ANÁLISE DE ADENOCARCINOMA COLORRETAL POR
ESPECTROSCOPIA ÓPTICA
J. L. Rangel*, L. Raniero*, C. S. P. Lima**, C. Oliveira**, R. A. Canevari*, J. Ferreira*, E. A. L.
Arisawa*, J. A. A. C. Piva*, A. A. Martin*
*Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento/UNIVAP, São José dos Campos, Brasil
**Departamento de Clínica Médica/UNICAMP, Campinas, Brasil
e-mail: jlucasrangel@hotmail.com
Abstract: Colon cancer is the second most common
cause of death in Brazil. In this study, we used the non-
destructive imaging technique by near infrared
spectroscopy. The sick and healthy tissues were
obtained from different patients. The results were
correlated with the histological images and classified in
a dendrogram using the Ward’s algorithm. Analyses
showed biochemical differences related to lipids,
proteins and DNA from tissues.
Palavras-chave: Imagem Bioquímica, Cólon,
Espectroscopia Óptica, Análise Morfológica.
Introdução
O câncer de colo-retal abrange tumores que atingem
o cólon (intestino grosso) e o reto. Tanto homens como
mulheres são igualmente afetados, sendo uma doença
tratável e freqüentemente curável quando localizada no
intestino (sem extensão para outros órgãos). O câncer de
colo-retal é a terceira causa mais comum de morte por
câncer no mundo [1]. A maior incidência dessa doença
ocorre na faixa etária entre 50 e 70 anos, mas há a
possibilidade de se iniciar a partir do 40 anos. Fatores
como histórico familiar, dieta com alto índice de
gordura, obesidade e sedentarismo, entre outros
aumentam as chances de risco [1].
Atualmente existem alguns tipos de diagnósticos,
tais como: exame físico completo, toque retal, exame
radiológico contrastada com o intestino grosso,
colonoscopia e biópsia com o estudo histopatológico da
lesão. Esses métodos, porém, além de invasivos
necessitam de vários dias para fornecerem os resultados,
desta forma retardando o tratamento do indivíduo. A
medicina moderna busca novas técnicas de diagnósticos
que possam ser menos traumática para o paciente e com
a possibilidade de fornecer o resultado em tempo real.
Dentre as técnicas que estão sendo estudadas, destaca-se
a de espectroscopia óptica. A principal vantagem desta
técnica, comparada com a histologia convencional, é a
possibilidade de realizar uma análise bioquímica das
alterações moleculares ao invés da análise morfológica.
Dentre as técnicas ópticas aplicadas para este fim, a de
1/4
Imageamento por Infravermelho próximo tem
recentemente sido utilizada com sucesso no estudo de
várias lesões cancerígenas[2,3,4].
A técnica de absorção de infravermelho analisa a
interação de radiação eletromagnética com a matéria,
determinando os níveis de energia de átomos e
moléculas [5]. O método fornece um espectro de
absorção bioquímica devido às vibrações de ligações
químicas de componentes celulares, tais como proteínas,
ácidos nucléicos, carboidratos e lipídeos [6,7,8]. A
região principal de identificação molecular esta na faixa
compreendida entre 400 a 4000 cm-1, região do
infravermelho próximo, que possibilita a identificação
do material. Nessa região, pequenas alterações na
estrutura e na constituição de uma molécula resultam
em mudanças significativas na distribuição das bandas
de absorção do espectro, que são relacionados com a
estrutura da molécula [9,10].
Assim, a fim de minimizar as desvantagens que
ocorrem nos diagnósticos histológicos convencionais, o
objetivo deste projeto foi utilizar a técnica de
espectroscopia de infravelho por transformada de
fourier (FT-IR) em modo imagem, no estudo das lesões
cancerígenas do intestino grosso e associar o
imageamento bioquímico com o histológico.
Materiais e Métodos
As amostras de tecidos estudas foram coletadas no
Hospital de Clínicas - UNICAMP, de acordo com as
normas do comitê de ética e pesquisa, L166/CEP2004.
As mesmas foram armazenadas em frascos criogênicos
Nalgene® de 1,2 ml e identificadas, visando a
preservação e manutenção de todas as amostras até o
momento do transporte e análises espectroscópicas. O
estudo foi conduzido no Laboratório de Espectroscopia
Vibracional Biomédica da Universidade do Vale do
Paraíba – São José dos Campos/SP.
Neste estudo foram utilizadas duas amostras, sendo
uma de tecido normal e outra de tecido neoplásico. As
imagens bioquímicas obtidas por FT-IR foram
comparadas com as correspondentes lâminas
histológicas ("padrão ouro"). A análise histológica foi
realizada por um patologista, que as classificaram como
XXII CBEB 2010
sendo uma de tecido neoplásico e outra de tecido
normal. As amostras foram seccionadas com a espessura
de 12µm, utilizando um Criostato modelo CM 1100,
marca LEICA, seguindo os parâmetros adequados do
equipamento.
Os cortes foram realizados alternadamente, sendo
que, a amostra obtida pelo primeiro corte foi colocado
na janela de fluoreto de cálcio (CaF2), para análise no
FT-IR e a segunda amostra obtida pelo segundo corte
