Sei sulla pagina 1di 10

See discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.

net/publication/312663240

Validazione ed accreditamento dei metodi chimici di analisi in campo


alimentare: principi, modalità operative e procedure gestionali

Article · January 2016

CITATION READS

1 1,937

1 author:

Marco Iammarino
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata
137 PUBLICATIONS   488 CITATIONS   

SEE PROFILE

Some of the authors of this publication are also working on these related projects:

International Journal of Food Science & Technology SPECIAL ISSUE: RECENT ADVANCES IN MEAT PRODUCTS QUALITY & SAFETY IMPROVEMENTS AND ASSURANCE View
project

DEVELOPMENT OF INNOVATIVE ANALYTICAL METHODS FOR MEAT PRODUCTS SAFETY AND QUALITY ASSURANCE View project

All content following this page was uploaded by Marco Iammarino on 24 January 2017.

The user has requested enhancement of the downloaded file.


ALIMENTA
COMMENTARIO TECNICO-GIURIDICO DELLA PRODUZIONE AGRO-ALIMENTARE
ESD

N. 1 Anno XXIV Gennaio 2016 Mensile

PROVA PRIVILEGIATA O PRIVILEGIO


DELLA PROVA ?
Se le "Savie Leggi" dello "schema Caselli"
necessitano di prove non disciplinate
SOMMARIO
Fra i numerosi punti critici dello "schema Caselli",
A. Rossi (3) oggi disegno di legge elaborato dalla Commissione
Ancora sullo "schema" della Commissione Caselli sui di cui prende il nome istituita per la repressione dei
reati agroalimentari "reati agroalimentari", colpisce la modifica dell'
art. 223 delle disposizioni attuative del codice di
G. Mazzolari (7) procedura penale al quale è aggiunto il comma 3
Nasce il Ministero dell'Agroalimentare
bis che recita; "Gli esiti delle analisi effettuate con
M. Iammarino (9) metodiche diverse da quelle descritte in leggi
Validazione ed accreditamento dei metodi chimici di speciali, disposizioni ministeriali o regolamenti
analisi in campo alimentare: principi, modalità operative comunitari sono valutati a norma dell'articolo 189
e procedure gestionali del codice".

V. Pullini (17)
Detto Art. 189 (Codice di procedura penale) sotto
Brevi note a margine della Sentenza n. 36506/2015 il titolo (Prove non disciplinate dalla legge) recita:
della Cassazione in punto di prove illegittimamente "Quando è richiesta una prova non disciplinata
acquisite per mancata o errata applicazione del diritto dalla legge, il giudice può assumerla se essa
europeo in tema di validazione dei metodi analitici risulta idonea ad assicurare l'accertamento dei
nell'ambito dei controlli ufficiali fatti e non pregiudica la libertà morale della
persona. Il giudice provvede all'ammissione,
Giurisprudenza (20) sentite le parti sulle modalità di assunzione della
Cass. Pen. Sent. n. 36506/15, ud. 19.11.2014 – Propoli prova".
integratore alimentare inquinato da fitofarmaci. Analisi
di laboratorio non accreditato.
Sul punto è riportata nello "schema" una nota
Circolare Ministero della Salute (6) dell'avvocato Lirosi, per conto di
Modifica della lista comunitaria di aromi di cui al FEDERALIMENTARE che "esprime riserve su
regolamento UE n. 872/2012. Chiarimenti tale previsione processuale, ritenendo che la
rigorosità dei metodi e delle procedure di analisi
ufficiali non sia surrogabile con metodiche
probatorie sperimentali che minerebbero la
genuinità della prova stessa, non relegabile
nell'alveo delle prove atipiche".
(segue)

a cura di Istituto Bromatologico Italiano Direttore responsabile: Antonio Neri

ASSOCIATO Unione Stampa Periodica Italiana


VALIDAZIONE ED ACCREDITAMENTO DEI METODI CHIMICI DI ANALISI
IN CAMPO ALIMENTARE: PRINCIPI, MODALITÁ OPERATIVE E
PROCEDURE GESTIONALI

Marco Iammarino, Struttura Complessa "Chimica" – Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della
Basilicata, Foggia

