Fisiologia animale: lezione 2

20-04-2017

ACCOPPIAMENTO
Una cosa necessaria da fare, nel momento in cui ho una colonia di topi nel
mio stabulario, è capire quali piani di accoppiamento fare. Devo perciò aver
già scelto il mio modello animale: la specie, il ceppo, eventualmente anche il
sesso e l'età dell'animale, che potrebbero essere importanti per la mia
sperimentazione, dato che potrei infatti avere esigenza di sperimentare su
animali omogenei di età oppure potrei avere esigenza di fare
sperimentazione su animali della stessa nidiata. Devo anche sapere quando
mettere in accoppiamento gli animali, sapendo che la gravidanza dura circa
21 giorni, in modo da avere pronti gli animali che mi servono nel momento in
cui ne ho bisogno.

Nel momento in cui ho messo i topi in accoppiamento, quindi nella stessa

gabbia il maschio con una o più femmine, diventa fondamentale capire se c'è
stato accoppiamento e se le femmine sono gravide.

Per capire se c'è stato l'accoppiamento quello che riesco ad individuare è il

vaginal plug: che è un tappo biancastro di eiaculato che è visibile dopo
l'accoppiamento per un periodo di tempo limitato, tra le 8 e le 30 ore (in
genere gli animali vengono messi in accoppiamento la sera e la mattina dopo
si va a vedere se le femmine presentano il vaginal plug). Il vaginal plug però
non mi dà alcuna inforamazione sul fatto che le femmine siano rimaste
gravide o meno.

Per sapere se c'è una gravidanza in corso devo aspettare l'undicesimo

giorno dopo la comparsa del vaginal plug ed effettuare una palpazione del
addome per vedere se riesco a sentire o meno la presenza dei feti: questo è
uno dei pochi modi che mi dà una certezza, ma è sconveniente perchè
richiede un'attesa di 11 giorni.

Ci sono anche altri sistemi che mi possono fornire delle indicazioni sulla
presenza di una gravidanza o meno, uno di questi, il più semplice da
realizzare, è verificare un incremento ponderale: dopo l'accoppiamento la
femmina viene pesata tutti i giorni, se vi è dopo 5/6 giorni circa una
tendenza all'aumento di peso posso supporre che quella femmina sia
effettivamente gravida.

Un'altra cosa che si osserva, ma che è più tardiva, intorno all'undicesimo

giorno, non è solo un cambiamento delle dimensioni, ma anche della
morfologia dell'area addominale. Nel momento in cui la femmina è in
deambulazione sui 4 arti ci sono degli ingrossamenti molto particolari a
livello addominale sui due fianchi.
Bisogna comunque fare occhio all'incremento ponderale, perchè è solo
un'indicazione dato che le femmine in seguito all'accoppiamento possono
entrare in uno stato che viene detto di pseudogravidanza. Se la femmina si
accoppia ma non rimane gravida c'è in ogni caso una variazione nel suo ciclo
riproduttivo per cui c'è un allugamento del ciclo riproduttivo perchè si
instaura, indipendentemente dal fatto che sia gravida o meno, una fase
luteale con produzione di progesterone, che non avrei non ci fosse stato
accoppiamento. L'aumento della produzione persistente di progesterone può
produrre un lieve incremento ponderale che però è ovviamente minore che
nella femmina gravida.

L'accoppiamento inoltre viene fatto alla sera perchè i topi sono animali ad
attività notturna, per quanto riguarda la stabulazione dei topi il ciclo
standard è 12 ore di luce e 12 di oscurità, se invece gli animali vengono
utilizzati come riproduttori, in un locale idoneo, si può passare ad un ciclo di
14 ore di oscurità e 10 di luce.

TRASFERIMENTO NIDIATE
Una cosa che può succedere, principalmente se si lavora con ceppi
transgenici, è che ci siano alterazioni dell'attività riproduttiva, come ad
esempio difficoltà o impossibilità a rimanere gravida, oppure problemi in
fase di lattazione. Nel caso in cui i problemi si presentino nella fase di
lattazione può risultare difficile il mantenimento della linea. Una soluzione
può essere togliere i topi neonati dalla gabbia della madre e andare a metterli
nella gabbia di un'altra femmina di un altro ceppo, che ha avuto una
gravidanza sovrapponibile con quella della femmina del ceppo modificato. In
questo modo i piccoli vengono allattati dalla madre adottiva. In realtà se
semplicemente si prendono i neonati e si trasferiscono, la femmina della
gabbia ricevente non li allatterà per via dei meccanismi di riconscimento
mediati da feromoni. I topi, come gli altri animali, hanno delle strutture
specializzate per la percezione dei feromoni: l'organo vomeronasale
percepisce i feromoni e invia i segnali al bulbo olfattivo accessorio, che ha
un suo particolare sistema di generazione delle risposte. I feromoni sono
prodotti e rilasciati principalmente tramite l'urina o tramite ghiandole
specializzate a livello epiteliale.

