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MISFOLDING E MALATTIE

NEURODEGENERATIVE
A cura di:
Giancarlo Trimarchi
Dario Scapellato
Flavio Trusso
Valeria Todaro
Melissa Torrisi
Fabio Vignera
Gaetano Strano
Cesare Saitta
Video 1
Folding ed attività biologica delle proteine
“La forma è l’immagine plastica della funzione.”
(Angelo Ruffini)
Le proteine sono molecole flessibili con struttura a rapida fluttuazione e le loro mobilità
strutturali sono collegate alla loro funzione.
Protein Folding: auto-assemblamento e ripiegamento intramolecolare attraverso cui il
polipeptide, mediante interazioni non covalenti, assume la propria conformazione nativa che gli
permette di svolgere la sua peculiare funzione fisiologica.
Denaturazione Proteica
Condizioni ed agenti denaturanti:

CALORE rotazione ottica a carico della struttura e


variazione di viscosità e di assorbimento UV;

pH estremi variazione degli stati di ionizzazione delle


catene laterali degli amminoacidi;

Dinamica molecolare
DETERGENTI compromissione delle interazioni idrofobe della mioglobina
mediante associazione ai residui non polari;

AGENTI
aumento della solubilità delle sostanze non polari
CAOOTROPICI in acqua disgregazione delle interazioni idrofobe;

Urea Formaldeide
Ione guanidinio Mercaptoetanolo
Esperimento di Anfinsen (1957)
La ribonucleasi A (RNasi A), completamente denaturata in una soluzione 8 M di urea
contenente 2-mercaptoetanolo, riassume la propria conformazione nativa attraverso l’eliminazione
per dialisi dell’agente denaturante e del riducente e l’esposizione ad O2 a pH 8.

RNasi A:
-proteina a catena
singola (124 residui)
- 4 ponti disolfuro
determinati da 8
-residui Cys.

Probabilità complessiva di riformazione


casuale dei ponti disolfuro della RNasi A:

1/7 x 1/5 x1/3 x1/1 = 1/105 = 0.0095 < 1%


Dogma di Anfinsen (1957)
“In condizioni fisiologiche, le proteine possono ripiegarsi spontaneamente nella loro
conformazione nativa che corrisponde ad un unico minimo di energia libera, stabile e
cineticamente accessibile. Ciò implica che la struttura primaria di una proteina,
costituita da una specifica sequenza di amminoacidi, determina univocamente la sua
struttura tridimensionale.”
Paradosso di Levinthal
Come fa una proteina a ripiegarsi nella sua conformazione nativa?
L’ eplorazione casuale di tutte le sue possibili conformazioni fino al raggiungimento
di quella corretta NON è una procedura possibile!!!
DIMOSTRAZIONE:
una proteina di n residui
• ogni residuo ha 2 possibili angoli di torsione (φ e ψ) possiede 2^n angoli di torsione;
• ciascun angolo di torsione ha tre conformazioni stabili 32n ≈ 10n conformazioni possibili;

• tempo di analisi di ogni nuova conformazione pari a 10-13 s tempo di analisi di tutte le
strutture t = 10n/1013

Es: proteina di 100 residui (molto piccola), t = 10^87 >> età dell’Universo.
“ Le proteine raggiungono la loro conformazione nativa in meno di qualche secondo e
pertanto il ripiegamento avviene necessariamente attraverso vie dirette, piuttosto che
attraverso la scelta casuale della struttura.”
Processo di Folding
Il ripiegamento avviene in modo gerarchico e la stabilità conformazionale della proteina
aumenta in maniera netta, ossia la sua energia libera (ΔG) diminuisce drasticamente.

Fasi del Folding:


• formazione di segmenti locali di struttura secondaria (α-eliche e foglietti-β) entro
5 ms dall’inizio del ripiegamento;
• collasso idrofobico;
• formazione globulo fuso (molten globule) con prevalenza di struttura secondaria
e poca struttura terziaria finale nativa;
• stabilizzazione della struttura secondaria e formazione di sottodomini con
parziale assemblaggio della struttura terziaria (5-1000 ms);
• impaccamento delle catene laterali interne, formazione di legami idrogeno ed
espulsione delle molecole d’acqua rimaste nel nucleo idrofobo;
• ΔG folding caratterizzato da valori bassi (-5, -10 kcal/mol)

Ipotetica via di ripiegamento


di una proteina composta di
due domini.
Profilo energetico del Folding
Una proteina che si ripiega deve procedere da uno
stato ad alta energia ed alta entropia a uno stato
caratterizzato da bassi valori di energia ed entropia;
tale nesso è conosciuto come «imbuto di
ripiegamento» (folding funnel).

