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UNIVERSIDADE ESTÁCIO DE SÁ

CURSO DE MEDICINA

Roteiro de Práticas (Protocolos),


Estudos Dirigidos e Casos Clínicos

BIOQUÍMICA MÉDICA

Docentes: Frederico Medeiros


Tania Mouço
NORMAS DE BIOSSEGURANÇA
Normas de conduta no Laboratório:

• O uso do jaleco (ou guarda-pó) é obrigatório nas dependências do laboratório;


• Todos deverão estar calçados com sapatos fechados;
• Os cabelos deverão estar presos (cuidado no uso da chama);
• Não comer, beber ou fumar dentro do laboratório;
• Não manter frascos sem identificação nas estantes, bancadas, geladeiras ou estufas;
• Não pipetar material (tóxico, infeccioso ou não) com a boca. A pipetagem deverá
sempre ser realizada com o auxílio de pipetadores;
• Descartar todo o material contaminado em recipientes apropriados;
• Limpar a bancada de trabalho, antes e após cada sessão;
• Conhecer a localização exata e saber como usar o chuveiro e o extintor de incêndio;

• LAVAR AS MÃOS com freqüência com água corrente, utilizando detergente ou


antisséptico, especialmente antes e após o trabalho laboratorial;
• Não lançar fósforos acesos nos locais destinados à coleta de lixo;
• Não manipular substâncias inflamáveis (álcool, éter, etc.) nas proximidades de uma
chama ou resistência incandescente;
• Nunca cheirar diretamente uma substância. Ventilar antes com a mão para diluir
seus vapores;
• Ao manipular substâncias voláteis agressivas, fazê-lo na capela. Ex: ácido clorídrico,
ácido nítrico, amônia; entre outras.
• Não trocar as tampas dos reagentes.

VIDRARIAS: IDENTIFICAÇÃO E FUNÇÃO


• Tubo de ensaio: pesagem, dissolução de sólidos, mistura de soluções, aquecimento;
• Becher: pesagem, aquecimento e dissolução de sólidos;
• Erlenmeyers: para dissolução de sólidos e titulações de reações químicas;
• Balão de fundo chato: dissolução de sólidos com aquecimento;
• Tela de amianto: aquecimento homogêneo;
• Bico de Bunsen: obtenção de chama;
• Provetas: medir volumes. 0,5% de precisão;
• Micro-pipetas: medida, com exatidão, de pequenos volumes.


OBS. Para serem submetidas ao aquecimento as vidrarias precisam ser Pirex .
PROTOCOLO I

Caracterização das propriedades físico-químicas das proteínas

As proteínas estão entre as biomoléculas de maior quantidade presente nos


organismos vivos. A variação das propriedades entre os aminoácidos que formam a
estrutura primária é um dos principais responsáveis pelo tipo de estrutura espacial que essa
proteína vai adquirir. Como já foi visto, as estruturas que formam as proteínas, com
exceção da primária, são realizadas por alguns tipos de ligações não covalentes.

Objetivo:
Observar os efeitos de agentes hábeis em modificar as interações não covalentes que
ocorrem entre os resíduos de aminoácidos que compõem duas proteínas. Para isso, será
utilizada a albumina, que sofrerá tratamentos, nos quais onde será observado seu efeito.
Tipos de tratamentos utilizados:
- Alteração de pH
- Modificação na temperatura
- Solventes orgânicos
- Altas concentrações de sais.

Procedimento:
Fazer as adições necessárias, em cada tubo, como indicado na tabela.
Observar as amostras contra a luz, centrifugar durante 3 min. a 3000rpm. Desprezar
o sobrenadante e adicionar 2,0 ml de tampão PBS pH 7,4. Agitar e observar novamente os
tubos contra a luz.

