Infezioni del Sistema Nervoso

Centrale: Meningiti ed Encefaliti

Dott. Fabbio Marcuccilli

 Anatomia del Sistema Nervoso Centrale
• Il SNC è contenuto in un ambiente chiuso a pareti rigide rappresentate dalla scatola
cranica e dal canale vertebrale.

• E’ sospeso nel liquido cefalorachidiano (LCR o liquor) ed è circondato da tre meningi:

 Pia madre (Leptomeninge)
 Aracnoide (Leptomeninge)
 Dura madre (Pachimeninge)

• Tra pia madre ed aracnoide si delimita lo

spazio sub-aracnoideo, che contiene il LCR
e comunica con il 4° ventricolo.
• Lo spazio compreso tra aracnoide e dura
madre prende il nome di spazio sub durale.
• Lo spazio epidurale è compreso tra la dura
madre e la superficie interna del canale
vertebrale. Esso manca a livello del cranio
in quanto la dura madre aderisce all’osso.
 Liquido Cefalorachidiano (LCR)
Il LCR, prodotto dai plessi coroidei, svolge una funzione protettiva del SNC in quanto:
• Ammortizza le diverse sollecitazioni meccaniche a cui è sottoposto il SNC
• Fornisce la struttura di sostegno, riducendo il peso effettivo dell’encefalo (<50 g).
• Tampona le eventuali alterazioni bio-chimiche
• Favorisce gli scambi neuro-ormonali
• Trasporta nutrienti e prodotti di rifiuto

Vulnerabilità anatomica:
pareti rigide rilevanza clinica anche di
piccoli aumenti della pressione intracranica
(eccetto che nel neonato e nel lattante)

Separazione dal resto dell’organismo tramite

varie barriere:
 barriera emato-encefalica
 barriera emato-liquorale
1. Infezioni acute: Meningiti ed
Encefaliti

2. Diagnosi

3. Infezioni cronico-persistenti:
Riattivazione di virus endogeni
che infettano anche il SNC

4. Danni a distanza
(malattie cronico-degenerative?)
 Infezioni del Sistema Nervoso Centrale
• Meningite  processo infiammatorio con
interessamento delle leptomeningi e del
liquido cefalorachidiano (LCR o liquor);

• Encefalite  processo infiammatorio con

interessamento del parenchima cerebrale;

• Meningo-encefalite  processo
infiammatorio con interessamento delle
leptomeningi e del parenchima cerebrale;

• Encefalomielite  infezione del

parenchima cerebrale e del midollo spinale;

• Ascesso cerebrale  infiammazione e

accumulo di materiale infetto che può
originare da otiti o sinusiti (per contiguità)
oppure da ascessi dentari, endocarditi e
polmoniti (emboli settici).
Infezioni del Sistema Nervoso Centrale
 Vie di penetrazione del SNC
I patogeni possono raggiungere le meningi attraverso varie vie:

1. Via ematica [virus e batteri]

Le barriere naturali prevengono le invasioni che originano dal sangue.
Queste ultime si verificano attraverso:
- La barriera emato-encefalica causando encefaliti
- La barriera emato-liquorale causando meningiti

I microbi passano attraverso queste barriere:

1. Moltiplicandosi in prossimità e infettando le cellule che formano le barriere;
2. Trasportati passivamente da vacuoli intracellulari attraverso le barriere;
3. Attraversando le cellule endoteliali dei vasi cerebrali direttamente o mediante
vescicole;
4. Trasportati passivamente dai leucociti/macrofagi infettati.

