Alessia, Amanda, Alessio, Matteo BIC-Olivone settembre 2009

Gli oli essenziali

quello che non ti hanno mai detto sulla camomilla e altro...

Introduzione:
Durante la settimana a Olivone, ci siamo occupati di separare e quantificare gli oli essenziali
presenti nella droga di rosmarino, camomilla, menta e timo, seguendo la normativa della
farmacopea svizzera.
In seguito abbiamo verificato il loro effetto antibatterico (battericida, batteriostatico) sugli
enterococchi umani per tramite di antibiogrammi.

Cosa sono gli oli essenziali:

Gli oli essenziali sono miscugli di sostanze volatili profumate, composte da molecole aromatiche
ma anche da molecole alifatiche.
Vengono ricavate da diverse parti della pianta (droga) grazie ad una distillazione in corrente di
vapore. Gli oli essenziali sono dei lipidi solubili in molti composti organici ma poco solubili in
acqua, alla quale tuttavia possono trasferire il loro aroma poiché leggermente idrofili.

Possono essere estratti soprattutto da fiori e foglie ma anche da semi radici, rizomi, cortecce e bulbi.

Nella pianta l’olio essenziale è una miscela di diversi metaboliti secondari. Sono prodotti in minori
quantità rispetto ai metaboliti primari (tutto ciò che serve alla pianta per sopravvivere come
carboidrati, proteine, acidi nucleici,…), infatti la produzione dei metaboliti secondari dipende da
pianta a pianta e da fattori ambientali. I metaboliti secondari permettono alla pianta di difendersi
dall’aggressione di erbivori, da organismi patogeni ma anche dallo stress causato da fattori abiotici
particolari.
Le componenti principali degli oli essenziali sono terpenoidi, fenoli semplici e fenil propanoidi. É
un gruppo fitochimico che costituisce lo 0.01% e il 2% di tutte le componenti della pianta. Non tutte
le piante producono gli oli essenziali. Nelle piante che li producono varia sia la quantità che la
qualità. Ne abbiamo riscontrato la veridicità nell’estrazione degli oli essenziali dalla camomilla.
Infatti con il doppio di droga di camomilla abbiamo ottenuto quantità di olio essenziale molto
minore rispetto alle altre piante.
L’insieme delle parti dalle quali si estrae l’olio essenziale si chiama droga (da non confondere con
le droghe voluttuarie). Nella droga, gli oli essenziali sono contenuti in particolari cellule che li
secernano.

Utilizzo degli oli da parte dell’uomo:

Gli oli essenziali possono essere utilizzati nel settore cosmetico, alimentare e terapeutico. In
quest’ultimo settore possono essere usati come antidepressivi, antispastici, antisettici, cicatrizzanti.
Però, se assunti in dosi eccessive possono anche causare effetti collaterali, quali intossicazioni.
L’olio essenziale ha anche un potere antiossidante e/o battericida che si può misurare mediante un
antibiogramma.

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Parte speriementale
Quantificazione secondo la farmacopea svizzera:
La distillazione in corrente di vapore permette di ricavare l’olio essenziale presente in una certa
quantità di droga di una determinata pianta.

Piante utilizzate:

Camomilla comune (Matricaria recutita L.)

L'olio essenziale viene estratto dai capolini mediante estrazione in corrente di vapore, é prodotto in
quantità molto limitata dalla pianta ed é di colore blu, ha un forte odore dolciastro.
Le sostanze principali presenti nell'olio essenziale sono: camazulene (assente nel fiore fresco, si
forma durante il processo di distillazione), bisabolene, α-farnesene, ossido di α-bisabololo.

Menta (Mentha piperita L.)

L'olio viene estratto da fiori e foglie della pianta mediante estrazione in corrente di vapore, é di
colore giallino e verdognolo ed ha un odore mentaceo.
Tra le sostanze principali vengono evidenziate il mentolo (29-48%), il mentone (20-31%),
mentilacetato, mentofurano, α e β-pinene, limonene, fellandrene, terpinene, cineolo, isomentone,
piperitone, pulegone, jasmone, neomentolo, sabinene, aromandrene, murolene, b-cariofillene,
bisabolene, bicicloelemenene, viridiflorolo, timolo, carvacrolo, aldeide acetica e isovalerianica.

Timo (Thymus vulgaris L.)

