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com/science/article/pii/S0960982215015183

Sommario

L'azoto è il quarto elemento più abbondante nella biomassa cellulare e comprende la maggior parte
dell'atmosfera terrestre. L'interscambio tra azoto gassoso inerte (N2) nell'atmosfera esistente e
"azoto reattivo" (quei composti azotati che supportano o sono prodotti del metabolismo e della
crescita cellulare) è interamente controllato dalle attività microbiche. Questo non era il caso,
tuttavia, nell'atmosfera primordiale, quando le reazioni abiotiche probabilmente giocavano un ruolo
significativo nell'inter-trasformazione degli ossidi di azoto. Sebbene tali reazioni abiotiche siano
ancora importanti, il ciclo dell'azoto esistente è guidato dalla fissazione riduttiva del diazoto e da un
inventario enzimatico che facilita le reazioni di produzione di diazoto. Prima dell'avvento del
processo Haber-Bosch (la fissazione industriale di N2 in ammoniaca, NH3) nel 1909, quasi tutto
l'azoto reattivo nella biosfera è stato generato e riciclato da microrganismi. Sebbene il processo
Haber-Bosch abbia più che quadruplicato la produttività delle colture agricole, i fertilizzanti chimici
e altre fonti antropiche di azoto fisso ora superano di gran lunga i contributi naturali, portando a un
degrado ambientale senza precedenti.
Il significato dell'azoto per la biosfera e per la vita cellulare è indiscutibile; tuttavia, la nostra
conoscenza fondamentale dei microrganismi e dei processi enzimatici che trasformano l'azoto nei
suoi vari stati di ossidazione rimane incompleta. Qui, descriviamo i principali processi microbici del
ciclo dell'azoto, i microrganismi che eseguono le trasformazioni dell'azoto e la modularità e la storia
evolutiva del ciclo dell'azoto e forniamo una prospettiva di questo ciclo, ora e nel futuro.

Figura 1. Intermedi del ciclo dell'azoto.


Intermedi, che rappresentano nove stati di ossidazione, che donano o accettano elettroni,
contribuendo così al flusso di elettroni e alla conservazione dell'energia nei microbi
partecipanti.

Principali processi del ciclo dell'azoto

Il ciclo dell'azoto è stato tradizionalmente suddiviso in tre processi - fissazione di N 2, nitrificazione


e denitrificazione - e i microbi sono stati storicamente etichettati dalla loro partecipazione
identificata a uno di questi processi, cioè “fissatori di azoto”, “nitrificatori” e “denitrificanti”.
Questa assegnazione di microbi a specifiche coorti eco-fisiologiche in base alla loro associazione
con un singolo processo è stata esaminata quando gli ecologi hanno trovato prove di una riduzione
dissimilatoria (cioè non assimilatoria) del nitrito in ossidi nitrici e protossido di azoto in ambienti
ossici, così come la riduzione dissimilatoria del nitrito in ammonio e ossidazione dissimilatoria
dell'ammonio in ambienti anossici. La nostra precedente comprensione del ciclo dell'azoto è stata
complicata dai numerosi e diversi approcci e obiettivi scientifici - dai composti che sono stati
trasformati, ai composti che sono stati generati, allo stato ambientale delle reazioni che hanno
costituito i processi. Gli obiettivi ristretti in questi approcci - impiegati per oltre 100 anni nella
ricerca sul ciclo dell'azoto - sono stati superati nell'era post-genomica grazie alla strumentazione
molto migliorata, una grande ricchezza di dati e una maggiore collaborazione interdisciplinare e
internazionale. Pertanto, la nostra comprensione del ciclo dell'azoto consiste ora in cinque flussi di
trasformazione dell'azoto accettati: ammonificazione, inclusa la fissazione dell'azoto, e riduzione
assimilatoria e dissimilatoria del nitrito; denitrificazione, inclusa la denitrificazione canonica,
dipendente da nitrificazione e dipendente da ossidazione del metano; anammox, come forma di
nitrificazione-denitrificazione accoppiata; e interconversione nitrito-nitrato. I processi generali di
mineralizzazione della materia organica (spesso etichettati erroneamente come “ammonificazione”)
e assimilazione (spesso erroneamente affermato di includere processi che regolano la generazione di
ammonio e il suo assorbimento) da parte della vita cellulare completano il movimento dell'azoto
reattivo attraverso la biosfera.