Il passaggio dell’agente patogeno avviene attraverso loci minoris resistentiae: la porta

di ingresso negli spazi subaracnoidei è rappresentata dai plessi coroidei, dalla lamina
cribiforme, dai seni venosi durali, dai capillari cerebrali. Lo spazio subaracnoideo ed il
LCR sono sostanzialmente senza difese nei confronti dei batteri, perché nel liquor sono
poche le cellule fagocitarie e bassa è la concentrazione del complemento e delle
immunoglobuline.
 Vie di penetrazione del SNC
2. Via neuronale [virus]
Mucosa nasale nervo olfattivo
Gangli sensitivi fibre nervose
Terminazioni nervose distali nervi periferici

3. Passaggio intracranico dalla mucosa oro-rino-faringea attraverso la lamina cribrosa

dell’etmoide (guaine del nervo olfattorio e ottico, capillari perinervosi, linfatici
perinervosi) [batteri e protozoi]

4. Contiguità da processi infettivi delle strutture craniche (sinusiti, otiti, mastoiditi,

trasudazione da un ascesso cerebrale) o attraverso fratture della scatola cranica e
fistole liquorali [batteri]

5. Malformazioni del canale vertebrale (spina bifida, meningocele) [batteri]

6. Inoculazione diretta in seguito ad interventi di neurochirurgia, derivazioni

ventricolo-peritoneali ed indagini strumentali invasive [batteri]
Route of entry of infectious agents into the CNS

from De Chiara et al., Mol Neurobiol 2012 in press

 MENINGITE
Processo infiammatorio di natura infettiva che interessa le 3 sottili membrane
che rivestono intimamente l’encefalo ed il midollo spinale (Pia Madre,
Aracnoide e Dura Madre) e lo spazio subaracnoideo in cui circola il LCR.

-Pachimeningite: infiammazione della Dura Madre;

-Leptomeningite: infiammazione della Pia Madre e dell’Aracnoide.

L'infiammazione che si verifica nello spazio subaracnoideo durante la

meningite può essere in larga parte attribuita alla risposta del sistema
immunitario all'ingresso degli agenti infettivi nel SNC piuttosto che ad una
conseguenza diretta dell’infezione.
 MENINGITE: classificazione
 In base a criteri eziologici :
 batterica  micotica  elminti
 virale  protozoaria

 In base a criteri temporali:

 FULMINANTE: con evoluzione rapida in coma e stato di shock quasi sempre
irreversibile;
 ACUTA: se i segni e sintomi di malattia si sviluppano nell’arco di ore o pochi giorni
(forme batteriche, micotiche e virali);
 SUBACUTA : se si sviluppa in settimane o mesi (TBC, Brucella, sifilide, criptococcosi);
 RICORRENTE: ripetuti episodi anche a distanza che sono espressione generalmente di
un’alterazione dell'anatomia locale oppure delle difese antibatteriche immunologiche
dell’ospite (es: trauma cranico, pazienti HIV+, ecc).
 DECAPITATA: forma il cui decorso è attenuato per il precoce ricorso alla terapia
antibiotica, che inoltre può determinare dei falsi negativi nelle indagini colturali del
microorganismo (es: N. meningitidis).

 In base alle caratteristiche macroscopiche del LCR:

 Meningite a liquor torbido (o purulenta)
 Meningite a liquor limpido (o asettica)
Ai due diversi aspetti liquorali corrispondono gruppi eziologici precisi
Agenti di Meningiti a LIQUOR TORBIDO

Aspergillus
Agenti di Meningiti a LIQUOR LIMPIDO
MENINGITE: fattori di rischio
MENINGITE: eziologia in base all’età ed ai
fattori di rischio

Virus
MENINGITE: sintomatologia
 MENINGITE: manifestazioni cliniche

• FEBBRE

• SINDROME MENINGEA

La sindrome meningea è caratterizzata da segni e sintomi diversi che

sono indipendenti dall’eziologia e presentano un’intensità variabile in
relazione all’ospite, alla patogenesi ed all’entità del coinvolgimento del
SNC. In base al meccanismo fisiopatologico che li determina, si
distinguono in:

1.segni di ipertensione endocranica;

2.segni di irritazione delle radici dei nervi cranici;

3.segni motori di sofferenza corticale

4.segni sensitivo-sensoriali, neurovegetativi e alterazioni psichiche

1. Segni di ipertensione endocranica:
• Cefalea
• Vomito (indipendente dall’ingestione del cibo, non preceduto da
nausea, a getto)
• Tensione della fontanella bregmatica (neonati)
• Alterazioni del fondo oculare