Per "Validazione" di una metodica chimica di analisi si intende la procedura mediante la quale questa viene testata
attraverso un numero statisticamente significativo di prove, in condizioni di variabilità analitica, sulle matrici oggetto
d'indagine; quindi, nel valutare i risultati ottenuti tramite specifici parametri di validazione.
Nella Norma UNI CEI EN ISO/IEC 17025, al punto 5.4.5.1, viene fornita la seguente definizione: "La validazione è la
conferma attraverso l'esame e l'apporto di evidenza oggettiva che i requisiti particolari per l'utilizzazione prevista
siano soddisfatti".
Altre definizioni disponibili per "validazione", sempre specificate nella Norma UNI CEI EN ISO/IEC 17025, sono le
seguenti: "Processo organico di controlli finalizzato a dimostrare che il metodo fornisce risultati adeguati allo scopo
per il quale è applicato", oppure "Processo finalizzato a dimostrare che un metodo può risolvere un determinato
problema analitico".
Quando è richiesta una validazione?
È necessario "validare" una metodica analitica in due casi:
1) La validazione è sempre richiesta nell'ambito dei controlli ufficiali (UNI CEI EN ISO/IEC 17025:2000 - Decisione
No. 2002/657/CE);
2) Si intende procedere con l'accreditamento della metodica d'analisi in questione.
Per quali metodi è richiesta una validazione?
Nella norma UNI CEI EN ISO/IEC 17025:2000 vengono citati:
Metodi ufficiali: Pubblicati o richiamati su G.U. CE o Nazionale;
Metodi normati: emanati da Enti di Normazione ISO (Organismo internazionale), CEN (europeo), UNI (nazionale);
Metodi non normati: emanati da laboratori nazionali di riferimento, da organismi internazionali riconosciuti (AOAC) o
nazionali (ISS-rapporti), pubblicati su riviste scientifiche, altri metodi (specifiche tecniche del produttore – metodi in
kit, ecc.);
Metodi interni (non normati): sviluppato o modificato in modo sostanziale dal laboratorio (es. estensione campo di
applicazione).
Nel caso dei metodi ufficiali o normati, ovvero quelli emanati da organismi internazionali (IUPAC, AOAC) e/o da enti
di normazione (ISO, CEN, UNI), o pubblicati su Gazzetta Ufficiale, non è richiesta una validazione completa, così
come verrà descritta in seguito; bisogna tuttavia garantire e formalizzare la rispondenza ai criteri minimi di rendimento
(es. ripetibilità, recupero %, sensibilità, ecc.). Ovvero, utilizzando una definizione riportata nella 17025, al punto 5.4.2 -
"Scelta dei metodi": "Il laboratorio deve confermare che può correttamente eseguire i metodi normalizzati prima di
metterli in opera". Tale processo viene anche chiamato "Validazione secondaria".
Per i metodi non normati e per quelli "interni" è necessario eseguire l'intera procedura di validazione. Proprio il caso dei
metodi interni è quello più frequente; infatti ci si può imbattere spesso in tipologie di analisi per le quali non è
disponibile un metodo ufficiale o normato. Ad esempio, la matrice di riferimento è diversa da quella da validare, oppure
la strumentazione e la relativa tecnica analitica impiegata nella Norma non è disponibile nel laboratorio e se ne vuole
impiegare una alternativa.
Una volta eseguita la validazione o, come nel caso dei metodi ufficiali-normati, verificata la rispondenza ai requisiti di
rendimento minimi, si può decidere di accreditare la metodica analitica.
Con l'accreditamento di un metodo di analisi, l'Ente Italiano di accreditamento -ACCREDIA- attesta la competenza
tecnica del laboratorio relativamente alla specifica prova, in conformità alle prescrizioni della norma UNI CEI EN
ISO/IEC 17025:2005.
Quando richiedere l'accreditamento di un metodo?
Prima di implementare un piano di lavoro che porti ad una richiesta di accreditamento, è necessario considerare che tale
lavoro richiederà un grosso dispendio in termini di materiali, risorse umane/strumentali e di tempo. Dunque è necessario
valutare quali vantaggi apporterà un accreditamento della metodica.

