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GENESI E CONDUZIONE DEL POTENZIALE D’AZIONE

•Il POTENZIALE D’AZIONE (PA) è l’evento alla base della eccitabilità cellulare

Sistema cardiocircolatorio Sistema muscolo-scheletrico Vasi, organi interni, sfinteri … Sistema nervoso

muscolo scheletrico

neuroni
muscolo cardiaco

muscolo liscio
•Le cellule eccitabili sono polarizzate, con l’interno negativo rispetto all’esterno

OUT + + + + gK
+
- - +
- -
- +
- + Cm
- +
- + EK
IN - +
- +
-
- +

Vrest ~ -90 mV

1 F/cm2
Capacità elettrica q+

V
A
Q+
d Q
C
Q- V
dQ A
iC 
dt C
dV d
iC  C corrente capacitiva
dt
Bottiglie di Leida
Macchine elettrostatiche

Tesla Coil

Generatore di Van de Graaf


Luigi Galvani (1737-1798)
Disputa Galvani – Volta sull’elettricità animale
Alessandor Volta (1745-1827)
Rane, torpedini e scintille. Galvani, Volta e
l'elettricità animale
Piccolino Marco; Bresadola Marco
Bollati Boringhieri (collana Saggi)

I fluidi della vita. Alle origini della controversia


sull'elettricità animale
di Bernardi Walter
1992, Olschki Editore

La rana ambigua
Marcello Pera
Einaudi
Differenza di potenziale: diverse centinaia di milioni di Volt
Altezza: p.es 5 Km
Campo elettrico: ~ 2*102 V/cm

Il CAMPO ELETTRICO è una proprietà di una regione spaziale che


definisce, per ciascun punto, la forza per unità di carica elettrica esercitata su
una carica puntiforme posta in quel punto.

Campo elettrico = 90 mV/7 nm ~ 105 V/cm


Corrente trans-membranaria

B
dq
i
++ gK
++ q
+
- - -
+
+ dt Cm
- + EK
- +
-
- +
A - +
- +

+ +
++
++ + Legge di Ohm per un canale ionico
+
+ +
- - -
-
-
+
+
+
i  g (V  E )
i m i
-
- +
- +
- +
Ei = -60 mV
+ +
++
++
+
+ i  g (V  E )
i m i
+ +
gi  20 nS (  50 M )
- - - +
- +
- +
-
- +
- + misura di corrente

- +
Ei = -60 mV

Relazione corrente-voltaggio
i (nA)
4

Ei
2
Ei
1
Potenziale di Nernst per un canale ionico
Potenziale di equilibrio elettrochimico
0
-100 -50 0 50 100
Vm (mV) Pila di Nernst
-1
‘Potenziale di inversione’
i  gi Vm
[K+]o
i  g (V  E )
i m i gK

EK [K+]i

+] [K+]o
[Ca2+][Na
o o

gNa gK gCl

[K+]i
ENa EK ECl [Ca2+]i [Na+]i

i  g Na Vm  VNa   g K Vm  VK   gCl Vm  VCl 


eccitabilità

gNa(V,t) gCl(V,t)
gK(V,t)

ENa EK ECl
INIEZIONE DI CORRENTE COSTANTE SU CIRCUITO RC

i
iC
iR
iR
C iC
R

Vm iR

V (t )  iR 1  e t /  

 = RC
proprietà elettriche passive di membrana
Rm (M) inversamente proporzionale alle dimensioni (superficie) cellulari

Cm (pF) direttamente proporzionale alle dimensioni (superficie) cellulari


dvm
I m  Cm  g vm
dt

dvm 1  vm 
 Im 
dt Cm  R 
gK

Cm
EK

i = 0.2 nA

Vr = 0

10 mV

20 ms

V (t )  i  R  (1  e t / );

where   R  C;
gNa gK gCl

ENa EK ECl

La corrente che fluisce in ciascun ramo è: I i  gi  Vm  Ei 

I tot  I C  I Na  I K  I Cl 

 g Na Vm  VNa   g K Vm  VK   g Cl Vm  VCl 


dVm
C
dt
POTENZIALE DI RIPOSO [Na+]o = 145 mM
[K+]o = 4 mM
[Ca+]o = 1.5 mM
RT c2
Vm  Ei 
+
-
+ [Cl-]o = 123 mM ln
- +
- + zi F c1
[Na+]i = 12 mM - +
[K+]i = 155 mM EQUAZIONE
- +
DI NERNST
[Ca+]i = 0.1 mM - +
[Cl-]i = 4.2 mM -
- +
- +

ENa = +67 mV
EK = -98 mV gNa gK gCl
ECa = 129 mV
ECl = -90 mV
ENa EK ECl
Na+ 2K+

3Na+ POTENZIALE DI MEMBRANA


A RIPOSO

~ -90 mV
VOLTAGGIO DIPENDENZA

i
Legge di Ohm
Vm
i = g.Vm

canali
i = g.Vm
voltaggio-dipendenti

canali ohmici i = g(Vm).(Vm - Ei)

i = g.(Vm - Ei)
Relazioni corrente-voltaggio ohmiche

Canali non-selettivi
oppure 3.2 nS

La conduttanza è proporzionale Non c’è gradiente


al numero dei canali E
Relazioni
corrente-voltaggio
non-ohmiche
Corrente di Sodio rapida

Corrente di Calcio di tipo L

Corrente di Potassio t.o. Corrente di Potassio D.R.