Per trasferire una nidiata da una madre all'altra devo quindi tenere in conto i
feromoni e per risolvere il problema posso utilizzare o della segatura dove la
madre adottiva ha urinato o direttamente l'urina stessa per marcare i piccoli
da trasferire: in questo modo la madre ricevente riconosce i piccoli come suoi
e li allatta.

Questo trasferimento vale per numeri non eccessivi (cioè inferiore a 6), in
caso di nidiate più numerose devo dividere i piccoli ed assegnarli a madri
diverse in modo tale che il latte sia sufficiente per tutti i piccoli.

Nel momento in cui io trasferisco i topi devo assicurarmi di poterli poi in

seguito riconoscere, in questo caso il metodo ideale è quello di assegnare i
neonati ad una madre ricevente con caratteristiche assolutamente differenti
(per esempio metto i neonati del ceppo FVB, che sono albini, insieme ad una
madre del ceppo C57, che è nera).

Passate 24 ore, periodo in cui la madre è particolarmente suscettibile agli

stress e può reagire cannibalizzando i piccoli, per sapere se questi vengono
allattati posso semplicemente osservarne la zona addominale: essa infatti
presenta una colorazione biancastra nel momento in cui è piena di latte.

MANGIME
E' assolutamente fondamentale sapere cosa sta mangiando l'animale, posso
infatti avere esigenze particolari per cui ho necessità che agli animali venga
fornita per esempio una dieta ipercalorica o al contrario posso avere ceppi
particolarmente suscettibili a diabete o obesità che necessitano di mangime
ipocalorico. Le formulazioni del mangime in pellet sono infatti tutte note:
da percentuali di carboidrati e proteine, alle tipologie di grassi saturi o
insaturi, alla presenza di micronutrienti come elettroliti, vitamine, ecc. La
data di scadenza viene sempre indicata poichè garantisce che il prodotto
sia conforme alla formulazione originaria: molte vitamine per esempio posso
andare incontro a degradazione.

I sacchi di mangime sono in genere sigillati e sterilizzati (il chè è molto

importante per esempio nel caso dei topi immunodeficienti).

I pellet solidi sono adatti nella magior parte dei casi ma non sono l'unico tipo
di formulazione acquistabile. Vi sono per esempio ceppi transgenici in cui vi
sono alterazione della mandibola o della mascella o della cavità orale per i
quali è necessario un tipo di alimentazione diversa dai pellet solidi, in questo
caso infatti si usa una formulazione gelationosa.

L'acqua deve essere a volontà e cambiata frequentemente.

METODI DI IDENTIFICAZIONE
Esistono due sistemi di identificazione a seconda delle mie esigenze: sistemi
temporanei e sistemi permanenti.

TEMPORANEI
1) Colorazione con un pennarello sulla coda: è il metodo più semplice e
rapido, che non richiede alcuna competenza. E' un sistema temporaneo e a
breve durata, non più di 2 giorni.

2) Coloranti ad uso alimentare, che sono atossici e il loro metabolismo

non rilascia sostanze nocive, con i quali posso colorare la pelliccia
dell'animale: anche questo metodo è temporaneo e la sua durata è di circa
una settimana.

3) Rasatura del pelo in aree specifiche: sistema molto rapido che può avere
anche una durata di 4 settimane.

PERMANENTI
1)Tatuaggio: non è molto utilizzato. Permette di effettuare una numerazione
qualsiasi ma richiede un'attrezzatura costosa e di difficile mantenimento.

2) Ear tag: viene fatto un buco nell'orecchio attraverso il quale faccio

passare una targhetta a numerazione progressiva a livello di stabulario che
permetto quindi anche una marcatura univoca a livello dello stabulario. E'
considerato un metodo permanente ma non è del tutto sicuro proprio perchè
la targhetta può andare incontro ad usura e venire rimossa anche
dall'animale stesso.

3) Ear clipping: faccio dei buchi a livello dell'orecchio, ma non vi inserisco

alcuna marca. A seconda di come e dove faccio la punzonatura sono in grado
di fare la numerazione.

