10/6/2009

Cromatografia Liquida
de Alta Eficiência
CLAE – HPLC
Introdução

Introdução
Definições..
Definições

Surgiu a partir da cromatografia gasosa;

Método físico-
físico-químico de separação;

Fase móvel e fase estacionária - imiscíveis;

Migração diferencial – diferença de equilíbrio dos
analitos;
analitos;

Fatores que afetam o equilíbrio:

composição da fase móvel,

composição da fase estacionária

Temperatura

taxa de fluxo

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Introdução
Definições

Utiliza
Utiliza--se de instrumentos sofisticados que podem
ser totalmente automatizados;

Colunas recheadas de materiais especialmente

preparados e uma fase móvel que é eluída sob
altas pressões;

Capacidade de realizar separações e análises

quantitativas e qualitativas;

Introdução
FASE MÓVEL(FM) FASE ESTACIONÁRIA(FE)

Ser de alto grau de pureza;

Ter capacidade máxima de

Dissolver a amostra sem amostra;
decompor seus
componentes;
Dar melhor resolução na
separação da mistura;

Não decompor ou dissolver
a fase estacionária;
Ser de fácil introdução na
coluna;

Ter baixa viscosidade;

Produzir pequena queda de

Ser compatível com o tipo pressão;
de detector utilizado;

Possuir baixo custo;

Ter polaridade adequada
para permitir uma separação
conveniente.

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Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)

• Vantagens
Vantagens::
• rapidez de análise, alta eficiência, reprodutibilidade
sensibilidade e possibilidade de automação.
• Limitações::
Limitações
• custo do equipamento, necessidade de operador experiente,
ausência de detector universal, emprega solventes de alta
pureza e materiais de alto custo.
• Aplicações::
Aplicações
• Análise qualitativa e quantitativa de ácidos nucléicos,
pesticidas, hidrocarbonetos poliaromáticos (HPAs),
HPAs),
polímeros, lipídeos, drogas farmacêuticas, herbicidas,
aditivos, antioxidantes, análises clinicas, aminoácidos,
carboidratos, etc.

Introdução
Modos/fases de operação

Fase Normal POLARIDADE: FE > FM

Fase Reversa POLARIDADE: FE < FM

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Fase móvel para CLAE (fase Reversa)

• Os eluentes mais usados Metanol é o mais utilizado

envolvem misturas de solvente como fase móvel
água com: é barato e absorve =
205nm
205 nm na região UV
metanol
Acetonitrila é um dos solvents
acetonitrila mais utilizado como fase móvel
Tetrahidrofurano THF é relativamente
é usado para barato
alterar ae
Tampão mais usados:
usados: absorve < 190nm
190 nm na região
polaridade de FM (metanol,
Tampão Fosfato Dihidrogenio de fosfatoUV de potassio pH 1,1 – 1,3é
água, acetonitrila) porém
Citrato de Dihidrogenio debastante
sódio instável e ,3forma
pH 11
11, – 11
11,,3
Acetato de trisódio peróxido.. Absorve pH
peróxido < 212nm
212
3,8 nm
– 5,na
6
Cloreto de amonia região UV pH 8,3 – 10
10,,3

Força de eluição do solvente

Nomógrafo para alteração de solventes no modo reverso

acetonitrila:água

metanol:água

THF:água

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Tampão: supressor iônico

• Tampão iônico em CLAE -fase

reversa

• Minimizar a interação entre o

analito e fase estacionária

• Uso em pH 2 – 8
• Diminuição do alargamento
do pico

• Exemplo: separação de
Paracetamol (pKa 9,5) e
Ácido acetil salicílico(pK
salicílico(pKa 3,5)
Mudar eluente

Fase móvel para CLAE (Fase Normal)

• Os eluentes mais usados são os seguinte:

– Hexano
– Isopropanol
– Metanol
– Cloreto de metileno (composto organoclorado !!!)
– Diclorometano (composto organoclorado !!!)
– Clorofórmio (composto organoclorado !!!)

Seria possível usar água ?

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MODOS DE SEPARAÇÃO NA CLAE

• Cromatografia por adsorção (CLS)
• Cromatografia por partição (CLL)
• Cromatografia fase ligada (CFL)
• Cromatografia troca iônica (CTI)
• Cromatografia exclusão(CLE)
• Cromatografia por afinidade(CLA)

Instrumentação