Figura 2. Principali processi del ciclo dell'azoto.


Le reazioni che compongono i sette principali processi del ciclo dell'azoto sono
rappresentate dai cerchi numerati. L'ammonizzazione può essere ottenuta mediante il
processo 1, riduzione del diazoto (indicato anche come "fissazione dell'azoto" o "Nif"), o
mediante il processo 2, riduzione del nitrito dissimilatorio ad ammonio (DNRA). La
nitrificazione è composta dal processo 3, l'ossidazione dell'ammoniaca in nitrito
(denominata anche "nitritazione") e dal processo 4, l'ossidazione del nitrito in nitrato
(denominata anche "nitratazione"). Il processo 5, riduzione del nitrato in nitrito, può essere
accoppiato ai processi 2, 6 o 7 in una popolazione o in una comunità. La denitrificazione è
indicata come processo 6, denominato anche “gassificazione con ossido di azoto”.
Anammox è mostrato come processo 7, ed è anche indicato come “nitrificazione-
denitrificazione” accoppiata.

Ammonificazione

La fissazione dell'azoto è una delle due versioni dell'ammonificazione ed è realizzata da batteri e


archeobatteri che codificano i complessi enzimatici nitrogenasi costituiti dalla proteina molibdeno-
ferro dinitrogenasi e dalla proteina vanadio o ferro dinitrogenasi reduttasi. Sebbene ci sia uno
slancio per ingegnerizzare geneticamente le piante per esprimere complessi microbici di nitrogenasi
o per esprimere la via di segnalazione per attrarre batteri nodulanti che fissano l'azoto per
colonizzare le colture di cereali, la fissazione biologica dell'azoto rimane un'attività svolta
esclusivamente da batteri e archei. La fissazione dell'azoto è estremamente sensibile all'ossigeno e
richiede ai microrganismi di sviluppare meccanismi protettivi, come il disaccoppiamento spaziale
(compartimentazione o formazione di cellule specializzate), disaccoppiamento temporale, rapido O2
respirazione o massimizzazione della sintesi e del turnover della nitrogenasi. L'ammonio prodotto
dalla fissazione dell'azoto viene assimilato nella biomassa o viene ulteriormente respirato da
microbi ossidanti l'ammoniaca aerobici e anaerobici. Questo accoppiamento della reazione 1 con la
reazione 3 o 7 si verifica tra microbi attivi nel ciclo dell'azoto nelle comunità o all'interno di singole
cellule, come nei batteri metanotrofici nitrificanti che fissano l'azoto.
La riduzione dei nitriti anaerobici assimilatori (ANRA) e dissimilatori (DNRA) ad ammonio è la
seconda versione dell'ammonificazione ed è eseguita sia da batteri che da funghi. Questo processo
può essere collegato alla riduzione dei nitrati in nitriti a livello cellulare o tra organismi in una
comunità. L'acronimo DNRA è stato originariamente coniato per descrivere un processo eco-
fisiologico in cui l'azoto sotto forma di nitrato veniva rimosso in modo tracciabile dal suolo senza
essere perso sotto forma di gas azotati (denitrificazione) o assimilato nella biomassa microbica.
Mentre il significato di ANRA e DNRA per il ciclo globale dell'azoto facilitato dalla fermentazione
di funghi nel suolo non è ben compreso, l'ammonificazione respiratoria da parte di batteri e archaea
in diversi habitat anossici è ben stabilita. DNRA può generare una forza motrice protonica cellulare
e quindi conservare energia per supportare la crescita cellulare, sebbene questa caratteristica
dipenda da quali enzimi sono accoppiati. Un potenziale redox negativo (cioè condizioni riducenti) è
lo stimolante più importante per DNRA.