foi colocado em uma lâmina histológica. As lâminas
foram coradas utilizando os procedimentos de
hematoxilina e eosina (H&E) e levadas para
confirmação patológica de um especialista. Este
procedimento foi realizado, tendo em vista a
necessidade de uma confirmação confiável das imagens
bioquímicas obtidas pelo equipamento de FT-IR e
atualmente, a histologia é o “padrão ouro” de
diagnóstico.
Para a análise espectroscópica não é necessário
nenhum tratamento prévio das amostras. A janela de
CaF2 serve de porta amostra, pois não possui bandas na
região de interesse. Antes da análise as amostras foram
mantidas em uma sala com baixa umidade por trinta
minutos com a intenção de manter o nivel mais baixo
possivel de água na amostra após a secção.
As imagens bioquímicas foram obtidas em modo de
imagem por transmitância, no intervalo de 4000-900
cm-1, com 32 varreduras por pixel (6,25 µm2) e
resolução de 4 cm-1, através da microespectroscopia FT-
IR utilizando o microscópio de imageamento (Spotlight
400 – Perkin-Elmer) equipado com detector MCT
operando a temperatura do nitrogênio líquido, acoplado
a um espectrômetro FT-IR (Spectrum 400 – Perkin-
Elmer).
Após as medidas das amostras no FT-IR, os dados
foram analisados no programa Cytospec (versão 1.4.02)
para verificação dos espectros da matriz de imagem.
Um parâmetro que deve ser avaliado é a formação de
cluster na amostra. Essa formação consiste na separação
bioquímica que o programa realiza utilizando os
espectros pertencentes a matriz de imagem. Esta
separação é de fundamental importância, a fim de
determinar pequenas alterações bioquímicas entre as
amostras. Antes da análise estatística dos dados foi
executado um pré-tratamento. O primeiro passo foi a
suavização espectral, que tem como objetivo diminuir a
interferência do ruído em cada espectro. Após a
suavização foi feito o cálculo da primeira derivada que
têm a intenção de evidenciar as mínimas diferenças no
espectro. Após a análise das imagens pelo programa
Cytospec e o pré-tratamento, foram obtidos espectros
médios de cada amostra. Esses espectros foram
analisados utilizando-se o programa estatístico OPUS
(versão 4.2, Bruker), com este programa foi possível
visualizar as características de cada espectro e montar o
dendograma.
Para calcular a distância da matriz, os dados foram
analisados estatisticamente através da análise de cluster
onde duas regiões espectrais discriminantes foram
selecionadas: 3000-2800 cm-1 e 940-1500 cm-1. Essas
2/4
regiões foram escolhidas pois apresentam as maiores
diferenças e características podendo diferenciar um
tecido do outro. A região de 3000-2800 cm-1 encontra-
se as bandas de estiramento de lipídeos e proteínas e na
região de 940-1500 cm-1 é conhecida como a região da
impressão digital da amostra, isto é, a região que
demonstra as minimas variações de cada amostra e
assim a melhor caracteriza. Como primeira medida para
análise estatística foi feita a aplicação do coeficiente de
correlação linear de Pearson [11].
Depois de efetua-lo o próximo passo foi calcular a
dimensão do intervalo (Scaling first range) e aplicar o
algoritmo Ward. Este algoritmo agrupa os dados de
forma minimizar a soma das diferenças
(heterogeneidade) entre os elementos de cada amostra,
construindo grupos mais homogêneos [12].
Resultados
A apresentação dos resultados foi dividida em duas
partes. A primeira delas foi a correlação entre a imagem
bioquímica feita por meio da análise de FT-IR, com sua
respectiva lâmina histológica. Assim, foi possível
correlacionar as estruturas morfológicas do cólon com
as alterações bioquímicas ocorridas. A segunda etapa foi
a análise estatística dos espectros, segundo o laudo
histológico, para verificar a possível diferenciação entre
os tecidos normais e neoplásicos.
A Figura 1 mostra a correlação entre a lâmina
histológica de um tecido normal (lado esquerdo) e o
respectivo imageamento bioquímico por FT-IR (lado
direito) desta região, onde a análise de cluster foi feita
utilizando o programa CytoSpec. Nesta imagem é
possível observar uma correlação entre a morfologia e
as mudanças bioquímicas do tecido, onde o tecido
conjuntivo, o tecido epitelial, a secreção glandular e o
tecido inflamado foram separados em clusters distintos
mantendo o mesmo mapa morfológico da lâmina
histológica. Portanto, para além do aspecto morfológico
pode-se dizer que existe diferenças bioquímicas que
caracterizam estes tecidos.
Tecido
Conjuntivo
Secreção
Glandular
Inflamação
Tecido
Epitelial
(a) (b)
Figura 1: Correlação entre (a) lâmina histológica e (b)
imageamento bioquímico e de uma amostra normal.
A Figura 2 mostra o mesmo procedimento, mas
agora para um tecido classificado histologicamente
como neoplásico. Do lado esquerdo a lâmina histológica
XXII CBEB 2010
 e do direito é mostrado o mapa bioquímico, feito através
da análise de cluster. Discussão