2. Segni di irritazione delle radici dei nervi

cranici (ipertonico-antalgici):
• Rigidità della nuca e del rachide (fino all’opistotono)
• Segno di Kernig
• Segno di Brudzinski
• Segno di Lasègue
• Segno di Binda
• Segno di Lesage e “floppy baby” nei neonati
Atteggiamento
in opistotono

Floppy baby
3. Segni motori di sofferenza corticale:
• Convulsioni generalizzate e parziali
• Spasmi tonici di gruppi muscolari
• Movimenti automatici

4. Segni sensitivo-sensoriali, neurovegetativi e

alterazioni psichiche:
• Fotofobia senza congiuntivite
• Ipersensibilità ai rumori
• Iperestesia
• Vertigini
• Dermografismo rosso persistente
• Stipsi
• Bradicardia
• Turbe del respiro (gruppi di inspirazioni profonde alternati a periodi di
apnea)
• Torpore, stato stuporoso, delirio, coma (associato o meno a convulsioni)
 MENINGITE BATTERICA

E’ l'infezione più comune e rilevante del SNC, che può

progredire rapidamente e portare a morte o disabilità permanente.
MENINGITE BATTERICA

Loci minoris resistentiae

Vie di accesso negli spazi
subaracnoidei: plessi corioidei,
seni venosi durali, piastra
cribiforme, capillari cerebrali

(LPS, peptidoglicano)

(IL-1, TNFa)
 MENINGITI VIRALI
• Le più frequenti e meno gravi
• Forme acute, senza sequele
• A liquor limpido (meningiti asettiche)
• Colpiscono prevalentemente bambini e giovani adulti
MENINGITI MICOTICHE
 MENINGITI PROTOZOARIE ED
ELMINTICHE

• Amebe (Naegleria, Acanthamoeba) MENINGITI A

LIQUOR TORBIDO

• Toxoplasma gondii
MENINGITI A
• Tripanosoma brucei spp. LIQUOR LIMPIDO

• Angiostrongylus cantonensis
 ENCEFALITE

Processo infiammatorio del parenchima cerebrale sostenuto da una

causa infettiva, di orgine virale, batterica e parassitaria.

La definizione di encefalite non implica necessariamente la

presenza dell’agente infettivo nell’encefalo, dal momento che
alcune forme possono essere scatenate da un meccanismo
immunitario.
ENCEFALITE VIRALE ACUTA E
SUBACUTA: agenti eziologici
DIAGNOSI
 MENINGITE: diagnosi

Importante la diagnosi precoce in quanto la meningite

è un’emergenza medica

L'iter diagnostico della meningite consta di diverse tappe:

1. Sintomi e segni clinici patognomonici

2. Esame macroscopico, chimico-fisico e microbiologico del LCR

3. Esami microbiologici su altri materiali biologici (sangue, urine,

tamponi nasofaringei, lesioni cutanee, essudato dell'orecchio
medio e aspirato da lesioni)

4. Esami sierologici e di laboratorio

5. Imaging (eco-transfontanellare, TC, RMN)

 1. DIAGNOSI: segni clinici
 Diagnosi semplice quando il quadro clinico è conclamato

 La sintomatologia può non essere specifica:

- nei bambini <1 anno

- negli anziani quadro clinico sfumato con febbricola e

turbe comportamentali
- nei soggetti immunocompromessi
SINTOMI E SEGNI CLINICI: Parametri
clinici indicativi di specifica eziologia
 2. DIAGNOSI: esame del liquor
 L’esame del LCR è di fondamentale importanza in tutte le forme di
meningite.

 La puntura lombare (o rachicentesi) deve essere eseguita in tutti i

pazienti con sospetta meningite.

 Deve essere procrastinato solo in presenza di sintomi o segni

indicativi di una lesione endocranica (rischio di incuneamento del
bulbo, in particolare per lesioni della fossa cranica posteriore).

 Non può essere effettuato in caso di:

- Immunocompromissione (es. AIDS)
- Alterazioni dello stato di coscienza (< 10 Scala di Glasgow)
- Deficit neurologico focale
- Storia di malattia del SNC (ictus, infezione focale, lesione occupante spazio)
- Coagulopatia
- Recente inizio di convulsioni: entro 1 settimana dalla presentazione
- Papilledema
 PRELIEVO DEL LIQUOR: rachicentesi

Pratica medico-chirurgica che consiste nella raccolta di un campione di LCR mediante

l'introduzione di un ago tra le vertebre L3-L4 o L4-L5.