Nitrificazione

Il processo di nitrificazione coinvolge tre coorti di microrganismi: coorte I, ossidanti


dell'ammoniaca che ossidano l'ammoniaca in nitrito (nitritazione; reazioni 3A e 3B); coorte II,
ossidanti di nitriti che ossidano i nitriti in nitrati (nitratazione; reazione 4); e coorte III, ossidanti
dell'ammoniaca completi che ossidano l'ammoniaca fino al nitrato (comammox; reazioni 3A, 3B e
4). Sebbene i microrganismi comammox siano stati scoperti solo nel 2015, la loro esistenza era
prevista circa 10 anni prima. Le coorti II e III includono solo microbi chemolitotrofici che possono
utilizzare nitriti e ammoniaca, rispettivamente, come uniche fonti di energia e riducenti per la
crescita cellulare. Mentre i chemolitotrofi nitriti-ossidanti della coorte II sono classificati in diverse
classi di Proteobacteria e phylum Nitrospirae, i batteri comammox sono, finora, limitati ai
rappresentanti della linea II del genere Nitrospira. I microbi nitrificanti che ossidano l'ammoniaca
della coorte I includono membri chemolitotrofici di Betaproteobacteria e Gammaproteobacteria e
membri del Thaumarchaeota. Oltre a questi chemolitotrofi, ci sono microrganismi eterotrofi e
metanotrofi che ossidano efficacemente l'ammonio in nitrito, ma non ottengono energia dal
processo per supportare la crescita. Il nitrito e il nitrato prodotti dalle reazioni aerobiche nel
processo di nitrificazione possono essere respirati anaerobicamente oppure l'ammonio risultante può
essere assimilato.

Denitrificazione

La denitrificazione descrive il processo di respirazione anaerobica di nitrito (NO 2-), ossido nitrico
(NO) e protossido di azoto (N2O) in N2. Microbi eterotrofi che può direttamente coppia queste tre
reazioni con riduzione dei nitrati a nitriti ed eseguire denitrificazione da NO 3- di N2 sono indicati
come denitrifiers classiche o canonici. È tuttavia riconosciuto che molti batteri e archaea esprimono
inventari denitrificanti solo parziali e mancano geni che codificano per enzimi coinvolti nelle
reazioni 5, 6B e / o 6C. Tali percorsi incompleti possono portare al rilascio di gas azotati come NO
e N2O nell'ambiente o al mancato esaurimento di NO 3-. Questo gruppo comprende tutti i batteri
chemolithotrophic ammoniaca-ossidante, che riducono NO2-di N2O aerobicamente. Inoltre, diversi
eucarioti, inclusi funghi e foraminiferi (una classe di protisti), possono ridurre l'NO 2- o l'NO3- a N2O
o N2, rispettivamente. In una svolta insolita al processo denitrificante, un batterio metanotrofico,
Candidatus Methylomirabilis oxyfera, consuma metano come fonte di energia, riducente e carbonio
e riduce l'NO2- a N2 esprimendo un ossido nitrico dismutasi. Questo enzima dismuta due molecole
di NO in O2 e N2 senza produrre l'intermedio N2O; l'O2 prodotto viene quindi utilizzato da questo
batterio per ossidare il metano a metanolo mentre risiede in un ambiente anossico, da cui il nome
“metanotrofio intraossigenico denitrificante”.

Anammox

Anammox, o ossidazione anaerobica dell'ammonio, utilizza i pool di NO2- e ammonio (NH4+) per
formare N2 tramite gli intermedi NO e idrazina (N2H4). La letteratura recente ha anche suggerito
l'esistenza di una via di anammox modificata, in cui viene utilizzata idrossilammina (NH 2OH) al
posto di NO per l'ossidazione di NH4+, ma saranno necessarie ulteriori sperimentazioni per
convalidare questo percorso. La chemolitotropia dell'anammox viene eseguita esclusivamente dai
batteri Brocadiaceae nell'ordine Planctomycetales all'interno di un organello specializzato chiamato
anammoxosome. Anammox è ecologicamente vantaggioso per il trattamento delle acque reflue
poiché rimuove contemporaneamente nitriti e ammonio senza produrre N2O ed è stato
implementato industrialmente su vasta scala. Anammox è anche un importante processo di
rimozione dell'azoto nell'oceano e nelle zone con un minimo di ossigeno.