Na mucosa colorretal, as células epiteliais formam

Tecido
Conjuntivo
Tecido
Epitelial
(a)
Figura 2: Correlação entre (a) lâmina histológica e (b)
imageamento bioquímico e de um adenocarcinoma
colorretal.
Os mapas bioquímicos mostrados nas Figuras 1 e 2
são exemplos dos resultados obtidos. Entretanto, para
comparar/separar os espectros entre as imagens foi
necessário fazer um espectro médio de cada cluster, ou
seja, para cada grupo representado pelas mudanças de
tom de cinzas foi feito um espectro médio.
Após a análise de imagem, a fim de realizar a
classificação espectral de cada tecido, os espectros
médios foram importados no software OPUS para
análise estatística. O resultado obtido separa os dados
por similaridade utilizando o algoritmo de Ward (que
consiste em clusterizar os dados que tem características
homogêneas) e são apresentados em forma de
dendograma, como mostrado na Figura 3. Observa-se na
Figura 3 uma diferenciação de 100 % entre as imagens
bioquímicas dos tecidos normais e neoplásicos.
Observa-se também que dentro de cada cluster de
amostras classificadas como normais e neoplásicas há
sub-clusters.
C1.0
uma camada de epitélio colunar com arquitetura bem
preservada. Nas criptas (glândulas tubulares), estas
células são organizadas juntamente com outros tipos de
células epiteliais (células goblet, células basais e vários
tipos de células endócrinas diferenciadas). A mucosa da
lâmina própria, as criptas e a mucosa muscular constitui
a membrana mucosa do cólon.
A Figura 1 ilustra uma lâmina histopatológica
representativa do tecido classificado como normal.
(b) Nesta figura, são mostradas as criptas seccionadas com
as células epiteliais (colonócitos), células goblet, a
mucosa da lâmina própria e a substância colóide
secretada pelas glândulas com predomínio de muco e
proteínas, também é ilustrado o tecido conjuntivo, onde
existe um maior predomínio de fibras colágenas do tipo
I e III, além de prolina e hidroxiprolina.
As células do adenocarcinoma colorretal originam-
se de colonócitos transformados, sendo capaz de se
infiltrarem nas camadas subjacentes (submucosa e
muscular) do cólon e do reto. A grande maioria destes
tumores se origina pelo acúmulo de alterações genéticas
que ocorrem em células epiteliais, localizadas na
superfície da mucosa e nas criptas. O adenocarcinoma
exibe sinais morfológicos típicos de malignidade: histo-
arquitetura atípica tais como múltiplas camadas de
células que exibem pleiomorfismo e infiltração da
submucosa.
A Figura 2 ilustra uma lâmina histopatológica
representativa de tecido maligno onde foi realizado o
mesmo método de correlação utilizado com as amostras
normais.
Na análise de correlação das imagens bioquímicas
oferecidas pelo FT-IR e das lâminas histológicas dos
tecidos normais, o resultado observado foi satisfatório,
onde pela análise de FT-IR todas as estruturas e
constituintes do tecido puderam ser discriminadas e
relacionadas à lâmina histológica. Deste modo, a

C2.0

C3.0

N1.0

N4.0

N6.0

N5.0

0
eficácia da técnica de imageamento por infravermelho
pode ser comprovada. Contudo, o mesmo resultado não
5
foi observado na análise de correlação das imagens
1 bioquímicas e das lâminas histológicas dos tecidos
10
neoplásicos. Isto pode ser explicado pela complexidade
Heterogeneity

