Caracterización de bacterias filamentosas en biorreactores

de estaciones depuradoras del sector petroquímico

A. Zornozaa,b, J.L. Alonsoc, G. Cuestad, A. Solerd
a Grupo Aguas de Valencia. EDAR Quart Benager, EPSAR. Camino de Picaña 16, 46014 Valencia, (E-mail: azornoza@aguasdevalencia.es)
b Asociación Científica Grupo Bioindicación de Sevilla (GBS), EDAR La Ranilla. San José de Palmete s/n, Sevilla 41006. Apdo 7279 (E-mail: grupobioindicacionsevilla@hotmail.com)
c Instituto de Ingeniería del Agua y Medio Ambiente, Universidad Politécnica de Valencia, Camino de Vera 14, 46022 Valencia, (E-mail: jalonso@ihdr.upv.es)
d Área de Microbiología. Departamento de Biotecnología. E. T. S. I. Agrónomos, Universidad Politécnica de Valencia, (E-mail: goncueam@btc.upv.es; alsoher@etsia.upv.es)
* Con la colaboración de las unidades de Protección Ambiental y plantas de CEPSA. Av. Partenón 12 2ª, 28042 Madrid (E-mail: manuel.pacheco@cepsa.com)

Introducción
Los residuos industriales líquidos (RILES) son aguas de desecho generadas en la industria. Estos vertidos plantean, por sus particulares características, una grave problemática para su incorporación a
redes urbanas o su vertido directo, que para ser desechados necesitan ser tratados previamente. El conseguir los niveles de depuración exigibles para las aguas residuales de cualquier comunidad, pasa por
exigir los mecanismos correspondientes de depuración a las estaciones depuradoras de aguas residuales industriales (EDARI). Sus biorreactores se caracterizan por la escasa biodiversidad dentro de la
comunidad de protozoos y metazoos, llegando incluso en muchos casos a estar ausentes. Por el contrario, es frecuente la presencia de bacterias filamentosas adaptadas a las diversas condiciones
ambientales que ofrecen los distintos sectores industriales. Incluso dentro de cada sector, y dado la multitud de procesos y maneras de operar, la diversidad prevalece ofreciendo una fuente importante
de estudio dentro del campo de la taxonomía, ecología y biotecnología. En el sector de refino de petróleo, los contaminantes que llegan a la EDARI varían en función de los crudos que se procesan, de la
complejidad y tipos de procesos de cada planta, la integración y tipo de petroquímica derivada que incorporen, tratamientos específicos de corrientes, etc. Estos están representados de forma general
por: hidrocarburos alifáticos, aromáticos, minerales insolubles, arenas y arcillas, sulfuros, ácidos orgánicos, mercaptanos, fenoles, cresoles, aldehidos, amonio, urea, aminas, tiosulfatos, fluoruros. Los
contaminantes de las plantas petroquímicas son específicos de cada proceso. En la fabricación de fenol-acetona: fenol, cumenos y derivados e intermedios y en la síntesis de aminas: alquilaminas. En la
síntesis de isómeros de ácido ftálico: ácidos, intermedios y derivados. El objetivo de este trabajo es la identificación de bacterias filamentosas presentes en fangos activos de instalaciones depuradoras
dentro de estos sectores, tanto a nivel convencional como utilizando la técnica de hibridación in situ (FISH), así como el asislamiento de actinomicetos nocardioformes.

Materiales y métodos
Se han tomado 24 muestras de biorreactores en 4 estaciones depuradoras de las distintas factorías de la empresa CEPSA: planta de Palos de la Frontera, Guadarranque, refinería la Rábida y Gibraltar-
San Roque. El análisis microscópico convencional de las bacterias filamentosas se ha llevado a cabo siguiendo los criterios descritos en Eikelboom (2000) y Jenkins et al., 2004, tomándose como referencia
la relación de organismos filamentosos en EDARI descritos por Eikelboom (2006). Técnica FISH: Las sondas utilizadas para la identificación de los morfotipos filamentosos y comunidades de bacterias del
flóculo han sido: EUB 338 I, II, III y IV, ALF1b, BET42a, GAM42a, HGC69a y HGC1156, GNSB941 y CFX1223, TM7-905, LGC mix: sondas LGC354A, 354B y 354C, CF319a NLIM mix: sondas 301, ML 792
y 830, MYC657, Mpa-all-1410, MPA645, Mpa-T1-1260, GOR0596, Noli-644; AHW183, Meg 983 y 1028, HHY, HHYall-654, LDI, CHL1851. Las muestras con la sonda de mycolata se trataron con
mutanolisina antes de la hibridación, y las muestras con las sondas de Actinobacteria, Gordonia y Firmicutes se trataron con lisozima antes de la hibridación.
Para el aislamiento de actinomicetos nocardioformes que contienen ácidos micólicos (mycolata) se ha utilizado el medio Czapeck modificado suplementado con ácido nalidixico. Las colonias con morfología
típica y las más abundantes fueron sembradas en el medio ISP-2 para obtener un cultivo puro. El contenido en ácidos micólicos se determinó por cromatografía en capa fina. Las cepas se sembraron en el
medio M9 conteniendo fenol como única fuente de carbono a diferentes concentraciones. Como control positivo se utilizó el medio M9 conteniendo glucosa como fuente de carbono.

