Introducción

¿Qué es un medio de cultivo?

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de

microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias
artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que
crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los
microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de 10.000 medios de
cultivo diferentes.

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe
reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión
de oxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de
cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar
exento de todo microorganismo contaminante.

La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en

composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos
medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán
otros ingredientes.

El Agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación

de medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del
agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas
excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no
es atacado por aquellas que crecen en él.

La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos

ya que bastantes bacterias provocan su licuación.

En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de

enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los
hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el
valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los
microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden
para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes.

También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por
ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y
no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH básico y
amarillo en pH ácido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el
crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram-positivas).

Condiciones generales para el cultivo de microorganismos: El desarrollo adecuado de

los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores
de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio
medio.

1- disponibilidad de nutrientes adecuados

Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de contener,

como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos
casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento.
Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o
captadores de electrones para las reacciones químicas que tengan lugar.

Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de

carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparación de
estas sustancias para su aplicación a los medios de cultivo provocaba la pérdida de los
factores nutritivos lábiles.

Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios es

utilizar peptona que, además, representa una fuente fácilmente asequible de nitrógeno
y carbón ya que la mayoría de los microorganismos, que no suelen utilizar
directamente las proteínas naturales, tienen capacidad de atacar los aminoácidos y
otros compuestos más simples de nitrógeno presentes en la peptona.

Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas específicas por lo que se añade a

muchos medios, sustancias como suero, sangre, líquido ascítico, etc. Igualmente
pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio,
magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento,
generalmente de naturaleza vitamínica.

Muy a menudo se añaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como indicadores
de ciertas actividades metabólicas o bien por sus capacidades de ejercer de inhibidores
selectivos de ciertos microorganismos.
2- consistencia adecuada del medio

Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo productos

como albúmina, gelatina o Agar, con lo que obtendríamos medios en estado semisólido
o sólido.

Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos
microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto
de fusión de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla.

Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad,
pero hay también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está ampliamente
extendido en el laboratorio.

3- presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases

Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno
normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados sustratos. Pero
los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en una
atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos
microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas parcialmente anaerobias
(tensión de oxígeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un
metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones.

4- condiciones adecuadas de humedad

Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es

imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en los
cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas
de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la
humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el
medio.

5- Luz ambiental

La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en

presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los
microorganismos fotosintéticos.
6- pH

La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los

microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH
neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos. No se debe olvidar
que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento
bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metabólicos
normales.

7- Temperatura

Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15 y

43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0ºC y los temófilos a 80ºC o incluso a
temperaturas superiores (hipertemófilos). En líneas generales, los patógenos humanos
crecen en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor de 37ºC, y los
saprofítos tienen rangos más amplios.

8- Esterilidad del medio

Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la
aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el
crecimiento microbiano normal del o de los especímenes inoculados en dichos medios.
El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza
vapor de agua a presión como agente esterilizante)

¿Qué es la tinción de gram?

La tinción de Gram es un tipo de tinción

diferencial empleado en microbiología para la
visualización de bacterias, sobre todo en
muestras clínicas. Debe su nombre al
bacteriólogo danés Christian Gram, que
desarrolló la técnica en 1884.

Se utiliza tanto para poder referirse a la

morfología celular bacteriana como para poder
realizar una primera aproximación a la
diferenciación bacteriana, considerándose
Bacteria Gram positiva a las bacterias que se
visualizan de color violeta y Bacteria Gram
negativa a las que se visualizan de color rosa.
El cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas (tanto
Gram positivas como Gram negativas).

El lugol está formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual
está presente para solubilizar el yodo. El I2 entra en las células y forma un complejo
insoluble en solución acuosa con el cristal violeta.

La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloración, ya que

en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no
se decoloran, mientras que los Gram negativos sí lo hacen.

Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de
contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina.
Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras
que las Gram positivas permanecen azules.

La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la técnica. Sirve para hacer una
tinción de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al término
del protocolo, las Gram positivas se verán azul-violáceas y las Gram negativas, se
verán rosas (si no se hizo la tinción de contraste) o rojas (si se usó, por ejemplo,
safranina)

Causas que alteran la tinción de Gram

• I: Edad de la bacteria.
• II: Errores del operador.
• III: Uso de antibióticos

A pesar de la gran utilidad del la tinción de Gram, este método debe ser valorado con
precaución, ya que la reacción puede variar según la edad de las células y la técnica
empleada, por ella junto a la muestra deben teñirse controles con grampositivas y
gramnegativas

¿Qué es el exudado faríngeo?

