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1. Introducción
2. Métodos de rotura celular y extracción de proteínas
3. Métodos cromatográficos
4. Métodos electroforéticos
1. Introducción
1
Tema 6. Purificación de proteínas Bioquímica
z Lisis celular. Válido para células sin pared celular como las células de
tejidos animales, pero no es suficiente para células vegetales o bacterias.
Consiste en suspender las células en una solución hipotónica (más diluida que
el interior celular). Debido a la diferencia osmótica el agua difunde al interior de
la célula, causando su hinchamiento y rotura.
Sonicación
Presión
2
Tema 6. Purificación de proteínas Bioquímica
La columna está rellena con un material sólido con las características químicas
adecuadas (fase estacionaria), y una solución tamponada se hace pasar a
través de la columna (fase móvil). El extracto crudo se aplica en la parte
superior de la columna y va poco a poco entrando en la columna con la fase
móvil. Cada proteína migrará a distinta velocidad según su grado de afinidad
por la fase estacionaria.
3
Tema 6. Purificación de proteínas Bioquímica
4
Tema 6. Purificación de proteínas Bioquímica
Sustrato
LIGANDO
Enzima
5
Tema 6. Purificación de proteínas Bioquímica
4. Métodos electroforéticos
( -)
(+)
6
Tema 6. Purificación de proteínas Bioquímica
Desteñir con
Teñir con
Acético 10%
Coomassie Metanol 25 %
Proteína
desconocida
Migración de la
banda
7
Tema 6. Purificación de proteínas Bioquímica
NATIVA-PAGE SDS-PAGE
150 kDa
90
40
30 kDa
23
15 kDa
12