Tratamentos Tubo com Albumina


Adicionar 2,0 ml de TCA 10% 1) 2,0ml
Ferver durante 10min 2) 3,0 ml
2,0 ml Sulfato de amônio 80% 3) 2,0ml
2,0 ml acetona 4) 2,0ml

Questões:
1) Quais foram os resultados obtidos nos tubos de ensaio durante os diferentes
tratamentos que as proteínas foram submetidas? Explique.
2) Qual a importância do tampão adicionado aos tubos de ensaio após se descartar o
sobrenadante?
3) Em qual tubo é possível recuperar a atividade biológica da proteína. Explique.
PROTOCOLO II

Fatores que interferem numa reaçào enzimatica


(Reação da Glicose Oxidase)

A determinação da concentração de glicose no plasma sanguíneo é um importante


ferramenta para o auxílio no diagnóstico de importantes patologias, com a diabetes. O
método se baseia em reações enzimáticas, através principalmente da enzima glicose
oxidase, que convertem cada molécula de glicose encontrada em uma amostra de sangue
em um cromógeno vermelho, possibilitando a quantificação através da espectrofotometria.
Neste trabalho analisaremos, qualitativamente, o papel exercido pelo pH, temperatura e,
principalmente, da concentração do substrato nessa reação enzimática, analisando a
coloração dos tubos após a reação ter sido realizada.

AGUARDE INSTRUÇÕES PARA INICIAR.

TODOS OS TUBOS DEVEM SER AGITADOS APÓS A COLOCAÇÃO DOS REAGENTES.


Sempre anote a temperatura.

Objetivo: Medir a atividade da enzima glicose oxidase na presença de crescentes


concentrações de substrato e com variações de temperatura e pH.

MATERIAL

1. Reagente de Uso (E) : Enzima glicose oxidade e peroxidase em tampão fosfato pH


7,4;
2. Substrato (S): Solução de glicose 50ug/mL;
3. Tampão A (TA): acetato/ác. acético 0,5M pH 3,5;
4. Tampão B (TB): fosfato 0,5M pH 7,4
5. Tampão C (TC): borato/ác. bórico 0,5M pH 10,5
6. NaOH 2M.

NOTAS:

1. Procure colocar em gráficos as observações colhidas.


2. A glicose deve ser a última a ser colocada em cada tubo.

A) INFLUÊNCIA DO pH

REAGENTES 1 2 3
Reagente de Uso 1 mL 1 mL 1 mL
(Enz.)
Tampão A 1 mL - -
Tampão B - 1 mL -
Tampão C - - 1 mL
Substrato (Glicose) 100 µL 100 µL 100 µL
(microlitros)

Agite levemente. Coloque em banho-maria 37ºC por 10 min. Marque o tempo a partir da
adição da glicose. Após 8 min, observe a coloração dos tubos.
B) INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO

REAGENTES 4 5 6 7 8 9
Reagente de Uso 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
(Enz.)
Tampão B (fosfato) 500 µL 450 µL 400 µL 300 µL 200 µL -
q.s.p.
Substrato (Glicose) 20 µL 50 µL 100 µL 200 µL 300 µL 500 µL

Agite levemente. Coloque em banho-maria 37ºC por 10 min. Marque o tempo a partir da
adição da glicose. Após 8 min, observe.

C) INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA

REAGENTES 10 11 12
Reagente de Uso (Enz.) 1 mL 1 mL 1 mL
COLOQUE OS TUBOS NAS
SEGUINTES 4ºC 37ºC 70ºC
TEMPERATURAS

Aguarde 3 min. Então adicione 100 µL do substrato (glicose) nos tubos.

Substrato (Glicose) 100 µL 100 µL 100 µL

Marque o tempo a partir da adição da glicose. Após 8 min, observe a coloração dos tubos
sem retirá-los das respectivas cubas.

* Faça um relatório citando e explicando seus resultados, utilizando


gráficos. Faça o gráfico de velocidade X concentração de substrato,
apontando neste o Km e a VMáx nos gráficos.
PROTOCOLO III

Processo de fermentação

Desde os primórdios da evolução, quando as primeiras espécies sobreviveram em


uma atmosfera sem oxigênio, a quebra anaeróbica da molécula de glicose é utilizada por
alguns seres vivos como um dos mecanismos bioquímicos mais primitivos para a extração
de energia a partir de combustíveis orgânicos. Até hoje, a fermentação é um processo
catalisado por diversos microorganismos e determinado tipo celular de organismos
superiores. O tipo de fermentação é caracterizado de acordo com o produto formado.

