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APLICADA
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I. DIRECTORIO
RECONOCIMIENTOS
LIC. EN BIOL. FRANCISCA LAGUNES OLIVARES
I.Q.I. ISRAEL ESTRADA GARCIA
II. PROFESORES DE LA CARRERA DE TECNOLOGÍA DE
ALIMENTOS
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE LA HUASTECA HIDALGUENSE.
MICROBIOLOGÍA APLICADA
ESTA OBRA, SUS CARACTERÍSTICAS Y DERECHOS SON PROPIEDAD DE LA
COORDINACIÓN GENERAL DE UNIVERSIDADES TECNOLÓGICAS (CGUT)
FRANCISCO PETRARCA No.321, COL. CHAPULTEPEC MORALES, MÉXICO D. F.
LOS DERECHOS DE PUBLICACIÓN PERTENEEN A LA CGUT. QUEDA
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN PARCIAL O TOTAL POR CUALQUIER MEDIO,
SIN AUTORIZACIÓN PREVIA Y POR ESCRITO DEL TITULAR DE LOS
DERECHOS.
ISBN (EN TRAMITE)
IMPRESO EN MÉXICO
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II. INDICE
CONTENIDO PÁGINA
I. DIRECTORIO Y RECONOCIMIENTOS 2
II. ÍNDICE 3
V. UNIDADES TEMÁTICAS
Unidad 1. Fermentación, métodos de cultivo y cinética. 5
Unidad 2. Cultivos industriales. 10
Unidad 3. Fermentación alcohólica. 13
Unidad 4. Fermentación acética. 23
Unidad 5. Vinificación. 28
Unidad 6. Fermentación láctica. 33
Unidad 7. Producción de biomasa. 46
Unidad 8. Enzimas microbianas y producción de aminoácidos.
VII ANEXOS 52
Prácticas de laboratorio.
3
INTRODUCCIÓN A LA ASIGNATURA
Los alimentos elaborados a base de fermentaciones han existido desde hace miles de
años. Por ejemplo, la mayoría de las dietas incluyen vinagre, fruto de la fermentación
mixta del vino mediante levaduras y, posteriormente, acetobacter (fermentos acéticos). El
acetobacter aparece espontáneamente cuando el vino está expuesto al aire, aunque la
producción comercial conlleva el uso de tanques de vinagre. La palabra "VINAGRE"
proviene de vinagre (del francés, vino agrio). Aunque no sólo se elabora a partir del vino,
cualquier otra bebida alcohólica puede emplearse como base, como por ejemplo la
cerveza para producir vinagre de malta; y también algunas frutas (frambuesas,
manzanas)o verduras y almíbares.
Los microorganismos también se utilizan para elaborar aditivos que dan consistencia a
los alimentos. Muchas gomas producidas por microorganismos se utilizan en la industria
alimentaria como espesantes, emulgentes y excipientes. Éstas pueden estabilizar la
estructura del alimento y hacerlo más agradable tanto a la vista como al paladar. Las
gomas más comunes son la xantina y la dextrina, producidas por cepas de las bacterias
Xanthomonas y Leuconostoc respectivamente.
4
En resumen, los microorganismos beneficiosos resultan de gran importancia en la
elaboración de alimentos. Sin ellos, nuestra dieta perdería tanto en sabor como en
variedad y sería menos nutritiva.
NOMBRE:_____________________________________________________________
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IV.- UNIDADES TEMÁTICAS
OBJETIVOS DE APRENDIZAJE:
Analizar el concepto de fermentación.
Identificar la importancia de los distintos medios de cultivo en las
fermentaciones.
Identificar los diferentes requerimientos energéticos y nutricionales para el
diseño, clasificación y control de un proceso de fermentación.
Establecer los diferentes métodos de fermentación en relación a su
funcionamiento.
DEFINICIÓN DE FERMENTACIÓN:
TIPOS DE FERMENTACIÓN:
o Fermentación acética
o Fermentación alcohólica
o Fermentación butírica
o Fermentación cítrica
o Fermentación láctica
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Que no produzcan sustancias tóxicas .
Tiempo de conservación debe de ser considerado (que el microorganismo no se
muera rápido).
El microorganismo debe ser industrialmente rentable .
Que crezca o se desarrolle en condiciones relativamente sencilla.
CULTIVO DE MICROORGANISMOS.
7
Siembra en jeringa Asa de
nicromio
Caja petri
Tanque
fermentador
a nivel industrial.
Segundo
recultivo
Etapa
fermentativa
Envasado
m y envío
Dosificador
Solución
Termómetro
Fermentador
En este tipo de fermentación las necesidades del material son escasos. El principio
consiste en tomar con ayuda de asas o ganchos material de un cultivo madre, para
sembrarlo directamente en los medios nutricios sólidos.
Siembra en jeringa
Asa de
nicromio
Caja petri
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UNIDAD 2.- CULTIVOS MICROBIANOS INDUSTRIALES
OBJETIVOS DE APRENDIZAJE:
Óptimo
Mínimo Máximo
Logaritmo Logaritmo Logaritmo
No. de No. de No. de
M.O M.O M.O
10
Influencia de conservación de iones de hidrógeno sobre procesos de fermentación.
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UNIDAD 3.- FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA
OBJETIVOS DE APRENDIZAJE:
Reacciones químicas de fermentación alcohólica.
Identificar las características bioquímicas y tecnológicas de la producción
de etanol, su inóculo y su preparación.
Identificar los diferentes requerimientos energéticos y nutricionales para el
diseño, clasificación y control de un proceso de fermentación.
Establecer los diferentes métodos de fermentación en relación a su
funcionamiento.
FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA
INTRODUCCIÓN.-
BEBIDAS ALCOHOLICAS.
12
Ejemplo de un proceso para una bebida alcohólica jugo vegetal 80 y 230 g/l de
azúcares fermentables pH:
3.6 y 4.3 antes de sulfatarlo.
Clarificación Microfiltración.
Inóculo cultivo puro.
Fermentación 20 y 28°C bajo una atmósfera de CO2.
DESTILACIÓN.
FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA.
13
Enzima : término propuesto en 1878 por Friedrich Wilhem Kuhne para designar a
las sustancias catalíticamente activas, a las que previamente se les había llamado
fermento. Derivado de las palabras griegas en (en) y zumos (levaduras).
GLICÓLISIS.
Derivado del griego glycos = azúcar (dulce), Lysis = disolución que quiere decir
azúcar en disolución.
La glucólisis es la secuencia de reacciones que convierte a la glucosa en piruvato
con la producción convidante de ATP.
La glicólisis es una de las diversas rutas catabólicas , conocidos generalmente
como fermentaciones anaerobias, mediante muchos organismos , obtienen energía
química de varios combustibles orgánicos en ausencia de oxígeno molecular.
Dado en que los organismos vivos sugieren inicialmente en una atmósfera que
careció de oxigeno.
La glicólisis es la secuencia de las reacciones que invierten la fructosa en piruvato
con la producción conocidamente en ATP . En los organismos aeróbicos la glicólisis sirve
de preámbulo al ciclo del ácido cítrico y a la cadena de transporte electrónica , las cuales
recolectan la mayor parte de la energía de la glucosa en condiciones aeróbicas , el
piruvato entra a la mitocondria en donde es completamente oxidasa hasta CO2 y H2 O.
Si el suministro es insuficiente como el músculo en contracción del piruvato se convierten
en lactano. En algunos organismos anaeróbicos como las levaduras del piruvato se
convierten en etanol : La formación del etanol y lactano a partir de glucosa son ejemplo de
fermentación.
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RUTA GENERAL DE LA GLICÓLISIS
GLUCOSA
ATP
ADP
GLUCOSA 6 FOSFATO
ATP
ADP
FRUCTOSA 6 FOSFATO
FRUCTOSA 1, 6 FOSFATO
ESCISIÓN
GLICERALDEHIDO 3 FOSFATO
H2PO4 H2PO4
2 FOFOGLICERATO n
H2O
FOSFOENOL PIRUVATO
ADP
ATP
PIRUVATO
ACETALDEHÍDO
ETANOL + H2O l
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RUTA DE LA GLICÓLISIS
-2
CH2OPO 3
H
CH2OH H H
H H H HEXOQUINASA H H
+ ATP OH OH
OH OH OH OH
OH OH
GLUCOSA GLUCOSA 6
FOSFATO
-2
CH2OPO 3 FOSFOGLUCOSA CH2OH
-2
H H H ISOMERASA OPO 3
+ ATP OH
H OH OH
OH OH
OH OH H H
H H H H
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Lo que sucede en esta reacción es que la enzima fosfofructoquinasa hace que
reaccione el ATP para que este sede un grupo fosfato a la posición 1 convirtiéndose el
ATP en ADP pero también en esta reacción se va un H para que la transferencia del
fosfato se ha exacta pasando de fructuosa 6 fosfato a fructuosa 1,6 difosfato.
CH 2OPO3 H H
H- C-OH
CH2OPO3
FRUCTOSA 1, 6 FOSFATO DIHIDROXIACETONA GLICERALDEIDO 3 FOSFATO
H TRIOFOSFATO H
H-C-OH ISOMERAZA C
C=O H -C-OH
CH2OPO3 CH2OPO3
2 C C
H C OH H C OH
CH2OPO3
CH2OPO3
GLICERALDEHIDO 3 FOSFATO 1,3 DIFOSFATO
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La isomerización de los azúcares fosforilados de 3 carbonos esta catalizada por la
triofosfato isomerasa.
Esta reacción es muy rápida y reversible. Así pues, se forma dos moléculas de
gliceraldehido 3 fosfato a partir de una molécula de fructosa 1, 6 difosfato por la acción
secuencial de la aldolasa y triofosfato isomerasa.
La reacción inicial de esta secuencia es la conversión de gliceraldehido 3 fosfato.
En 1,3 difosfato, reacción catalizada por el gliceraldehido 3 fosfato de deshidrogenasa.
O= C OPO-23
FOSFOGLICERATO
O =C O
H C OH + ATP QUINASA
C CH2OPO3
CH2OPO3
1, 3 DIFOSFOGLICERATO
3 FOSFOGLICERATO
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FORMACIÓN DEL PIRUVATO Y PRODUCCIÓN DE UN SEGUNDO ATP
2 C O FOSFOGLICERATO C - O
QUINASA
-2
H C OH + ADP C - OPO 3
CH2OPO3 CH2OH
3 FOSFOGLICERATO 2 FOSFOGLICERATO
O H
O H PIRUVATO C
C QUINASA
C=O
C-OPO3
H C CH3
H
H
O H PIRUVATO C
C CARBOXILASA
C=O
C=O
CH2 CH2
PIRUVATO ACETALDEHIDO
H
ALCOHOL H
C DESHIDROGENASA
H C OH
C=O
CH2 CH3
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PRODUCTOS DE LA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA.