Corrente di Potassio IK1 (inward rectifier)
VOLTAGGIO DIPENDENZA

i
Legge di Ohm
Vm
i = g.Vm

canali
i = g.Vm
voltaggio-dipendenti

canali ohmici i = g(Vm).(Vm - Ei)

i = g.(Vm - Ei)
TEMPO DIPENDENZA

m3

ATTIVAZIONE
+V
h depolarizzazione

INATTIVAZIONE

MOLECULAR GATES

i = g(Vm, t).(Vm - Ei)

iNa = gNa,max.m3.h.(Vm - ENa)


Sir Andrew Huxley and
Sir Alan Hodgkin
Per ciascun valore del potenziale di membrana V

1-y y
(V)

(V)
C O

dy
  (1  y )  y
Cinetica classica
del 1° ordine
dt
1-y y
y(V)

y(V)
C O

Cinetica classica dy
del 1° ordine   y (1  y)   y y
dt
g  g max  y  w
w 1-w
w(V)

w(V)
O C
Cinetica classica dw
del 1° ordine   w (1  w)   w y
dt
TEMPO DIPENDENZA
Corrente di Sodio
m3

ATTIVAZIONE
+V
h depolarizzazione

INATTIVAZIONE

i = g(Vm, t).(Vm - Ei)

iNa = gNa,max.m3.h.(Vm - ENa)


t-1
m = f1(V,t)

h = f2(V,t) 

E

V2
V
V1  zwF
V
   0 e RT
O
z (1 w ) F
 V
C   0 e RT
TEMPO DIPENDENZA
Corrente di Potassio

n4
+V
ATTIVAZIONE
depolarizzazione

i = g(Vm, t).(Vm - Ei)

iK = gK,max.n4.(Vm - EK)
•Il PA è una rapida variazione del potenziale di membrana seguita da un ritorno, di solito più lento, al
potenziale di riposo.

Il profilo temporale di tale evento è diverso in diversi tipi cellulari a causa di diversi meccanismi ionici sottesi.
Tale diversità rende ragione di diverse proprietà eccitabili in relazione a diverse funzioni
Quello che sappiamo riguardo ai meccanismi ionici sottesi alla insorgenza del potenziale
d’azione è in larga misura frutto di studi effettuati a partire dagli anni ’40 sul preparato più
famoso della elettrofisiologia:
l’ASSONE GIGANTE DEL CALAMARO (squid giant axon)
(NERVO MEDIALE POSTERIORE)
La sopravvivenza del calamaro dipende dalla sua abilità di allontanarsi rapidamente in situazioni di pericolo. Il suo mantello può venire
espanso e contrarsi portando acqua nella cavità ed espellendola dal sifone. Ciò richiede l’attivazione coordinata e simultanea delle fibre
muscolari di tutto il mantello. Questa funzione è ottenuta tramite l’attivazione di cellule nervose fra le più grandi in natura, gli assoni
giganti appunto. Essi possono raggiungere la lunghezza di 10 cm e la larghezza di mezzo millimetro. Il più grande di questi assoni è il
NERVO MEDIALE POSTERIORE, usato appunto classicamente dagli elettrofisiologi.

Quando un microelettrodo viene inserito all’interno


Diametro fino a 0.5 mm dell’assone, si può misurare una differenza di
potenziale fra l’interno e l’esterno della membrana di
circa -70 mV.
Misura di segnali elettrici di membrana

Tecnica dei microelettrodi

Setting sperimentale
Current clamp Iniettare corrente e misurare le
variazioni del potenziale di
membrana

single electrode current clamp


Voltage clamp correnti cationiche
im
Imporre alla membrana una certa differenza di
potenziale costante (non necessariamente Correnti uscenti
costante) e misurare la corrente ionica che outward
polarizzanti
scorre.
Vm
dV
ITOT  I C  I R  C  g Na Vm  VNa   g K Vm  VK   gCl Vm  VCl  Correnti entranti
dt inward
depolarizzanti

single electrode voltage clamp


Relazione intensità-durata
CURRENT CLAMP
Iniezioni sotto- e sopra-soglia
+60
ENa
+50 gNa gK

ENa EK
IK(V)

leakage current
IL
INa(V) IK1(V)

gNa gK
EK
ENa EK
h4
h +60
+50

IK(V)

INa(V)
m3
 g Na Vm  VNa   ...
dV
gNa gK gL I tot  C
dt
g Na  f1 Vm , t  gNa,max.m3.h
ENa EK EL
g K  f 2 Vm , t  gK,max.n4
g L  costante

SISTEMA DI HODGKIN e HUXLEY

 g Na Vm  VNa   ...