Objetivo:
Observar as células de leveduras Sacharomyces cerevisae incubadas em diferentes
condições.

Material:
- células de Sacharomyces cerevisae (Fermento biológico seco). Pesar 5g/ erlenmeyer
- agitador de bandeja
- solução de sacarose 10% ou glicose 10%
- erlenmeyer de 250ml e balões de borracha

Procedimento:
Preparar as amostras conforme tabela abaixo.
Sacarose Levedura Água Ferver Resultados
Erlenmeyers
(ml) 5g (ml) 15min obtidos
1 - 5 50 não
2 50 - - não
3 50 5 - não
4 50 5 - sim

Fechar os erlenmeyers com os balões de borracha vedando bem a boca do vidro e levá-los
ao agitador de bandeja durante 30min. Observar e descrever o resultado.

Questões:
1. O que você observou nos erlenmeyers incubados com leveduras?
2. Como você acha que está a concentração de glicose no início e no final do
experimento? Faça um gráfico para ilustrar a sua resposta.
3. Quais são os produtos formados pelas leveduras durante este processo de
fermentação que ocorreu nos erlenmeyers?
4. Explique resumidamente a via bioquímica da fermentação da glicose neste processo,
evidenciando as principais enzimas envolvidas.

ESTUDO DIRIGIDO I

1) A estrutura dos aminoácidos é composta por uma porção amina e carboxil semelhante
entre os 20 tipos de aminoácidos e o radical ou substituinte confere a identidade de cada
um. Em alguns aminoácidos o radical também pode sofrer ionização. Nesse caso, como isso
interfere na capacidade tamponamento desta molécula? Explique.

2) Ocasionalmente aminoácidos são utilizados no preparo de tampões. Examine a tabela


abaixo e escolha um aminoácido adequado para tamponar soluções nos seguintes valores
de pH: pH=4, pH=6, pH=9 e pH=12.

Aminoácido pK1 (COOH) pK2 (NH2) pKR (radical) pHI (ponto isoelétrico)
Glicina 2,3 9,6 - 6,0
metionina 2,3 9,2 - 5,8
ác. aspártico 2.1 9,8 3,9 3,0
ác. glutâmico 2,2 9,7 4,3 3,2
Histidina 1,8 9,2 6,0 7,6
Lisina 2,2 9,2 10,5 9,8
Arginina 2,2 9,0 12,5 10,8

3) Dos aminoácidos da tabela acima, qual pode participar melhor do tamponamento celular
(pH variando de 6,5 a 7,2, dependendo da célula) , quando compondo a estrutura de
proteínas.

4) Escolha quatro aminoácidos diferentes e descreva a formação das ligações peptídicas


entre eles.

5) Cite duas funções dos aminoácidos especializados.

4) Explique a importância da prolina e da cisteína na estrutura tridimensional das


proteínas.
ESTUDO DIRIGIDO II

1) Mais da metade do nosso peso seco corresponde às proteínas. Proteína do grego


"proteios" significa 1a classe, já demonstrando sua importância. Devido a sua
abundância, podemos observar que esta classe de moléculas desempenha vários papéis
biológicos. Cite os 5 papéis relevantes, exemplificando cada um deles.

2) Quais são os tipos de interação e ligação química que ocorre nas proteínas? Relacione
estas forças com os níveis estruturais protéicos.

3) As forças mencionadas na questão 3 podem ser formadas baseado-se no local onde a


proteína se encontra. Por exemplo, partindo do pressuposto que a proteína nativa se
encontra em um ambiente hidrofílico com pH próximo a 7,2, o que ocorreria com a sua
estrutura (da primária a quaternária) se o pH for alterado para 4,0 ou 10,5.

4) Descreva os processos de desnaturação e precipitação salina.