L' olio viene estratto tramite estrazione in corrente di vapore dalle foglie e dalle sommità fiorite, é
di colore verde chiaro ed ha un profumo dolce.
Le sostanze principali sono il timolo e il carvacrolo (69%), cimene, terpinene, canfene, borneolo,
linalolo.

Rosmarino (Rosmarinum officinalis L.)

L'olio essenziale é estratto dalle foglie e dalle sommità fiorite, é di colore chiaro ed ha un profumo
mentaceo molto forte, se di qualità scadente ha un odore canforaceo.
Le sostanze presenti sono pineni, canfene, limonene, cineolo, borneolo, canfora, linalolo,
teroineolo, acetato di bornile.

La distillazione in corrente di vapore ed i suoi vantaggi

La distillazione è una tecnica nella quale si riescono a separare le sostanze da una miscela iniziale
sfruttando i differenti punti di ebollizione delle componenti della miscela. Una volta raggiunto il
punto di ebollizione che è determinato dalla pressione e dalla temperatura alla quale si trova la
miscela da separare, i vapori delle componenti volatili si separano dalla miscela e vengono
trascinati verso la parte più fredda dell’apparecchiatura nella quale condensano (condensatore).
Il punto di ebollizione delle fasi liquide presenti nella miscela dipende dalle sostanze che
contengono e dalla loro concentrazione:
- il punto di ebollizione di una soluzione ideale è una media pesata dei punti di ebollizione
delle singole componenti
- il punto di ebollizione di due fasi immiscibili a contatto tra loro è invece leggermente
inferiore al punto di ebollizione della fase più volatile che nel nostro caso è l’acqua.
In ogni caso si raggiunge il punto di ebollizione solo quando la pressione dei vapori all’interno della
bolla (del liquido in ebollizione) raggiunge la pressione misurata all’esterno della bolla (nel nostro
caso la pressione atmosferica).

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Uno dei vantaggi della distillazione in corrente di vapore consiste nel fatto che durante il
procedimento di separazione dell’olio, la droga si mantiene a temperature leggermente inferiori ai
100°C evitando così la decomposizione delle sostanze termolabili eventualmente presenti nell’olio.
Quando i vapori condensano si ottengono due fasi liquide (lipidica e acquosa), che si mantengono
separate permettendone la quantificazione.

Procedimento: vedi dispense Olivone

Risultati ottenuti:

Gruppo 1:

Campione in Droga iniziale [g] Olio estratto [ml] Tenore in oli Tenore minimo
esame [ml/kg] [ml/kg]
Rosmarino 25.06 g 0.28 ml 11.173 ml/kg >25 ml/kg
Camomilla 40.00 g 0.05 ml 1.25 ml/kg >4 ml/kg
Timo 25.06 g 0.7 ml 27.9 ml/kg >12 ml/kg
Menta 15.02 g 0.23 ml 15.31 ml/kg >12 ml/kg

Gruppo 2:

Campione in Droga iniziale [g] Olio estratto [ml] Tenore in oli Tenore minimo
esame [ml/kg] [ml/kg]
Rosmarino 25.00 g 0.44 ml 17.6 ml/kg >25 ml/kg
Camomilla 40.00 g 0.02 ml 0.5 ml/kg >4 ml/kg
Timo 25.01 g 0.75 ml 29.99 ml/kg >12 ml/kg
Menta 15.06 g 0.23 ml 15.27 ml/kg >12 ml/kg

Discussione
Per prima cosa si può iniziare dicendo che le quantità di droga iniziali, a causa di errori
sperimentali, non erano del tutto perfette.
Questo fattore, probabilmente, può aver condizionato i risultati, anche se, crediamo, non in modo
determinante. Se si confronta il tenore in oli essenzialimisurato, con quello prescritto dalla
Pharmacopea Europea, si giunge alla conclusione che soltanto due risultati soddisfano i criteri,
mentre gli altri due sono pienamente lontani dal soddisfarli. Le cause che possono aver influito sui
risultati negativi possono essere molte: innanzitutto le parti della droga utilizzata, dove e quando
essa è stata raccolta, la sua esposizione alla luce solare e quanto tempo dopo la raccolta è stata
utilizzata. Tutti questi fattori sono da tener conto per la buona riuscita dell’esperimento. Le
differenze tra i due gruppi sono state minime, tranne però quella del rosmarino, dove supponiamo
che un gruppo abbia preso un campione della droga più ricco di foglie e l’altro un campione
contenente una maggior quantità della parte legnosa.