Dagli organismi alla modularità del ciclo dell'azoto

Per centinaia di anni, i microbiologi hanno arricchito e isolato i microrganismi dall'ambiente per
collegare entità biologiche discrete a processi particolari. L'enzimologia dei suddetti processi del
ciclo dell'azoto è stata ampiamente scoperta utilizzando colture axeniche di microrganismi,
portando all'impressione che questi filotipi microbici coltivati dovrebbero anche essere i principali
attori responsabili di tali processi nell'ambiente. Ad esempio, i primi batteri ossidanti l'ammoniaca
furono isolati negli anni 1890 e una grande proporzione di conoscenze biochimiche, fisiologiche e
genetiche sull'ossidazione dell'ammoniaca derivò dalla ricerca eseguita con questi stessi isolati. Per
molti anni, gli ecologi microbici si sono affidati a sequenze geniche e attributi fisiologici derivati da
un piccolo numero di isolati per rilevare ed enumerare gli ossidanti dell'ammoniaca nell'ambiente.
Tuttavia, negli anni 2000, le sequenze metagenomiche hanno mostrato un'associazione
inconfutabile tra ammoniaca monoossigenasi (il primo enzima coinvolto nella chemolitotrofia
dell'ammoniaca) e geni di rRNA 16S archaeal che hanno spostato l'attenzione dagli ossidanti
batterici dell'ammoniaca a una nuova impresa di ricerca basata sull'ossidazione dell'ammoniaca
thaumarchaeota. In seguito alla scoperta del thaumarchaeota ossidante l'ammoniaca, fu il primo
ceppo isolato nella coltura pura le sequenze metagenomiche hanno mostrato un'associazione
inconfutabile tra l'ammoniaca monoossigenasi (il primo enzima coinvolto nella chemolitotrofia
dell'ammoniaca) e i geni dell'rRNA 16S archeologico che ha spostato l'attenzione dagli ossidanti
batterici dell'ammoniaca a una nuova avventura di ricerca basata sul thaumarchaeota che ossida
l'ammoniaca. In seguito alla scoperta del thaumarchaeota ossidante l'ammoniaca, fu il primo ceppo
isolato nella coltura pura le sequenze metagenomiche hanno mostrato un'associazione inconfutabile
tra l'ammoniaca monoossigenasi (il primo enzima coinvolto nella chemolitotrofia dell'ammoniaca) e
i geni dell'rRNA 16S archeologico che ha spostato l'attenzione dagli ossidanti batterici
dell'ammoniaca a una nuova avventura di ricerca basata sul thaumarchaeota che ossida
l'ammoniaca. In seguito alla scoperta del taumarcheota ossidante l'ammoniaca, fu il primo ceppo
isolato nella coltura pura Nitrosopumilus maritimus nel 2005, consentendo la caratterizzazione
fisiologica e biochimica di un gruppo completamente diverso di chemolitotrofi ossidanti
l'ammoniaca.
Oltre a rivelare phyla completamente nuovi di microbi del ciclo dell'azoto che avevano eluso
approcci secolari dipendenti dalla coltivazione, il sequenziamento del genoma e del metagenoma ha
anche rivelato che i singoli moduli, indipendenti da percorsi integrati completi, sono codificati ed
espressi dai microrganismi per eseguire singoli segmenti di azoto -ciclo metabolismo. Ad esempio, i
batteri metanotrofi possono esprimere molti geni che codificano per enzimi con un coinvolgimento
noto nei processi di fissazione dell'azoto, nitrificazione e denitrificazione. Curiosamente, non esiste
un'associazione prevedibile tra i geni del ciclo dell'azoto e il filotipo tra i metanotrofi. Inoltre,
l'entità dell'inventario del ciclo dell'azoto è dispersa; alcuni metanotrofi codificano insieme nitriti e
ossido nitrico riduttasi, alcuni fissano l'azoto e codificano una suite di geni di denitrificazione,
mentre altri possono codificare solo una reduttasi o nessuna. Quindi, i fattori ambientali
apparentemente guidano eventi di trasferimento genico laterale casuale per eseguire compiti per
migliorare l'idoneità di una particolare specie, portando così alla differenziazione di nicchia. Ad
esempio, l'acquisizione e l'espressione di moduli nitrificanti potrebbe consentire a determinati
metanotrofi di sopravvivere a carichi di ammonio elevati in situazioni in cui l'NH 3 può competere
con il metano per l'accesso agli enzimi metano monoossigenasi. Allo stesso modo, l'espressione di
moduli denitrificanti può consentire a una specie metanotrofica di crescere in ecosistemi quasi
anossici. La fissazione dell'azoto è intrinsecamente modulare, con cluster di geni distribuiti tra
numerosi phyla batterici e archeologici, sostenendo ancora una volta che le condizioni dell'habitat
selezionano per questo tratto.
Per la maggior parte della storia della ricerca sul ciclo dell'azoto, ci siamo attenuti al concetto che
gli organismi di particolari filotipi sono nitrificanti, denitrificanti, fissatori dell'azoto e simili.
Questo concetto di organismo è ora messo in discussione dalla consapevolezza che i geni e i
processi del ciclo dell'azoto non sono necessariamente vincolati dal filotipo, ma piuttosto forniscono
agli organismi l'inventario necessario per adattarsi e prosperare negli ecosistemi in cui le molecole
azotate subiscono cambiamenti dinamici nella concentrazione e nella composizione. Immaginare il
ciclo dell'azoto come un continuum di evoluzione modulare è di conseguenza la prospettiva più
parsimoniosa.