Per esporre al meglio l'area da pungere il paziente può posizionarsi in decubito laterale con le
braccia a tenere le ginocchia raccolte (posizione fetale) oppure in posizione seduta e raccolta
 LIQUOR: modalità di conservazione

 Il campione di LCR deve arrivare in laboratorio entro 1 ora

dal prelievo, evitando l’esposizione al calore e alla luce
diretta.

 Il campione deve essere conservato a temperatura ambiente

(22-25° C) per un tempo non superiore alle 12 ore.

 Deve essere assolutamente evitata la refrigerazione perché i

patogeni responsabili delle meningiti sono sensibili agli agenti
chimici e fisici, in particolare al freddo e all’essiccamento.
 LIQUOR: diagnosi eziologica

- Esame macroscopico

- Esame chimico-fisico

- Esame microbiologico
 LIQUOR: esame macroscopico

Valuta l’aspetto del liquor:

- Ematico
- Xantocromico
- Opalescente
- Purulento
 LIQUOR: esame chimico-fisico
 Pressione: 35-40 cm di H2O (in posizione seduta) e 15-20 cm di H2O (in decubito
laterale).

 Aspetto: limpido, incolore, trasparente (acqua di rocca).

 Concentrazione di proteine (protidorrachia): 15 - 45 mg/dl.

 Contenuto di glucosio (glicorrachia): 45-80 mg/dl (60-70% dei valori glicemici).

 Cloruri ~700 mg/dl

 Elementi cellulari (in gran parte linfociti): <5 cell/mm3

ALTERAZIONI LIQUORALI:
 In caso di meningite il liquor può fuoriuscire ad una pressione aumentata (fino a
250-300 cm di H2O)

 Aspetto:
1) Meningiti a liquor torbido
2) meningiti a liquor limpido
LIQUOR: esame chimico-fisico
 MICRORGANISMI PROTEINE GLUCOSIO
DIAGNOSI CELLULE/mm3 OSSERVAZIONI
PATOGENI (mg/100mL) (mg/100mL)

Liquor limpido
NORMALE / 0-5 linfociti 15-45 45-80
(acqua di rocca)

-Meningococchi
-Pneumococchi Liquor torbido
500-20.000
MENINGITE (ACUTA, -H.influenzae
o più PMN Aumentate Basso
PURULENTA, -Streptococchi Microrganismi
(soprattutto 50-1000 o più <45
BATTERICA) -Stafilococchi negli strisci o nelle
NEUTROFILI)
-Coliformi colture
-Anaerobi

-Virus parotite
-Herpes simplex Liquor limpido
0-2000
-V.coriomeningite-
MENINGOENCEFALITE o più Normali o
linfocitaria Normale Isolamento virale
VIRALE prevalentemente aumentate
-Coxsachievirus o aumento del
LINFOCITI
-Echovirus titolo anticorpale
-Arbovirus

Liquor limpido
-M.tuberculosis,
MENINGITE 10-1000 o più,
-Criptococco, Aumentate Basso
TUBERCOLARE E DA prevalentemente Microrganismi
-Coccidioides. 45-500 o più <45
ALTRI MICETI LINFOCITI negli strisci e nelle
-Histoplasma
colture

Liquor limpido
25-2000 o più,
MENINGITE LUETICA E -T.pallidum Aumentate
prevalentemente 15-75
DA LEPTOSPIRA -Leptospira 45-400 e più Prove sierologiche
LINFOCITI
positive
VICINANZA AD
ASCESSI ENCEFALICI
O EXTRADURALI, A Normali o
Aumentate Normale Colture negative
TROMBOSI, A aumentate
SOMMINISTRAZIONI
INTRATECALI
 LIQUOR: esame microbiologico