Valutazione dell’attività antimicrobica mediante l’antibiogramma

Lo scopo della nostra esperienza con gli oli essenziali é determinare l'azione antibatterica e/o
batteriostatica di alcuni oli essenziali estratti. La tecnica usata è quella dell’antibiogramma.

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L'antibiogramma é una prova di sensibilità in vitro o in vivo di una specie o una comunità batterica
a uno o più prodotti antibiotici (nel nostro caso gli oli essenziali di Timo, Camomilla, Menta e
Rosmarino).

La differenza tra resistenza e sensibilità sta nell’effetto antibiotico:

La resistenza all'antibiotico si manifesta quando la proliferazione ed il potere patogeno dei batteri
NON é influenzato dall'antibiotico, quindi esso é inutile a scopo terapeutico battericida

La sensibilità all'antibiotico si manifesta invece quando la proliferazione ed il potere patogeno dei

batteri é influenzato dall'antibiotico, quindi esso é utile a scopo terapeutico.

L'effetto dell'antibiotico può essere battericida, cioè esso uccide le cellule batteriche, oppure
batteriostatico, cioè inibisce la crescita batterica.

Per effettuare l'antibiogramma abbiamo utilizzato il metodo per diffusione (prova di sensibilità su
terreno solido inoculato).
In una capsula contenente dell'agar abbiamo inserito i batteri contenuti nel Bioflorin ( enterococchi
ceppo SF68 umani) in ogni capsula sono presenti 104 cellule, ottenute per diluizione progressiva.
Preparazione delle capsule: si deve preparare un fondo nutritivo e molto acquoso per lo sviluppo dei
batteri. L'agar é l'ideale per questo. È composto da cristalli che in soluzione acquosa a temperature
elevate si sciolgono formando un liquido, e in seguito al raffreddamento si solidifica e diventa una
specie di gel.

Diluizione della coltura di batteri:

Sopra all'agar abbiamo applicato due dischetti di carta bibula, uno imbevuto di olio essenziale e uno
di controllo (H2O).
Le capsule vengono poi incubate a 37° per 24 ore. In seguito si osserva il risultato, misurando
l'alone di inibizione, cioè la zona attorno al cerchietto di carta bibula dove non sono cresciuti
batteri.
Per confrontare gli anelli di inibizione bisogna seguire il protocollo standard:
Il peso molecolare della molecola di antibiotico (più essa é leggera più la diffusione sarà ampia)
L'idrofobicità della molecola di antibiotico ( l'agar é a base di acqua)
Il confronto é possibile solo tra molecole simili e soprattutto nella stessa capsula.

Alone di inibizione: da 1 a 9 mm: specie resistente

da 10 a 18 mm: specie con resistenza intermedia
> 19 mm: specie sensibile

Risultati ottenuti (analizzati solo timo, menta e rosmarino)

Menta: misurato anello di inibizione di 130 mm circa

Timo: misurato anello di inibizione di 140 mm circa.
Rosmarino: non ha anello di inibizione

Mentolo

Nell'analisi del potere antimicrobico (disinfettante, antibiotico, battericida) su agar dei vari oli
essenziali, si è potuto constatare che non tutti hanno questo potere. Dai risultati si é potuto
constatare che il timo ha la maggiore proprietà battericida (alone di inibizione 4.4 centimetri), la
menta ha una debole proprietà battericida (alone di inibizione 1,3 centimetri), mentre il rosmarino
non ha potere battericida. Non si è potuto osservare se la camomilla ha potere battericida, poiché

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nell’estrazione si è dovuto utilizzare lo Xilene che è tossico per l'uomo e potrebbe esserlo anche per
i batteri. Ora ci siamo chiesti come mai il timo ha questo potere, e osservando le molte sostanze in
esso contenute riteniamo possa essere la presenza di timolo. Controllando nella letteratura abbiamo
potuto constatare che questo olio essenziale ha potere disinfettante. Questo però non spiega come
mai anche la menta, contenente principalmente il mentolo, ha potere antimicrobico. Si é supposto
che anche il mentolo potesse avere le stesse proprietà, ma dalla nostra ricerca è risultato che questo
ha solo proprietà rinfrescanti. Per questo é molto usato nei dentifrici. Controllando meglio nei
principi attivi della menta si é scoperto che anch'essa contiene timolo, e visto che ha un potere
antimicrobico meno forte del timo si é supposto che il timolo sia presente in minori quantità.