4) Toe clipping: amputazione di una delle dita. Può essere utile in quanto mi
consente di recuperare del materiale che posso usare per esempio per la
genotipizzazione. E' un sistema usato molto poco, causa molto dolore per cui
lo si fa prima dei 12 giorni di vita.

5) Microchip: usati per esempio nei cavalli o negli animali domestici come
cani e gatti.

GENOTIPIZZAZIONE
Serve nel caso di una colonia di topi transgenici per identificare il sito di
inserimento del transgene oppure dopo un accoppiamento tra individui
eterozigoti o se sto accoppiando 2 trensgenici per ottenere un doppio
mutante. Serve
quando devo mantenere un ceppo di topi in eterozigosi.

Se sono io a generare una nuova linea di topi transgenici la sola PCR non è
sufficiente, per consuetudine e per esigenze di caratterizzazione della linea si
richiede che una nuova linea venga caratterizzata per southern blotting, in
questo modo sono in grado di vedere non tanto dove è avvenuta
l'integrazione ma posso vedere per esempio il numero di integrazioni del mio
transgene nel genoma del topo.

Come funziona il southern blotting:

- recupero il DNA dell'animale
- faccio una digestione con un enzima di restrizione per frammentare il DNA
- faccio correre il DNA su un gel di agarosio
- trasferisco il DNA su una membrana di cellulosa o a base sintetica
- immobilizzo il DNA sulla membrana
- con una sonda complementare al frammento che voglio cercare vado a fare
un'ibridazione per vedere se il frammento è presente o meno.

Quindi se sto generando un ceppo transgenico faccio sia la PCR sia il

southern blotting, uno mi dice dove si integra il frammento l'altro mi
dice quante coppie ne ho.

CRIOPRESERVAZIONE DEGLI EMBRIONI

La criopreservazione è una procedura complicata non a costo zero (costo
reagenti per il congelamento, costo azoto liquido) che richiede la
soppressione della madre gravida per estrarre gli embrioni.

E' utile nel caso in cui gli animali devono essere trasportati da un
laboratorio all'altro: non devo trasportare animali vivi ma solo delle cellule
congelate.

Serve inoltre per poter rigenerare una data colonia senza dover per forza
mantenere la colonia in vita nel momento in cui non mi serve più, perchè il
mantenimento in vita di una colonia ha molti costi e può presentare svariati
problemi, tra cui quello della fertilità.

Serve anche nel momento in cui la mia colonia viene a contatto con un
patogeno, non letale, ma di difficile eradicazione: in questo caso è più
conveniente riderivare la linea cioè accoppiare i topi infetti, sacrificare la
madre gravida, recuperare in maniera sterile gli embrioni, criopreservarli,
eliminare la colonia, fare una bonifica dell'ambiente di stabulazione, usare poi
degli animali sani in cui impiantare gli embrioni e riderivare la mia linea sana,
libera da patogeni (questi però sono in genere casi limite).

METODI DI SOPPRESSIONE
Il metodo che scelgo deve essere sicuro, cioè garantirmi la morte
dell'animale, non costituire un rischio per l'operatore, deve essere
accettabile dall'operatore da un punto di vista psicologico, deve
essere rapido ed indolore. In realtà non esiste una metodica che soddisfi
tutte queste esigenze, ma c'è ne sono diverse che possono essere usate con i
loro pro e contro a seconda dei casi.

L'applicazione di una corretta metodica di soppressione serve

fondalmentalmente a tutelare due cose: il benessere dell'animale (ed
evitarne condizioni di stress) e le mie esigenze sperimentali.

Una volta applicata la metodica devo confermare la morte dell'animale.

Posso verificare la presenza di alcuni riflessi, entro certi limiti, perchè a
seconda del metodo che uso potrei trovarmi nella situazione di avere la
perdita di alcuni riflessi ma non la morte dell'animale

Oppure posso usare un'altra metodica di soppressione che mi confermi

ulteriormente la prima metodica utilizzata.

Ci sono una serie di metodiche che sono consentite a livello normativo, ma

ogni stabulario può decidere di adottare misure più restrittive.

