Durante la fase
S avvengono due eventi principali. La
--L replicazione del DNA copia completa-
mente ciascun cromosoma e, immedia-

l tamente dop o, viene stabilita la coesio-


ne fra i cromosomi fratelli mediante il
posizionamento d i anelli di coesina at-
torno alle d ue copie del DNA replicato.
cromatidi Ciascuna striscia blu o rossa rappresen-
fratelli ta una molecola di ssDNA.
142 I Parte seconda • Manutenzione del genoma e 88-08-11 a90-0

eventi chiave della fase M

microtubuli

distruzione della coesina

centro di organizzazione
dei microtubuli

attacco ai cinetocori . separazione dei cromatidi fratelli

Figura 7. 12 che tutti i cinetocori si sono legat i ai poli, la coesione fra i croma-
Gli eventi della mitosi (fase M). Gli event i più importanti awen- tidi viene eliminata distruggendo gli anelli d i coesina. Infine,
gono durante la mitosi. I d ue cinetocori di ciascuna coppia di dopo che la coesina è stata elim inat a, i cromatid i sono segregati
cromatidi si attaccano ai poli opposti del fuso mitotico. Una volta ai poli opposti del fuso.

cromatidi fratelli. I crom atidi fratelli sono tenuti insieme, dopo la duplica-
zione, mediante l'azio ne di una molecola proteica detta coesina, che descri-
veremo successivamente. Il processo che tiene i due cromatidi adesi l'uno al-
l'altro è indicato come coesione dei cromatidi fratelli e questo stato di coe-
sio ne è mantenuto fintan to che i cromosomi non vengon o segregati nelle
due cellule fi glie.
La segregazione dei cromosomi avviene durante la mitosi o fase M del ciclo
cellulare. Vedremo il dettaglio del processo di mitosi successivamente m a p ri-
ma di tutto è necessario menzionare tre fenomeni imporrami che avvengono
durante il processo (Figura 7 .12). Primo, ciascun paio di cromatidi figli è le-
gato ad una struttura ch iamata fuso mitotico. Questa struttura è composta da
lunghe fibre proteiche, i microtubuli che sono attaccati ad uno dei due centri
di organizzazione dei microtubuli (altrimenti chiam ati centrosomi nelle cel-
lule animali o corpi polari nei lieviti e negli altri funghi). I due centri di orga-
nizzazione dei microtubuli sono localizzati in posizione diam etralmente op- ·
posta nella cellula formando i poli verso cui i cromatidi vengono attratti. I.:ag-
gancio dei cromatidi è mediato dal cinetocore assemblato su ciascu n centro-
mero (vedi la Figura 7.6). Secondo, la coesione fra i cromatidi, che contrasta-
va la fo rza di attrazione del fuso mitotico, viene abolita e a questo punro av-
viene il terzo e più imporrante evento della mi cosi: la separazione dei croma-
tidi fratelli . In assenza di forze d i bilanciamento che tengono uniti i cromati-
di , questi vengono rapidamente attirati verso i poli del fuso. Così, l'equilibrio
che si instaura tra le forze di coesione fra i cromatidi e quelle opposte di attra-
zione verso i poli gioca un ruolo contrapposto che permette di coordinare in
m odo appropriato la segregazione cromosomica.

La struttura del cromosoma cambia durante la divisione


cellulare eucariotica

La struttura dei cromosomi, durante un ciclo di divisione cellulare, varia d i-


verse volte. Possono verificarsi due situazioni principali (Figura 7 . 13). I ero-
e aa-08-17890-0 7. Cromosomi, cromatina e nucleosoma I 143
interfase fase M