Timolo: Mentolo:

Caratterizzazione dell’olio essenziale mediante gascromatografia (GC)

Mentre la distillazione in corrente di vapore è la tecnica a cui si fa riferimento per determinare la
concentrazione percentuale degli oli essenziali presenti in una determinata droga, la
caratterizzazione chimica in termini di composizione viene svolta di regola mediante la
gascromatografia.
La gascromatografia è una tecnica di separazione, impiegata a scopo analitico per campioni che
contengono sostanze volatili entro i 270°C.
Le sostanze della miscela vengono separate in base alla velocità con la quale riescono a percorrere
un lungo tubo contenente o rivestito internamente con una fase che rimane ferma all’interno di esso
(fase stazionaria). In questa tecnica si riescono a far fluire le sostanze ad una velocità differente
sfruttando il differente modo con cui queste si distribuiscono tra una fase ferma (stazionaria) e una
fase mobile, costituita da un gas inerte: le sostanze che hanno una maggior affinità per la fase
stazionaria vengono frenate maggiormente delle altre.

I meccanismi di separazione utilizzati sono:

-adsorbimento: la fase stazionaria è un solido sulla cui superficie si trovano dei siti attivi in grado
di stabilire una serie di legami secondari (dipolo-dipolo, ponte idrogeno, Van der Waals, dipolo-
dipolo indotto, ecc.) con le diverse molecole della miscela da risolvere, si parla perciò di
cromatografia gas-solido (GSC)
-ripartizione: se la fase stazionaria è liquida si verifica una vera e propria solubilizzazione delle
sostanze in questa fase, nella quale il gas si ripartisce lungo il liquido. Si parla di cromatografia gas-
liquido (GLC).

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Schema e funzionamento del gas cromatografo
La gascromatografia è costituita da una colonna nella quale scorre un gas trasportatore più la
sostanza volatile da analizzare. I gas inerti più utilizzati come fase mobile per trasportare la sostanza
sono l'azoto, l'elio o l'argon. Lungo il percorso il gas può scorrere attraverso una fase solida o
liquida che costituiscono la fase immobile del sistema. Il processo di separazione avviene per le
varie velocità di spostamento delle sostanze, permettendo così di separare le componenti della
miscela da analizzare.

Cromatogramma

3 55

6 6

1 2
1 44

1) Sistema di alimentazione gas di trasporto (carrier).

Si tratta di bombole di gas inerte (azoto, elio, argon), talvolta può essere utilizzato anche l’idrogeno.
Lo scopo principale é quello di trascinare i componenti della miscela in analisi lungo la colonna
cromatografica.
2) Sistema di alimentazione dei gas per il rivelatore FID.
Qualora si utilizzi un rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID) è necessario alimentare un
combustibile ed un comburente (ad esempio idrogeno ed aria).
3) Iniettore o camera di iniezione.
Il suo compito é assicurare l’istantanea vaporizzazione del campione.
4) Colonna.
Le colonne sono alloggiate in una camera termostatica, in genere a circolazione di aria calda, con
questo sistema viene assicurata una buona stabilità di temperatura. Un dispositivo permette
all’operatore di fissare la temperatura, la quale può essere mantenuta costante per tutta la durata
dell’analisi (isoterma) oppure fatta variare (programmata).
5) Rivelatore.
I dispositivi in grado di rivelare la presenza di una sostanza estranea nel gas di trasporto, a valle
della colonna.
6) Registratore e integratore.
Il segnale in uscita dal rivelatore passa ad un registratore che ha il compito di realizzare il tracciato
cromatografico: il cromatogramma.

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Risultati e discussione
Grazie alla gascromatografia siamo riusciti a separare le sostanzi presenti nell’olio essenziale (OE)
di timo e della menta. Rapportando l’area del picco cromatografico assegnato al timolo, nel
cromatogramma della menta, con quella misurata sul cromatogramma del timo, possiamo inoltre
confrontare la concentrazione del timolo presente nell’OE della menta con quella nell’ OE di timo
(abbiamo iniettato nel gascroatogramma per entrambi gli OE lo stesso volume ).