2.- GLICERINA
En 1910 fue emitido por f ehrlich que los alcoholes superiores, (alcohol propílico,
isopropilico, amílico, isoamilico e isobutilico), se originan de los aminoácidos
correspondientes (ácido amino butírico, valina leucina, isoleucina) mediante capacitación
de agua y desprendiendo dióxido de carbono y amoniaco. Efectivamente en experiencias
modelo puede comprobarse que agregando aminoácidos al medio que vaya a fermentar
se estimula la formación de alcoholes superiores por levaduras.
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Azúcar ácido pirúvico
productos
intermedios
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Existen varios sabores: primarios, secundarios, tanto para olores como colores.
Sabores secundarios: son la mezcla de los sabores primarios (1, 2 o más).
Existen 4 sabores primarios: dulce, salado, agrio, amargo.
Sabor dulce: Los compuestos que lo presentan son: los azúcares que son los
carbohidratos: mono y disacárido. Los carbohidratos que son más complejos no presentan
sabor (almidón, celulosa, hemicelulosa).
Compuestos químicos que presentan sabor:
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Clasificación de bebidas alcohólicas de acuerdo con el sustrato del que proceden.
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UNIDAD 4.- FERMENTACIÓN ACÉTICA
OBJETIVOS DE APRENDIZAJE:
Analizar el concepto de fermentación acética.
Identificar la importancia de los distintos medios de cultivo en las
fermentaciones.
Identificar los diferentes requerimientos energéticos y nutricionales para el
diseño, clasificación y control de un proceso de fermentación.
Establecer los diferentes métodos de fermentación en relación a su
funcionamiento.
INTRODUCCIÓN.-
HISTORIA.-
La historia del vinagre está íntimamente ligada a la historia del vino, como su
mismo nombre demuestra. El nombre castellano del vinagre proviene del latín “vinum
acre” o vino agrio y así ocurre en la mayoría de lenguas, con la excepción del italiano,
que toma el nombre de su principal componente, el ácido acético, y lo llaman “ACETO”.
No obstante el vinagre ese regalo que Dios nos dio, se puede obtener de
muchas otras frutas, plantas y cereales.
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Las primeras noticias, sobre un tipo de vinagre, que se obtenía de la palma,
provienen de Oriente y son del año 5.000 antes de Cristo (El salvador del mundo).
Autores griegos y romanos nos hablan también del vinagre, en este caso procedente del
vino, que no sólo utilizaban como condimento, sino como conservante de alimentos,
muchas veces mezclado con sal y miel.
Fue Pasteur el que explicó con más detalle y exactitud el proceso, consistente
en la fermentación que una bacteria, el “Mycoderma aceti”, realiza en el alcohol vínico
para obtener el ácido acético. Pero, si para Pasteur la formación del vinagre se debía
considerar como un proceso fisiológico, ya que es una fermentación, para Liebig la
transformación del alcohol etílico en vinagre por acción de las bacterias, no es otra cosa
que un proceso de oxidación.
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Si en la cuenca mediterránea la base del vinagre era el vino, en Inglaterra del
norte, donde la cerveza era la bebida nacional, predominaba el vinagre de malta y en el
sur de Inglaterra, donde se cultivaban las manzanas, el vinagre era de sidra. En cada
región, de acuerdo con su clima y los cultivos propios, se encontró una materia prima
para producir vinagre.
MICROORGANISMOS PARTICIPANTES.
Ssp. Orlaense.
Son las bacterias del vinagre del vino y de la acidificación rápida que tiene las
tasas máximas de conversión de etanol a ácido acético. Es la más eficaz porque produce
un ácido muy concentrado.
Ssp. Xylinum
Se encuentra en las heces del vinagre (vinagre madre) conformando una capa
sólida correosa en los depósitos del vinagre tiene una eficacia limitada y resulta
indeseable porque forma colores y olores desagradables.
Las otras dos especies Acetobacter Pasterianus y Peroxidans, no tienen elaboración
de vinagre. La primera pertenece también a las bacterias perjudiciales vinagre de cerveza y
forma sustancia musilaginosas durante la obtención del mosto.
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“Mycoderma aceti”
La bacteria llamada “Mycoderma aceti” realiza la fermentación acética del
alcohol, que contiene el vino, para transformarlo en ácido acético. Por esta razón, para la
producción de un buen vinagre se debe tratar con sumo cuidado esta bacteria. Además la
bacteria requiere unas condiciones especiales de trabajo. Su temperatura ideal para el
trabajo es de 25% a 30%, un exceso de temperatura causaría su muerte y con una
temperatura muy baja su ritmo de trabajo es muy lento, se retarda el proceso y por lo
tanto se incrementan los costos. Para su existencia y para su trabajo de oxidación
necesita también abundancia de oxígeno por lo que durante el proceso se deberá
mantener una buena oxigenación del vino.
MATERIAS PRIMAS.
Con el fin de que el vino que se va a utilizar esté totalmente limpio, por medio
del centrifugado, se procede a su limpieza y se almacena en grandes depósitos, de
donde se alimentaran los generadores del vinagre, su grado alcohólico debe ser como
mínimo de 11º y no debe tener ningún tipo de sabor y olor extraño.
La materia prima para obtener vinagre es el alcohol etílico, que sufre un proceso
aeróbico denominado “Oxidación”, debido a la presencia de bacterias del tipo
Acetobacter. Se trata de un género microbiano caracterizado por tener células de formas
elipsoidal y esférica, sueltas o unidas en cadenas, por lo general inmóviles, aunque
algunas son móviles por ayuda de flagelos. Según su función pueden clasificarse en dos
grupos: los que oxidan el ácido acético y lo transforman en dióxido de carbono y agua y
los que carecen de esta propiedad.
Teniendo en cuenta la materia prima de la cual ha sido fabricado, los vinagres se
pueden clasificar en:
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por su suave y delicado sabor. Se puede elaborar a partir de la pulpa de manzana
o su zumo, cuyo azúcar se convierte primero en alcohol y posteriormente en ácido
acético, o a partir de la sidra o mosto de manzana fermentado. A las ensaladas les
proporciona un toque a manzana y combina muy bien con pescados, carnes
blancas y salsas suaves.
2. Vinagres fabricados por hortalizas y amilasas, como son los vinagres de papatas,
cuyo almidón debe ser previamente hidrolizado a azucares. Como ejemplo esta el
vinagre de arroz es típico de países asiáticos como China o Japón donde se
incluye en la mayoría de platos populares de la gastronomía propia de estos
países. Se trata de un vinagre con sabor suave y algo dulce y con un color que
oscila entre el blanco, dorado pálido o rojizo, según se elabore solo con arroz o se
combine con otros cereales como el trigo, el sorgo o el mijo.
5. Vinagres que se fabrican con espíritu de vino a alcohol, como el que se fabrica con
el líquido que queda después de preparar las levaduras de cerveza. Como el que
se fabrica con el alcohol desnaturalizado o diluido.
7. Color.- El vinagre se encuentra con una gran variedad de tonos de colores, desde
un casi transparente vinagre blanco destilado a las diferentes tonalidades de rojo
de los vinagres de vino, amarillentos de los vinagres de sidra y color chocolate de
los vinagres de malta. El color del vinagre se deriva básicamente de los
ingredientes usados para su elaboración. Es también de esperar que el color varíe
entre los mismos tipos de vinagre, por ejemplo cambios naturales en la coloración
de las manzanas varían de cosecha en cosecha, y los tipos de manzanas
utilizados. Aunque también se puede utilizar color caramelo para darle un tono
café al vinagre.
28
PROCESO FERMENTATIVO.
29
IMPORTANCIA INDUSTRIAL DEL ÁCIDO ACÉTICO.
El vinagre puede ser usado en muchas formas. Existen mas de 300 aplicaciones
de cómo usarlo. A veces se piensa que sólo es utilizado en la cocina como acompañante
de las ensaladas mezclándolo con aceite y/o pimienta y sal. Sin embargo, el vinagre tiene
usos que van desde ser un ingrediente versátil de sus comidas como resaltador del sabor
o condimento, un ablandador de las carnes, un preservante natural de alimentos, un
agente medicinal y un elemento de gran utilidad en la limpieza del hogar y los equipos
utilizados en la industria de alimentos. En fin, el vinagre se utiliza en cualquier medio
donde se requiera de un acidulante natural. Algunas aplicaciones se muestran a
continuación:
Resaltador del sabor.- Puede agregarse a la salsa que vaya a utilizar para
cocinar. Cuando se cocina su plato, el agua se evapora dejando el exquisito aroma y
sabor del vinagre. En el caso de los mariscos, es mejor agregar el toque de vinagre luego
de cocinados para mejorar así el sabor de los mismos.
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UNIDAD 5.- VINIFICACIÓN
OBJETIVOS DE APRENDIZAJE:
Analizar el proceso de vinificación, identificar las materias primas
empleadas en el proceso de vinificación.
Que el alumno conozca las características bioquímicas y tecnológicas de la
producción de vino, así como los grupos de levaduras características de
este proceso.
Dar a conocer los métodos de conservación, maduración, clasificación,
pasteurización y envasado de los vinos, así como la preparación del mosto.
Que el alumno reconozca la conservación, maduración, clasificación,
pasteurización, envasado y alteración de vinos y aplique el proceso de
sulfitación y trasiego.
INTRODUCCIÓN.
El vino es una bebida que se obtiene mediante fermentación alcohólica del sumo
de la uva fresca. Los <vinos> preparados a partir de otros frutos , como manzanas y
grosellas, no deben llamarse solamente vinos, sino que debe aludirse a los productos
vegetales de que proceden. El vino debe prepararse a partir de uva fresca. Resulta
esencial que el vino se obtenga mediante fermentación y que contenga alcohol.
Una actividad que ha estado ligada a la mayoría de las culturas durante miles de
años ha sido la producción de bebidas alcohólicas.
Evidencias arqueológicas que demuestran que desde hace mas de 7000 años de
antigüedad los humanos aprendimos a encausar las fermentaciones alcohólicas de
diversos sustratos en forma empírica. Quizá las primeras bebidas se hicieron con base a
sustratos azucarados como jugos de fruta, ya que éstos sólo requieren ponerse en
contacto el jugo con la levadura silvestre presente en la superficie de la propia fruta.