Gram + Gram -

- Esame batterioscopico

- Ricerca degli antigeni solubili

- Esame colturale
 LIQUIDO CEFALORACHIDIANO

0.5 ml 3-4 ml

Ebollizione per 10 min Centrifugazione

1500 g/20 min

Centrifugazione
1400 g/10 min
Sedimento

Sovranatante

TEST AL LATTICE PER ESAME SEMINA SU

ANTIGENI SOLUBILI BATTERIOSCOPICO TERRENI
SOLIDI
 LIQUOR: esame batterioscopico

1. COLORAZIONI COMBINATE E DIFFERENZIALI

 Colorazione di Gram:
- batteri
- miceti (es. Candida spp.)
 Colorazione di Ziehl Neelsen (a caldo) e di Kinyoun (a freddo):
- batteri acido resistenti (M. tubercolosis)

2. COLORAZIONI SEMPLICI
 Colorazione con blu di metilene di Loeffler:
- batteri intracellulari (es. Neisseriaceae)

3. ESAME A FRESCO
 Esame con inchiostro di china (colorazione negativa):
- miceti (C. neoformans)
 LIQUOR: ricerca degli antigeni solubili

Antigeni polisaccaridi di superficie rilasciati dai batteri nel liquor

possono essere qualitativamente messi in evidenza con particelle al
lattice di polistirene sensibilizzate con anticorpi diretti contro gli
antigeni batterici.

E’ una reazione di agglutinazione al lattice.

I kit presenti in commercio rilevano gli antigeni capsulari di:

- N. meningitidis A, B, C, Y, W135
- S. pneumoniae
- H. influenzae tipo B.
- E. coli K1
- S. agalactiae
 LIQUOR: esame colturale

L’esame colturale si esegue dal sedimento.

Si utilizzano terreni agarizzati:

- Agar sangue: terreno non selettivo per microrganismi più esigenti

- Agar cioccolato addizionato di fattori di crescita (amminoacidi, vitamine,

carboidrati, NAD): per microrganismi esigenti (es. Neisseria, Haemophilus)

- Enterococcosel: selettivo per enterococchi

- MacConkey: selettivo e differenziale per enterobatteri

- Sabouraud: per miceti

- Mannitol Salt Agar: selettivo per stafilococchi

- Oxford: selettivo per Listeria

- Lowenstein Jensen: selettivo e differenziale per Micobatteri

LIQUOR: diagnosi eziologica

I microrganismi presenti in numero inferiore

a 5x104 UFC/ml hanno scarsa probabilità di
essere rilevati. La centrifugazione aumenta
la sensibilità del Gram di circa 10 volte.

I kit presenti in commercio rilevano

anche gli antigeni capsulari di E. coli K1 e
di S. agalactiae
LIQUOR: diagnosi eziologica

(M. tubercolosis)
3. DIAGNOSI: altri campioni da prelevare

Per la diagnosi eziologica di meningite/encefalite si possono

eseguire analisi microbiologiche anche su altre tipologie di
campioni:

• Tampone nasale/tampone faringeo (per i portatori!)

• Sangue per emocoltura (diagnosi di sepsi)

• Per le meningiti a liquor limpido è possibile eseguire:

- tampone faringeo (enterovirus, virus della parotite),
- ricerca nella saliva per il virus della parotite,
- ricerca nell’espettorato per gli adenovirus,
- ricerca nelle feci per gli enterovirus
 4. ALTRI DATI DI LABORATORIO

- Proteina C reattiva: aumentata in circa il 95% dei soggetti con meningite

batterica ma non nella maggior parte dei pazienti con meningite virale

- Ricerca LDH: l’isoforma LDH 5 è presente solo nelle meningiti batteriche.

– Batteriemia:
 nell’80% circa dei casi di meningite da Haemophilus influenzae
 nel 60% dei casi di meningite pneumococcica

Richiedere sempre l’emocoltura!