rep licazione del DNA

mosomi possono essere nella loro forma più compatta al momento della mi- Figura 7.13
tosi o della meiosi. Il processo che permette il compattamento dei cromosomi Cambiamenti nella struttura cromati-
nica . I cromosomi sono condensati al
è indicato come condensazione cromosomica. Durante questo stato di con-
massimo d urante la fase Me deco n-
densazione i cromosomi vengono completamente separati l'uno dall'altro, fa- densati durante la rima nente parte del
cilitando così il processo di segregazione. ciclo (G 1, S, G2 nelle cellule mitotiche).
Durante le fasi G 1, Se G2 (complessivamente indicate come interfase), i cro- Tutte q ueste fasi in cui si ha deconden-
sazione vengono chiamate complessi-
mosomi sono significativamente meno compatti e si presentano aggrovigliati vamente interfase.
come un piatto di spaghetti. Comunque anche durante questa fase la struttu-
ra dei cromosomi cambia. La replicazione del DNA richiede il quasi comple-
to disassemblaggio e riassemblaggio delle proteine associate con ciascun cro-
mosoma. Immediatamente dopo la replicazione del DNA, la coesione dei
cromatidi fratelli viene stabilita legando i cromatidi neosintetizzati l'uno al-
l'altro. Mentre la trascrizione dei singoli geni viene accesa o spenta, aumenta-
ta o diminuita, nella struttura dei cromosomi avvengono modificazioni che
sono tipiche del momento del ciclo cellulare. Così, il cromosoma, cambiando
continuamente struttura, può essere considerato più un organello piuttosto
che un semplice filamento di DNA.

La coesione dei cromatidi fratelli e la co.ndensazione dei


cromosomi sono mediate dalle proteine SMC
Le proteine chiave che mediano.la coesione dei cromatidi e la condensazione
dei cromosomi sono correlate le une con le altre. Le proteine implicate nel
mantenimento della struttura del cromosoma (Structural Maintenance of
Chromosome, SMC) sono proteine che formano estesi complessi interagendo
attraverso domini coiled-coil (vedi il Capitolo 5). Insieme a proteine non-
SCM esse formano complessi multiproteici che agiscono legando assieme le
due eliche del DNA. Un complesso proteico contenente proteine SMC, chia-
mato coesina, è necessario per connettere le due molecole di DNA dupliqte
(cromatidi fratelli). Questo legame è la base della coesione fra i cromatidi fra-
telli. Si pensa che la coesina abbia una struttura formata da un grande anello
costituito da due proteine SMC e una terza proteina non-SMC. In verità, so-
no sempre maggiori le evidenze che dimostrano che il meccanismo di coesio-
ne dei cromatidi è in funzione del fatto che entrambi i cromosomi figli devo-
no passare attraverso l'anello di coesina (Figura 17.1 4). Questo modello pre-
vede che un'attività proteolitica idrolizzi la subunità non SMC della coesina
con una conseguente apertura dell'anello e perdita della coesina.
La condensazione del cromosoma richiede anche una proteina correlata al
complesso SMC: la condensina. Sebbene siano poco conosciute la struttura e
la funzione di questo complesso, esso condivide molte proprietà con la coesi-
na suggerendo che anch'esso sia un complesso con una struttura ad anello, il
che potrebbe essere determinante per la condensazione del cromosoma. Per
esempio, legando assieme differenti regioni dello stesso cromosoma la con-
densina potrebbe ridurne la lunghezza (Figura 7 .14).
144 I Parte seconda • Manutenzione del genoma e BB.os-11a90-0

Figura 7.14
Un modello speculativo per la struttu-
ra della coesina e della condensina. Le
coesi ne e le condensine sono compo-
nenti dell'impalcatura nucleare. En-
trambe giocano un ruolo nel tenere
unit e regioni d el DNA d istanti o diffe-
renti . L'ipotetica struttura ad anello di
queste proteine dovrebbe permettere
un flessibile ma, nel contempo, forte
legame fra due regioni del DNA. In
questa illustrazione, le proteine SMC
sono mostrate in verde (la coesina) o in
b lu (la condensina). (Fonte: Haering
C. H. 2002. Mo/. Ce//9: 773-778, F8,
pa g. 785.)