Fue hasta el siglo XV cuando empezó a popularizarse el arte de la destilación y de esta
forma aparecen las bebidas con mayor contenido alcohólico.
Debido a la gran importancia de estos productos la investigación científica y tecnológica
generan industrias, las cuales son de mayor importancia económica en el mundo.
HISTORIA.
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La producción de bebidas alcohólicas ha sido una actividad ligada a la mayoría
de las culturas durante milenios. Existen evidencias arqueológicas de más de 7000 años
de antigüedad.
En una ocasión, una de sus mozas que se encontraba más tiempo al lado del rey
fue desplazada por otra de sus mozas mas joven y bella. La moza al darse cuenta del
desplazamiento que la nueva y bella joven había logrado, toma la decisión de quitarse la
vida bebiendo de dicho veneno. Todos se quedaron sorprendidos esperando la muerte
de esta mujer decepcionada, pero grande fue la sorpresa al ver que ella no agonizaba y lo
único que observaron en ella fue una inmensa alegría y una actitud fuera de control. A
partir de ese momento todos los que conformaban el reino de Egipto, probaron de esa
misteriosa sustancia y descubrieron las grandes virtudes que esta poseía.
En forma empírica los humanos aprendimos a encauzar las fermentaciones
alcohólicas de diversos sustratos. (García Gariba y Col. Biotecnología Alimentaria, 1993).
Probablemente las primeras bebidas se hicieron a partir de sustratos azucarados como
los jugos de frutas, ya que éstos sólamente requieren poner en contacto al jugo con la
levadura silvestre presente en la superficie de la propia fruta (Wacher y Col., 1990).
CARACTERÍSTICAS GENERALES.
Las uvas que se utilizan para fabricar vinos son de origen Europeo debido a que
contiene eninas. Las eninas son compuestos químicos colorantes que se encuentran en la
mayoría de las uvas, por lo tanto juega un papel primordial el la coloración del vino. ( las
semillas le dan la coloración al vino). Un ejemplo del porque no todas las uvas, del mundo
se pueden utilizar para hacer vinos son las que proceden de Chile. Las uvas de Chile no
tienen la misma composición química que las Europeas, debido a que estas uvas
contienen enidinas en lugar de eninas. Las enidinas es un compuesto químico que
transfiere un sabor amargo, esto se debe a los factores ambientales como son: el clima, la
temperatura, composición del suelo, la presión atmosférica y la altitud.
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TÍTULO TIPO DE UVA
Existen una serie de características que determinan el tipo de vino del que se trata.
Veamos:
LEVADURAS UTILIZADAS.-
Otro factor importante son las levaduras, de composición muy sencilla, son células
redondas ovaladas y elípticas envueltas en una membrana muy fina elástica cuyo
diámetro es de 0.014 mm. El interior de dicha célula es incolora y a veces presenta un
aspecto granular, el protoplasma se encuentra situado junto a la pared celular y en su
interior aparece una o varías vacuolas que contienen el jugo celular.
Esta demostrado que las distintas levaduras difieren entre sí y que no todas las
especies de levaduras producen el mismo tipo de fermentación, presentando cada una de
ellas características propias, las levaduras más importantes para la fabricación de vino
33
son las comprendidas dentro del género saccharomyce y dentro de éstas encontraremos
a la Saccharomyce cereviseae var. Ellipsodeus.
Por otra parte la fermentación producida por levadura de uva origina valiosas
sustancias aromáticas que son las responsables del bouquet.
Las uvas que aún antes de haber madurado por completo han sido picadas y
estropeados por avispas y pájaros, constituyen auténticas incubadoras de gérmenes
fermentativos. Muchas de estas células de levadura crecen a través de la tierra y forman
ahí nuevas esporas que persistirán a lo largo del invierno.
PIE DE CUBA.
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Estrujado, escurrido y prensado.- Cuando las vendimias llegan a la bodega se
procede al estrujado de la uva, liberando así el primer mosto.
1.- Estática: deslizando el mosto, por gravedad, entre los partes sólidas (hollejos,
pepitas, escobajos) de la vendimia.
2.- Dinámica: haciendo circular toda la masa de vendimia por un tornillo sin fin
que extrae el mosto.
Clarificado.- Los mostos turbios deben ser clarificados para obtener vinos
limpios y de la máxima finura aromática. Las burbas o impurezas se eliminan por
decantación, dejando reposar los mostos en los depósitos. Pero las técnicas más
perfectas y modernas permiten la utilización de filtros y máquinas centrifugadoras que
eliminan los sólidos por medios estrictamente físicos y naturales, sin utilizar ningún
aditivo.
Los vinos rosados permanecen sólo unas horas en contacto con sus hollejos,
hasta que se ha extraído la coloración deseada, luego, prosiguen su fermentación en los
depósitos de acero inoxidable sometidos a estricto control de temperatura.
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Se utilizan hoy delicadísimas técnicas para elaborar vinos tintos más finos y
genuinos: maceraciones carbónicas, utilización de depósitos autovaciantes, vinificación de
cada variedad por separado.
Crianza de los Vinos.- La mayor parte de los vinos blancos son vinos jóvenes,
embotellados en pleno esplendor frutal. Todos ellos exhiben en su etiqueta o en su
collarín la añada.
Algunos tintos jóvenes y frutales reciben una ligera crianza en roble nuevo que no
se prolonga más del tiempo justo para redondear sus taninos y ceñir su cuerpo, sin
castigar su expresión varietal.
PROCESO DE INDUSTRIALIZACIÓN.
1. -Control de la Maduración.
2. -Transporte de la vendimia.
3. -Recepción en bodega y toma de muestras.
4. -Extracción del Mosto.
5. -Maceraciones prefermentativas.
6. -Corrección del Mosto.
7. -Separación de Fangos.
8. -Comportamiento Fermentativo.
9. -Fermentación en Barrica.
10. -Acabado de la fermentación Alcohólica .
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1.- Control de la maduración.- Se realiza un control de maduración en viña para
conocer el momento óptimo de maduración fénolica en la uva. Los análisis de grado Brix
que determinan el azúcar contenido en la uva ,(la concentración de los azúcares
superiores a 200mg/l pueden originar problemas para desdoblar los últimos gramos de
azúcar con el riesgo que repercute en la fermentación), y los análisis de taninos-
antocianos, que determinan el equilibrio y estabilidad posterior de los vinos, y cuando
estos parámetros son los adecuados para la recolección.
37
entre las partes sólidas del racimo (hollejos, orujos, raspón,) con las superficies de
presión.
5. Esquema del sistema de obtención del mosto .- Veamos los pasos a seguir
para la obtención del mosto.
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E) Escurridores o Patines: su misión es separar el zumo liberado por el estrujado
e interviene inmediatamente después de esta operación. Se distinguen dos escurridos:
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- En mosto macerado aumenta la densidad y el grado Brix.-
- La acidez total se mantiene o eleva ligeramente, mientras que el pH aumenta
conforme lo hacen los tiempos de maceración. Los tiempos de maceración
breves ( 4 y 6 horas ) presentan un efecto poco significativo con respecto a los
no macerados, por lo que es conveniente alargar los tiempos de maceración de
9 a 12 horas para obtener un aumento de componentes aromáticos y tener
mejor estructura en boca.
- Cuando no hay posibilidad de bajar las temperaturas y se quiere realizar una
maceración pelicular se puede recurrir al empleo de preparados enzimáticos de calidad
que acortan los tiempos de maceración.
40
ajustada la dosis de activadores al mosto, realizamos una siembra de levaduras
seleccionadas, lo cual nos encontramos en las últimas operaciones prefermentativas.
En los "Estudios sobre el vino " PASTEUR escribió que "Las cualidades del vino
dependen en gran parte de la naturaleza específica de las levaduras que se desarrollan
durante la fermentación de los mostos". Así, podemos pensar que, al someter a un mismo
mosto a la acción de levaduras distintas se lograrán vinos de distinta naturaleza. La
garantía que tiene el enólogo al utilizar las levaduras secas seleccionadas es que le
permite un buen manejo, tienen dificultad para su contaminación y la inoculación de una
alta población viable.
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11. Acabado de la fermentación alcohólica.- Si la marcha de la fermentación
alcohólica está bien definida por la toma de densidad, el densímetro no basta para decidir
sobre el final de la transformación de todo el azúcar contenido en el mosto en alcohol.
Para ello, hay que recurrir a análisis químicos y averiguar los azúcares reductores que
hay en el medio.
El gusto de los consumidores del vino se ha ido desplazando cada vez mas hacia
los vinos jóvenes y frescos. En la actualidad se prefieren vinos brillosos y claros,
completamente resistentes al aire.
El enturbiamiento del vino se puede eliminar por: clarificación, filtración y
centrifugación. Los tres procedimiento son eficaces proporcionando buenos resultados si
se utilizan correctamente. El vino se puede clarificar con tierra de España o caolín. Estas
se utilizan para clarificar los vinos dulces y para el tratamiento del vino viscoso en dosis
de 100 a 4000 gr., por hectolitro ( 100-400 gr / Hl).
La tierra de España o Caolín es el silicato de aluminio hidratado y es un producto
que se obtiene de las ricas feldespatiferas.
A).- Bentonita.
42
Es el carbón vegetal ( de madera) y carbón animal (de hueso). El carbón activo se
utiliza para decolorar los vinos y baja la concentración del sabor y color.
El vino de matiz amarillento obscuros se utiliza una cantidad de 10 a 15 gr/Hl para
decolorar vinos pardos se emplea de 15 a 30 gr/Hl .
43
UNIDAD 6.- FERMENTACIÓN LÁCTICA
OBJETIVOS DE APRENDIZAJE:
Analizar el proceso de la fermentación láctica.
Identificar las características de la producción de ácido láctico y los
microorganismos productores de ácido láctico.
Dar a conocer las rutas metabólicas y las fermentaciones que están
asociadas a la formación de ácido láctico.
Que el alumno aprenda a realizar: productos con leche fermentada y
productos fermentados con hortalizas.
INTRODUCCIÓN.
Los lactobacillus, son bacterias que utilizan la fermentación láctica para obtener
energía; estos organismos transforman la lactosa de la leche en glucosa y posteriormente
en ácido láctico. Este proceso tiene importancia industrial ya que se utiliza en la
fabricación de yogurt.