Resultados y discusión
Se han descrito 20 bacterias filamentosas que responden a diferentes
características morfológicas y tinciones simples diferenciales (tabla 1). De
manera provisional y para facilitar su manejo han sido nombradas con un
código numérico precedido de unas siglas “CP-XX” (1000x).
Tabla 1: CARACTERISTICAS MORFOLOGICAS Y RESPUESTA A TINCIONES
BACTERIA Morf. Localización del Diámetro Longitud Morf. Ramif Septos Constricc. Crec. Cristal Tinción Tinción Tinción PHA
FILAMENTOSA Tricoma tricoma tricoma tricoma celular Celulares en septos Epifítico Violeta Gram Neisser Neisser
(presencia) (µm) (µm) (vaina) tricoma gránulos

CP-01 CP-02 CP-03 CP-04 CP-05

CP-01 Recto, lig. Extendiéndose Aprox. 1 < 200 Rectangular NO SI NO NO SI - - + NO
(Palos) curvado desde el floc., libre (difícil ver) (difícil ver) (debil)
CP-02 Torcido, curvado Extendiéndose <1 < 200 No se NO NO NO NO NO + - + NO
(Palos) desde el floc., libre observa
CP-03 Torcido, curvado Extendiéndose Aprox. 1 < 200 Oval NO SI SI NO NO + - + NO
(Palos) (irregular) desde el floc., libre (difícil ver) (difícil ver) (fuerte)
CP-04 Micelial Interior >1 < 200 No se SI SI SI NO NO + - - NO
(Palos) observa (fuerte)
CP-05 Recto Extendiéndose <1 < 200 Rectangular NO SI NO NO NO - - - NO
(Palos, desde el flóculo (difícil ver) (difícil ver)
Gibr.,Guad.Rab.)
CP-06 Torcido, curvado Libre, interior Aprox. 1 < 200 Esférica NO SI SI NO NO + - + NO
(Palos) (fuerte)
CP-07 Torcido, curvado Libre, interior >1 < 200 Esférica NO SI SI NO NO - - - NO
(Guadarranque) oval,
discoidal
CP-08 Torcido, curvado Libre, interior >1 < 200 Oval, NO SI SI NO SI - - - NO
(Gibr.,Guad.,Rab.) esférica
CP-09 Recto, torcido, Extendiéndose >1 > 200 Rectangular NO SI NO SI SI - variable - NO
CP-06 CP-07 CP-08 CP-09 CP-10 (Guadarranque) lig. curvado desde el flóculo
CP-10 Recto, curvado Extendiéndose >1 > 200 Cuadrada NO SI NO SI SI - - - SI
(Guadarranque) desde el flóculo (difícil ver) (difícil ver)
CP-11 Recto, torcido, Extendiéndose >1 < 200 Rectangular, NO SI NO SI SI - - + NO
(Gibr., Rab.) lig. curvado desde el flóc. libre cuadrada
CP-12 Recto y curvado Extendiéndose <1 < 200 Rectangular NO SI NO NO SI - - + NO
(Rabida) desde el floc., libre
CP-13 Recto, torcido, Extendiéndose Aprox. 1 < 200 Cuadrada, NO SI NO NO SI - + - SI
(Gibraltar) lig. curvado desde el floc., libre rectangular
CP-14 Recto, torcido, Extendiéndose Aprox. 1 < 200 Bacilar Si SI SI NO SI + - + NO
(Gibraltar) lig. curvado desde el flóculo (falsa)
CP-15 Torcido, curvado, Libre, interior >1 < 200 Oval, SI SI SI NO SI - - - SI
(Gibraltar) enrollado esférica
CP-16 Recto, lig. Extendiéndose >1 < 200 Rectangular NO SI NO SI SI - variable - NO
(Gibraltar) curvado desde el flóculo (difícil ver)
CP-17 Torcido, curvado, Extendiéndose >1 < 200 discoidal NO SI SI NO SI - - - NO
(Gibraltar) enrollado desde el floc., libre
CP-18 Micelial Extendiéndose >1 < 200 No se SI NO NO NO NO + - + NO
CP-11 CP-12 CP-13 CP-14 CP-15 (Gibraltar) desde el floc., libre observa (fuerte) (fuerte)
CP-19 Recto, curvado Extendiéndose <1 < 200 Rectangular NO SI NO SI SI - - - NO
(Gibraltar) desde el flóculo (difícil ver) (difícil ver)
CP-20 Torcido, curvado Extendiéndose < 0,5 < 200 No se NO NO NO NO SI + - - NO
(Gibraltar) desde el floc., libre observa