da histo-arquitetura do tecido tumoral que direciona o

15
imageamento pelo FT-IR, onde as estruturas teciduais
estão alteradas pelo próprio processo neoplásico. Uma
20
explicação adicional, é que a amostra analisada além de
conter componentes de tecido neoplásico poderá conter
25
tecidos normais e tecidos com alterações não
Data Preprocessing: First Derivative
Ward's Algorithm
Correlation with
Frequency Ranges (Weights) =
940 - 1450 /cm (1.0)
neoplásicas, tais como infiltrado inflamatório. Contudo,
Scaling to 1st range 2800 - 3000 /cm (1.0)
Method File = TEMPVIEW.CLA
Date: 26/02/2010
apesar destas implicações, foi possível detectar pelo
imageamento bioquímico estruturas que correspondem à
lâmina histológica, demonstrando assim a
Figura 3: Dendograma de diferenciação dos tecidos potencialidade da técnica.
normais e neoplásicos, demonstrando a separação dos A análise de comparação dos tecidos foi realizada
tipos de tecidos (cluster) e as pequenas variações pela técnica de imageamento para auxiliar na
ocorridas em uma mesma amostra (sub-clusters). identificação dos tecidos de uma maneira mais rápida e

3/4 XXII CBEB 2010

eficaz. A técnica de imageamento por infravermelho é
capaz de distinguir as diferentes estruturas que
constituem a amostra e de determinar com precisão a
partir de um banco de dados qual o tecido que está
sendo analisado.
Antes do início do processo de comparação entre os
tecidos, todos os dados foram tratados pelo coeficente
de Pearson a fim de remover as variações espectrais de
uma mesma amostra, em seguida os dados foram
importados para o programa estatístico OPUS, os dados
passaram pelo o algoritmo de Ward. Observando o
dendograma pudemos notar que a separação foi
completa entre as amostras. Outro ponto a ser analisado
no dendograma é a separação em sub-clusters entre as
amostras de mesmo tipo, isso pode ser devido a
pequenas diferenças bioquímicas entre as mesmas, mas
que não interferem na análise estatística.
Foi excluído locais que não fazem parte das
estruturas morfológicas da amostra, como por exemplo
janela de CaF2, cola (utilizado no processo de corte),
assim como, regiões contendo sinais de inflamações no
tecido, para que essas regiões não possam interferir no
espectro das amostras, na analise dos dados e no
dendograma.
Conclusão
[4] Lash, P., Naumann, D. ( 2006) “Spatial resolution in
infrared microspectroscopic imaging of tissues”.
[5] Sala, O. (1995) “Fundamentos da Espectroscopia
Raman e no Infravermelho”. ED. UNESP/ São Paulo, p.
244.
[6] Maquelin, K., Naumann, D., Puppels, G. J. (2002)
“Identification of medically relevant microorganisms by
vibrational spectroscopy”.
[7] Baldauf, N. A. (2007) “Effect of selective growth
media on the differentiation of Salmonella enterica
serovars by Fourier-Transform Mid-Infrared
Spectroscopy”.
[8] Amiali, N. M. (2007) “Rapid identification of
coagulase-negative staphylococci by Fourier transform
infrared spectroscopy”.
[9] Naumann, D. (2000) “Infrared Spectroscopy in
Microbiology”.
[10] Wartewig, S. (2003) “IR and Raman Spectroscopy:
Fundamental Processing”, Alemanha: Wiley p 171.

Os resultados preliminares apresentados neste estudo [11] Díaz, F. R; López, F. F. B. (2007) “Bioestatisca”,
demonstraram a potencialidade da utilização da técnica Ed.: unica São Paulo: Thomson, p. 57.
de espectroscopia de infravermelho na detecção de
mudanças bioquímicas que ocorrem nas células quando [12] Ward, J. H. (1963) “Hierarchical grouping to
sofrem alterações de um estado normal para alterado. optimize an objective function”, In: Journal of the
Este estudo conseguiu de maneira satisfatória American Statistical Association, v. 58, p. 236-244.
correlacionar também os resultados da imagem de FT-
IR com as estruturas celulares obtidas pela imagem
morfológica. No futuro, pretendemos identificar as
bandas vibracionais que podem ser consideradas como
as mais importantes para realizar este diagnóstico.
Assim, nossos resultados preliminares mostram a
potencialidade desta técnica para uma futura utilização
clínica na análise histopatológica de amostras com
diagnóstico duvidoso.

Agradecimentos

Ao CNPQ pela bolsa de iniciação científica.

Referências

[1] INCA, Ministério da Saúde “Incidência de câncer no

Brasil- Estimativa/ 2010”. Disponível em:
http://www.inca.gov.br/estimativa/2010/ Acesso em 25
mar. 2010.

[2] Krafft, C. (2008) “Raman and FTIR microscopic

imaging of colon tissue: a comparative study”.

[3] Lash, P., Naumann, D., Diem M. (2004) “Imaging of

colorectal adenocarcinoma using FT-IR
microspectroscopy and cluster analysis”.

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