Historia.-
Sus últimos trabajos le permitieron establecer que existe una levadura láctica que está
siempre presente cuando hay transformación de azúcar en ácido láctico, especialmente
en una materia azoada, elemento indispensable para el desarrollo de una fermentación.
44
parte soluble, manteniéndola en el punto de ebullición con aproximadamente 1/5 de su
peso en agua.
Luego, disolvió nuevamente en esa solución unos cien gramos de azúcar por litro,
filtrándolo con mucho cuidado. La solución se mantenía en una estufa a una temperatura
de 30 a 35 grados. Hizo pasar una corriente de ácido carbónico por el frasco para eliminar
el aire y aproximadamente 24 horas después se produjo un cambio: el líquido se agitó y la
cal desapareció, formándose un depósito que aumentaba sin cesar.
Para este experimento, Pasteur había creado un medio artificial que podía ser
reproducido en su totalidad, eliminando de ese modo numerosas causas de errores. Hoy
en día, la diferencia de medios -medios controlados-, todavía se utilizan de forma habitual
en todos los laboratorios de biología, química-biología y microbiología.
2.- De igual modo, constató que para estudiar una fermentación había que
preparar un medio de cultivo apropiado al fermento y estéril; sembrar ese medio con una
traza de fermento puro.
45
distintas vitaminas del grupo B (lactoflavina, tiamina, biotina, ácido nicotínico, ácido
pantoténico, ácido fólico) y varios aminoácidos.
Hay un gran grupo de bacterias que incluyen las que fermentan los azúcares a
ácido láctico preferentemente, es decir, un 90 % o más.
46
RUTAS METABÓLICAS.
47
La enzima lactato-deshidrogenasa, que reduce el ácido pirúvico a ácido, tiene una
estereoespecificidad distinta según la especie bacteriana. Por ello algunas bacterias sólo
forman ácido láctico dextrorrotatorio [D-(-)] y otras, por el contrario, levorrotatorio[L-(+)].
Hay bacterias que sintetizan además la enzima lactato-racemasa que lleva a cabo la
interconversión de las dos formas ópticamente activas.
48
Esquema de la heterofermentación ácido láctica.
Para obtener ácido láctico puro por un proceso microbiológico, que es mas
rentable que la síntesis química se emplean únicamente bacterias homofermentativas
porque al no producir metabolitos secundarios, permiten unos rendimientos mayores.
49
O OH CO2 H2O
50
mantequilla contiene un 13-16 % de agua y también las sales, proteínas lácteas y
productos del metabolismo de las bacterias lácticas.
El Yogur.
El Kefir.
El Queso.
Madurados y Frescos.
51
La consistencia y sabor de los madurados están influenciados por :
El contenido graso.
Tipo de coagulación de la caseína.
Aditivos.
Tratamiento con bacterias y mohos y especie a la que pertenezcan.
Doble crema 60 %
Crema 50 %
Super graso 45%
Graso 40 %
Semigraso 20 %
Poco graso 10 %
Magros menos del 10 %.
Quesos Frescos.
A. Queso blanco
B. Queso en capas y
C. Queso crema fresco.
A.- Queso blanco.- Se obtiene como cuajada ácida por precipitación a partir de
Leche ácida y cuajada enzimática ( fermento lab.) mayoritariamente.
B.- Queso en capas.- Contiene una capa intermedia algo más grasa.
C.- Queso Crema y doble crema.- A partir de leche entera a la que se le añade
crema.
52
Quesos madurados.- se obtienen por:
Quesos de leche ácida.- Son quesos magros que se obtienen por degradación
microbiana progresiva de la cuajada ácida.
Haserkäse
Karbkäse
Stangekäise
Quesos de hierbas
Quesos con mohos.
Fuente C
(ác.láctico)
Degradación
Bacteriana
Quesos con fermento lab.- Se realizan con leche acidificada débilmente y sin
cuajar, se le añaden de 1-2 % ( en volumen ) de cultivo de bacterias lácticas y fermento
Lab en forma de polvo o liquido.
53
En el suero quedan : Lactato, albúmina, lactosa y sales minerales.
Quesos blandos .
Camembert y Brie que son madurados con Moho blanco, se inoculan con
Penicillium camemberti y Endomyces sp.
Roquefort, Bavaro azul que son madurados con moho azul , y se inoculan con
Penicillium roqueforti.
Quesos Duros.
Tilsit.- Es semiduro , flexible, 4-5 kg., con ojos repartidos y recubierto de una capa
pegajosa amarilla rojiza.
Emmental o suizos.- Son duros, grandes hasta de unos 100 cm. de diámetro y
unos 40 kg. de peso, grasos con grandes ojos y aroma característico.
Chester.- Son elaborados a partir de leche dulce y están recubiertos con cera.
54
PREMADURACIÓN
Bacterias lácticas y
Estreptococos proteolisis.
Propionibacterium freudenreichii
P. ácidi- propionici
P. jensennii
El CO2 liberado forma los agujeros característicos de los quesos duros, los ojos.
Maduración principal.-
Cetoacidos
Oxiacidos
Ac. Grasos sencillos
Esteres de ácidos grasos
Existen otros muchos productos tradicionales de leche ácida originarios del medio
y lejano Oriente, a los que no podemos referirnos aquí con más detalle (por ejemplo dahi,
kumiss, leben, kurunga). Se obtienen a partir de la leche de distintos animales
domésticos y de inóculos de diversa composición.
55
56
Elaboración de queso de fermentación láctica (queso de untar).
Introducción.
Este tipo de queso está directamente relacionado con el queso más sencillo que
existe que es el que se elabora añadiendo un agente acidificante a la leche (ácido
clorhídrico, limón o vinagre) ya que la base es la misma pero en el caso del uso de las
bacterias ácido lácticas se tiene la gran ventaja de que es la lactosa (azúcar de la leche)
la que se metaboliza produciendo un sabor, una textura y una digestibilidad muy superior
que el producto obtenido por la simple acidificación.
La coagulación de las proteínas lácticas (conocidas como caseínas) por medio del
un descenso en la acidez de la leche origina la unión de las proteínas unas cono otras,
formando estructuras de mayor tamaño. Cada molécula de ácido actúa como un cemento
que se encargaría de unir las proteínas de la leche que actuarían como ladrillos siendo así
muy fáciles de separar de la parte acuosa de la leche (suero) constituyendo lo que se
denomina la cuajada. Como curiosidad conviene apuntar que este es un proceso químico
reversible, es decir que si se le añade a la leche coagulada por la acción de un ácido un
álcali (sustancia química con un pH alto como por ejemplo la lejía) la cuajada volvería a
ser líquida otra vez (cuidado ya no sería leche que se pudiera beber aunque su aspecto
sería igual que el de la leche fresca).
Su consistencia va desde una pasta muy densa hasta una crema ligera que se
puede usar para hacer repostería como base de deliciosos bizcochos, etc.
57
1. 1 litro de leche.
2. Olla grande para el baño María si la temperatura es inferior a 22 ºC.
3. Recipiente para la coagulación puede ser de plástico, acero inoxidable o
vidrio. No se recomienda la porcelana, ni el aluminio, ni cualquier recipiente que
pueda ser alterado por la acción del ácido o no se pueda limpiar con facilidad.
4. Termómetro
5. Gasa
6. Fermento iniciador
7. Cazo de sopa o cucharón
8. Colador
9. Cuchillo de punta
10. Cuchara sopera
Proceso de elaboración:
Tomar la punta de un
Tomar 1 litro de leche cuchillo de fermento
pasteurizada y calentarla al iniciador y depositarla en la Diluir el fermento en una
cuchara sopera. cucharada de leche a 30 ºC.
baño María hasta 30º.
58
tela o trapo para evitar que
se ensucie la leche pero que
se airee.
59
Para obtener un queso más cremoso se puede añadir nata comercial a la leche antes de
empezar el proceso y se pueden variar los tiempos de fermentación y desuerado, así
como la cantidad de fermento; para obtener texturas y sabores diferentes. Es ideal como
ingrediente de repostería en vez de la nata o mezclado con los condimentos como
aperitivo.
Hortalizas fermentadas.
Los encurtidos son aquellos productos vegetales hortícolas que, tras ser sometidos
a diversas transformaciones, tienen en común su aderezo con vinagre. Entre las especies
hortícolas cultivadas para encurtir destacan: pepinos, zanahorias, remolachas (hervirlas
diez minutos antes); repollo colorado, col crespo. Algunas combinaciones posibles:
pepinos o chauchas con borraja, eneldo y menta; repollo colorado con zanahorias, granos
de mostaza, kummel y coriandro; pimientos con zapallitos (probar que no sean amargos),
cebollas, oregano y ajo. Remolachas con manzanas, kren (rábano blanco picante),
cáscaras de limón, granos de mostaza y jengibre. Tallos de apio, manzana con kren o
jengibre. Cada cultura ha desarrollado diferentes variantes para encurtir hortalizas a partir
de esta técnica.
60
Materia prima.
La materia prima está constituida por los frutos inmaduros de las especies
anteriormente citadas. La textura de los frutos destinados a encurtir debe ser firme y éstos
deberán estar exentos de sabores extraños y amargos, así como de malos olores.
Selección.
61
Calibrado.
Lavado.
El lavado se realiza simplemente con agua, la maquinaria empleada suele ser lavadoras
de tipo rotativo compuestas por cilindro de chapa perforada semisumergido en agua y
cintas transportadoras, también perforadas, con duchas a presión.
Fermentación.
62
cubiertas, aunque en algunas zonas cálidas los depósitos se colocan abiertos y al aire
libre. Los depósitos han de ser limpiados antes y después de su uso.
Cambios físicos.
En las primeras 48-72 horas el agua, los azúcares, proteínas, minerales y otras
sustancias contenidas en los frutos se difunden por ósmosis a la salmuera. En la
salmuera estas sustancias constituirán el alimento de las bacterias productoras de ácido
láctico y otros microorganismos. Como consecuencia, el producto pierde peso y se
produce en él un arrugamiento. Transcurrido este periodo, la sal comienza a penetrar en
los tejidos y con ella se produce la entrada de agua, con la que los frutos ganan peso y
vuelven a su situación normal. El cambio de textura de los productos durante la
fermentación es el aspecto físico más importante, ésta va a determinar las diferencias
cualitativas entre los encurtidos procedentes de producto fermentado y fresco.
Cambios químicos.
Cambios microbiológicos.