El exudado faríngeo es la toma de muestra que se realiza en el

fondo de la garganta (en las amígdalas, generalmente), mediante
el uso de un hisopo estéril. Sirve como herramienta de
diagnóstico de padecimientos de origen bacteriano.

El hisopo se introduce y se dan vueltas sobre la muestra a fin de

que todo éste quede impregnado. Se prosigue a sembrar en
medios de cultivo, tomando como los más nutritivos Agar sangre
y Agar chocolate, se pueden usar también el Macconkey, entre
otros. Después se procede a incubar a 37ºC y observar resultados
en 48 horas
¿Qué tipos de medio de cultivo existen?

Medio Mio:

1. Preparar 47 cajas con volumen de 20 ml

Disolver 29.14 g del polvo deshidratado en 940

ml de agua purificada para 47 cajas petri.
Calentar hasta disolver completamente y colocar
en tubos de 13X100 con taparrosca esterilizada,
esterilizar a 121°C de presión durante 15 minutos

2.

Extracto de carne……………………………..1.0g

Peptona de carne……………………………..5.0g

Peptona de caseína………………………..…5.0g

NaCl…………………………………………………..75.0g

D-manitol…………………………………………..10.0g

Agar……………………………………………………15.0g

Rojo de fenol……………………………………..0.025g

pH final 7.4 ±0.02

Fuente de carbono:

D-manitol

Fuentes de nitrógeno:

Peptona de carne

Peptona de caseína

Indicador:
 Rojo de fenol

3. Clasificación:

Selectivo/Diferencial

Sirve para pruebas bioquímicas

Agar de Mueller Hinton:

1. Preparar 47 cajas con volumen de 20 ml

Disolver 35.72 g del polvo deshidratado en 940 ml

de agua purificada para 47 cajas petri. Mezclar
perfectamente, calentar agitándolo
frecuentemente y hervir durante 1 minuto hasta
disolución. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos.
Enfriar a 40-50°C y si se desea puede prepararse
placas o tubos de Agar chocolate, agregar sangre
estéril. La mezcla con sangre debe achocolatarse
a 80°C durante 10 minutos. No sobrecalentar.

Determinar la funcionalidad del cultivo con

2. Fuente de carbono:

Almidón

Fuentes de nitrógeno:

Extracto de carne

Peptona de caseína acida

Indicador:

No presenta

3. Clasificación:

Enriquecido
 Es recomendado para pruebas de sensibilidad, antibióticos y cultivo Neisseria

Agar sangre y manitol

1. Preparar 47 cajas con volumen de 20 ml

Disolver 104.34 g del polvo deshidratado en 940

ml de agua purificada para 47 cajas petri. Mezclar
perfectamente, calentar agitándolo
frecuentemente y hervir durante 1 minuto hasta
disolución completa, esterilizar a 121°C durante
2. Fuente de carbono:

D-manitol

Fuentes de nitrógeno:

Peptona de carne

Peptona de caseína

Extracto de carne

Indicador:

Rojo de fenol

3. Clasificación:

Selectivo
 Se emplea para aislar estafilococos patógenos de materiales clínicos diversos
(orina, genitales, heridas, exudados faríngeos, etc.).También en la industria
alimenticia con los mismos fines.

Agar Mac Conkey

1. Preparar 47 cajas con volumen de 20 ml

Disolver 47 g del polvo deshidratado en 940 ml de

agua purificada para 47 cajas petri. Mezclar
perfectamente, calentar agitándolo
frecuentemente y hervir durante 1 minuto hasta
disolución. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos.

Determinar la funcionalidad del cultivo con

microorganismos típicos.
2.

Peptona de caseína………………..1.41g

Peptona de gelatina……………….15.98g

Peptona de carne……………………1.41g

Lactosa……………………………………9.4g

Sales biliares……………………………1.91g

NaCl………………………………………..4.7g

Agar…………………………………………12.69g
 Rojo neutro…………………………….0.028g

Cristal violeta…………………………..0.00094g

pH final 7.1±0.02

Fuente de carbono:

Lactosa

Fuentes de nitrógeno:

Peptona de carne

Peptona de caseína

Peptona de gelatina

Indicador:

Rojo neutro

3. Clasificación:

Selectivo/diferencial

En ellas crecen gram negativas, se emplea para aislar e identificar enterobacterias

y coliformes a partir de heces fecales, orina, aguas negras y diversos alimentos.
Conservar cerrado de 2-30°C

Base Agar sangre

1.
Disolver 37.6 g del polvo deshidratado en 940 ml
de agua purificada para 47 cajas petri. Mezclar
perfectamente, calentar agitándolo
frecuentemente y hervir durante 1 minuto hasta
disolución. Distribuir y esterilizar a 121°C durante
15 minutos.