– VES: elevata

– Esame emocromocitometrico: una spiccata leucocitosi suggerisce un’eziologia

batterica (Attenzione: all’esordio di una meningite c’è scarso numero di cellule
leucocitarie con un Giemsa si distinguono i granulociti dai linfomonociti)

- Indagini sierologiche possono indirizzare verso un’eziologia virale

 5. RADIOLOGIA
 La radiografia del torace può mettere in evidenza un
focolaio pneumonico

 La TC-cranio può evidenziare:

- accentuazione del contrasto in sede meningea
- edema cerebrale
- aree focali di cerebrite
- lesioni focali
- allargamento degli spazi subaracnoidei
- ascessi subdurali

Comunque i pazienti con meningite raramente presentano reperti TAC

significativi in assenza di reperti neurologici focali.
RIATTIVAZIONI DI
VIRUS ENDOGENI
CHE INFETTANO
IL SNC
 Infezioni virali del SNC
Virus Caratteri generali Pazienti Malattia
ECHOVIRUS/ Virus senza envelope Bambini e adulti durante
Meningite asettica
COXSACKIEVIRUS con ssRNA l’estate
VIRUS
DELL’ENCEFALITE, Virus con e senza Bambini e adulti punti da Encefalite, spesso
SOPRATTUTTO envelope con ssRNA artropodi vettori dei virus fatale
ARBOVIRUS
Neonati, soggetti con Encefalite
Virus con envelope e infezione primaria necrotizzante,
HERPES SIMPLEX
dsDNA genitale, o con altre meningite asettica
infezioni ricorrenti benigna
Retrovirus con envelope
HIV AIDS Demenza, meningite
e con RNA
Virus senza envelope e
POLIOVIRUS Soggetti non vaccinati Poliomielite
con ssRNA
VIRUS DELLA Virus con envelope e Soggetti morsicati o
Rabbia
RABBIA ssRNA graffiati da animali rabidi
Virus senza envelope e Soggetti
POLIOMAVIRUS JC PML
dsDNA immunocompromessi
Bambini senza vaccinazione
VIRUS DEL Virus con envelope e e nei paesi in via di
Encefalite
MORBILLO ssRNA sviluppo rappresenta un
grave problema
 HERPES SIMPLEX VIRUS DI TIPO 1 E 2
􀂾 Sono virus a DNA appartenenti alla famiglia
Herpesviridae, sottofamiglia Alpha-herpesvirus.

􀂾 Nell’infezione primaria il virus si moltiplica nelle

cellule epiteliali della cute o delle mucose, producendo
le caratteristiche lesioni erpetiche.

􀂾Successivamente invade le terminazioni nervose.

􀂾 Da qui percorre in modo centripeto gli assoni,

raggiunge i gangli sensitivi e stabilisce la latenza nei
neuroni gangliari.

􀂾 Sembra che il DNA rimanga in forma episomiale nel

nucleo.

􀂾 In seguito a diversi stimoli (decadimento

dell’efficienza dell’immunità cellulare) il virus si
riattiva e si dirige in modo centrifugo lungo l’assone e
va a localizzarsi perifericamente, provocando le
malattie secondarie ricorrenti.

􀂾Generalmente si localizza nella stessa sede in cui si è

manifestata l’infezione primaria.
MENINGITE DA HSV1 E HSV2
 ENCEFALITE ERPETICA

Localizzazione encefalica di HSV-1 o HSV-2, più frequentemente

in corso di infezione primaria. Il 25% delle manifestazioni
dell’adulto sono tuttavia riattivazioni di virus latenti.

EPIDEMIOLOGIA

• Due picchi di frequenza: tra i 5 ed i 30 anni e dopo i 50 anni.

• HSV-1 è responsabile del 90% delle manifestazioni post-

neonatali, mentre il 75% delle manifestazioni neonatali è dovuto ad
HSV-2, che contamina il canale del parto.
 ENCEFALITE ERPETICA

SINTOMATOLOGIA

• Febbre
• Alterazioni neurologiche quali
convulsioni (40% dei casi),
manifestazioni paralitiche, rigor
nucalis, alterazioni psichiche, segni
focali (95% dei casi con disturbi
dell’olfatto e gusto, disfasia, anomalie
localizzate di EEG) più raramente
sindrome di Guillaim-Barrè, mieliti
trasverse, neuropatie periferiche
(paralisi di Bell)

• Possibili
presenza di vescicole erpetiche a livello mucocutaneo che precedono o
accompagnano le manifestazioni erpetiche