Ciclo dell'azoto moderno e sfide sociali

È diventato ampiamente riconosciuto, in particolare nell'analisi degli studi sulla produzione


alimentare e sul cambiamento climatico globale, che il destino dell'umanità è intrecciato con la
nostra capacità di controllare il ciclo dell'azoto. Da un lato, la Rivoluzione Verde del 20 ° secolo
scongiurato una crisi alimentare mondiale, in parte con l'introduzione diffusa l'utilizzo di
fertilizzanti sintetici. Per mettere questo in prospettiva, il processo Haber-Bosch è responsabile
dell'alimentazione di circa il 48% della popolazione umana globale, equivalente a sostenere quattro
miliardi di nascite dal 1908. Dall'altro lato, con la nostra crescita demografica estremamente rapida
e il continuo aumento dell'uso di fertilizzanti, abbiamo spinto il ciclo dell'azoto oltre la sostenibilità,
dove ora NO3- inquinamento è responsabile per aumentare le zone morte in zone costiere e N 2O è
considerato il gas serra chiave per mitigare nel 21 ° secolo e oltre. Il controllo del ciclo dell'azoto è
un affare complicato, in parte a causa del nostro successo con la produzione alimentare dipendente
dai fertilizzanti, e anche perché stiamo ancora scoprendo come funzionano i processi microbici del
ciclo dell'azoto. Ad esempio, le scoperte relativamente recenti dei processi anammox e comammox,
così come la scoperta del thaumarchaeota ossidante l'ammoniaca (descritto sopra) hanno rivelato
organismi e processi che hanno profondamente influenzato il modo in cui vediamo e studiamo le
trasformazioni dell'azoto e i fattori ambientali che le controllano. Inoltre, controlli metabolici e
ambientali su organismi e processi che rilasciano e accumulano i principali inquinanti, come NO 3- e
N2Oh, rimani in gran parte misterioso. Sebbene si sia tentati di utilizzare la manipolazione genetica
per progettare colture di cereali che fissano l'azoto o per migliorare gli inibitori della nitrificazione,
le soluzioni tecnologiche continueranno a essere limitate dalla nostra comprensione della
microbiologia sottostante. Spetta quindi alla scienza e alla società prestare attenzione al ciclo
dell'azoto e prendere spunto dai microbi che alla fine lo controllano.

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