Para la preparación de placas con sangre, enfriar

la base de 40-50°C y adiciona 57°C de sangre
estéril desfibrado.
 2. Fuente de carbono:

Extracto de levadura

Fuentes de nitrógeno:

Infusión de musculo cardiaco

Peptona de caseína

Indicador:

No presenta

3. Clasificación:

Enriquecido

Sirve de cultivo y actividad hematica de gérmenes

Agar de hierro y triple azúcar

 1.
Disolver 55.38 g del polvo deshidratado en 940 ml
de agua purificada para 47 cajas petri. Mezclar
perfectamente, calentar agitándolo
frecuentemente y hervir durante 1 minuto hasta
disolución. Distribuir y esterilizar a 118°C durante
15 minutos. Enfriar en posición inclinada

2. Fuente de carbono:

Sacarosa

Dextrosa

Fuentes de nitrógeno:

Peptona de carne

Peptona de caseína

Indicador:

Rojo de fenol

3. Clasificación:

Diferencial
¿Cual es la catalasa y cual es la coagulasa?

Permite separar Staphilococcus aureus, que produce la enzima

coagulasa, de las otras especies de estafilococos que se denominan
coagulasa negativos.

Fundamento: Staphilococcus aureus posee dos tipos de coagulasa:

* Una endocoagulasa o coagulasa ligada o
"clumping factor" que está unida a la pared celular. Esta
actúa directamente sobre el fibrinógeno provocando la
formación de coágulos cuando se mezcla una
suspensión bacteriana con plasma citratado u oxalatado, la velocidad de
coagulacion es directamente proporcional a la concentración enzimatica.

Técnica: varía según la coagulasa investigada.

- coagulasa ligada (en portaobjetos)
en una gota de solución fisiológica emulsionar una suspensión de
Staphilococcus y agregarle una ansada de plasma citratado mezclando
suavemente. Leer.

**Resultados: positivo: EN PORTA. Positivo: aglutinación entre 20.30 seg

(cepa staph.aureus virulenta); Dudoso: aglutinación e/20 seg a 1 min
(cepa staph.aureus virulenta).negativo: suspensión homogénea.

EN TUBO. Positivo: coagulo total. Parcial: cualquier grado de coagulacion

negativo: suspensión homogénea (staph epidermidis u otro organismo.

PRUEBA DE LA CATALASA:
Fundamento: la enzima catalasa se encuentra en la mayor parte de las
bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo
(excepto el estreptococos) generalmente las bacterias que carecen de
citocromo también carecen de catalasa, lo que les impide descomponer
el peróxido de hidrogeno o mejor conocido como agua oxigenada.
La catalasa descompone el peróxido de hidrógeno (H2O2) en agua y
oxígeno bajo la fórmula 2 H2O2-->2 H2O + O2. De esta manera las
bacterias se protegen del efecto tóxico del H2O2, que es un producto
final del metabolismo aerobio de los azúcares.
Tenica: Se coloca una gota de H2O2 al 30% sobre un portaobjetos y
luego se transfiere una porción de colonia sobre el H2O2 realizándose
una emulsión. En lo posible debe tomarse la colonia a partir de un medio
sin sangre ya que los eritrocitos tienen actividad de catalasa y pueden
falsear los resultados. (Falso positivo) Esta prueba también puede
realizarse en un aislamiento en tubo, simplemente colocando unas gotas
de H2O2
dentro del mismo.
Resultados: positivo: producción de burbujas (por liberación de oxigeno)