63
productoras de ácido láctico, aunque presentan variaciones estaciónales y de distribución,
son siempre las responsables de los mayores cambios en los frutos. Dentro de este grupo
se encuentran Leunostoc mesenteroides, que en los primeros momentos de la
fermentación predomina sobre el resto, esta bacteria se cultiva sobre medios
hipersacarosados produciendo voluminosas cápsulas (dextrano), esta producción se ha
empleado en la producción de alimentos de textura más o menos filante o espesa.
También están presentes las siguientes especies: Streptococcus faecalis (bacteria
homofermentativa, pues su fermentación es de tipo homoláctico, transformando la lactosa
en ácido láctico), Pediococcus cerevisiae, un coco muy productor de ácido, cuya actividad
microbiológica se incrementa en proporción al tiempo transcurrido, y Lactobacillus brevis,
que puede contribuir a la formación de ácido láctico y a su vez es productora de gas.
Lactobacillus plantarum es la bacteria más importante a la hora de producir ácido láctico.
Dentro del grupo de bacterias productoras de gases tenemos las especies coliformes del
género Aerobacter, que se caracterizan por la producción de anhídrido carbónico e
hidrógeno. También dentro de este grupo se encuentra Lactobacillus brevis, que es un
bacilo productor de gas, pero que en determinadas ocasiones ayuda a la formación de
ácido láctico, se trata de una bacteria heterofermentativa que no puede desarrollarse en
anaerobiosis con glucosa, porque no es capaz de reducir el acetil-fosfato a etanol.
Almacenamiento.
64
Recepción y control de la materia prima.
Desalado.
65
Mediante escurrido se elimina la salmuera inicial de los bidones. A continuación se
vuelven a llenar de agua y al cabo de unos minutos se escurren nuevamente, alcanzando
así los productos una concentración aproximada del 2% de sal. En cada lavado se
consumen 25 litros de agua para 100 kg de producto.
Lavado.
Una vez desalado el producto, se realiza un último y ligero lavado del mismo con
agua corriente. Para esta operación se emplea una cinta transportadora, provista en su
mitad inicial, de un sistema de aspersores o duchas de baja presión. La segunda parte de
la cinta, sin aspersores, completa el escurrido, con objeto de eliminar el exceso de agua
de la superficie del producto.
Previamente al llenado, el envase debe ser lavado, lo cual se lleva a cabo en una
lavadora de frascos dispuesta para tal fin. En primer lugar se vierte el envase y, a
continuación, se lanza un chorro de agua caliente, manteniéndose los frascos invertidos
para evitar contaminaciones y facilitar el escurrido antes del llenado.
Una vez preparada la materia prima para su envasado, es enviada por medio de
una banda transportadora a la llenadora-dosificadora, que realiza el llenado de los
frascos de manera precisa sin derramar el producto, ni contaminar la zona de cierre. Este
hecho es de gran importancia ya que la presencia de pequeñas partículas de producto
entre el borde de la tapa y el envase, puede producir problemas en el cierre y, como
consecuencia, tener lugar posibles alteraciones de oxidación o de reinfección por
microorganismos, con la consiguiente putrefacción.
La adición del líquido de gobierno cumple entre otros los siguientes objetivos:
66
El preparado consistirá en una disolución al 10% de vinagre puro de vino en
agua. Su añadido, a los envases con el producto, se realizará por medio de una
dosificadora volumétrica que se alimenta de un depósito en el cual se formula el líquido
de gobierno. La máquina permite variar de forma automática e independiente el volumen
a dosificar. La temperatura del líquido en el momento de su incorporación será de unos
85 ºC.
Cerrado.
Tratamiento térmico.
A continuación del túnel de pasteurizado y como una extensión del mismo, se instalará un
túnel de secado por chorros de aire. Su función será eliminar completamente las gotas de
agua existentes en los envases, elemento antiestético de cara a su posterior
comercialización.
Etiquetado.
El etiquetado se realizará una vez llevado a cabo el marcado de las tapas de los
envases. Para esta operación se empleará una etiquetadora lineal automática
autoadhesiva, dotada de dos cabezales para practicar, según las circunstancias,
etiquetado simple o doble.
Embalaje.
67
se instalarán dos líneas de embalado, una en cajas de cartón y otra en bandejas, también
de cartón, retractiladas.
Paletizado.
Almacenamiento.
o Almacenar los palets colocando unos junto a otros, sin realizar ningún tipo
de apilado que pueda dar lugar a la rotura de envases, deformaciones en
las tapas, etc.
68
La adopción de estas medidas es imprescindible para una buena conservación de
los encurtidos. Se trata de productos de duración media superior a dieciocho meses, que
en condiciones adecuadas pueden permanecer varios años en perfecto estado de
consumo.
Sin embargo, habían sido los chinos los primeros en hacer fermentar el repollo
(como también el arroz y la soja). La fermentación láctica (ahora redescubierta por la
industria alimenticia en las leches cultivadas y otros brebajes del rubro, con rimbombantes
nombres científicos y un apoyo publicitario espectacular), es de todos los procesos de
fermentación en los que intervienen ácidos orgánicos, el que más inhibe el desarrollo de
microorganismos. Esta propiedad, junto a su capacidad de facilitar el acceso a nutrientes
de alto valor biológico en épocas de escasez, justifican la importancia que ha tenido en la
cultura alimentaria de casi todo el mundo. Sigue siendo hoy día una técnica sencilla para
producir y conservar alimentos nutracéuticos que son la principal fuente de vitamina C, y
encimas de muchos pueblos.
69
que se conserva, enriquece y predigiere el forraje almacenado para vacas u otros
animales.
70
reiteradas veces con agua caliente. Finalmente lo llenamos con agua y un veinte
porciento de vinagre común, para desinfectarlo. Lavamos muy bien un repasador o un
paño de tela natural cruda (sin teñir), un plato de loza o madera y una piedra que calcen
en el envase y sirvan como pesa. Los colocamos en el recipiente para que también
entren en contacto con el agua con vinagre.
Procedimiento.
Vaciamos el recipiente (el agua con vinagre se descarta) y colocamos una capa de
unos cinco centímetros del repollo picado y sazonado. Apretamos bien el repollo dentro
del envase con el pisón (o con el puño limpio), para que comience a soltar el jugo.
Agregamos otra capa y repetimos la operación, hasta llenar el envase unos diez
centímetros debajo de su borde. Es fundamental comprimir bien el repollo.
Fermentación:
Las levaduras y los bacilos que producen la fermentación láctica están presentes
en el ambiente. Si no, no se cortaría la leche. La velocidad del proceso de fermentación
dependerá de la temperatura ambiente. a 16 grados centígrados demorará unas seis
semanas, a 18 grados, cinco, a 21, cuatro y a 24 grados, lo que se considera la
temperatura ideal, unas tres semanas. A mayor temperatura se corre el riesgo de que se
descomponga antes de acumular suficiente acidez que conserve el alimento. A
temperatura muy baja, el proceso es demasiado lento y puede producir el mismo
resultado. En ambos extremos es conveniente agregar un poco de suero de manteca,
como ya se describió.
71
La temperatura ambiente de su lugar de depósito, además de la disponibilidad de
hortalizas, serán entonces los condicionantes para la elaboración de hortalizas ácidas. En
el Sur de la Argentina, esto se realizará en verano, en el Norte en invierno y en regiones
moderadas, al inicio de la primavera o otoño.
Unas seis horas después de rellenado el recipiente, el repollo debe haber liberado
suficiente jugo como para quedar cubierto de líquido al menos un centímetro. Si no hay
líquido suficiente, hervir agua con sal (15 g. de sal por litro de agua), dejarla enfriar y
agregar hasta llevar al nivel indicado. Agregar también un poco de suero de manteca,
para favorecer la fermentación.
Para evitar esto, la selección de repollos con alto contenido de humedad y el buen
machacado inicial son fundamentales.
Almacenado:
Si se conserva en el envase original, para utilizar una porción, ésta se saca con
una pinza de acero inoxidable u otra herramienta bien limpia. Ni bien se forma una baba
(levaduras) en el paño que recubre el encurtido, se debe quitar, lavar bien, lavar bien el
plato y la piedra, hervir el paño en agua con vinagre y volver a colocar todo en su lugar.
Notas.
Recuerde siempre recubrir a las hortalizas con agua hervida con sal y suero de
manteca, si luego de unas horas de preparado, no liberaron suficiente jugo, para
asegurarse la acidez necesaria, sobre todo en hortalizas como los pimientos y las
cebollas. El sabor de estos alimentos deberá ser siempre ácido, lo cual es un indicador
de su buen estado de conservación. Si el líquido se tornara turbio y perdiera su acidez, el
alimento puede deteriorarse y no debe ser utilizado. En su conservación en el envase
72
original, las hortalizas nunca deben quedar fuera del jugo. En contacto con el aire del
ambiente, pueden contaminarse con hongos y levaduras que iniciarán un proceso de
alcalinización, con el consiguiente riesgo de intoxicación por salmonelas. Por este motivo,
se descarta generalmente la capa superior y se utiliza el plato con el paño y la pesa.
73
UNIDAD 7 B I O M A S A
OBJETIVOS DE APRENDIZAJE:
Analizar el término biomasa y los microorganismos mas comúnmente
empleados en la producción de biomasa.
Analizar las materias primas y métodos de producción de biomasa.
Que el alumno pueda preparar un pan siguiendo el proceso de producción
de biomasa.
Dar a conocer los diferentes productos de la producción de biomasa.
INTRODUCCIÓN.
La vegetación empleada para energía puede llegar a ser uno de los combustibles
más importantes en el futuro. En los próximos veinte años podría suministrar un octavo
del presupuesto energético mundial. Una gran variedad de desechos agrícolas y
madereros y de cultivos energéticos, simbolizados por el campo de maíz, pueden
transformarse para suministrar una gama de combustibles para el transporte, o pueden
ser quemados para generar electricidad. Un ejemplo de esto es la conversión de las
astillas de madera en un gas rico en metano. Al igual que los combustibles fósiles, este
gas puede quemarse en centrales eléctricas eficientes que maximicen el contenido
energético del combustible, generando electricidad al mismo tiempo que utilizan el calor
sobrante.
74
Los combustibles derivados de la biomasa abarcan varias formas diferentes, entre
ellas los combustibles de alcohol (mencionados antes en este artículo), el estiércol y la
leña. La leña y el estiércol siguen siendo combustibles importantes en algunos países en
vías de desarrollo, y los elevados precios del petróleo han hecho que los países
industrializados vuelvan a interesarse por la leña. Por ejemplo, se calcula que casi la
mitad de las viviendas de Vermont (Estados Unidos) se calientan parcialmente con leña.