Le «fenditure» e le «gole» più piccole rappresentano


conformazioni acquisite temporaneamente dalle proteine
sino a quando, attraverso un’attivazione termica casuale,
superano la leggera rampa della barriera di energia
libera possono procedere verso una conformazione a
energia inferiore.

“Le proteine si sono evolute in modo da


possedere vie di ripiegamento efficienti e
conformazioni native stabili.”
Disolfuro isomerasi delle proteine (PDI)
Anche in condizioni sperimentali ottimali, le proteine si ripiegano in modo più lento in vitro che
in vivo a causa della formazione di ponti disolfuro non riscontrati nelle forme native. Tale
constatazione condusse Anfinsen alla scoperta della PDI.
•PDI si lega a proteine non ripiegate mediante interazioni idrofobiche con residui superficiali;
•PDI ridotta catalizza il processo di scambio di ponti disolfuro (~2 min in RNasi);
•PDI ossidata catalizza la formazione iniziale dei ponti disolfuro in un polipeptide;
Chaperon molecolari
• Famiglia di proteine presente in tutti gli organismi, dai batteri all’uomo;
• Si trovano in ogni compartimento cellulare;
• Rendono più efficiente il ripiegamento («folding») di altre proteine;
• Inoltre partecipano al mantenimento o alla creazione di uno stato di
parziale denaturazione delle proteine, favorendone così il trasporto
attraverso le membrane dei mitocondri o dei plastidi (nel caso delle cellule
vegetali).
Chaperon molecolari
Esistono due classi di chaperon molecolari:
• Chaperon veri e propri (Hsp70, Hsp90);
• Chaperonine o chaperon di II classe (GroEL/GroES nei
procarioti; Hsp60/Hsp10 negli eucarioti).
Hsp = «Heat shock proteins» (cioè «proteine da shock termico»),
perché sono state rilevate durante studi di denaturazione delle
proteine mediante calore.
Il numero che segue indica il peso molecolare espresso in kD
(kiloDalton).
1 D = 1 uma = 1,660 538 921 × 10−27 kg.
Chaperon e chaperonine non sono separate tra loro, ma collaborano nel corretto folding
delle catene polipeptidiche.
N.B.: Dalla figura in alto potete notare che il complesso GroEL/GroES dei procarioti è
identico al complesso Hsp60/10 presente negli eucarioti. Per quale motivo?

TEORIA ENDOSIMBIONTICA: il mitocondrio deriverebbe da un batterio aerobio


che si è adattato a vivere all'interno di una cellula eucariotica ancestrale
anaerobia.
Lynn Margulis, 1967
Meccanismi d’azione delle chaperon
molecolari
Hsp70 (o dnaK in E.Coli):
1. Le Hsp70 si legano all’ATP nel loro dominio ammino-terminale (-NH₂)
e assumono conformazione aperta.
2. Legame tra dominio carbossi-terminale (-COOH) delle Hsp70 e catene
polipeptidiche nascenti ancora legate ai ribosomi;
3. Idrolisi dell’ATP legato alle Hsp70 permette la chiusura di tali chaperon
con successivo folding della proteina.
Meccanismi d’azione delle chaperon
molecolari
Complesso GroEL/GroES (uguale al complesso Hsp60/Hsp10 del mitocondrio):
• GroEL: costituito da due anelli sovrapposti di sette subunità ciascuno con una
cavità centrale dove vi è il sito di ripiegamento ATP-dipendente della proteina;
• GroES: costituito da un singolo anello di altre sette subunità che si dispone a
cupola su GroEL;
• Non appena la proteina ha completato definitivamente il processo di
ripiegamento, viene rilasciata da GroEL.

GroES

GroEL
Grande utilità delle chaperon molecolari
Cellular homeostasis and stress survival requires maintenance of the proteome
and suppression of proteotoxicity. Molecular chaperones promote cell survival
through repair of misfolded proteins and cooperation with protein degradation
machines to discard terminally damaged proteins. Hsp70 family members play an
essential role in cellular protein metabolism by binding and releasing nonnative
proteins to facilitate protein folding, refolding and degradation.