La mitosi mantiene il medesimo numero parentale


di cromosomi

La micosi può essere suddivisa in diverse fasi (Figura 7.15). Durante la profase,
i cromosomi si condensano in una forma altamente compatta necessaria p er
la segregazione. Alla fìne della profase la membrana nucleare si dissolve e la
cellula entra in metafase.
e 88-08-17890-o 7. Cromosomi, cromatina e nucleosoma I 145

Figura 7.15
interfase
Mitosi in dettaglio. Prima della mitosi, i
cromosomi si trovano in uno stato de-
cromosomi decondensati condensato chiamato interfase. Duran-
replicanti
te la profase i cromosomi sono con -
membrana nucleare densati e districati come preparazione
alla segregazione e, nella maggior
parte degli eucarioti, la membrana nu-
cleare, che circonda i cromosomi, viene
destruttu rata. Durante la metafase, cia-
scun paio d i cromat idi si attacca agli
opposti po li del fuso mitotico. L'anafa-
se inizia con la perdita della coesione e
profase A~===~~~::::;::?,... microtubuli quindi con la separazione dei cromatidi
-==::::3~~r-- centro di organizzazione frate lli. La telofase è distinguibile dalla
dei microtubuli diminuzione della condensazione dei
anelli di coesina crom osomi e la formazione della mem-
bra na nucleare attorno ai due gruppi
dei cro mosomi segregati. La citochine-
si è l'event o fina le del ciclo cellu lare
durante il q uale la membrana cellulare
che awolge i due nuclei forma.una
struttura mediana e quindi si separa
completamente dando origine a due
cellule fig lie. Tutte le molecole d i DNA
metafase sono a doppio fi lamento.

attacco monovalente

attacco b ivalente

anafase

rottura
degli anelli
di coesina

telofase

cit ochinesi

cellula figli a cellula figlia


146 I Parte seconda • Manutenzione del genoma e 88-08-11090-0

Durante la metafase si forma il fuso mitotico e i cinetocori dei cromatidi fra-


telli si attaccano ai microtubuli. Un vero e proprio aggancio dei cromatidi si
realizza quando i due cinetocori sono attaccati ai microtubuli emanati dagli
opposti centri di organizzazione. Questo tipo di aggancio è chiamato aggan-
cio bivalente (Figura 7.15) e risulta in un sistema di trazione dei cromatidi,
operato dai microtubuli, così che i cromosomi fratelli vengono tirati in dire-
zioni opposte. L'ancoraggio di entrambi i cromatidi ai microtubuli emanati
da un unico centro di organizzazione dei microtubuli o l'ancoraggio di un so-
lo cromatide della coppia, detto aggancio monovalente, non esercita trazione
e può portare alla perdita di cromosomi. La trazione esercitata in un aggan-
cio bivalente si oppone alla coesione della coppia di cromatidi e ha come ri-
sultato un allineamento di tutti i cromosomi nella zona mediana della cellula
fra i due centri di organizzazione dei microtubuli (questa formazione è chia-
mata piastra metafasica). A questo punto ciascun cromatide fratello è pronto
per essere segregato.
La segregazione cromosomica è resa possibile dalla degradazione proteolitica
delle molecole di coesina che determina l'abolizione della coesione fra croma-
tidi fratelli. Ciò avviene quando la cellula entra in anafase, durante la quale i
cromatidi fratelli si separano e si spostano ai poli opposti della cellula. Una
volta che i due cromatidi non sono più tenuti assieme vengono allontanati l' u-
no dall'altro dalla trazione impressa dai microtubuli. L'aggancio bivalente assi-
cura che i membri di ciascun paio di cromatidi vengano attirati ai poli opposti
e ciascuna cellula figlia riceva una copia dei cromosomi duplicati.
L'evento finale della mitosi è la telofase, durante la quale si riforma la mem-
brana nucleare attorno a ciascun set di cromosomi segregati. A questo pun-
to, la divisione cellulare può essere completata separando