Los científicos están dedicando cada vez más atención a la explotación de plantas
energéticas, aunque existe cierta preocupación de que si se recurre a gran escala a la
agricultura para obtener energía podrían subir los precios de los alimentos.
Sirven como alimento de alto valor proteico, por ejemplo, el cultivo de hongos
(principalmente champiñones), como complemento en la alimentación o como material de
partida para la obtención de grasas o de otras sustancias celulares útiles.
75
Las fuentes principales de proteínas vegetales son las tortas de soja con un 45 %
de proteínas y las tortas de semillas oleaginosas de algodón y girasol con cerca del 41 %
de proteínas.
Dado que ni los mamíferos ni el hombre son capaces de sintetizar por sí mismos
ocho aminoácidos a partir de los alimentos, se ven obligados a ingerir ciertas cantidades
mínimas de dichos «aminoácidos esenciales». En la siguiente Tabla se muestran algunos
de los aminoácidos más importantes.
Aminoácidos
esenciales
Leucina 4.2 4.9 5.0 3.4 7.2
Lisina 4.2 4.3 4.9 2.8 4.9
Valina 3.2 3.8 3.7 2.3 4.6
Fenilalanina
Y tirosina 4.7 4.8 5.2 3.8 4.2
Isoleucina 2.7 3.0 3.0 2.2 3.9
Treonina 2.9 3.3 3.0 1.9 3.3
Metionina
Y cistina 1.8 2.4 2.6 1.3 2.7
Triptófano 0.8 0.6 0.9 0.6 1.1
76
Los microorganismos, por ser células de crecimiento rápido, tienen un mayor contenido de
ácidos nucleicos que las células animales y vegetales de los alimentos.
Para las necesidades humanas sólo se contempla la posibilidad de utilizar como
alimento las levaduras en forma de suspensión, pasta o polvo seco. Su alto contenido de
vitaminas (coenzimas) del complejo B las hace especialmente apropiadas para la
terapéutica dietética de convalecientes con una gran necesidad de vitaminas.
Su ventaja sobre las levaduras radica en su mayor contenido de proteína (85 %), un
tiempo de generación menor, de dos horas, así como una concentración de producto de
30 g – L. de peso celular seco.
77
Diagrama.- Fermentador continuo con aire a presión para la obtención de biomasa
LEVADURA: PANIFICACIÓN.-
Cultivo de Levaduras.-
78
que no pueden ser utilizadas por Saccharomyces pero si por Candida y Torula, Sobre
todo las cepas de Candida tienen múltiples aplicaciones porque pueden utilizar la mayoría
de los sustratos.
Levadura en la panificación.-
La levadura que hemos añadido a la masa debe mantenerse viva para hacer su
función. La energía necesaria para la actividad celular la obtiene a partir de los azúcares
libres presentes en la masa, preferiblemente glucosa. Se consumen primero los que ya
aporta la harina y que provienen del grano de trigo. Después, debe ponerse en marcha
una compleja maquinaria bioquímica: la amilolisis.
Teniendo en cuenta los niveles de temperatura a los que se realizan las distintas
operaciones de la panificación, podemos distinguir tres fases:
– Amasado y fermentación.
– Cocción.
– Enfriamiento y almacenamiento.
79
fermentación alcohólica que produce el dióxido de carbono –o gas carbónico–, necesario
para el desarrollo de la masa. Su comportamiento químico es éste:
La cocción del pan se produce a una temperatura de unos 250º C y en presencia de vapor
de agua, siendo una etapa tan importante como la fermentación.
Cuando el interior de la pieza alcanza los 65º C, los gránulos de almidón sufren un
violento hinchamiento acompañado de una salida de amilosa, precisamente cuando la
actividad de las amilasas es máxima. Sin embargo, las enzimas, como cualquier proteína,
son sensibles al calor. Cuando se alcanzan los 70º C, la beta-amilasa y la amilasa fúngica
añadida, quedan inactivadas. La alfa-amilasa natural resiste hasta los 80º C.
El efecto final de la amilolisis en esta fase, está directamente ligado a la cinética térmica
interior de la pieza –la velocidad con que aumenta la temperatura en su interior–, y al tipo
de alfa-amilasa (natural o añadida; entre éstas, fúngica o bacteriana).
Los mejores resultados tecnológicos se obtienen cuando existe un equilibrio ente alfa y
beta amilasa.
80
APLICACIONES.-
Cultivo de Bacterias.-
Debido a las dificultades para separar las pequeñas células bacterianas del
medio de cultivo y por su
alto contenido en ácidos nucleicos, hasta ahora se ha empleado poco la
biornasa bacteriana como
suplemento proteico.
Además de las parafinas también son adecuados para la obtención de grasas los
sustratos azucarados principalmente.
Además de la selección de las cepas adecuadas, son importantes sobre todo los
sustratos pobres en nitrógeno y fósforo para que haya un almacenamiento importante de
grasas en la célula microbiana. Por ello en muchas levaduras la mejor síntesis de grasas
se consigue cuando el medio de cultivo tiene un contenido de nitrógeno de un 50 –70 %
por debajo del contenido optimo.
También en este caso los medios de cultivo tienen que ser ricos en azúcares pero
pobres en nitrógeno y fósforo. Se ha comprobado que resulta ventajoso que la relación
C:N en el medio de cultivo sea 66:1.
Las algas unicelulares fotosintéticas también pueden llevar a cabo una gran
producción de grasas sí se les suministra sólo una pequeña parte de sales nutritivas
nitrogenadas (como máxirno 1 % del medio de cultivo). Especialmente el alga verde
Chlorella pyrenoídosa pueden almacenar un máximo de 70-80 % de su peso seco como
grasa respectivamente.
81
Cultivo del Champiñón.-
Vitaminas.
Enfermedades
VITAMINAS FUNCIONES
carenciales
Coenzima de algunas peptidasas. Interviene en la
C (ácido ascórbico) Escorbuto
síntesis de colágeno
Coenzima de las descarboxilasas y de las enzima que
B1 (tiamina) Beriberi
transfieren grupos aldehídos
Dermatitis y lesiones en las
B2 (riboflavina) Constituyente de los coenzimas FAD y FMN
mucosas
B3 (ácido Fatiga y trastornos del
Constituyente de la CoA
pantotinico) sueqo
B5 (niacina) Constituyente de las coenzimas NAD y NADP Pelagra
Interviene en las reacciones de transferencia de grupos
B6 ( piridoxina) Depresisn, anemia
aminos.
B12 (cobalamina) Coenzima en la transferencia de grupos metilo. Anemia perniciosa
Coenzima de las enzimas que transfieren grupos
Biotina Fatiga, dermatitis...
carboxilo, en metabolismo de aminoácidos.
82
UNIDAD VIII. ENZIMAS MICROBIANAS Y PRODUCCIÓN DE AMINOÁCIDOS.
OBJETIVOS DE APRENDIZAJE:
Analizar las características de las amilasas, como un tipo importante de
enzimas, también la existencia de otro tipo de enzimas y microorganismos
que las producen y evaluar los diversos usos y aplicaciones que tienen las
enzimas microbianas: amilasas microbianas y su aplicación en los
diferentes procesos de fermentación para la producción de enzimas
microbianas de interés industrial.
Comprender el proceso de producción de L-lisina, así como los
microorganismos empleados, rutas metabólicas, regulación metabólica
medios de cultivo, procesos de producción y recuperación.
INTRODUCCIÓN.-
Las enzimas, en griego in ferment, son biocatalizadores compuestos por una parte
proteica llamada apoenzima y una no proteica llamada coenzima Las enzimas, también
denominadas fermentos, son sustancias capaces de acelerar las reacciones bioquímicas
del organismo. Están formadas por una proteína unida a una coenzima, sustancia de
naturaleza no orgánica que es a veces un oligoelemento, imprescindible para el
funcionamiento de la enzima, y que suele ser el centro activo de la misma.
Casi todas las reacciones químicas de las células son catalizadas por enzimas,
con la particularidad de que cada enzima solo cataliza una reacción, por lo que existirían
83
tantas enzimas como reacciones, y no se consumen en el proceso. Los catalizadores no
biológicos son inespecíficos.
En una reacción catalizada por enzima (E), los reactivos se denomina sustratos (S)
, es decir la sustancia sobre la que actúa la enzima. El sustrato es modificado
químicamente y se convierte en uno o más productos (P). Como esta reacción es
reversible se expresa de la siguiente manera:
Especificidad.-
Clases de enzima.-
El nombre de las enzimas es el del sustrato + el sufijo: -asa. Los nombres de las
enzimas revelan la especificidad de su función:
Una enzima, por sí misma, no puede llevar a cabo una reacción, su función es
modificar la velocidad de la reacción, entendiéndose como tal la cantidad de producto
formado por unidad de tiempo. Tal variación se debe a la disminución de la energía de
activación Ea; en una reacción química, la Ea es la energía necesaria para convertir los
reactivos en formas moleculares inestables denominadas especies en estado de
transición, que poseen mayor energía libre que los reactivos y los productos.
84
1. Orienta a los sustratos: parte de la energía de activación se utiliza para que los
sustratos roten y se enfrenten con los átomos correctos para formar los enlaces.
2. Agregan cargas a los sustratos: las cadenas laterales (R) de los aminoácidos de
las enzimas pueden participar directamente haciendo a los sustratos
químicamente más reactivos.
3. Inducen la deformación en el sustrato: cuando una sustancia se une al sitio activo,
la enzima puede causar que los enlaces se estiren, poniéndolo en un estado de
transición inestable.
4. Cambio de forma de la enzima al unirse al sustrato: el modelo de llave- cerradura
de Fisher fue actualizado cuando se descubrió que las enzimas son flexibles y sus
sitios activos pueden cambiar (expandirse) para acomodarse a sus sustratos. Este
cambio de forma causado por la unión al sustrato se denomina ajuste inducido.
5. En la Hexoquinasa puede observarse este ajuste inducido, con el sustrato
(glucosa) y sin él. El ajuste inducido alinea las cadenas laterales reactivas del sitio
activo de la enzima con los sustratos.
Ya sea que consistan en una única cadena polipeptídica plegada o en varias unidades,
muchas enzimas requieren otras moléculas no proteicas para funcionar.
Las coenzimas reaccionan con la enzima de igual modo que el sustrato, uniéndose al
sitio activo. Se mueven de una enzima a otra agregando o quitando grupos químicos del
sustrato.