ALIMENTA vol. XXIV n. 1/16 9


Accreditare un metodo significa, in un certo senso, "assicurarlo" e, in effetti, le prove che si dovranno effettuare ne
assicurano la qualità. Tale "assicurazione" rende il laboratorio certo che il dato che fornirà al cliente è difficilmente
confutabile da altri laboratori, soprattutto se questi sono, a loro volta, accreditati. Tale discorso è valido soprattutto per
quelle metodiche applicate ad analisi di sostanze che, nel corso degli anni, si sono mostrate più a rischio di non
conformità. In questi casi la successive denuncia di esito sfavorevole, se supportata da una metodica accreditata,
risulterà sicuramente più attendibile e meno contestabile anche e soprattutto in sede legale.
Va inoltre sottolineato che l'accreditamento delle prove secondo la norma UNI CEI EN ISO/IEC 17025:2005 è requisito
fondamentale ormai, non solo per quanto concerne i laboratori privati, per potersi proporre sul mercato (i clienti, infatti,
si rivolgono ormai solo a laboratori accreditati), ma anche e soprattutto per gli Enti pubblici che hanno in carico i piani
di controllo degli alimenti in ambito locale, regionale e nazionale.
Ok, come procedere?
Per poter valutare, con parametri statistici significativi, un metodo di analisi e permetterne l'accreditamento, si deve
procedere con una serie di prove ripetute sulle matrici oggetto di analisi nelle quali è presente l'analita ad una precisa
concentrazione.
Tali matrici possono essere:
Matrici Certificate;
Campioni Reali;
Campioni additivati "in-house".
Le matrici certificate sono materiali di riferimento, caratterizzati attraverso una procedura metrologicamente valida, per
una o più proprietà specifiche, accompagnati da un certificato (RM) che fornisce il valore della proprietà specifica,
associato all'incertezza e corredato da una dichiarazione di tracciabilità metrologica (ISO Guide 30:2015).
I campioni reali vengono presi in considerazione nel caso in cui si può disporre di campioni già analizzati (con una
metodica validata ed accreditata) e, quindi, a concentrazione nota. In questo caso, si possono utilizzare tali campioni in
sostituzione delle matrici certificate, assumendo come concentrazione "certificata" quella determinata con la metodica
già validata.
In molti casi non si hanno a disposizione né matrici certificate, né campioni reali. In queste situazioni il laboratorio può
preparare le matrici di riferimento per la validazione, ovvero i campioni additivati in-house. Tale preparazione consiste
nell'additivare i campioni ad una concentrazione prestabilita di analita aggiungendo a questi una precisa quantità di
soluzione standard. Si tratta, a tutti gli effetti, di materiali di riferimento, da preparare secondo precise modalità, così
come descritte nella ISO Guide 80:2014.
Su queste matrici dovranno essere eseguite una serie di prove relative alla metodica da accreditare, seguendo 3 Step
fondamentali:
Test preliminare della metodica nelle condizioni specifiche del laboratorio.
Validazione del metodo.
Richiesta di accreditamento.
STEP 1
Per ottenere l'accreditamento di un metodo di analisi il laboratorio deve testarlo nelle particolari condizioni che
sussistono nel laboratorio stesso (tipo di apparecchiature disponibili, livello di purezza dei reagenti e degli standards,
grado di preparazione ed esperienza del personale addetto, ecc.). Tale verifica è fondamentale quando si vuole
accreditare un metodo normato, ovvero un metodo di riferimento, riconosciuto dalla Commissione Europea.
Anche quando ci si avvale di metodi interni è molto importante verificare alcuni parametri fondamentali, in modo tale
da valutare le eventuali ottimizzazioni da apportare, nel caso in cui tali parametri non risultino soddisfacenti.
La verifica consisterà di alcune prove preliminari, volte a testare le attrezzature disponibili in laboratorio, per effettuare:
la fase preparativa dell'analisi;
le fasi di purificazione del campione;
L'identificazione e la quantificazione dell'analita.
Si tratta di verificare alcune performances minime della metodica, in assenza delle quali non conviene avviare la
procedura di validazione, ma valutare alternative tecnico/procedurali adatte a migliorare i risultati. Tali performances
sono:

ALIMENTA vol. XXIV n. 1/16 10


Linearità strumentale;
Specificità;
Recupero %;
Ripetibilità.
LINEARITÀ STRUMENTALE
La costruzione della retta di calibrazione e la valutazione dei relativi parametri di accettabilità permettono di verificare:
La precisione e la sensibilità della risposta strumentale;
Le proprietà chimico-fisiche degli standard.
Parametri di accettabilità: Per verificare la linearità strumentale è necessario che la retta di calibrazione costruita sia
ritenuta accettabile. Viene ritenuta accettabile una retta di taratura che soddisfa i parametri di accettabilità, ovvero:
Coefficiente di determinazione;
Significatività dell'intercetta;
Pendenza;
Scarto dei residui.
In molti casi, si intende verificata la linearità strumentale soltanto dopo verifica del coefficiente di determinazione (r2)
che, per molte tecniche, è soddisfacente per valori superiori a 0.990. Tale verifica non è tuttavia sufficiente per
assicurare la linearità strumentale. È necessario infatti verificare la significatività dell'intercetta (che non deve essere
significativamente diversa da 0), prova che accerta anche parametri minimi di sensibilità e specificità; l'accettabilità
della pendenza (verifica utile anche per il controllo nel tempo della risposta strumentale e della stabilità degli
standards); e lo scarto dei residui, verifica necessaria per assicurare che l'incertezza relativa alla taratura sia costante nel
tempo.
Sono disponibili attualmente in commercio software validati per l'allestimento e la verifica delle rette di calibrazione.
Il caso della "retta in matrice". È possibile effettuare una calibrazione strumentale, impiegando, al posto delle classiche
soluzioni standard, campioni additivati a concentrazioni crescenti di analita. Tale approccio è sicuramente preferibile in
quanto la quantificazione finale risulta maggiormente corrispondente alle reali condizioni di prova, non è necessario
correggere per il recupero e viene monitorata costantemente l'intera procedura analitica. Tuttavia, tale approccio è
sicuramente di più difficile gestione e spesso si sceglie di non adottarlo al fine di semplificare le procedure.
SPECIFICITÁ
È la capacità di un metodo di distinguere tra l'analita che si intende misurare ed altre sostanze interferenti. Tale
caratteristica dipende strettamente dalla tecnica di misura impiegata, ma può variare anche in base alla classe del
composto ed alla matrice.
Nel caso di una corsa cromatografica HPLC, vediamo l'esempio della determinazione dei nitrati, caratterizzati da un
tempo di ritenzione pari a 13.40 minuti. Nella Figura 1 viene mostrata la verifica della specificità per un campione di
carne bovina, il cui cromatogramma non mostra picchi significativi nella finestra di riferimento.