• Letalità del 70% nelle forme non trattate da HSV-1 e del 60% nelle forme neonatali da
HSV-1
 ENCEFALITE ERPETICA

DIAGNOSI
• PCR su liquor
• determinazione del titolo anticorpale utile solo per diagnosi
retrospettive

• TAC e RMN: focolaio temporale suggerisce la possibilità di

encefalite erpetica

TERAPIA
• Acyclovir (10 mg/kg ev x3/die per 14-21 giorni)

• Vidarabina nei casi resistenti all’acyclovir

Famiglia Polyomaviridae
Specie JC polyomavirus (JCV)
Scoperto nel 1971
Padgett BL et al. Cultivation Of Papova-like Virus
From Human Brain With Progressive Multifocal
Leucoencephalopathy. Lancet; 1 (7712): 1257-60.

Specie ospite Homo sapiens

Latenza Cellule gliali del SNC, reni, tonsille, PBMC

Via Respiratoria e tratto gastrointestinale

Human PyV BK, WU, KI, MC, TS, 6, 7, 9 and MW

Eziologia PML
Epidemiologia Ubiquitario: 66-92% di
sieroconversione nella popolazione adulta
Struttura Virus nudo a simmetria icosaedrica IL GENOMA
Dimensioni Piccole (~45 nm)
Genoma dsDNA circolare di ~5.2 Kb
Segni particolari si riattiva in condizioni di
immuno – compromissione (AIDS, malattie linfo- e
mielo- proliferative, trapianti, chemioterapia) ed in
seguito all`utilizzo di farmaci biologici in malattie
autoimmuni, quali sclerosi multipla e morbo di Crohn
 1) Regione precoce: proteine della trascrizione e
replicazione virale (AgT, Agt e T’135, T’136 e T’165)

2) Regione tardiva: proteine capsidiche e agnoproteina

(VP1, VP2, VP3 e VPx)

3) Non-coding control region (NCCR) regione chiave

NCCR nella regolazione virale associata alla neurovirulenza

98 bp
25 bp 55 bp 18 bp 98 bp
TATA cre-TAR TATA cre-TAR

ori A C 85 A E A C 85 A E
226 A
F

TATA cre-TAR

ori A B C 85 G D E 226 G F
108 G 217 G
23 bp 66 bp
 1959: Cavanaugh et al
• inclusioni intranucleari sono stati
ritrovati all'interno di oligodendrociti

1965: ZuRhein et al
• la microscopia elettronica rivela
particelle virali Polioma-like

1971: Padgett et al
1958: Åström et al
• Poliomavirus isolato dal cervello di
• 3 pazienti con un disordine linfo- John Cunningham affetto da PML
proliferativo e deficit neurologici da mediante colture di cellule gliali
degenerazione progressiva della
sostanza bianca
 3-5%

Kharfan-Dabaja et al, 2007

in corso di HAART

• PML-IRIS: stabilizzazione dalla progressione

della PML in seguito ad un paradossale
iniziale peggioramento del quadro clinico

dal 2005:

• PML nel trattamento di malattie autoimmuni Steiner and Berger, 2012

con farmaci biologici: natalizumab, rituximab
ed efalizumab
 In stati di immuno-
soppressione, CD34+ si
differenziano in cellule B
mature che trasportano JCV al
SNC?

Marshall and Major, 2010

Major, 2010
 Placche di demielinizzazione
Il lobo parietale è quello più
comunemente coinvolto 2. Esame istopatologico con
colorazione luxol fast blue

Sintomi clinici:
• Disordini cognitivi
• Deficit visivi
• Disfunzioni Motorie*

*Disturbi del linguaggio,

convulsioni e cefalee sono più
frequenti nei pazienti con AIDS

3. Cristallografia di
tessuto cerebrale
1. MRI di lesioni demielinizzanti
bilaterali multifocali della
sostanza bianca subcorticale Major, 2010
Virioni maturi di JCV nel
nucleo di un
oligodendrocita
Brew et al, 2010