ESTUDO DIRIGIDO III

1) A enzima anidrase carbônica é fortemente inibida pela droga acetazolamida, a qual é


usada como diurético e também no tratamento de glaucoma (reduz substancialmente a
alta pressão intra-ocular). Esta enzima desempenha função importante nestes e em
outros processos secretórios porque participa na regulação do pH e do conteúdo de
bicarbonato de vários fluidos corporais. A droga citada acima, funciona como um potente
inibidor não competitivo da enzima. Com base nos seus conhecimentos sobre as
propriedades cinéticas dos inibidores competitivo e não competitivo, represente
graficamente as curvas de velocidade da reação versus concentração de substrato ([S])
para a reação da anidrase carbônica na ausência e presença do inibidor e explique.

2) Explique o que é uma enzima alostérica e o que é o processo de cooperatividade.

3) Enzimas são os catalisadores específicos mais conhecidos. A especificidade reside no


sítio de ligação ao substrato. Vários modelos têm sido proposto para explicar a
especificidade da enzima e substrato. Cite e comente os dois modelos mais conhecidos
que explicam a formação do complexo enzima-substrato.
4) Cite e explique qual o melhor ponto para se controlar a produção do composto 6 na
seqüência de reações a seguir:

Cpd 3

Cpd 1 Cpd 2 Cpd 4 Cpd 5 Cpd 6


A C D E

5) Cite e explique os tipos de regulação fisiológica da atividade enzimática.

6) A sensibilidade pouco comum de asiáticos à bebidas alcoólicas tem uma base bioquímica.
Em japoneses e chineses, muito menos álcool é necessário para produzir uma
vasodilatação, que resulta em rubor facial e aceleração dos batimentos cardíacos, do que é
necessário para produzir este quadro clínico em europeus. Os efeitos fisiológicos se devem
ao acetoaldeído gerado pela enzima álcool desidrogenase hepática a partir do álcool
ingerido. O acetaldeído é normalmente removido por uma aldeído desidrogenase
mitocondrial (enzima) que o converte em acetato. Em alguns asiáticos, a forma normal da
aldeído desidrogenase mitocondrial, que tem um baixo Km para acetoaldeído, está ausente.
Esses indivíduos têm somente a forma citosólica desta enzima que apresenta um alto km
(baixa afinidade para o acetoaldeído). Diante destes fatos, explique por que o efeito descrito
acima acontece nos indivíduos asiáticos.
ESTUDO DIRIGIDO IV

1) A partir das estruturas abaixo responda:


a) Qual (s) dela (s) possui cetose?
b) Escreva a ligação glicosídica da lactose.
c) Quantos anéis piranosídicos possui a sacarose?
d) Qual possui ligação tipo β ?

CH2OH CH2OH CH2OH

OH O O OH O CH2OH
H H H O H
H H H
O OH H H OH
OH H OH H
H H OH O
CH2OH
H OH H OH H OH OH H

lactose sacarose

2) O amido, o glicogênio e a celulose são exemplos de homopolissacarídeos. Explique este


termo e identifique diferenças em sua estrutura.

3) Por que alguns mamíferos conseguem extrair a energia contida na celulose enquanto
outros não são capazes?

4) Descreva a classificação estrutural dos lipídeos exemplificando cada tipo.

5) Como é formada a membrana biológica? Por que apresenta assimetria? Explique o


movimento flip-flop e lateral dos lipídeos de membrana.

6) O colesterol pode modular a fluidez de membranas biológicas. Como ele exerce essa
função?
ESTUDO DIRIGIDO V

1) Discuta o que é metabolismo.

2) Explique a relação energética existente entre as vias catabólicas e anabólicas.

3) Comente como o metabolismo é regulado, tanto em nível tecidual como em nível celular.

4) Explique o papel das moléculas NAD, NADP e FAD no metabolismo.

ESTUDO DIRIGIDO VI

1) Através da veia porta, o fígado recebe mais que 90% do sangue que passou pelo trato
intestinal, contendo portanto, os nutrientes que foram absorvidos. Logo após uma
alimentação rica em carboidratos, a concentração de glicose sangüínea pode aumentar
até 10 mM. A enzima que catalisa a primeira reação da via glicolítica transforma
glicose em glicose 6-P e pode apresentar duas isoformas, a glicoquinase e a
hexoquinase. A primeira está presente no fígado e possui um Km = 10 mM e a
segunda está presente nos tecidos extra-hepáticos e possui um Km = 0.1 mM. Discuta
a importância fisiológica deste resultado.

