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DETERMINAZIONE SPETTROFOTOMETRICA DELLA LATTATO DEIDROGENASI (LDH)

INTRODUZIONE E SIGNIFICATO CLINICO


La Lattato Deidrogenasi è un enzima che catalizza la riduzione dell’acido piruvico ad acido lattico:
LDH
Acido piruvico + NADH + H+ ⇄ Acido lattico + NAD+
La reazione è reversibile, ma l’equilibrio è fortemente spostato verso l’acido lattico.
Questo enzima è largamente diffuso nei tessuti dell’organismo e nelle cellule ha una localizzazione
citoplasmatica. Il tessuto con la più elevata concentrazione di LDH è il rene, ma si trova anche nel
miocardio, nei muscoli scheletrici, nella milza, nel fegato e nei polmoni. La LDH è un tetramero formato da
4 subunità con caratteristiche chimico-fisiche diverse e formate da 2 tipi di monomeri: il tipo H ed il tipo M;
dalla loro combinazione si ottengono 5 isoenzimi (enzimi, cioè, che catalizzano la stessa reazione ma che
differiscono tra loro nella sequenza degli amminoacidi che costituiscono la catena polipeptidica).
La distribuzione dei vari isoenzimi nei diversi tessuti è la seguente:
● LDH1: miocardio, muscoli scheletrici, eritrociti, rene;
● LDH2: polmoni, miocardio, eritrociti, pancreas, rene;
● LDH3: polmoni, placenta, muscoli scheletrici, pancreas;
● LDH4: polmoni, placenta, muscoli scheletrici, rene;
● LDH5: fegato, rene, pancreas.
I valori di riferimento vanno da 200 a 480 UI/l. Quando le cellule sono danneggiate o distrutte, l’enzima LDH
viene rilasciato nel sangue comportando un suo aumento. Il suo dosaggio, quindi, rappresenta un
indicatore generale di un danno tissutale e cellulare, ma esso non è un test specifico per la larga diffusione
di questo enzima nell’organismo. In caso di infarto del miocardio i valori della LDH (in particolare della
LDH1), rispetto a quelli della AST e della Creatina fosfochinasi, aumentano più tardivamente (24-72 ore) e
tornano alla normalità dopo circa 10 giorni; questo consente una diagnosi tardiva di infarto del miocardio.
Nell’epatite virale vi è un aumento dell’isoenzima LDH 5, ottenendo un aumento della LDH totale nel siero
più modesto di quello di altri enzimi (in particolare di quello delle transaminasi) e, quindi, il valore
diagnostico di questa determinazione è limitato. Nelle anemie emolitiche vi è un aumento della LDH totale
nel siero per liberazione dell’enzima da parte degli eritrociti. Nei portatori di neoplasie maligne vi può
essere aumento della LDH totale nel siero ed è stato osservato anche un certo rapporto tra l’entità di
questo aumento e la rapidità di crescita del tumore. Aumenti della LDH totale nel siero sono stati rilevati
nelle lesioni muscolari per distrofie o lesioni infiammatorie. Infine, aumenti della LDH totale nel siero sono
stati osservati nei casi di carcinoma renale, cistiti acute. Una diminuzione, invece, dei valori di LDH totale al
disotto di 200UI/l non ha alcuna rilevanza diagnostica. Il dosaggio della LDH, con il metodo di seguito
descritto, non è in grado di fornire indicazioni su quale isoenzima crei l’aumento rispetto ai valori di
riferimento; infatti, per avere tali indicazioni si ricorre alla separazione elettroforetica dei 5 isoenzimi.
PRINCIPIO DEL METODO
La lattato deidrogenasi (LDH) catalizza la reazione di riduzione dell’acido piruvico ad acido lattico con
ossidazione del NADH a NAD+ . L’ossidazione del NADH a NAD+ crea una riduzione dei valori di assorbanza
(letta a 340 nm) direttamente proporzionale all’attività dell’enzima LDH (UI/l).
REATTIVI
R1 = tampone pH 7.3, EDTA Na2 (conservante), acido piruvico;
R2 = tampone pH 7.3, NADH;
Campione = siero o plasma.
PROCEDIMENTO
Lunghezza d’onda: 340 nm (334 o 365 nm);
Temperatura: 37 °C.
Pipettare in due provette di vetro, precedentemente siglate con B (Bianco) e C (Campione):

BIANCO CAMPIONE
REATTIVO R1 800μl 800μl
CAMPIONE (SIERO) // 20 μl
ACQUA DISTILLATA 20μl //
Mescolare ed incubare a 37 °C per 1 minuto, quindi aggiungere:
REATTIVO R2 200 μl 200 μl