Con la técnica FISH se han identificado morfotipos filamentosos

CP-16
FISH: CP-18
sonda Myc657 Mycolata, 1.000x
Bacterias en medio Czapeck de
la refineria de la Rábida. Las
colonias naranjas son mycolata
Patrocinadores GBS: COSELA, AGUA Y GESTION-BEFESA, TECNOLOGIA DEL AGUA, DAM, GRUPO AGUAS DE VALENCIA, SURCIS, IZASA y EMASESA
CP-17
FISH: CP-08 Isosphaera sp.
Sonda mix: NLIMIII 301,
NLIMIII 792, NLIMIII 830, 1.000x
Cultivo puro de mycolata de
la refinería de la Rabida en
medio ISP-2
CP-18
FISH: CP-15 Ca.“Monilibacter batavus”
Sonda MC2-649, 1.000x
Bacterias en medio Czapeck
de la refineria de Palos de
la Frontera.
asociándolos a distinto nivel taxonómico con los resultados obtenidos a
nivel convencional. En la planta de Palos de la Frontera las bacterias del
flóculo han correspondido a la clase alfa-Proteobacteria y al phylum
Actinobacteria, encontrandose la clase beta-Proteobacteria muy poco
CP-19 CP-20 representada. En la planta de Guadarranque las comunidades de bacterias
dominantes en el flóculo han sido las beta-Proteobacteria, alfa-
Proteobacteria y phylum Actinobacteria. En la EDAR de la refinería la
Rábida las comunidades bacterianas del flóculo correspondían a las clases
alfa-Proteobacteria, beta-Proteobacteria, gamma-Proteobacteria y al
phylum Actinobacteria. En la EDAR de la refinería de Gibraltar la
comunidad bacteriana dominante ha sido la beta-Proteobacteria, seguida
de alfa-Proteobacteria y gamma-Proteobacteria. Algunos ejemplos de
morfotipos filamentosos identificados con la técnica FISH son el grupo
Mycolata (CP-18), Isosphaera sp. (CP-08), correspondiente al morfotipo
Nostocoida limicola III y que aparece tanto en forma filamentosa como
células aisladas. Otro morfotipo filamentoso identificado ha sido Ca.
“Monilibacter batavus” (CP-15), que aparece ramificado y que también es
un morfotipo N. limicola. Los morfotipos N. limicola I, II y III se asocian
con bajas cargas másicas, déficit de nutrientes (fósforo, nitrógeno) y
niveles bajos de O2 disuelto (Jenkins et al., 1993; Eikelboom, 1983). Sin
FISH: CP-07 embargo, los resultados obtenidos demuestran que pueden corresponder a
Sonda: ALF1b, 1.000x
diferentes especies de bacterias, con características fisiológicas y
ecológicas diferentes. Por tanto, establecer medidas de control de estos
en función solo de sus características morfológicas puede ser arriesgado,
como señalan también otros autores (Liu y Seviour, 2001).
Control Se han obtenido en cultivo puro 18 cepas de actinomicetos de las plantas
positivo con
Fenol 0,1%
glucosa 0,1%
estudiadas. Todas son Gram positivas con morfología que varia desde
formas cocoides, filamentosas y ramificadas. Todas las cepas aisladas
excepto una contenian ácidos micólicos. Esta última fué aislada de la planta
Palos de la Frontera y es la bacteria más abundante. Estudios morfologícos
y de FISH confirman tambien en esta planta la presencia de un organismo
filamentoso similar a M. parvicella (CP-02) que pertenece al phylum
Colonia aislada de la refinería de Palos de Actinobacteria pero que no hibrida con las sondas de Mycolata y M.
la Frontera creciendo en el medio M9 con parvicella. En el mismo bioreactor se ha aislado una cepa que es capaz de
fenol como única fuente de carbono
crecer utilizando fenol como única fuente de carbono.