Kharfan-Dabaja et al, 2007

 Non solo PCR
• Branched DNA signal amplification
• LCR
• Q replicasi
• 3SR (NASBA, TMA, TAS)
• …………………………….
 Non solo PCR
• Branched DNA signal amplification
• LCR
• Q replicasi
• 3SR (NASBA, TMA, TAS)
• …………………………….
 Non solo PCR
• Branched DNA signal amplification
• LCR
• Q replicasi
• 3SR (NASBA, TMA, TAS)
• …………………………….
 Non solo PCR
• Branched DNA signal amplification
• LCR
• Q replicasi
• 3SR (NASBA, TMA, TAS)
• …………………………….
Real-Time NASBA
Principles and Methods
 Contents
• RNA NASBA
• DNA NASBA
• DNA amplification under RNA NASBA
conditions
• NASBA characteristics
• NASBA critical components and steps
• Real-Time Detection of NASBA products
• Molecular Beacons,
characteristics/design/QC
• Quantitation
• Procedures
• Conclusions
 NASBA versus PCR
NASBA
•RNA as principle target
•DNA, when using “tricks”
•Isothermal
•Continuous
•ssRNA amplicons
•Primers not in end-product
PCR
•DNA as principle target
•RNA, when using “tricks”
•Different temperatures
•Cyclic
•dsDNA amplicons
•Primers in end-product
Quantitative PCR Techniques, May 17, 2001
RNA NASBA
 P2 extension in the
amplification phase

AMV-RT polymerase
P2

15 nts
 P2 extension in the
amplification phase

P2 AMV-RT polymerase

15 nts

RNase H
 P2 extension in the
amplification phase
E. coli
RNase H

P2 AMV-RT polymerase

15 nts

RNase H
 P2 extension in the
amplification phase
E. coli
RNase H

P2 AMV-RT

15 nts

RNase H

P1
 T7 RNAP promoter
“synthesis”

P2 AMV-RT
AMV-RT

3’ OH

3’ OH
P1
 Transcription in the
amplification phase

AMV-RT T7 RNAP
P2

P1

AMV-RT
 Transcription in the
amplification phase

AMV-RT
P2 T7 RNAP

P1
 Transcription in the
amplification phase

P2 T7 RNAP T7 RNAP T7 RNAP

P1

AMV-RT T7 RNAP
NASBA amplification efficiency

1014 Input copies/20 µl

total copies RNA

1012 negative
1
1010
10
108 100

106 1,000
10,000
104

102

100
0 20 40 60 80 100

time (minutes)
 DNA NASBA
• Model described by Sooknan et al. 1995
• Involves two denaturation steps at 95 °C
1. P1 added, denaturation 1
2. AMV RT extends
3. P2 added, denaturation 2
4. AMV RT added again, RNAse + T7 polymerase
1. AMV RT extends, results in ds T7 promoter region
2. T7 pol will start RNA production, cyclic NASBA starts
 DNA amplification under RNA
NASBA reaction conditions (1)
• Theoretically unlikely because
– Ds DNA is not likely to denature at 65 ºC
– RNAse H no expected to be functional
• Experimental results in absence of RNA
(HGD)
– Many targets no DNA ampl.
– For some, only product detected at very high DNA
input levels (5 ng)
• Mixed systems (e.g. Salmonella dnaK mRNA)
show RNA but no DNA amplification
• Some systems (e.g. cystic fibrosis) showed
amplification at low DNA input (12.5 pg)
 DNA amplification under RNA
NASBA reaction conditions conclusions

1. DNA can be used as template in absence

of RNA in some RNA-based NASBA
systems
2. Sensitivity of DNA assay is far less than
RNA assay
3. RNA NASBA is highly specific for RNA,
only in absence of RNA or enormous
excess (> 1000-fold) of DNA, DNA can be
amplified
4. Experimental data suggest DNA ampl. is
only possible when primers are directed
against DNA regions easily accessible (ss
 NASBA is unique

• RNA NASBA is able to selectively amplify ss RNA

in the presence of ds DNA of identical sequence

• RNA NASBA is ideal method for detecting gene

expression

• With RT-PCR , DNA amplification can never be

excluded
 Metodiche di ibridazione e di
amplificazione
MJ Wolkott. Advances in nucleic acid based
detection methods
Clin Microbiol Rev 1992, 5, 370-386