Mescolare ed incubare a 37 °C per 1 minuto; travasare il contenuto delle provette in due cuvette di quarzo,
leggere l’assorbanza iniziale del campione azzerando con il bianco, ripetere la lettura ad intervalli costanti
di 1 minuto per 3 minuti. Calcolare il valore medio delle variazioni di assorbanza (in decremento) al minuto
(ΔA/min = ΔA1 + ΔA2 + ΔA3 / 3) e moltiplicare per il fattore 8095, ottenendo così i valori di LDH in UI/l di
campione.
LDH (UI/l) = ΔA/min x 8095

DETERMINAZIONE SPETTROFOMETRICA DELLA GAMMA – GLUTAMILTRANSFERASI (GGT o γ-GT)


INTRODUZIONE E SIGNIFICATO
La GGT è un enzima che appartiene alla classe delle transferasi e catalizza il trasferimento di un gruppo
glutammico da un peptide ad un amminoacido ed è coinvolta nel trasferimento di amminoacidi attraverso
le membrane cellulari. La GGT è presente in numerosi tessuti: il contenuto più elevato si trova nel rene e,
precisamente, nelle cellule dei tubuli renali, seguito dal pancreas e dal fegato. Esso è presente anche
nell’intestino, nei polmoni, nella milza e nella tiroide. I suoi valori, in condizioni normali, vanno da 8 a 31
UI/l nelle donne e da 10 a 50 UI/l nell’uomo. L’interesse clinico della determinazione della GGT nel siero
risiede nel fatto che questo enzima aumenta costantemente in tutte le patologie epatiche e biliari e, solo
raramente, in altre condizioni morbose. Infatti, gli aumenti più marcati si osservano negli itteri da
ostruzione delle vie biliari (ittero post-epatico), insieme all’aumento della bilirubina diretta.
Nell’epatite virale la GGT aumenta, ma meno delle transaminasi, ed il ritorno ai valori normali avviene
lentamente. Inoltre, si riscontrano aumenti di questo enzima nel siero di pazienti con tumori epatici (ittero
intra-epatico). Infine, la determinazione della GGT nel siero costituisce un indice molto sensibile
dell’intossicazione alcolica; infatti, è sufficiente l’introduzione di una quantità modesta di alcool per
determinare un innalzamento dei valori di GGT nel siero e valori costantemente elevati si riscontrano negli
alcolisti cronici. Il dosaggio della GGT, inoltre, è utile per controllare l’astensione dall’alcool di un etilista in
fase di disintossicazione poiché, quando l’alcolista sospende l’introduzione di alcool, il valore della GGT
torna ai valori normali. Aumenti della GGT si possono osservare anche in caso di pancreatite, neoplasie
renali, diabete, carcinoma pancreatico. Nel siero sono presenti 3 diversi isoenzimi della GGT: quello più
abbondante migra, nella separazione elettroforetica, con una velocità corrispondente all’albumina; un
secondo isoenzima migra con una velocità corrispondente alle α 2- globuline ed entrambi sono presenti
normalmente nel siero; un terzo isoenzima, con velocità di migrazione corrispondente alle β- globuline, si
ritrova solo in caso di ittero.
PRINCIPIO DEL METODO
L’enzima GGT catalizza il trasferimento del gruppo gamma-glutammile dalla gamma–glutamil–carbossi–
nitroanilide alla gliciglicina. La reazione libera la p–nitroanilina la cui assorbanza, misurata a 405 nm, è
direttamente proporzionale all’attività della GGT presente nel campione.
REATTIVI
R1 = tampone (pH 8.25), glicilglicina;
R2 = gamma-glutamil-carbossi-nitroanilide.
Campione: siero o plasma
PROCEDIMENTO
Lunghezza d’onda: 405 nm (400-420 nm)
Temperatura di lavoro: 37 °C

Pipettare in due provette di vetro, siglate con B (BIANCO) e con C (CAMPIONE) :

BIANCO CAMPIONE
REATTIVO R1 800 μl 800 μl
CAMPIONE (SIERO) // 100 μl
ACQUA DISTILLATA 100 μl //
Mescolare ed incubare a 37 °C per 1 minuto, quindi aggiungere:
REATTIVO R2 200 μl 200 μl

Mescolare ed incubare a 37 °C per 1 minuto; travasare il contenuto delle provette in due cuvette di vetro,
leggere l’assorbanza iniziale del campione azzerando con il bianco, ripetere la lettura ad intervalli costanti
di 1 minuto per 3 minuti. Calcolare il valore medio delle variazioni di assorbanza (in decremento) al minuto
(ΔA/min = ΔA1 + ΔA2 + ΔA3 / 3) e moltiplicare per il fattore 1159, ottenendo così i valori di GGT in UI/l di
campione.
GGT (UI/l) = ΔA/min x 1159