Documenti di Didattica
Documenti di Professioni
Documenti di Cultura
GUÍA Nº 2:
MICROSCOPIA I
INTRODUCCIÓN
Las células son las unidades básicas de los seres vivos. La mayoría de ellas son de pequeño
tamaño por lo que es indispensable el uso de instrumentos como los microscopios para su
visualización. Por lo general el poder resolutivo del ojo humano es de 0.2mm (200 µm), o
sea la menor distancia vista o resuelta por el ojo humano es de dos líneas separadas 1mm de
distancia; si hay dos líneas a 200 µm de distancia, veremos una sola línea. Los
microscopios se utilizan para mejorar la resolución.
El término célula fue usado por primera vez cuando Robert Hooke observó un trozo de
corcho en un microscopio de luz en 1665. Luego, Antony van Leeuwenhoek observó en
1670 varios tipos de células y finalmente, fue en 1838 cuando Matthias Schleiden y
Theodor Schwann propusieron a partir de sus observaciones microscópicas de diversos
tejidos la teoría celular “Todos los organismos están compuestos de células, y todas las
células provienen de la división de otras células preexistentes”. Estos descubrimientos
dieron así origen al nacimiento de la biología celular contemporánea.
Las células son muy pequeñas y además son traslúcidas lo que hace imposible su
observación por ojo humano desnudo. Es por eso que el microscopio ha sido, y es una de
las herramientas más utilizadas en biología. El progreso en la construcción de nuevos
microscopios, así como el desarrollo y uso de nuevos métodos de fijación, corte y tinción
han permitido una serie de descubrimientos en los campos de la histología, citología y
bacteriología, permitiéndonos entender cada vez con más claridad la estructura de la célula
y su organización, lo que es una importante ayuda para la comprensión de su
funcionamiento.
El sistema óptico se compone de 2 sistemas diferentes de lentes. Los oculares son 2 lentes
separados por un diafragma fijo, tienen la función de aumentar la imagen proyectada por
los objetivos. Los objetivos son 3 ó 4 lentes ubicados en el revólver, son los que aumentan
la imagen y pueden ser secos (entre ellos y la muestra hay una capa de aire) o de inmersión
(entre ellos y la muestra se coloca una sustancia especial que permite lograr un aumento
mayor).
La luz posee una naturaleza dual, y puede ser entendida al mismo tiempo como una
partícula y como una onda. La comprensión de este comportamiento, así como de algunas
características de la luz, es importante para entender el proceso de formación de la imagen
en un microscopio, y cómo manejando ciertos parámetros físicos podemos obtener
imágenes más nítidas y de mayores aumentos.
La luz posee una determinada longitud de onda y viaja en el espacio con una determinada
velocidad. Cuando la luz llega a una superficie que separa dos medios transparentes una
parte de ella se refleja volviendo por el mismo medio en que se propagaba, y otra parte en
cambio es refractada, penetra en el segundo medio y cambia su dirección y velocidad. Esto
ocurre cuando la luz llega por ejemplo a una lente. Si ésta es convergente, los rayos se
juntan en un punto, el que corresponde al foco, la distancia entre ese punto y el centro de la
lente es la llamada distancia focal.
Como ya vimos, la velocidad de la luz es diferente en el vacío que en otros medios. Esta
diferencia de velocidad puede compararse mediante el índice de refracción, que
corresponde al cociente entre la velocidad de la luz en el vacío y la velocidad de la luz en
un medio determinado en el que ésta incide.
Mientras más se acerca un objeto al ojo, más detalles de él pueden ser distinguidos, pero
hay una distancia límite a la que se pueden acercar los objetos, y sobre esa distancia, ya no
se distinguen los objetos con claridad, y se hace necesario el uso de lentes o lupas para
aumentar el objeto en estudio. El aumento de una lente está dado por el límite de cercanía a
la que pueden llevar los objetos en el ojo humano y por su distancia focal. Si se quiere
aumentar aún más una imagen, se pueden colocar dos lentes en serie (objetivo y ocular en
el caso de los microscopios compuestos), y el aumento final logrado será entonces el
producto del aumento de cada uno de ellos.
Si tiene en un microscopio un objeto a observar, los rayos de luz reflejados o emitidos por
el objeto que se sitúa fuera de la distancia focal de un lente (objetivo) al pasar por el objeto
son refractados y enfocados en un plano que se ubica más allá de la cara opuesta de la lente
obteniéndose una imagen real que es invertida y de tamaño distinto (mayor) al del objeto
original. A medida que el objeto se acerca al foco la imagen obtenida es más grande.
Lente
Plano focal
¾ Poder de resolución: Permite distinguir como objetos separados dos puntos que se
encuentran muy cercanos entre sí.
USO DEL MICROSCOPIO
Para un buen uso del microscopio sea cuidadoso y siga atentamente las siguientes
instrucciones:
Las preparaciones permanentes son aquellas que se han sometido a un proceso largo de
preparación, el que permite que se mantengan en buenas condiciones para su observación
por periodos prolongados de tiempo. La preparación de estas muestras incluye etapas de
fijación del material, deshidratación, inclusión en parafina, corte de la muestra en capas
muy finas con un micrótomo, colocación de estas capas que contienen la muestra en un
portaobjetos, disolución de la parafina, tinción de la muestra para contrastar las diferentes
estructuras celulares y colocación de un cubre objetos para proteger la preparación.
