Potencial Microbiológico para el tratamiento de aguas residuales mediante la utilización

de filtros horizontales

Para evaluar la eficiencia de filtros horizontales en la remediación de agua con elevados

índices de DBO y coliformes fecales proveniente de un importante rio que ha
funcionado como colector de aguas residuales, hemos diseñado experimentos de
microcosmos para analizar la dinámica tanto en la estructuración de la comunidad
bacteriana como en los parámetros físico-químicos.
Los resultados obtenidos, luego de utilizar el FH, indican una disminución de la DBO,
la cual se ve se ve favorecida al utilizar estrategias de bioaumentación, y un importante
cambio en la estructuración de la comunidad bacteriana lo que estaría dado tal vez por
la disminución en la cantidad de importantes agentes infecciosos.
Concluimos que la utilización de FH para el tratamiento de aguas es un sistema
eficiente para descontaminar aguas para que cumpla con los estándares requeridos para
su utilización en sistemas de riego o recreaciónales.

Proyecto EXPLORA ECT03/11

ESTUDIO PRELIMINAR DE LA COMUNIDAD BACTERIANA DEL RÍO

MAPOCHO Y EVALUACIÓN INICIAL DE UN MÉTODO PARA REMOVER
SU CARGA CONTAMINANTE.

Valenzuela D.1; Godoy M.1; Pinto E.1; González B.1

1
Depto. Genética Molecular y Microbiología, , Núcleo Milenio en Ecología Microbiana y Biotecnología
Ambiental. (EMBA). Facultad de Ciencias Biológicas P. Universidad Católica de Chile.
davalenz@puc.cl.
Resumen

El Mapocho es un río que al cruzar Santiago recibe una alta carga de material
contaminante proveniente, principalmente, de desechos domiciliarios. Con el propósito
de determinar la posibilidad de llevar a cabo esquemas de autodepuración o
biorremediación de este río, en este trabajo se realizó un estudio preliminar de su
comunidad bacteriana y una evaluación inicial de un método para remover su carga
contaminante. Para ello, se escogió estudiar la comunidad bacteriana en puntos del río
con distintos niveles de contaminación, utilizando por primera vez una técnica
independiente de cultivo, basada en los perfiles de restricción terminales (T-RFLP) del
marcador molecular 16s rRNA. La comparación de los perfiles de T-RFLP mostró un
cambio de la comunidad bacteriana, a medida que la carga contaminante del sitio
muestreado era mayor. El aislamiento de bacterias a partir de algunos de estos sitios
reveló un alto grado de resistencia a diversos antibióticos. Mediante un bioreactor
sencillo se estudió la posibilidad que los parámetros químicos, físicos y biológicos del
río pudiesen recuperar los niveles de un río no contaminado. El tratamiento en el
bioreactor produjo una reducción de un 50% en la demanda bioquímica de oxigeno, una
disminución significativa de la turbidez del agua y un perfil de la comunidad bacteriana
significativamente similar al encontrado en los puntos con bajos índices de
contaminación.

Financiamiento: Programa Explora ECT3/011 y Proyecto EMBA P/04-007-F, de la

Iniciativa Científica Milenio.

Materiales y métodos

Muestreo y Caracterización físico química: La selección de los puntos muestreados

se baso en estudios previos. La ubicación de los puntos evaluados se encuentra en la
tabla 1.
Para evaluar la comunidad bacteriana presente en cada uno de los cuatro puntos se
tomaron las muestras por triplicado en tubos falcón estériles de 50 ml.
Para evaluar la eficiencia del reactor se llevo a cabo un segundo muestreo en el cual se
tomaron 50 litros de agua del punto 4 y nuevamente se evaluó la comunidad bacteriana
mediante la toma de muestras por triplicado en el mismo punto.
Mediciones de la demanda bioquímica de oxigeno fueron llevadas a cabo en un
volumen de 500 ml, los cuales fueron mantenidos a 4ºC hasta su análisis, el que fue
realizado por la empresa DICTUC.
Análisis de turbidez fue realizado mediante centrifugación de 2 ml de muestra a 14000
rpm durante 10 minutos, posteriormente se peso el pellet obtenido.

Extracción de ADN: Los 50 ml de agua fueron centrifugados a 7000 rpm durante 20

minutos. El pellet obtenido fue utilizado para la extracción de ADN mediante el método
fenol-cloroformo. La calidad la extracción fue visualizada mediante electroforesis en
gel de agarosa al 0,8% p/v.

Condiciones de PCR: La amplificación del gen 16S rRNA se llevo a cabo mediante la
utilización de los partidores universales 8F y 1393R. El protocolo de la reacción fue el
siguiente; 5 minutos de denaturación iniciales a 94ºC, seguido por 28 ciclos los que
consisten en 45 segundos a 94ºC, 1 minuto a 56ºC y 2 minutos a 72ºC, finalmente una
extensión final de 7 minutos a 72ºC.Esta reaccion se llevo a cabo en un volumen final
de 25 ul que contenían 2,5 ul buffer PCR 10X, 3 mM de Cl2Mg, 0,5 ul BSA 100X, 0,2
uM de cada partidor 1 U de Taq polimersa Invitrogen, xxxxxxxxxx dNTPs y 10 nmoles
de templado.