L’omeostasi cellulare e la sopravvivenza allo stress richiedono il mantenimento del


proteoma e la soppressione della proteotossicità. Le chaperon molecolari
garantiscono la sopravvivenza della cellula attraverso la riparazione di proteine
mal ripiegate e la cooperazione con complessi di degradazione proteica al fine di
eliminare le proteine terminalmente danneggiate. Le Hsp70, legando e liberando
proteine non native per facilitare il folding proteico, il refolding e la degradazione,
giocano un ruolo fondamentale nel metabolismo cellulare delle proteine.

From “Specification of Hsp70 Function by Type I and Type II Hsp40” by Douglas M. Cyr, Carlos H.
Ramos, 09 Dec 2014
RIPIEGHIAMOCI !

FLAVIO TRUSSO
Ripieghiamoci !
mm.. La proteina non si ripiega mica sola

chaperon
Controlla il corretto
ripiegamento

Viene particolarmente stimolata dal calore


Pronto..

ribosoma
..All’ opera!
AA + AA

AMMINOACIDO
AA + AA + AA

AMMINOACIDO
..Procedono i lavori

Ottimo !

Prima costruzione della


proteina
Andiamo alla grande!

Che bella proteina


Ma …
Non c’ è voglia di lavorare
E ci sono certi imprevisti !

esempio
Incidenti

OOK !

Oops normale

Proteasi
Proteosoma

Foro piccolo
7
Foro grande 7
ATPasica
+
riconoscimento
Concentrazione proteica
Ubiquitina
Ubiquitina

ATP
E1
E2 + E3
E1 =
Ubiquitina ligasi
E2
E3
Quindi..

Proteosoma

ubiquitina
Processo
Capita però..
Amiloidosi

PrPc : sensibile alla proteasi

PrPsc: resistente alla proteasi


MISFOLDING

Video 2 VIDEO
INSERIMENTO
VIDEO 1
https://www.youtube.com/watch?v=hywcyZb
WIeg
1. Proteina sierica precursore

Formazione delle amiloidi


Aumento dei foglietti beta

Protofibrille

Protofilamenti
2.Fattori ambientali
3. Prioni
AMILOIDI
PROTEINA MALATTIA PATOGENESI MECCANISMO

Emoglobina Anemia falciforme Aggregazione L’emoglobina non correttamente ripiegata


perde la sua funzionalità e la sua elasticità,
causando seri danni alla circolazione
sanguigna.
CFTR Fibrosi cistica Trasporto Forme mutanti di CFTR non si dissociano
dagli chaperoni e non raggiungono la
Malattie da misfolding proteico
Huntingtina M. di Huntington Aggregazione
membrana.
La ripetizione di p-glu più lunga porta alla
formazione di aggregati cellulari insolubili.
Proteina b-amiloide M. di Alzheimer Aggregazione Il peptide beta-amiloide non correttamente
ripiegato si accumula nel tessuto nervoso
umano, formando dei depositi noti come
placche neuritiche.
Proteina prionica (PrP) M. di Creutzfeld- Aggregazione Effetto a cascata in cui sempre più proteina
Jakob viene convertita nella forma che determina
la malattia.
a-Synucleina M. di Parkinson Aggregazione La proteina con avvolgimenti sbagliati si
aggrega in masse sferiche (corpi di Lewy)
P53 Tumori Trasporto P53 impedisce la divisione cellulare.
Mutazioni di p53 portano ad un non corretto
ripiegamento; le proteine p53 instabili sono
distrutte.
Video 3 Morbo Di Alzheimer
Video
https://www.youtube.com/watch?v=dj3GGDuu15I&in
dex=7&list=PLLfnIn4GFtd5tOZ1qFcA0eOorWWV8KyI3
Tagliare da 1:31 a 2:10
SNPs coinvolti nella malattia di Alzheimer

Esistono delle basi genetiche?