Nessun segnale
al t.r. = 13.40
+/- 2.5%,
ovvero tra
13.06 e 13.73

Figura 1 – Prova di specificità: carne fresca bovina analizzata per nitrati

ALIMENTA vol. XXIV n. 1/16 11


Per un test preliminare della metodica può essere sufficiente l'analisi di due campioni per ogni matrice oggetto
d'indagine, mentre in sede di validazione deve essere testato un numero minimo pari a 20 campioni.
RECUPERO %
Sulle stesse matrici testate per la specificità, quindi per le quali è stata verificata l'assenza della sostanza d'interesse, può
essere aggiunta una quantità nota di analita e verificarne la percentuale recuperata al termine della prova. La stima del
recupero % (esattezza) dovrebbe sempre essere eseguita utilizzando matrici certificate, in quanto solo in tal caso viene
simulata concretamente la situazione reale di campione contaminato. Nel caso in cui viene eseguita una additivazione, è
necessario, pertanto, rendere il campione quanto più possibile omogeneo con la sostanza aggiunta (es. aumentando i
tempi di contatto, omogeneizzare nuovamente la matrice in presenza dell'analita, ecc.). Per un test preliminare può
essere considerata soddisfacente una percentuale di recupero compresa tra il 60% ed il 120%. Possono a volte
verificarsi percentuali di recupero superiori al 100%, ciò è ammissibile in quanto alcune sovrastime possono essere
dovute ad interferenze sulla misurazione finale. L'importante sarà tenere conto di questo errore correggendo il risultato
finale per la percentuale di recupero determinata in validazione.
RIPETIBILITÁ
In un test preliminare della metodica è conveniente anche saggiare la ripetibilità effettuando più ripetizioni (almeno 4
per ogni specie) sullo stesso campione, additivato con una concentrazione nota di analita. Si andrà quindi a valutare il
CV% (preferibile inferiore al 10%).
In sede di validazione si possono effettuare prove in condizioni di ripetibilità e/o di riproducibilità, secondo quanto
previsto dai Regolamenti relativi alla specifica prova da validare. Si parla di ripetibilità se si valutano risultati di prove
indipendenti effettuate impiegando lo stesso metodo, su elementi di prova identici, nello stesso laboratorio e con lo
stesso operatore che utilizza la stessa apparecchiatura (prove effettuate in un breve intervallo di tempo). Si parla invece
di riproducibilità quando si valuta la precisione elaborando risultati di prove indipendenti impiegando lo stesso metodo,
su elementi di prova identici ma in laboratori differenti con differenti operatori che utilizzano apparecchiature differenti
(può essere studiata anche all'interno dello stesso laboratorio variando gli operatori e le apparecchiature e lavorando su
lunghi intervalli di tempo).
Entrambe vengono solitamente valutate come Scarto Tipo delle n misurazioni effettuate.
I parametri di esattezza (recupero %) e precisione (CV%), ottenuti durante la validazione, devono essere confrontati con
i valori di riferimento che, per i metodi chimici di analisi non normati, sono stati stabiliti nella Decisione 2002/657/CE
(L221/15) che fa anche riferimento all'equazione di Horwitz, utile per valutare la precisione ottenuta in validazione.
Una volta testato, il metodo deve essere VALIDATO. Per VALIDAZIONE di un metodo di analisi si intende:
L'insieme di prove ripetute da effettuare per saggiarne l'attendibilità;
L'elaborazione dei parametri statistici che ne descrivano l'efficienza o ne accertino la corrispondenza ad eventuali
parametri di riferimento;
La stima dell'incertezza di misura;
L'implementazione delle Carte di Controllo;
La corretta stesura di tutto il lavoro svolto, assemblato nel Dossier di Validazione.
STEP 2
LA VALIDAZIONE
I parametri da studiare:
Accuratezza (Esattezza e Precisione);
Recupero;
Linearità;
Specificità;
Ripetibilità-Riproducibilità;
Robustezza;
Limiti di rivelabilità (LOD e LOQ);
Incertezza di misura.