dV
I tot  C Vm (t)
dt
dm
  m (1  m)   m y m(V,t)
dt
dh h(V,t) Iion (t)
  h (1  h)   h y
dt n(V,t) …
dn
  n (1  n)   n y

dt
Teoria di Hodgkin e Huxley della
eccitabilità di membrana

Sir Andrew Huxley and


Sir Alan Hodgkin
1950

days

ms
Fig. 1. Schematic illustration of the interplay of Ca2+, basal Ca2+-activated AC, cAMP, PDE
activity and PKA and CaMKII activity, cast in the context of sarcoplasmic reticulum Ca2+
cycling, L-type Ca2+ channels, and other ion channels. Spontaneous but rhythmic local
submembrane Ca2+ releases during the later DD activate INCX, causing the DD to increase
exponentially to achieve the threshold for ICaL activation and the generation of the next AP.
See text for further details.
Lakatta EG, DiFrancesco D. J Mol Cell Cardiol. 2009 Aug;47(2):157-70. Epub 2009 Apr 8.
What keeps us ticking: a funny current, a calcium clock, or both?
Voltage clamp

soluzione con TTX

soluzione di perfusione normale

soluzione con TEA


Sia i canali di sodio che i canali di potassio-ripolarizzanti si aprono in
seguito alla depolarizzazione della membrana in virtù della loro
VOLTAGGIO-DIPENDENZA

Vm
(mV)

+20

-80

INa IK
IK1

TEMPO-DIPENDENZA
rapide

+ lenta

La depolarizzazione fa aprire le gates di attivazione e


chiudere quelle di inattivazione
Na+ entry
positive feed-back
+ +
++
++ +
+
+ +
- - - +
- +
- +
-
- +
- +
- +
Ei = -60 mV
IK(V)

INa(V)
Stimolazioni sottosoglia

i = 0.2 nA

Vr = 0

10 mV

20 ms

V (t )  i  R  (1  e t / );

where   R  C;
LE VARIAZIONI DI POTENZIALE DI MEMBRANA SOTTOSOGLIA
Si propagano CON DECREMENTO (elettrotonico)
DECREMENTO ELETTROTONICO

 è la COSTANTE DI SPAZIO
tipicamente intorno ai 1-3 mm
in cellule nervose e muscolari
Propagazione con
decremento (elettrotonico)

[vale per stimoli sottosoglia]

rm
velocità di propagazione v 
ri
LE VARIAZIONI DI POTENZIALE DI MEMBRANA
SOPRASOGLIA (potenziali d’azione)
Si propagano SENZA DECREMENTO
PROPAGAZIONE SENZA DECREMENTO
(propagazione di onde in mezzi eccitabili)

analoghi
CONDUZIONE SALTATORIA

Nel sistema nervoso centrale le cellule che rivestono


l’assone sono gli oligodendrociti, mentre nel sistema
nervoso periferico sono le cellule di Schwann
TECNICA DEL PATCH CLAMP
(Neher and Sakmann, Premi Nobel per la Fisiologia
e la Medicina, 1991)
the cell attachment (Giga-seal)

obiettivo del microscopio


rovesciato
Configurations of the
Patch clamp technique
Differenza tra corrente ionica di singolo canale e corrente complessiva di membrana (Whole Cell)

Correnti ‘stocastiche discrete’

Correnti ‘deterministiche continue’


Voltage clamp step

WHOLE CELL

PATCH
TEOREMA ERGODICO

G = conduttanza di un dato canale ionico aperto, dotato di una gate di attivazione,

y = probabilità di apertura di tale gate a un dato potenziale e a un dato tempo

a un dato potenziale di membrana e ad ogni istante la sua conduttanza effettiva è yG, e


la conduttanza di N canali a quello stesso valore di Vm e ad ogni istante sarà N(yG)

N(yG) = (yN)G

Studio corrente di Proprietà corrente di


singolo canale whole-cell
RIPOLARIZZAZIONE PRECOCE
Inattivazione INa
Attivazione IKTO

PLATEAU
IK e Ica si controbilanciano e
ECCEDENZA il potenziale tende a non
(OVERSHOOT) variare

RIPOLARIZZAZIONE TARDIVA
FASE DI DEPOLARIZZAZIONE IK prevale
RAPIDA Ica si inattiva
Attivazione INa

PIEDE DEL POTENZIALE D’AZIONE SOGLIA


Corrente depolarizzante scarica la capacità Si aprono canali INa
di membrana Si chiudono canali IK1

POTENZIALE DI RIPOSO
(Eq. GHK)
Refrattarietà
Refrattarietà assoluta relativa
REFRATTARIETA’ ASSOLUTA
REFRATTARIETA’ RELATIVA
Back to the controversy Galvani-Volta

 dVm
C
 dt  I st  G Na m 3
h V m  E Na   G K n 4
Vm  E K   G L Vm  E L 

 dm   (V ) 1  m    (V ) m
 dt m m m m


 dh   (V ) 1  h    (V ) h
 dt h m h m

 dn
   n (Vm ) 1  n    n (Vm ) n
 dt
 m Vm   f m Vm 

 m Vm   f m Vm 

 h Vm   f h Vm 
 V   f V 
h
 h m m

 n Vm   f n Vm 

 n Vm   f n Vm 