Negativo: no se producen burbujas

 Equipo, material y reactivos

Cantidad Material Imagen

1 Agitador de vidrio

47 Cajas petri

1 Asa de cultivo

2 Matraz erlenmeyer

3 Mecheros de Bunsen

1 Parrilla

1 Probeta
1 Espátula

1 Holder

1 Ligadura

1 Par guantes de asbesto

- Torundas

1 Aguja

4 Tubos vacutainer

1 Hisopo
1 Abatelenguas

1 Par de guantes de látex

1 Cubrebocas

1 Vidrio de reloj

1 Puente de tinción

1 pizeta

1 Portaobjetos
1 Marcador de cera

1 Aplicador de madera

Cantidad Equipo Imagen

1 Balanza granataria

1 Autoclave
1 Estufa bacteriológica

1 Centrifuga

Cantidad Equipo Imagen

37.06 g Aguar sangre o gelosa sangre

940 ml Agua destilada

1 Yodo lugol
1 Alcohol cetona

1 Safranina

1 plasma

1 Peróxido de hidrogeno (agua oxigenada)

- Benzal

Procedimiento

1. Ponerse la bata

2. Desinfectar el área de trabajo

3. Solicitar material y equipo

4. Nivelar la balanza granataria

5. Pesar el matraz Erlenmeyer y agregar el agar

6. Bajar el matraz de la balanza y agregar agua con la probeta

7. Disolver la mezcla con agitador de vidrio

8. Colocarlo al fuego para obtener la disolución

9. Dividir la mezcla del matraz erlenmeyer, uno de ellos, es tapado con

algodón

10. Meter los matraces en el autoclave previamente calentado

11. Cerrar el autoclave y esperar a que alcance los 121°C durante 15 minutos

12. Enfriar el autoclave con agua fría

13. Abrir el autoclave y sacar los matraces con los guantes de asbesto

14. Enfriar los matraces

15. Prender un mechero de Bunsen para tener un área de 40cm de protección

16. Destapar el matraz que tenia el algodón

17. Realizar la toma de muestra sanguínea con el sistema vacutainer y obtener

4 tubos de sangre:

a) Se localiza la vena a puncionar

b) Se prepara el holder y la aguja

c) Ponemos la ligadura a aproximadamente 15 cm arriba de donde vamos a
puncionar

d) Desinfectamos el área con una torunda al 70%

e) Introducimos la aguja con el bisel hacia arriba y enseguida colocamos

los tubos vacutainer

f) Acabados los tubos, desligamos y retiramos la aguja

 g) Inmediatamente, ponemos una torunda en el área que puncionamos y
pedimos al paciente que doble el brazo para detener la torunda

18. Agregar la sangre al Agar y mezclarlo perfectamente

19. Colocarlo en las cajas petri y en caso de presencia de burbujas, deshacemos

las burbujas pasando la caja petri por encima del mechero

20. Cerrar las cajas petri y meterlas al refrigerador durante 24 hrs

21. Pasando las 24 horas, se realiza un exudado faríngeo para cultivarlo en el
Agar sangre por medio de la técnica de estría cruzada y a partir de eso, se
deja 24 horas en la estufa bacteriológica.

a) El técnico se coloca guantes de látex y Cubrebocas

b) Realiza la toma de la faringe, o amígdalas, nunca de las paredes bucales

c) Con ayuda del abatelenguas, bajamos la lengua, obteniendo paso a la
faringe

d) Introducir el hisopo hasta chocar con faringe o donde se encuentren las

partes blanquecinas y raspar, retiramos y realizamos nuestra siembra por
la técnica de estría cruzada en nuestro Agar sangre

22. Pasando las 24 horas, se observa y escribe las características morfológicas

de la(s) colonia(s)

23. Después de nuestra observación, realizamos una tinción de gram

a) Con ayuda del asa bacteriológica, raspamos nuestro cultivo, y lo ponemos
sobre una gota de agua que se encontrara en un portaobjetos previamente
marcado con el marcador de cera

b) Una vez secado, se realiza la fijación de esta en la flama azul de un mechero

de bunsen

c) Se agrega cristal violeta durante 1’ y enjuagamos con agua

d) Se agrega yodo lugol durante 1’ y enjuagamos con agua

e) Decoloramos con alcohol cetona por goteo durante 10-20’’ y enjuagamos
con agua

f) Se agrega safranina durante 1’ y enjuagamos con agua

24. Se deja secar, se envuelve en una hoja de papel y se rotula

25. pasadas algunas horas y totalmente seco nuestro portaobjetos y

observamos al microscopio
26. hacer nuestro reporte según nuestros cocos gram observados

27. para realizar la catalasa se necesita:

a) un portaobjetos desinfectado

b) dejamos caer una gota de agua oxigenada en el portaobjetos seco y

desinfectado

c) con ayuda de un aplicador de madera, ponemos una pequeña porción de

bacterias sobre el agua oxigenada y observamos la reacción que tiene el
uno sobre el otro
 d) escribimos nuestro resultado y anotamos si fue negativo o positivo

28. para realizar la coagulasa se necesita

a) un portaobjetos seco y desinfectado

b) obtenemos el plasma de la sangre en tubos vacutainer con tapa color azul

sea que contenga citrato para separar el suero de la sangre

c) el tubo se debe meter a la centrifuga para mejor y mas rápida separación de

plasma y sangre
d) en el portaobjetos, ponemos una gota de plasma y con un aplicador de
madera limpio, ponemos una pequeña porción de nuestro cultivo

e) movemos de un lado a otro nuestro portaobjetos por 4 minutos y

observamos

f) reportamos nuestros resultados