85
ENZIMAS MICROBIANAS.-
Xilanasas.-
Amilasas.-
Se distinguen dos tipos de amilasas, que se denominan alfa (a) y beta (b), y cuya acción
combinada permite liberar unidades de maltosa, azúcar que se forma por la unión de dos
unidades de glucosa. Pero las moléculas de almidón, sistema de reserva de energía de
muchos vegetales, en su estado natural se encuentran empaquetadas en unas
86
estructuras denominadas gránulos, cuya forma y tamaño es característica de la especie (
trigo, maíz, patata...).
1. Amasado y fermentación.
2. Cocción.
3. Enfriamiento y almacenamiento.
87
actividad –la intensidad de la producción de maltosa– está, pues, parcialmente
condicionada por el nivel de alfa-amilasa existente en la masa.
Cuando el interior de la pieza alcanza los 65º C, los gránulos de almidón sufren un
violento hinchamiento acompañado de una salida de amilosa, precisamente cuando la
actividad de las amilasas es máxima. Sin embargo, las enzimas, como cualquier proteína,
son sensibles al calor. Cuando se alcanzan los 70º C, la beta-amilasa y la amilasa fúngica
añadida, quedan inactivadas. La alfa-amilasa natural resiste hasta los 80º C.
El efecto final de la amilolisis en esta fase, está directamente ligado a la cinética térmica
interior de la pieza –la velocidad con que aumenta la temperatura en su interior–, y al tipo
de alfa-amilasa (natural o añadida; entre éstas, fúngica o bacteriana). La alfa-amilasas
fúngicas se inactivan antes de la gelificación total del almidón, con lo que su efecto en la
cocción es mucho menor que el de las naturales o las microbianas.
Los mejores resultados tecnológicos se obtienen cuando existe un equilibrio ente alfa y
beta amilasa. Así, en una harina hiperdiastásica, la actividad de la beta-amilasa es
insuficiente para transformar todas las dextrinas presentes, quedando parte que produce
pegajosidad de la miga y corteza de color rojizas.
88
Proceso de producción de enzimas y aminoácidos.-
Introducción.-
89
o microorganismos (bacterias, levaduras y hongos) para iniciadores en la industria
agroalimentaria
o aditivos alimentarios específicos (enzimas, colorantes, aromas)
o herramientas de diagnóstico molecular para la detección de contaminantes
microbianos o fraudes en alimentos
o microorganismos probióticos (de utilización en salud, nutrición del consumidor,
etc.)
o productos farmacéuticos microbianos
o insecticidas microbianos, productos fitosanitarios
o validación de procesos (biosensores)
o manejo de los distintos microorganismos usados como iniciadores en la industria
alimentaría (bacterias lácticas, levaduras y hongos filamentosos)
o producción por vía microbiana de aditivos
o diseño de métodos de purificación de proteínas a partir de caldos de
fermentación
o adaptación de técnicas moleculares en alimentos
o crecimiento de microorganismos en fermentadores de hasta 50 litros
o optimización de procesos a partir de fermentadores de laboratorio
o manipulación de los caldos de cultivo tanto para la recuperación de células como
para la separación de componentes de alto valor añadido
90
Fermentadores de 5 y 2 litros
Controles de calidad: En todas y cada una de las fases del proceso, y al finalizar el
mismo, se realizan controles de calidad
91
Sistema fermentador: El biorreactor dispone de sensores específicos que
permiten la medida y el control "in situ" de las variables de una forma precisa y
reproducible.
o pH
o temperatura
o presión parcial de oxígeno
o producción de espumas
o nivel.
AMINOÁCIDOS.-
92
son los aminoácidos actualmente disponibles a precios competitivos para la fabricación de
piensos.
La lisina.-
La metionina.-
93
de producto comercial) que es el valor recomendado por los proveedores del producto
comercial. Además, es un producto ligeramente ácido, lo que potencia en cierta medida el
control de hongos por antifúngicos.
La L-treonina.-
El L-triptófano.-
El Ácido Glutámico.-
Sus funciones :
94
Alivia la fatiga, la depresión y la impotencia.
Se usa en el tratamiento de la esquizofrenia y la demencia senil.
Excelente en el tratamiento de las funciones normales de la próstata.
Interviene específicamente en la utilización de la glucosa por las células del
cerebro.
Funciona como sistema de transporte de aminoácidos y de nitrógeno desde tejidos
periféricos hacia el hígado.
Precursor en la biosíntesis de las bases purínicas y primidínicas.
95
VI.- ANEXOS
PRACTICA N° 1
ELABORACIÓN DE VINO
OBJETIVO:
El alumno obtendrá una bebida tipo vino de frutas, a partir de un sustrato de frutas
inoculando con levaduras mediante un proceso de fermentación.
INTRODUCCIÓN
El vino es una bebida que se obtiene mediante fermentación alcohólica del sumo
de la uva fresca. Los <vinos> preparados a partir de otros frutos , como manzanas y
grosellas, no deben llamarse vinos sin más de más, sino que debe aludirse a los
productos vegetales de que proceden. El vino debe prepararse a partir de uva fresca.
Resulta esencial que el vino se obtenga mediante fermentación y que contenga alcohol.
Una actividad que ha estado ligada a la mayoría de las culturas durante miles de años ha
sido la producción de bebidas alcohólicas.
Evidencias arqueológicas que demuestran que desde hace mas de 7000 años de
antigüedad los humanos aprendimos a encausar las fermentaciones alcohólicas de
diversos sustratos en forma empírica. Quizá las primeras bebidas se hicieron en base a
sustratos azucarados como jugos de fruta, ya que estos solo requieren ponerse en
contacto el jugo con la levadura silvestre presente en la superficie de la propia fruta.
Fue hasta el siglo XV cuando empezó a popularizarse el arte de la destilación y de esta
forma aparecen las bebidas con mayor contenido alcohólico.
Debido a la gran importancia de estos productos la investigación científica y tecnológica
generan industrias, las cuales son de mayor importancia económica en el mundo.
“Son soluciones acuosas que contienen además de agua y alcohol sustancias orgánicas
que ejercen influencia sobre los aromas y el sabor “.
“Son bebidas obtenidas a partir de cualquier jugo vegetal que no sea de uva y que tienen
propiedades organolépticas nuevas y atractivas para una prueba estadística significativa de
consumidores”.
96
vino y las prácticas de viticultura tienen evidentemente su origen en los valles fluviales
ricos en vides silvestres de Asia Menor. Allí habitaban pueblo indogermánicos que
deben que deben considerarse antecesores inmediatos del cultivo de la vid y de las
prácticas viticultoras.
MATERIALES Y REACTIVOS.
97
1 bureta de 50 ml
pinzas para bureta
1 embudo de filtración
1 cuchillo
1 campana de flujo laminar
3 matracez erlenmeyer de 125 ml.
1 baso de precipitado de 1000 ml
2 vasos de precipitado de 250 ml
1 baso de precipitado de 1000 ml
1 matraz volumétrico de 1000 ml
1 matraz volumétrico de 100 ml
3 matracez de 500 ml
1 licuadora
1 extractor de jugos
Centrifuga
Balanza analítica
Etiquetas
Gasas
Algodón
Papel estraza
Mangueras látex
Hielo
Fenolftaleina
NaOH 0.1 N
Solución Buffer PH 4, 7, 10.
Azul de metileno
Felhing A y B
Sacarosa
Na Cl
TÉCNICA:
98
n) En 2 matraces se le agrega 0.5 g de levadura y en los otros 2 matraces se le
agrega 1.5 g de levadura.
o) Meter los matraces a la estufa que se encuentra a 28°C.
p) 2 matraces salen a las 25 hrs. que contiene 0.5g de levadura.
q) 2 “ “ 35 hrs. que contiene 1.5g de levadura.
r) 2 “ “ 45 hrs. que contiene 1.5g de levadura.
s) 2 “ “ a las 55 hrs. que contiene 2.5g de levadura.
t) Filtrar el jugo en algodón o con papel estraza.
u) Centrifugar.
v) Realizar determinación de pH, Acidez, concentración de alcohol y la prueba de
evaluación sensorial.
DETERMINACIÓN DE ACIDEZ:
CONCENTRACIÓN DE ALCOHOL:
99
PRACTICA 2
Ingredientes: 1 espumadera
2 kgs. Extracto de Malta líquido 1 fermentador (5 galones)
1 oz. Bittering Lúpulo 1 hidrómetro
1 oz. Lúpulo Final 1 termómetro
1 cucharadita de té Irish moss 1 embotelladora
¾ taza Priming Sugar 1 Airlock (trampa de aire)
50 unidades y Tapas para botellas 1paq. De solución blanqueadora para
1 cucharadita de Levadura Nottingham esterilizar (One Step No-Rinse Cleaner)
Ale 1 tubo para embotellar
1 sifón
Equipo: 1 bottling bucket
1 cacerola de 10 litros aprox. 1 grifo
1 batidor 1 colador
1 cuchara larga 50 botellas de 250 cm3
100
Procedimiento:
101
PRÁCTICA No. 3
CURVAS DE CRECIMIENTO MICROBIANO
OBJETIVO.
Utilizar algunos métodos para evaluar el crecimiento de los microorganismos.
INTRODUCCIÓN.
El crecimiento celular se define como un aumento ordenado de la cantidad de los
constituyentes y las estructuras celulares. Este crecimiento lleva a un incremento en el
tamaño y peso de las células lo que, en la mayoría de los microorganismos, conduce a la
división celular, dando por resultado el aumento en el numero de células (crecimiento
poblacional). Es importante no confundir este concepto con el de crecimiento individual
que implica solamente el aumento de tamaño, volumen y diferenciación dentro de un
mismo individuo. En general cuando se habla de crecimiento en bacterias se refiere a
crecimiento poblacional.
En la mayoría de las bacterias, el crecimiento se lleva a cabo por un proceso que se
conoce como fisión binaria, durante el cual todos los componentes estructurales de la
célula se duplican. El producto de la división celular genera el ciclo celular que en
bacterias puede ser muy sencillo como el de Escherichia coli (fig. 1).
102
Las poblaciones microbianas muestran un patrón de crecimiento característico
donde el número de células se duplica por unidad de tiempo, al que se llama “Crecimiento
exponencial”. Experimentalmente esto se puede observar mejor si se hace una gráfica del
número de células a diferentes tiempos, obteniéndose una línea recta (fig. 2). Esta gráfica
se puede utilizar para calcular el tiempo de generación de una bacteria determinada (en el
ejemplo es de 2 horas).
