COMPONENTI di una REAZIONE di PCR

Stampo DNA a doppio filamento

Oligonucleotidi complementari a regioni dei filamenti

Primers
opposti che fiancheggiano la sequenza DNA bersaglio

Deossiribonucleotidi trifosfati Miscela equimolare di dATP,

dTTP, dGTP, dCTP

Tampone contenente Lo ione Mg2+ è essenziale per il

cloruro di magnesio funzionamento dell’enzima

Tradizionalmente viene usata la Taq polimerasi, enzima

Enzima termostabile estratto dal batterio termofilo Thermus
aquaticus
TRASCRITTASI INVERSA E PCR
 SYBR Green
E’ un colorante fluorescente che si lega solo al DNA a doppio filamento ed
emette la fluorescenza solamente in queste condizioni.

DENATURAZIONE ANNEALING
Non viene rilevata fluorescenza
L’intensità della fluorescenza
SYBR Green comincia ad aumentare
Primer
Luce emessa

ALLUNGAMENTO
L’intensità della fluorescenza continua
ad aumentare e diventa massima al
termine della fase di allungamento
Polimerasi
L’AUMENTO DELLA FLUORESCENZA E’
REGISTRATO A 530nm
PCR E SONDE TAQMAN
DIVERSI APPROCCI NELLE PCR

ATTIVITA’
ESONUCLEASICA 5’-3’
DELLA TAQ POLIMERASI
 ALTRE FUNZIONI NUCLEOTIDI

I nucleotidi svolgono numerose funzioni cellulari oltre al loro ruolo di

subunità costituenti degli acidi nucleici. Essi possono essere
adoperati dalla cellula come: Trasportatori di energia chimica,
Componenti di cofattori enzimatici e Messaggeri chimici.
TRASPORTO DI ENERGIA CHIMICA DA PARTE DEI NUCLEOTIDI

I nucleotidi possono legare gruppi fosforici addizionali

legati al gruppo fosforico presente sul carbonio 5′ del
ribosio. I tre gruppi fosforici sono indicati con a, b e g.
Il gruppo fosforico a è legato al ribosio con un legame
estereo. I legami tra α e β e tra β e γ sono
fosfoanidridici. L’idrolisi dei nucleosidi trifosfato
rappresenta una importante fonte di energia chimica
per la cellula. L’energia rilasciata dall’idrolisi dipende,
tuttavia dal legame in cui il gruppo fosforico è
coinvolto. L’idrolisi dei legami fosfoanidridici fornisce
una quantità di energia maggiore (30 kJ/mole)
dell’idrolisi del legame estereo (14 kJ/mole).
 ATP:
MONETA ENERGETICA
DELLA CELLULA
Per idrolisi l’ATP può formare ADP e Pi
TRASFERIMENTI DI GRUPPI DA PARTE DI ATP

Glucosio

g
b
a
Ac. Grasso

Metionina
COMPOSTI FOSFORICI AD ALTO E BASSO CONTENUTO ENERGETICO
 OSSIDARE SUBSTRATI ORGANICI
(REAZIONE DI DEIDROGENAZIONE)

I trasportatori partecipano alle

ossidoriduzioni trasferendo 2
elettroni alla volta

AH2 A

NAD NADH + O2 H2O + NAD

+ H+

ATP
 Coenzimi contenenti Adenosina
Alcuni cofattori enzimatici contengono nella loro struttura Adenosina: Il
coenzima A, Il FAD, Il NAD. L’adenosina, unico punto comune alle loro
strutture, non partecipa alla funzione primaria dei cofattori.
I NUCLEOTIDI PIRIDINICI NAD+ E NADP+ SONO I COENZIMI DI MOLTE
DEIDROGENASI. ESSI TRASPORTANO IONI IDRURO (2 e- , 1 H+)

IL NAD+ TRASPORTA EQUIVALENTI RIDUCENTI DALLE VIE CATABOLICHE

ALLA CATENA RESPIRATORIA MITOCONDRIALE.
IMPORTANTE PER IL METABOLISMO ENERGETICO

IL NADP+ RACCOGLIE ELETTRONI DA UTILIZZARE NELLE VIE ANABOLICHE

LA VITAMINA NIACINA è LA FONTE DELLA PARTE NICOTINAMMIDICA

NELLA SINTESI DEI NUCLEOTIDI NICOTINAMMIDICI.
CATENA RESPIRATORIA E SINTESI ATP
I NUCLEOTIDI FLAVINICI (FAD e FMN) SONO LEGATI SALDAMENTE
AGLI ENZIMI (ES: SUCCINATO DEIDROGENASI)
Nucleotidi nelle vie di trasduzione del segnale