1) Soffocamento con anidride carbonica (non con monossido di carbonio,

perchè è tossico): gabbia chiusa collegata con un tubo ad una fonte di
erogazione di anidride carbonica. L'animale muore perchè l'ambiente si
satura di anidride carbonica e non c'è più ossigeno. Molto utilizzata perchè
facile da realizzare, non richiede particolari attrezzature, il contatto tra
operatore e animale è molto limitato, molto efficace. Svantaggi: non è una
metodica rapida, intorno ai 3/4 minuti si ha l'asfissia mentre l'animale
perderà comunque coscienza prima, quindi risulta poco conveniente in
considerazione del benessere dell'animale.

2) Iniezione letale, per esempio con anestetico: uso un mix di barbiturici. In

ambito veterinario, quindi non sperimentale, viene molto utilizzato il Tanax in
seguito ad una preanestesia. Il sodio tiopentale è molto utilizzato sia come
preanestetico a durata molto breve, sia superando la dose letale: la morte è
molto rapida. I barbiturici hanno un effetto depressivo sui centri del
respiro quindi la morte avviene per arresto respiratorio.

3) Dislocazione cervicale: si può fare su topi e ratti fino a 150 grammi circa
(quindi non ancora adulti) o per i conigli indipendentemente dal peso. La
morte dell'animale avviente per arresto respiratorio perchè viene causato
un danno al midollo spinale: interrompo la connessione tra i corpi cellulari dei
neuroni dei centri di respiro e gli assoni che innervano i muscoli respiratori. E'
rapido, la morte avviene in meno di un minuto mentre la perdita di coscienza
avviene in pochi secondi. La sicurezza del metodo invece dipende dalla
competenza tecnica dell'operatore.

4) Decapitazione: si utilizza una ghigliottina. In questo caso il problema è

l'impatto emotivo sull'operatore poichè si ha una copiosa perdita di sangue.

5) Proiettile captivo penetrante: è una bombola carica di gas compresso a

cui è attaccato un tubo alla cui estremità si trova un pistoncino bloccato che
viene spinto fuori dall'erogazione di gas e crea una rottura della scatola
cranica e un danno al tessuto cerebrale sottostante. Vi sono diversi
modelli, a molla o a detonazione. Utilizzato per animali di media e grossa
taglia. In caso di animali di grossa taglia però in genere non è sufficiente,
quindi viene utilizzato per creare uno stordimento nell'animale che morirà poi
per dissanguamento dovuto al taglio della giugulare.

FISIOLOGIA DELLO STRESS

La condizione di stress o la compromissione del benessere dell'animale in vari
modi sono delle condizioni assolutamente da evitare poichè sono
condizioni su cui io non ho alcun controllo e che possono alterare in vari modi
alcuni parametri che mi possono interessare, alterando così in maniera ignota
e non definita i risultati dei miei esperimenti.

La percezione di un pericolo fa si che venga attuata una risposta difensiva:

le due risposte immediate sono combatti o fuggi.

Lo stress è una serie di risposte a degli stimoli di vario tipo che ha una sua
utilità.

L'omeostasi è il mantenimento di condizioni all'interno di una sistema che

attuo tramite una serie di sistemi di controllo che rispondono a stimoli interni
o esterni.

L'ipotalamo è una delle porzioni più conservate evolutivamente

dell'encefalo, è una regione molto importante perchè media il collegamento
tra il sistema nervoso e il sistema endocrino perchè essendo parte del
sistema nervoso agisce controllando l'ipofisi (o ghiandola pituitaria).

Parte delle risposte allo stresso sono collegate all'attivazione dell'ipotalamo e

quindi dell'ipofisi. L'ipofisi controlla infatti le ghiandole surrenali: una parte
della ghiandola surrenale è importante nelle risposte allo stress.

L'ipotalamo produce dei fattori proteici di rilascio che arrivano all'ipofisi,

le cui cellule, in risposta a questi fattori, producono degli ormoni che
finiscono in circolo e controllano l'attività di altre ghiandole endocrine. I fattori
prodotti in genere dall'ipotalamo sono dei releasing hormones che
promuovono il rilascio degli ormoni da parte della ghiandola pituitaria, pochi
invece sono i fattori di ritorno. Il principale fattore di ritorno è la dopamina
che ha un'effetto inibitorio su alcune cellule dell'adenoipofisi. L'ipofisi infatti si
divide in 3 parti di origine embrionale leggermente diversa: l'adenoipofisi o
ipofisi anteriore, la neuroipofisi o ipofisi posteriore, la pars intermedia.

La neuroipofisi di fatto è tessuto nervoso: sono prolungamenti, assoni di

neuroni i cui corpi cellulari stanno nell'ipotalamo.

MIRON Maria Luana