2) A reação da gliceraldeído 3-P desidrogenase necessita de fosfato inorgânico (Pi) e um


composto com alto potencial de redução e oxidação (NADH) para ocorrer. O
nucleotídeo deve estar na forma oxidada (NAD+) para dar seqüência a reação. No
entanto, um dos produtos da reação será o NADH, que deverá ser reoxidado. Explique
como ocorre a reoxidação do NAD+ no metabolismo anaeróbico.

3) Explique por que a glicólise pode ocorrer tanto em aerobiose quanto em anaerobiose,
enquanto o ciclo de Krebs funciona apenas na presença de oxigênio.

4) Descreva as reações reguladoras da via glicolítica, ressaltando seus moduladores.


ESTUDO DIRIGIDO VII

1) Hans Krebs, um talentoso cientista uniu vários resultados observados por ele e outros
cientistas e concluiu que em uma suspensão muscular, o piruvato (3 carbonos) ou
acetato (2 carbonos), quando incubados com oxaloacetato (4 carbonos) formam
citrato (um composto com 6 carbonos). Eles já haviam observado que fornecendo
fumarato, succinato ou malato, havia a formação de oxaloacetato. Com o fornecimento
de citrato, também havia a formação de oxaloacetato. Com base nestes resultados,
Hans Krebs, deduziu o ciclo, o que fez com que o ciclo do ácido tricarboxílico fosse
também chamado ciclo de Krebs. Observe e discuta de onde vem os carbonos que
alimentam o ciclo e o que é formado a cada volta .

2) Descreva os moduladores do Ciclo de Krebs, rassaltando as enzimas envolvidas na


regulação.

ESTUDO DIRIGIDO VIII

1) Qual a função da glicogenina no metabolismo do glicogênio?

2) Durante o exercício, haverá a quebra do glicogênio hepático e muscular. Qual o destino


das moléculas de glicose originadas a partir da quebra do glicogênio presente nesses
dois tecidos acima mencionados? Justifique.

3) A presença de ramificações no polímero de glicogênio potencializa a síntese e a


degradação do mesmo. Comente esta afirmação.

4) Por que não ocorre a síntese e a degradação do glicogênio ao mesmo tempo?


ESTUDO DIRIGIDO IX

1) A ativação de lípases hormônio-sensíveis no adipócito promove a liberação de ácidos


graxos na corrente sangüínea. Uma grande parte dessas moléculas, no entanto, sofre
degradação na matriz mitocondrial do hepatócito. Como ocorre o transporte dessas
moléculas do citosol para a matriz mitocondrial?

2) De qual maneira ocorre a completa degradação do palmitato (16:0)? Quantas moléculas


de acetil-CoA, NADH e FADH2 são formadas? Qual o rendimento energético na forma de
ATP do palmitato?

3) Qual o destino e por que ocorre o aumento da concentração de citrato intramitocondrial


hepático no estado pós-prandial?

4) Como é formado o malonil-CoA e qual a sua função?

5) Durante a fome os níveis plasmáticos de alguns aminoácidos encontram-se como


demonstrados na tabela abaixo. Discuta os resultados.

Dias de jejum Aminoácidos plasmáticos


(unidades arbitrárias)
1o O,50

2o 0,75

3o O,90

6) Explique os possíveis danos que uma célula pode sofrer com uma deficiência da enzima
glicose 6-fosfato desidrogenase.
CASOS CLÍNICOS I

CASO A - A anemia falciforme é uma doença causada pela mutação de um único


nucleotídeo (mutação puntiforme) no DNA do gene para a cadeia beta da hemoglobina. A
hemoglobina que se forma difere da normal apenas pela presença de VALINA em vez de
ÁCIDO GLUTÂMICO na posição 6 das cadeias beta da hemoglobina. No entanto, as
conseqüências desta substituição de apenas um aminoácido são imensas. A partir das
informações acima:
1) Caracterize a doença acima, desde as bases protéicas até o quadro clínico.
2) De uma maneira generalizada, explique como algumas mutações podem alterar a
estrutura das proteínas. Assim, explique o que é mutação conservativa e mutação não-
conservativa.
3) Caracterize a hemoglobina, descrevendo seus níveis estruturais e sua classificação entre
as demais proteínas.