ALIMENTA vol. XXIV n. 1/16 12


ACCURATEZZA
Sulla definizione di accuratezza si possono spesso riscontrare incongruenze e/o imprecisioni. Questo parametro
rappresenta lo scostamento tra il risultato di una prova e il valore di riferimento convenuto. L'accuratezza viene
determinata studiando: Esattezza e Precisione.
L'esattezza rappresenta la concordanza tra il valore medio ottenuto da un'ampia serie di risultati e un valore di
riferimento accettato. Solitamente viene espressa come percentuale di scostamento tra il valore misurato e quello
certificato. Si parla di esattezza nel caso in cui si disponga di matrici certificate, altrimenti, nel caso di campioni additi
vati in-house, è più corretto parlare di verifica e stima del recupero % medio.
La precisione rappresenta la concordanza tra i risultati di prove indipendenti ottenuti in condizioni definite. Viene
espressa in termini di imprecisione come deviazione standard della misurazione.
Vediamo alcuni esempi:
1° caso: Valore certificato: 5 mg L-1. Valori ottenuti da 6 prove ripetute: 8.0 mg L-1; 9.0 mg L-1; 9.0 mg L-1; 8.0 mg L-1;
8.5 mg L-1; 8.5 mg L-1. Valore medio: 8.5 mg L-1.
Dev. Std: 0.45 = Metodo Preciso
Errore: 70% = Metodo non Esatto
In questo caso abbiamo una buona ripetibilità dei dati che corrisponderà ad una bassa deviazione standard; tuttavia, la
media delle 6 misurazioni si discosta di molto dal valore "vero", rendendo la prova non soddisfacente.
2° caso: Valore certificato: 5 mg L-1. Valori ottenuti da 6 prove ripetute: 0.1 mg L-1; 0.3 mg L-1; 0.2 mg L-1; 5.0 mg L-1;
0.5 mg L-1; 25.0 mg L-1. Valore medio: 5.2 mg L-1.
Dev. Std: 9.9 = Metodo non Preciso
Errore: 4.0% = Metodo Esatto
In questo secondo caso, solo una delle sei prove fornisce un risultato comparabile con quello atteso, mentre gli altri
cinque sono caratterizzati da una fortissima dispersione. Tuttavia, paradossalmente, la media delle 6 prove fornisce un
risultato che possiamo considerare esatto (errore: 4.0%). L'elevata deviazione standard che conferma l'evidente
imprecisione del metodo è, comunque, un fattore determinante che comporterà un giudizio ampiamente insoddisfacente
della prova.
3° caso: Valore certificato: 5 mg L-1. Valori ottenuti da 6 prove ripetute: 5.5 mg L-1; 5.0 mg L-1; 4.5 mg L-1; 4.5 mg L-1;
4.5mg L-1; 5.0 mg L-1. Valore medio: 4.8 mg L-1.
Dev. Std: 0.4 = Metodo Preciso
Errore: 4.0% = Metodo Esatto
In quest'ultimo caso è stata verificata una buona ripetibilità (precisione) ed una corretta percentuale di recupero
(esattezza) che possono consentire il proseguimento della procedura validativa.
Limiti di determinazione (LOD e LOQ)
Il limite di determinazione (LOD), o quantità minima rilevabile, è la concentrazione di analita che produce un segnale
significativamente diverso da quello del bianco campione e quindi ascrivibile all'analita, mentre il limite di
quantificazione (LOQ) è la concentrazione più bassa alla quale si può eseguire una misurazione quantitativa. Per alcune
determinazioni chimiche viene richiesta anche la determinazione di altri due parametri relativi alla sensibilità analitica,
ovvero CCα e CCβ. Si tratta rispettivamente del "limite di decisione", ovvero il limite oltre il quale è possibile
concludere con una probabilità di errore pari ad α che un campione è non conforme, e della "capacità di rilevazione",
ovvero il contenuto più piccolo della sostanza che è possibile rilevare, identificare e/o quantificare in un campione con
una probabilità di errore pari a β. Entrambi questi ultimi due parametri vengono impiegati soprattutto per metodiche
cosiddette di "screening", ovvero non quantitative.
LOD e LOQ, come calcolarli?
Esistono vari approcci da poter attuare per la determinazione di LOD e LOQ, quello maggiormente impiegato è stato
descritto da Miller & Miller (1993): LOD = 3.3sa/b e LOQ = 10sa/b, dove sa è la deviazione standard dell'intercetta e b è
la pendenza della retta di calibrazione. Tali valori devono essere poi moltiplicati per il fattore di diluizione (o
concentrazione) caratteristico della specifica procedura per ottenere i limiti di determinazione in matrice. Nel caso della
"retta in matrice" la stima di LOD e LOQ può essere considerata sicuramente più precisa.
LOD e LOQ, come esprimere un risultato?
Sussistono ancora alcune contraddizioni nelle modalità di espressione dei risultati in relazione ai limiti di
determinazione. Nel caso in cui la concentrazione risulti inferiore al LOD non vi è dubbio sul presentare la risposta