Gene analizzato Varianti genetiche studiate

ACT -51 G-T

Cys112Arg
APO E
Arg158Cys

HMGCR -911 C-A

IL-1B -511 C-T

IL-10 -1082 G-A

VEGF -2578 C-A


Prospettive future
• Uso di cellule staminali pluripotenti indotte
• Uso di osmoliti o di chaperone molecolari
• Uso di nanoparticelle funzionalizzate
L’apice del misfolding delle proteine: la saga dei prioni
Islanda, anni ’50  SCRAPIE (eng. To scrape = grattare, scorticare)

Lymph nodes from (a) healthy and (b) infected sheep - colouring with antibodies shows
clear sign of scrapie prions in the intracellular tissue of the infected sheep

IPOTESI  VIRUS
Smentita dagli studi di Stanley B. Prusiner (Nobel 1997)
«Prion diseases are transmissible, progressive and invariably fatal
neurodegenerative conditions associated with misfolding and aggregation of
a host-encoded cellular prion protein, PrPC»
An overview of human prion diseases, Imran and Mahmood, Virology Journal 2011, 8:559

PrPC PrPSc
«Proteine infettive»: il contagio conformazionale
…ma come è cominciato tutto? Cosa ha determinato la mutazione
conformazionale della proteina PrP a parità di struttura primaria?
Classificazione delle malattie da prioni (PrDs):

• Sporadiche (85-90%) es. sporadic Creutzfeldt-Jacob disease (sCJD),


sporadic fatal insomnia (sFI)
• Acquisite (1-3%) es. iatrogenic CJD (iCJD), Kuru, variant CJD (vCJD)
• Genetiche (10-15%)* es. Fatal familial insomnia (FFI), familial or
genetic CJD (f/gCJD), Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome (GSS)

100
80
60
40 PrDs
20
0
Sporadiche Acquisite Genetiche

*percentuali tratte dalla Review «Prion Diseases», L.T.Takada, M.D.Geschwind, Semin Neurol
2013;33:348-356
PRNP
Più di 30 mutazioni
nell’ORF del gene

 PRNP pathogenic point mutations


Tratto da JKMS, «Genetic Studies in Human
Prion Diseases, Byung-Hoon Jeong and
Young-Sun Kim
Ricerca
Topo knockout per PRNP:
Sopravvivenza, immune a infezioni da prioni

258a 272a

• Capacità di sintesi enzima che


«disattiva» PRNP
• Encefalite spongiforme senza
sintomi, non letale
• Scomparsa spongiosi dopo 12 mesi
Encefalopatie spongiformi
trasmissibili(TSE)
Le encefalopatie spongiformi trasmissibili sono un gruppo di
malattie neurodegenerative che colpiscono l'uomo e gli animali,
caratterizzate da un lungo periodo d'incubazione e da lesioni al
SNC.

 Nei bovini:Encefalopatia bovina spongiforme


 Nella pecora: Scrapie
 Nell'uomo: malattia di Creutzfeldt-Jakob

La malattia di Creutzfeldt-Jakob descritta negli anni venti da Hans


Creutzfeldt e Alfons Jakob è una rara patologia degenerativa del
sistema nervoso centrale, caratterizzata da una progressiva
demenza fatale.
Classificazione

La MCJ sporadica

La forma sporadica comprende circa l'80% dei casi di MCJ; inizialmente presenta dei
sintomi aspecifici quali, perdita di peso, atassia, diturbi visivi come allucinazioni
visive.
Nella fase avanzata della malattia avremo comparsa di crisi epilettiche, coma, con una
durata media della malattia di circa 6 mesi.

Un ruolo fondamentale che causa la malattia è svolto da un polimorfismo al codone


129 del gene PRNP che regola la suscettibilità alla malattia.

La diagnosi è definita solo post mortem dall’analisi neuropatologica e/o dall’analisi


biochimica eseguita su tessuto cerebrale.
Intra vitam la diagnosi è probabile se il paziente presenta una demenza, disturbi visivi
o segni cerebellari, associato a un tracciato elettroencefalografico.
La MCJ familiare

La MCJ familiare è legata a svariate mutazioni puntiformi del gene PRNP e si presenta
con una sintomatologia simile alla forma MCJ sporadica ma con un esordio più
precoce(intorno ai 45 anni).
Caratterizzata da movimenti involontari e da demenza, la MCJ ha un decorso clinico che
oscilla tra i 2 e i 10 anni.
La MCJ variante
Nel 1996 è stata descritta nel Regno Unito la forma variante della MCJ legata al consumo
alimentare di prodotti carnei contaminati dall’agente infettivo responsabile dell’encefalopatia
spongiforme del bovino.

Si discosta dalla forma classica di MCJ per la durata della malattia superiore ai sei mesi, per
l'insorgenza della malattia con un'età media di 28 anni e per le caratteristiche cliniche di
esordio di tipo psichiatrico (depressione, ansietà, apatia, illusioni).