B) Pesquise e explique sobre doença do xarope de bordo e homocisteinúria.

CASO CLÍNICO II

1) A aspirina (ácido acetil salicílico) é uma droga que tem sido amplamente usada para
diminuir a febre, dor e a inflamação. Ela também é eficaz em impedir a coagulação
excessiva do sangue, que pode levar a ataques cardíacos e derrames. Todos esses
efeitos devem-se ao fato da aspirina inibir não-competitivamente a atividade da
ciclooxigenase, bloqueando assim, a formação de prostaglandinas e,
conseqüentemente de tromboxano A2 , um potente agregador plaquetário.
a) Explique o que é uma inibição não-competitiva e correlacione com os outros tipos de
inibição.
b) Represente graficamente a atividade da ciclooxigenase na ausência e presença do
inibidor (aspirina).
c) Explique como a aspirina inibe a ciclooxigenase.

2) No tempo das grandes navegações era comum a tripulação chegar ao seu destino
com hematomas espontâneos pelo corpo, sangramento das gengivas e nos casos
mais graves perda dos dentes. Com o tempo foi observado que o retorno da
alimentação obtida em terra fazia com que esses sintomas desaparecessem.
Constatou-se que suco de limão acelerava o processo de cura. Mais tarde, atribuiu-
se a cura desta doença ao ácido ascórbico e por isso a doença foi denominada de
escorbuto. O escorbuto se instala quando não ocorre uma modificação pós-
traducional no processo de formação do colágeno funcional, na qual a vitamina C
tem um papel fundamental na atividade da enzima responsável por este passo
metabólico. Pesquise e responda:
a) Qual a enzima responsável por este passo metabólico em questão e qual a função do
ácido ascórbico nesta enzima?
b) Qual o motivo do sangramento nas gengivas durante a manifestação do escorbuto?
c) Explique o que é uma modificação pós-traducional?

CASO CLÍNICO III

1) P.M., um jovem de 16 anos, procurou auxílio médico mostrando desenvolvimento de


fraqueza muscular progressiva. Apresentava caimbras dolorosas após a realização de
exercícios físicos intensos, mas aceitava exercícios moderados normalmente. Após a
realização de exercícios intensos, era observada a presença de atividades elevadas de
enzimas como lactato desidrogenase, aldolase e creatina quinase no plasma. O nível de
glicose era normal e o paciente apresentava resposta hiperglicemiante normal após
administração de glucagon. Curiosamente, enquanto indivíduos normais apresentavam
uma acentuada elevação dos níveis plasmáticos de lactato após a realização de
exercícios físicos intensos, o paciente em questão, não mostrava elevação de lactato na
mesma situação. Foi feita uma biópsia muscular:

Paciente Glicogênio Glicose 6- Frutose 6 fosfato Frutose 1,6


(mg/g fosfato (nmol/g (nmol/g tecido) BP (nmol/g
tecido) tecido) tecido)
P. M. 43,8 9,2 1,6 0.02
Normal 9.6 +/- 1,8 0.5 +/- 0.3 0.1 +/- 0.05 0.61 +/- 0.23

Responda:
a) Explique o resultado da biópsia, ressaltando o possível problema deste paciente.
b) Por que o exercício intenso resulta em produção de lactato em indivíduos normais,
enquanto o mesmo não era observado no paciente?
2) Um paciente com 2 anos de idade chega ao hospital local com fraqueza muscular e após
exames clínicos detectou-se hiperamonemia, cardiopatia, défict respiratório e
hipoglicemia. Diante dos resultados obtidos suspeitou-se de deficiência da cartinina-
acilcarnitina translocase que foi confirmado posteriormente. O médico prescreveu como
tratamento uma dieta pobre em ácidos graxos de cadeia longa, uma dieta suplementada
com triacilgliceróis de cadeia curta e média e evitar jejum prolongado. Explique os sinais
apresentados e o fundamento do tratamento prescrito.