Dall’analisi cromatografia abbiamo notato inoltre che gli oli essenziali, provenienti da due piante
differenti della stessa specie, contengono le stesse sostanze, ma che queste differiscono spesso nella
concentrazioni in cui si trovano (nell’olio).

Per illustrare ciò abbiamo riportato i due cromatogrammi dell’analisi gascromatografica svolta per
un campione di olio essenziale di menta proveniente dalla montagna e per un campione proveniente
dalla pianura. Analizzando i due cromatogrammi, si osserva che il numero di picchi presenti nei
cromatogrammi è lo stesso e che questi (se le condizioni in cui si svolge l’analisi sono le stesse)
vengono registrati negli stessi istanti (stessi tempi di ritenzione).
Le aree sottostanti i differenti picchi non sono però sempre uguali anche se le condizioni di analisi e
la quantità di OE iniettato è lo stesso in entrambi i casi.
Queste variazioni sono dovute ad una differente concentrazione di alcuni dei metaboliti secondari
che costituiscono l’OE , differenza probabilmente dovuta a fattori ambientali quali: l'esposizione al
sole, l’altitudine, la composizione del suolo, dell’ecosistema...

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Identificazione e quantificazione di una sostanza presente in un OE
mediante gascromatografia

Dal numero di picchi del cromatogramma, si può dedurre il numero di sostanze presenti nell’olio
essenziale (assumendo che la separazione sia stata completa) ma non si riesce a determinare, senza
ulteriori informazioni, di che sostanza si tratta. Se si conoscono i tempi di ritenzione (tR) - misurati
in condizioni ben determinate- si può escludere la presenza di determinate componenti se questi
sono sufficientemente differenti. Spesso accade però che i tempi di ritenzione siano troppo vicini gli
uni agli altri rispetto alla scarsa precisione con la quale questi si possano misurare: le fluttuazioni
casuali dei tR sono relativamente grosse. Per questo motivo all’ OE da analizzare si aggiunge un
campione della sostanza che si ritiene essere presente e che si vuole identificare. In seguito alla
gascromatografia si controlla su quale picco è avvenuto un aumento. Ad esempio nel caso del timo
si sa che contiene del timolo, ma per rilevare quale picco corrisponde a questa sostanza si aggiunge
un po' di timolo nel campione da analizzare. Questo procedimento eseguito più volte e con
quantitativi variabili della sostanza di riferimento, permette di accertarsi della presenza di tale
sostanza nell’OE ma anche di quantificarne la presenza mediante una curva di calibrazione.

Dal cromatogramma alla curva di calibrazione

Il cromatogramma è un diagramma che rappresenta il segnale generato dal rivelatore in funzione del
tempo trascorso dall’iniezione. Grazie ad esso è possibile qualificare e quantificare le sostanze
contenute nel campione.
La curva di calibrazione si costruisce riportando graficamente l’area sottostante il picco di una
determinata sostanza, in funzione della quantità in cui si trova nel campione iniettato. È necessario
effettuare quindi diverse gascromatografie, minimo tre. Questa curva è spesso una retta in quanto la
relazione tra l’area sottostante il picco cromatografico della sostanza e il quantitativo di sostanza
presente nel campione è una proporzionalità diretta. Dall'area (o dall'altezza) del picco che si misura
sul cromatogramma dell’OE da analizzare, mediante la curva di calibrazione è possibile
determinare la quantità e la concentrazione della componente specifica.

Esempio di retta di calibrazione

Curiosità:
Scienziati italiani hanno isolato nelle radici del vetiver - pianta erbacea di origine sub tropicale che
possiede un apparato radicale molto profondo - dei batteri in grado di promuovere la produzione di
oli essenziali e di modificarne la composizione, aumentandone le proprietà termicide, insetticide,
antimicrobiche e antiossidanti. Le radici del vetiver, coltivate per la produzione di oli essenziali,
forniscono sostanze largamente utilizzate in profumeria e in cosmetica. Si tratta di composti chimici
complessi che comprendono alcoli, idrocarburi e sesquiterpeni, la più grande classe di terpenoidi
presenti in natura, che nel vegetale hanno funzioni attrattive (come feromoni) e di mantenimento
dello stadio giovanile.

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