T
Resultados

Caracterización de la comunidad bacteriana: El nivel de contaminación en cada uno

de los puntos muestreados es clave para determinar la estructura de la comunidad
bacteriana. Las comunidades de los puntos M1 y M2 (Puente Tabancura y Rotonda
Pérez-Zujovic, respectivamente), los que presentan un bajo nivel de nivel de
contaminación, se diferencias significativamente de las comunidades de los puntos M3
y M4 (Puente del Arzobispo y Puente Cal y Canto, respectivamente), los que presentan
altos índices de contaminación. Este resultado es avalado estadísticamente. Las
diferencias se deben a las variaciones que sufren las abundancias relativas de los
distintos OTUs (unidades taxonómicas operacionales) en los perfiles de TRFLP de cada
uno de los puntos evaluados (Figura 1).

Efectividad del reactor: Ya establecida la complejidad de la comunidad bacteriana y

los cambios que sufría al elevarse los niveles de contaminación se decidió llevar acabo
procesos restauradores mediante biorremediación. Durante la permanencia del agua en
el reactor se llevaron a cabo procesos bioestimulantes a modo de mejorar sus
características físicas, químicas y biológicas.
Los procesos de aireación y recirculación a través de una matriz que permitiera el
asentamiento de biofiltradores permitieron mejorar la calidad del agua. Las
características físicas, químicas y bióticas del agua preveniente del Punto M4 fueron
evaluadas antes y después del tratamiento de 20 horas, obteniendo importantes
resultados. Los niveles de material particulado en el agua fueron reducidos casi en su
totalidad (dato no mostrado). Las variaciones en el índice de DBO5 (Demanda
Bioquímica de oxigeno), luego de las 20 horas de tratamiento resultaron en una
disminución de un 50% (Figura 3.B). Por ultimo la caracterización biótica, basándose
en el estado de la comunidad bacteriana, fue realizada. Los perfiles de TRFLP para las
comunidades antes y después del tratamiento demuestran importantes variaciones en la
estructura de la comunidad luego de las 20 horas de tratamiento. Al comparar la
comunidad bacteriana post-reactor con las obtenidas en los experimentos llevados a
cabo para caracterizar la estructura de las comunidades a lo largo del rió se obtiene un
interesante resultado respaldado estadísticamente por el valor de R: 0.509 (p 0.1%). La
estructura de la comunidad establecida en el agua, luego de permanecer en el reactor,
resulto ser significativamente similar a la de los puntos M1 y M2, cuyo nivel de
contaminación es reducido. (Figura 3.A)

Aislamiento de cepas bacterianas: La presión ejercida por el antibiótico, como agente

seleccionador, fue determinante en la obtención de las cepas bacterianas aisladas. El
análisis de resistencia indica un alto grado de resistencia a los diversos agentes
antibacterianos utilizados. (Tabla 1)
Aislados con distintos perfiles de restricción del gen que codifica para el 16s rRNA
fueron sometidos a secuenciación, con esto se determino con que especies se trabajo.
Cuatro aislados corresponden a bacterias cuyas características fenotípicas aun no
permitían su aislamiento. (Tabla 1)

Figura 1. Estructura de la comunidad bacteriana a lo largo del río Mapocho. Los datos
entregados corresponden a los promedios de los perfiles de la comunidad bacteriana,
obtenidos mediante T-RFLP de los genes 16s rRNA utilizando la enzima de restricción
MspI, en cada uno de los puntos evaluados. Los nombres de los gráficos corresponden a
los cuatro puntos caracterizados; M1 (Puente Tabancura), M2 (Cercano a la rotonda
Pérez Zujovic), M3 (Puente El Arzobispo) y M4 (Puente Cal y Canto). Las diferencias
entre los niveles de contaminación y la estructura de la comunidad bacteriana permiten
agrupar a los puntos M1 y M2 separados de los puntos M3 y M4.

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Tabla 1: Caracterización de las cepas Aisladas. La mejor coincidencia de las secuencias
obtenidas mediante secuenciación con la base de datos del Gene bank fue considerada
para asignar la especie a cada uno de los aislados. Los niveles de resistencia, evaluados
mediante difusión en agar, son descritos considerando los siguientes niveles de
resistencia; R: resistente, I: resistencia intermedia y S: susceptible. ND: sin evaluación.
Los Antibióticos utilizados corresponden a: T: Tetraciclina; C: Clorafenicol; G:
Gentamicina; Sul: Estreptomicina; K: Kanamicina; N: Acido Nalidixico; P: Penicilina;
Sxt: Sulfatrimetropim.
Figura 2: Eficiencia del reactor. Los datos corresponden a los valores obtenidos a partir
de la muestra de agua utilizada para probar la eficiencia del reactor. A: NMDS de la
estructura de la comunidad bacteriana evaluada mediante TRFLP del gen 16S rRNA,
utilizando la enzima de restricción MspI. El valor del estadístico R es 0.509 (p 0.1% y
un estrés de 0.007). Las figuras en color blanco corresponden a los datos obtenidos en el
punto M1 (triángulos), M2 (Triángulos invertidos) y las muestras de agua obtenidas
luego de 20 horas de tratamiento (rombos). Las figuras de color negro corresponden a
los datos obtenidos en el punto M3 (Triángulos), M4 (triángulos invertidos) y la
muestra de agua utilizada para probar la eficiencia del reactor (Rombos). B: Grafico de
los niveles de DBO5 (demanda bioquímica de oxigeno) del agua, antes y después de las
20 horas de tratamiento. DBO5 expresada en miligramos de oxigeno consumido por litro
de agua.

A-.

B-.