ALIMENTA vol. XXIV n. 1/16 13


relativa alla presenza dell'analita nel campione come "non rilevabile"; così com'è altrettanto ovvio presentare una
quantificazione precisa, corredata dalla relativa incertezza di misura, se la concentrazione dell'analita risulta maggiore o
uguale al LOQ. Le contraddizioni possono nascere per i valori compresi tra LOD e LOQ. In questi casi, la soluzione più
appropriata sembra essere la formula "presente, non quantificabile", in quanto è sicura la presenza dell'analita
(concentrazione maggiore o uguale al LOD), tuttavia non è possibile eseguire una precisa quantificazione, a causa
dell'elevato errore che caratterizza la misurazione a livelli così bassi.
ROBUSTEZZA
Questa caratteristica del metodo analitico rappresenta la sua capacità di non essere influenzato significativamente, in
termini di risultati finali, da variazioni deliberate introdotte nelle sue fasi di effettuazione. La robustezza può essere
studiata in condizioni di "minor changes" ovvero variazioni lievi (es. modifica della marca di un reagente, lieve
variazione della velocità o del tempo di una centrifugazione, ecc.), oppure di "major changes" ovvero variazioni
marcate (es. modifica della modalità di estrazione dell'analita dalla matrice, eliminazione di uno step analitico, ecc.).
Tuttavia, negli ultimi anni, si dedicano spesso gli studi di robustezza alla verifica delle potenzialità del metodo in
relazione alla variazione della matrice da analizzare (campo di applicazione). Vale a dire, si modifica la tipologia di
campione analizzare, considerando tale operazione come una condizione di "major change" in modo da ottenere una
estensione del campo di applicazione del metodo senza dover ri-validare l'intera procedura. Un utile approccio per
l'esecuzione degli studi di robustezza, volti alla verifica dell'applicabilità del metodo a matrici diverse rispetto a quella
di validazione, è stato proposto da Youden & Steiner (1975). Tale approccio, corredato dalla verifica della specificità
del metodo, anche per le matrici alternative, può consentire un grosso guadagno per il laboratorio, in termini di tempo e
risorse, nell'ambito delle validazioni dei metodi chimici di analisi.
INCERTEZZA DI MISURA
Per definizione, l'incertezza di misura è il "Parametro, associato al risultato di una misurazione, che caratterizza la
dispersione dei valori ragionevolmente attribuibili al misurando" (UNI ENV 13005:2000). La stima dell'incertezza di
misura è obbligatoria in quanto un metodo validato deve sempre fornire al cliente un risultato finale corredato dalla
relativa incertezza di misura. L'incertezza di una misurazione deriva dalla sommatoria di una serie di errori sistematici e
casuali. I primi si ripetono costantemente e sono quindi prevedibili (pipette, micropipette, cilindri, standards, ecc.). Non
possono essere attenuati effettuando un numero elevato di misure, ma possono essere stimati in modo da correggere il
valore misurato. I secondi sono determinati da variabili casuali che influenzano la misura e che sono al di fuori del
controllo degli operatori (effetti termici, dovuti all'operatore, ecc.). Nel corso degli ultimi anni sono stati proposti
diversi metodi per l'elaborazione e la stima dell'incertezza di misura. Un approccio affidabile e non particolarmente
complesso è quello proposto da Hund et al. (2001), nel quale i paramateri di validazione, così come studiati in
precedenza, vengono impiegati seguendo il metodo cosiddetto "bottom-up". In pratica si tratta di sommare in quadratura
i vari fattori di incertezza in ingresso, ad esempio:
ū =  (ū (C) )2 + (ū (V) )2 + (ū (W) )2
dove ū indica l'incertezza relativa, C è la concentrazione dell'analita (ricavata da quattro fonti di incertezza: (a)
preparazione degli standards; (b) ripetibilità del metodo; (c) recupero % del metodo; (d) curva di calibrazione), V è
l'incertezza relativa alle misurazioni dei volumi e W è l'incertezza relativa alle operazioni di pesata. Viene poi
solitamente impiegato un fattore di copertura k pari a 2, corrispondente ad un livello di confidenza pari al 95%, per
ottenere la cosiddetta "incertezza estesa".
Incertezza di misura: Quando un campione è da considerare positivo?
Vediamo la figura seguente:

Nei casi A e D non vi sono dubbi, A è un campione sicuramente negativo, mentre D è sicuramente positivo. Come
comportarsi nei casi B e C? In questi due casi i campioni non possono essere considerati positivi, quindi non si procede
con la denuncia di esito sfavorevole di analisi, in quanto non sussiste la certezza di positività, così come invece
apprezzabile nel caso D. Tuttavia il caso C merita un approfondimento, in quanto la concentrazione misurata (120 µg
kg-1) è ben superiore rispetto al limite massimo residuale (100 µg kg-1). L'incertezza relativa non ci consente di

ALIMENTA vol. XXIV n. 1/16 14


procedere con una denuncia di esito sfavorevole in quanto la concentrazione "vera" potrebbe essere anche inferiore a
100 µg kg-1 e precisamente scendere fino a 96 µg kg-1. Ciò nonostante, dovrebbe essere sempre cura dell'Ente preposto
ai controlli, provvedere ad una comunicazione, mediante la quale il cliente venga messo a conoscenza del risultato
"positivo" ottenuto per l'analisi in questione, considerato al netto dell'incertezza di misura. Tale informazione può
risultare particolarmente utile nei casi in cui il produttore o l'azienda in questione abbiano la possibilità di porre rimedio
alla problematica e garantire, in tal modo, un livello maggiore di sicurezza alimentare.
STEP 3
L'ACCREDITAMENTO
Per richiedere l'accreditamento all'Ente Italiano di Accreditamento ACCREDIA è necessario:
"Formalizzare" tutto quello che è stato fatto in sede di validazione (Documenti di validazione)
Definire i tempi e le modalità di riesame della validazione
Stabilire con precisione i responsabili e gli esecutori delle prove
Gestire in maniera adeguata le apparecchiature, i reagenti ed i materiali di riferimento
Gestire il mantenimento della qualità
DOCUMENTI DI VALIDAZIONE
Procedura Tecnica (PT): in cui si descrive tutta la tecnica, le apparecchiature, i reagenti ed i materiali di riferimento, le
modalità di espressione dei risultati e di controllo qualità del dato finale
Dossier di Validazione: in cui vengono assemblati, elaborati e valutati tutti i dati relativi alle prove effettuate in sede di
validazione
Dichiarazione di Conformità: in cui il Responsabile della prova, visti i risultati ottenuti in sede di validazione, dichiara
la tecnica validata, adatta allo scopo richiesto.
RIESAME DELLA VALIDAZIONE
Periodicamente, deve essere effettuato un riesame della validazione, come definito al punto 5.4.5.3 della Norma UNI
CEI EN ISO/IEC 17025: "…..dovrebbero essere eseguiti riesami regolari per verificare che le esigenze del cliente
continuino ad essere soddisfatte". Tale esame consiste nel valutare l'adeguatezza della validazione rispetto ad eventuali
variazioni legislative e/o tecniche, sopraggiunte nel tempo, e provvedere ad eventuali variazioni ed aggiornamenti.
RESPONSABILITÁ
Sulla PT devono essere specificate le responsabilità della prova (es. Dirigente Responsabile), inoltre nell'apposito
Registro del Personale, devono essere indicati gli operatori abilitati all'esecuzione della prova. Tale abilitazione si può
formalizzare allegando al curriculum dell'operatore una prova della metodica in questione, eseguita dall'operatore
stesso, in doppio, della quale vengono valutati il recupero % e la ripetibilità.
GESTIONE APPARECCHIATURE E MATERIALI
In prossimità delle apparecchiature necessarie per lo svolgimento della prova devono essere consultabili:
I manuali delle strumentazioni
Le registrazioni delle verifiche del corretto funzionamento delle stesse
Le registrazioni delle carte di controllo e di eventuali Ring/Proficiency Tests, adeguatamente valutate e compilate.
Per i materiali di riferimento occorre allestire un apposito Registro nel quale indicare:
Luogo e temperature di stoccaggio
Date di apertura delle confezioni e date di scadenza
Eventuali soluzioni diluite, preparate in laboratorio, con relativi luoghi, temperature di stoccaggio, date di preparazione
e di scadenza.
È necessario inoltre allegare i certificati delle ditte produttrici e le eventuali schede tossicologiche.
MANTENIMENTO DELLA QUALITÁ
Le performances analitiche e strumentali che caratterizzano il metodo validato ed accreditato, verificate in fase di
validazione, devono essere confermate nel tempo, attraverso il cosiddetto mantenimento della qualità. Tale
mantenimento si assicura mediante due prove: allestimento delle carte di controllo e partecipazione a Proficiency/Ring
Test; i risultati delle quali devono essere poi adeguatamente verificati, valutati ed archiviati.