Fondamentale per la diagnosi clinica di vMCJ è l'esecuzione della risonanza magnetica; si è


visto che l'analisi del gene PRNP non ha identificato alcuna mutazione nè altre alterazioni di
rilievo (inserzioni, delezioni), mentre tutti i casi sono risultati omozigoti per metionina al
codone polimorfico 129 del gene PRNP.
Trattamenti
Per la MCJ al momento non è stato dimostrato alcun trattamento
efficace, la malattia è sempre fatale e la ricerca per una nuova cura
continua.

Tuttavia esistono dei farmaci da somministare ai pazienti affetti da MCJ


con funzione di ridurre le convulsioni nervose, spasmi muscolari e crisi
epilettiche dovute a stadi avanzati della malattia.
MORBO DI PARKINOSN

MALATTIA
NEURODEGENERATIVA
EZIOLOGIA
EPIDEMIOLOGIA
SINTOMI
TERAPIE
INTERVENTO
(NEUROCHIRURGIA
STEREO-TASSICA)
EZIOLOGIA

Genetica
Accumulo amiloidale
ROS
Infettiva
Tossica
EPIDEMIOLOGIA

Maggiore nei maschi


Età di esordio circa: 50 / 55 anni
TERAPIE

• Precursori dopamina (L-Dopa)


• Dopamino-agonisti
• Chirurgica (tramite elettro stimolazione)
DEEP BRAIN STIMULATION

Video 4
TO be
CONTINUED…
Credits
bibliografia/sitografia.
-JOURNAL OF VIROLOGY, Feb.1993,p.643 Byron Caughey-
Gregory Jay Reymond
-Current Therapeutic Research Volume 66.Number 6
November/December 2005 Peter Gosh-Jack Edelman
-National Academy Science USA oct 1998 Larisa Cervenàkova-
Ralph Garruto-Lev G.-Goldfarb-Hee Suk Lee-Paul Brown.
Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin
Raff, Keith Roberts, Peter Walter
Biologia molecolare della cellula
Quinta edizione
Harvey Lodish, A Berk, C.A. Kaiser, M. Krieger, M.P. Scott,
A. Bretscher, P. Ploegh, Paul Matsudaira
Biologia molecolare della cellula
Terza edizione italiana condotta sulla sesta edizione
americana
Majno - Joris , Editore: Casa Editrice Ambrosiana ,
Edizione: II 5/2009 , Volume: Unico
Cellule, tessuti e malattia - Principi di patologia generale
Credits
Donald Voet, Judith G Voet, Charlotte W Pratt
Fondamenti di biochimica
Terza edizione italiana condotta sulla quarta edizione
americana -Pocchiari M, Ladogana A. La malattia di
Creutzfeldt-Jakob.
Aspetti clinici ed epidemiologici.
- Collinge J, Sidle KC, Meads J, Ironside J, Hill AF.
Molecular
analysis of prion strain variation and the etiology of “new
variant” CJD. Nature 1996;383:685-90.
-Zanusso GL, Ferrari S, Rizzuto N, Monaco S. Malattie da
Prioni umane: etiologia, patogenesi e aspetti clinico-
patologici.
Brescia Medicina 2000;3-4:3-11. -"An overview of
human prion diseases", Muhammad Imran and Saqib
Mahmood, Virology Journal 2011, 8:559
-"Prions and Prion-Like Pathogens in Neurodegenerative
Disorders", Caterina Peggion, Maria Catia Sorgato and
Alessandro Bertoli, Pathogens 2014, 3, 149-163
Credits
-"Genetic Studies in Human Prion Diseases", Byung-Hoon
Jeong and Yong-Sun Kim, J Korean Med Sci 2014, 29,
623-632
-"Prion Diseases", Leonel T. Takada and Michael D.
Geschwind, Semin Neurol 2013, 33:348-356
-"Cellule, tessuti e malattie. Principi di patologia
generale", Isabelle Joris and Guido Majno "Biologia e
Genetica", 2009, II edizione, De Leo, Ginelli, Fasano.

http://www.slideshare.net/cmid/master-buffa-marzo-
09http://flipper.diff.org/app/items/1194
http://www.amiloidosi.it/medici_amilo_sis.htm
http://www.inbb.it/wp-
content/uploads/2014/07/Atti_WS-2009.pdf
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3192805
/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24854788
http://didattica.uniroma2.it/assets/uploads/corsi/14073
7/Lezione_2_malattie_da_accumulo_proteinopatie.pdf