Las preparaciones temporales corresponden a cortes frescos del material a observar, los que
se realizan en el momento y tienen una corta duración. Una vez realizados los cortes, se
coloca una gota de agua en un portaobjetos, y en ella se ubica un trozo del material a
observar, el que debe quedar completamente cubierto por el agua. Sobre esta preparación se
coloca cuidadosamente un cubreobjeto, evitando la formación de burbujas que interfieren
en la observación microscópica. Finalmente, se elimina exceso de agua, y la preparación
puede teñirse para ser observada.
La citoquímica corresponde a los métodos químicos y físicos por los cuales se logra la
visualización directa de diferentes substancias celulares a través del microscopio.
Generalmente se usan diferentes colorantes que tiñen lípidos, proteínas, carbohidratos o
ADN, o sustratos de enzimas específicas que permiten localizarlas en un sitio celular
específico. Algunos ejemplos son:
Las imágenes logradas en este tipo de microscopio son siempre en blanco y negro, y las
zonas más oscuras corresponden a zonas de mayor densidad electrónica en la muestra. Su
poder de resolución es del orden de 4 Aº, y permite lograr aumentos de hasta 1.000.000 de
veces. Sin embargo, una desventaja es que se necesitan cortes extremadamente finos, y las
muestras deben someterse a procesos de preparación (deshidratación) antes de ser
colocadas al vacío para ser observadas.
Poder de resolución = NA
0,61 * λ
Teniendo claros estos conceptos, podemos comenzar el estudio de los componentes del
microscopio, para llegar a calcular el aumento de las imágenes y la distancia mínima que
podemos llegar a distinguir al realizar una observación en un microscopio compuesto.
2. Anote el poder de aumento y apertura numérica de los lentes objetivos. Estos valores se
encuentran en la parte cilíndrica o “cañón” de los lentes.
Aumento (X) Apertura Numérica (NA)
La apertura numérica efectiva máxima es el valor más bajo de los anteriores. Utilizando
este valor menor de apertura numérica de trabajo, calcule el límite de resolución y la
resolución de su microscopio asumiendo un λ=400 nm, correspondiente a la luz visible.
ACTIVDAD Nº 2: Manejo del microscopio.
Procedimientos y observaciones
1. Utilizando el lente objetivo 10x observe la preparación con una letra impresa con tinta
sobre papel que le será entregada. Tenga presentes las instrucciones para el manejo
correcto del microscopio que se encuentran en la Introducción de la presente guía.
3. Rote el revólver portaobjetivo hasta llegar al lente 40x y colóquelo en posición. Centre
y enfoque la preparación con la letra. ¿Hay algún cambio en la orientación de la letra?
Uno de los métodos más utilizados para realizar preparaciones permanentes consiste en
fijar el material de interés en una solución FAA (formaldehído-alcohol- ácido acético),
concentración (entre 50 y 100%) y finalmente embeberlo en parafina para obtener bloques
que puedan ser cortados en secciones muy finas utilizando un micrómetro. Estas secciones
que contienen material fijado y desecado se colocan cuidadosamente en un portaobjetos, y
se disuelve la parafina con un solvente orgánico como xilol. Una vez hecho esto, la muestra
se tiñe para contrarrestar las distintas estructuras celulares y se protege con un cubreobjeto
montado sobre una sustancia sellante.
Procedimientos y observaciones
Observaciones microscópicas de las preparaciones biológicas: Corte de Intestino de
Rattus norvegicus (Berkenhout), Tejido Hepático (hepatocitos) de Rattus norvegicus
(Berkenhout) y Frotis de Sangre Humana.
1. Observar cada una de las preparaciones entregadas por su profesor y realice un dibujo
teniendo presente las siguientes recomendaciones:
2. Los dibujos deben realizarse siempre a lápiz mina, evitando borrones y colores oscuros.
La utilización de lápices de colores es opcional, pero el colorear su dibujo le puede
ayudar a diferenciar con mayor claridad las estructuras observadas.
3. Realice un dibujo simple o esquemático, pero lo suficientemente grande como para
mostrar todos los detalles importantes.
4. Trate de mantener una escala apropiada al tamaño de las estructuras observadas.
5. Acompañe su dibujo de notas explicativas, escritas en forma ordenada, clara y breve. Si
lo desea, anote los nombres de las estructuras identificadas en su observación.
6. Indique siempre el aumento con que está observando su preparación. Ej: 10X10 o
100X.
La carga neta de las moléculas es la que determina con qué tipo de colorante reacciona, y es
lo que permite realizar tinciones específicas para distintos tipos de moléculas y estructuras
celulares.
Procedimientos y observaciones
1. Tome el trozo de cebolla que le ha sido entregado, y con una hoja de gillette limpia
realice un pequeño corte en forma transversal al tejido. Levante cuidadosamente el
epitelio de la cebolla y tire de él hasta obtener un trozo adecuado de tejido que le
permita realizar una buena observación microscópica. Si el trozo que usted cortó es
demasiado grande, córtelo para darle un tamaño adecuado.
2. Coloque una gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio, utilizando una pipeta
Pasteur con gotario o una piceta.
3. Sobre la gota ubique un trozo de catáfilo de cebolla de tamaño adecuado para que pueda
ser cubierto posteriormente por el cubreobjetos. Su muestra debe quedar completamente
cubierta por el agua.