ALIMENTA vol. XXIV n. 1/16 15


Carta di controllo: È un diagramma temporale di una quantità che si assume costante, costruito allo scopo di verificare il
mantenimento nel tempo della precisione e dell'esattezza del metodo. Per fare questo, si esegue una prova in doppio, ad
intervalli di tempo predefiniti, oppure solo in occasione dell'analisi ufficiale nel caso di metodiche eseguite raramente.
Sono disponibili attualmente in commercio software validati per l'allestimento delle carte di controllo.
Ring Test / Proficiency Test: L'adesione al Ring Test o al Proficiency Test (detti anche circuiti interlaboratorio) è
ancora facoltativa nell'ambito della richiesta di accreditamento. Tuttavia una partecipazione ai circuiti attesta in maniera
oggettiva, perché accertata da terzi (ovvero l'Ente organizzatore) l'adeguatezza del laboratorio allo svolgimento
dell'analisi in questione. La differenza tra le due tipologie consiste nel fatto che nel Ring Test tutti i laboratori adottano
la stessa tecnica, mentre nel Proficiency Test possono essere impiegate tecniche diverse (in quest'ultimo caso il circuito
può essere organizzato anche per valutare la tecnica d'elezione per un particolare tipo di determinazione). Il laboratorio
non dovrà far altro che svolgere l'analisi su campioni a concentrazione incognita e fornire il risultato finale, che sarà
confrontato sia con il valore atteso (se disponibile) che con quelli forniti da tutti gli altri laboratori partecipanti.
Documenti e pubblicazioni di riferimento:
Commissione Europea. Linee Guida SANCO/2004/2726: "Guidelines for the implementation of Decision 2002/657/EC".
Commissione Europea. Decisione N. 2002/657/CE del 12 agosto 2002 che attua la direttiva 96/23/CE del Consiglio relativa al
rendimento dei metodi analitici e all'interpretazione dei risultati.
ISO - International Organization for Standardization. UNI CEI EN ISO/IEC 17025:2005: "Requisiti generali per la competenza dei
laboratori di prova e di taratura".
ISO - International Organization for Standardization. ISO Guide 30:2015: "Reference materials - Selected terms and definitions".
ISO - International Organization for Standardization. ISO Guide 80:2014: "Guidance for the in-house preparation of quality control
materials (QCMs)".
Commissione Europea. Regolamento (CE) n. 882/2004 del Parlamento Europeo e del Consiglio del 29 aprile 2004 relativo ai
controlli ufficiali intesi a verificare la conformità alla normativa in materia di mangimi e di alimenti e alle norme sulla salute e sul
benessere degli animali.
Gruppi di lavoro dei settori chimici degli II.ZZ.SS. "Linea guida per la validazione intra-laboratorio di metodi di prova e di
conferma per la determinazione delle sostanze non autorizzate in accordo con la Decisione 2002/657/CE".
Miller EJC & Miller JN. 1993. Statistics for Analytical Chemistry. 3rd ed. New York (USA): Ellis Horwood PTR Prentice Hall.
p.115.
Youden WJ & Steiner EH. 1975. Statistical Manual of the AOAC. Washington DC (USA): Association of the Official Analytical
Chemists. p. 35.
UNI - Ente Italiano di Normazione. Norma UNI CEI ENV 13005:2000: "Guida all'espressione dell'incertezza di misura".
Hund E, Massart DL, Smeyers-Verbeke, J. 2001. Operational definitions of uncertainty. Trends Analytical Chemistry, 20(8): 394–
406.
Desimoni E, Brunetti B. 2004. "Assicurazione di qualità nel laboratorio chimico. Validazione dei metodi di analisi". ECM -
Educazione continua in medicina.
UNICHIM, Manuale n. 197: "Guida alla scelta e all'uso dei materiali di riferimento", Milano (2003).
UNICHIM, Manuale n. 179: "Linee guida per la validazione di metodi analitici nei laboratori chimici", Milano (1999).
IUPAC Technical Report: "Harmonized guidelines for single-laboratory validation of methods of analysis". Pure and Applied
Chemistry (2002).

ALIMENTA vol. XXIV n. 1/16 16


View publication stats