103
Los datos presentados en la figura anterior reflejan sólo una parte del ciclo de
crecimiento de una población bacteriana. La curva completa de crecimiento de cualquier
población bacteriana (fig. 2), la cual se puede dividir en las siguientes fases:
104
determinada turbidez o densidad celular. El medio de cultivo de un turbidostato no posee
ningún nutriente limitante y mientras que el quimiostato es más efectivo a velocidades de
dilución bajas, el turbidostato trabaja mejor a velocidades de dilución altas.
105
Es muy importante para un microbiólogo conocer y estudiar el crecimiento
microbiano durante la fase exponencial, ya que esto contribuye a la investigación básica
en fisiología y ecología microbianas y a la solución de varios problemas que se presentan
en el área de la microbiología industrial. Así, cuando un medio de cultivo se inócula con
una sola célula que se divide cada 20 minutos, la población total será de dos células
después de transcurridos los primeros 20 minutos, de cuatro células después de 40
minutos y así sucesivamente. Debido a que la población se está duplicando cada vez que
las células se dividen, podemos expresar con base de 2 el crecimiento exponencial de la
siguiente forma:
Nf=1 x 2n (2)
Si la población original o inicial no es una sino cientos o miles de células,
expresamos la población final como:
Nf = No x 2n (3)
Así, conociendo la población inicial “No” y la población final “Nf”, se puede calcular
el número de generaciones “n” que se han producido después de un tiempo de incubación
“t”.
Por otro lado, el tiempo de generación o duplicación “T” de una población
microbiana es igual a tiempo de incubación “t” dividido entre el número de generaciones
“n”:
T= t
n (7)
Despejando “n”, tenemos que:
106
N= t
T (8)
Substituyendo la ecuación (8) en la (6):
Donde “L” es el tiempo de duración de la fase lag y “t”, “T”, “Nf” y “No” tienen los
significados establecidos anteriormente.
Otra de las formas matemáticas de considerar el crecimiento exponencial es mediante el
uso del cálculo diferencial, el cual toma como base que dentro de una población
heterogénea (población donde existe una mezcla de células que se encuentran en un
estadio diferente del ciclo celular) una pequeña fracción de esta población está
dividiéndose en un tiempo dado y está contribuyendo con esto a un aumento infinitesimal
en el tamaño de la población. Por lo tanto, si consideramos una población inicial “No” a un
tiempo t=0, entonces después de un intervalo pequeño de tiempo “dt”, una pequeña
fracción de los organismos presentes en “No” completará su ciclo celular, dividiéndose y
aumentando el tamaño de la población en “dN”. Considerando que la magnitud de “dN”
depende del tamaño de “No” a un “dt” constante, la velocidad del cambio celular o más
comúnmente conocida como la velocidad de crecimiento de la población será
directamente proporcional al tamaño de la población inicial. Lo anterior lo podemos
expresar como:
dN No (11)
dt
dN = No (12)
dt
t -1 o bien, h –1 o 1
107
h
dN = No
dt
t
Nt = Noe (13)
Si transformamos la ecuación anterior con logaritmos naturales:
In Nt = In No + t (14)
Por lo tanto, con estas dos ecuaciones (14 y 15) podemos calcular las variables
que se mencionaron en párrafos anteriores.
El crecimiento poblacional puede obedecer a un modelo exponencial sólo bajo
circunstancias especiales (de laboratorio generalmente) y por periodos cortos, pues
ninguna especie exhibe en realidad un patrón de incremento indefinido debido a que
algún factor limita su crecimiento.
108
En general, conforme aumenta la cantidad de células en un medio dado, la tasa de
incremento dN/dt disminuye gradualmente hasta que alcanza un valor de cero, en donde
la densidad de la población llega a un máximo; esta mediante una curva como la que se
muestra en la Fig. 4b, que en general puede ser descrita adecuadamente por la ecuación
logística de crecimiento de Verhulst-Pearl y que se expresa de la siguiente forma:
En esta ecuación, la letra “K” se conoce como la capacidad portadora del medio y
representa la densidad de población máxima que de manera estable puede soportar un
ambiente dado y en la que por definición
= 0, y, dN = C
dt dN
La disminución en la tasa de crecimiento dt se logra mediante una
retroalimentación negativa de la densidad, haciendo que cada célula que se agregue a la
población produzca una reducción en la velocidad de crecimiento; dicho mecanismo
retroalimentador queda manifiesto mediante el término
1-N
K
En el caso del crecimiento exponencial la velocidad específica de crecimiento se
mantiene constante, pero en el modelo logístico ésta va disminuyendo a medida que “N”,
el número de individuos, tiende al valor de “K”, lo cual expresa se expresa de la siguiente
manera:
dN1 = (1 – N ) (17)
dt N K
N
Conforme “N” aumenta, la razón K se aproxima cada vez más a la unidad y el
término entre paréntesis finalmente llega a hacerse igual a cero, indicando que cuando
N=K, la población se mantiene estable y el crecimiento efectivo es nulo.
Si efectuamos una modificación a la ecuación (17), obtenemos:
N= (1 – N) = - (N) d (18)
Ndt K K
Esta expresión representa la ecuación de una recta con una ordenada al origen
igual a “ ”, una pendiente negativa igual a y que corta al eje de las abscisas cuando N =
K (y cuando dN = 0 (ver Fig. 5).
109
En el modelo logístico del crecimiento existen dos densidades en las que dN=0
dt , una que corresponde a los inicios del desarrollo cuando “N” es muy
pequeña y representa una población crítica por debajo de la cual la población no se
desarrollará y la otra corresponde a la densidad máxima en la que semantiene una
población estable. Así conforme “N” aumenta, también lo hará dN hasta que se alcanza
un incremento máximo cuando el tamaño de la dt población es igual a k , que es donde
se presenta el punto de inflexión de la curva de crecimiento (fig. 2).
110
(1+e a- f)
en donde Nt es el tamaño de la población al tiempo “t”, ; “K”, “ ” y “t” tienen los
significados ya mencionados y “a” es una constante surgida de la integración de (16), la
cual se define como:
a= Iv (K-No)
No
En la que “No” es la población inicial. La gráfica descrita por la ecuación (19) es una curva
sigmoidal como la mostrada en la Fig.6ª
111
Para el cálculo de las constantes de la ecuación (19), trabajando con datos
experimentales, ésta se transforma para obtener:
1v (K-N) = a - t (20)
N
Que de acuerdo al modelo de crecimiento logístico representa la ecuación de una
recta que tiene una pendiente negativa (fig. 5). Para efectuar el cálculo de la pendiente y
de la ordenada al origen “a” se tiene que utilizar la ecuación (20) y se requiere de una
estimación inicial de “K” que junto con las observaciones de “N” a los correspondientes
“ts” obtenidos en el desarrollo de la población nos permite, a su vez, efectuar una
regresión lineal de 1 n K-N
N
Contra “t” mediante el método de los mínimos cuadrados.
Para determinar el crecimiento bacteriano se pueden utilizar diferentes métodos,
ya sean directos o indirectos. Entre los tres principales métodos directos se encuentran:
A) La cuenta directa al microscopio: donde se utiliza la cámara de Petroff-
Hausser y se cuentan directamente las bacterias presente en una muestra dada,
posteriormente esta cuenta se multiplica por un factor para finalmente determinar el
número de bacterias/ml.
B) La cuenta viable: en la cual se realizan diluciones de la muestra original y
una alícuota de éstas se siembra en el medio de cultivo adecuado, expresándose el
resultado como el número de bacterias o unidades formadoras de colonias por mililitro
(UFC/ml) según sea el caso.
C) La medición de la turbidez: la cual puede efectuarse debido a que las
bacterias absorben y desvían cierta cantidad de luz, permitiendo de esta forma medir el
grado de turbidez del cultivo. Esto último se realiza con la ayuda de un fotocolorímetro con
un filtro rojo o azul o un espectrofotómetro y la lectura se expresa en unidades de
absorbancia. Para organismos unicelulares la absorbancia es proporcional al número de
células.
Dentro de los métodos indirectos, podemos mencionar:
A) La medición de algún componente celular, como las proteínas o el ATP.
B) La medición del consumo de la fuente de carbono del medio de cultivo.
C) La medición en el cambio de algunas variables fisicoquímicas como el pH.
CRECIMIENTO DE HONGOS
Cuando una espora germina, emite un filamento o hifa que se alarga y ramifica
rápidamente a medida que va creciendo, formando así un conjunto de hifas llamado
micelio. El crecimiento de los hongos se lleva a cabo en los ápices de las hifas por lo que
se le conoce como crecimiento apical. Este crecimiento se puede ver al microscopio de
luz con un hongo de crecimiento “rápido” como Neurospora crassa el cual crece a una
velocidad de 40 m/min. a 25°C. También se ha visto un movimiento neto del citoplasma
hacia el ápice de la hifa, por lo tanto, para que el ápice de la hifa crezca tiene que utilizar
el material citoplásmico que viene de atrás.
Por otro lado, se sabe que el ápice hifal también está rodeado por la pared celular,
aunque ésta es más delgada y más “plástica” que la que se
Presenta en el resto de la hifa. Por lo tanto, en el crecimiento de la hifa deben
intervenir tanto una degradación como una síntesis de pared celular de una manera
balanceada.
112
Hace tiempo se observaron en los ápices hifales ciertas vesículas que aparecían
cuando la hifa estaba creciendo y desaparecían cuando dejaba de crecer. Dichas
vesículas no se han caracterizado completamente pero presentan varios precursores para
la biosíntesis de pared celular y algunas enzimas murolíticas. En la Fig. 6 se observa una
representación hipotética de lo que sucede con las vesículas en la pared celular del ápice
hifal. No se sabe cual es el mecanismo del movimiento de estas vesículas hacia el ápice,
pero se ha sugerido que puede ser: a) por un gradiente electrogénico a través de la hifa,
b) por un flujo electroosmótico de agua hacia el ápice, o c) por un sistema de microtúbulos
o microfilamentos.
También se ha observado que cuando la espora germina existe una fase inicial de
“hinchazón” donde aumenta de tamaño debido a la entrada de agua y que, por lo tanto,
dicha espora tiene que sintetizar pared celular nueva de una manera más o menos
uniforme. Posteriormente la “hifa joven” llamada tubo germinativo emerge de la espora y
es en el ápice de esta estructura donde la síntesis de pared celular empieza a ocurrir. (fig.
7) En otras palabras, la germinación de la espora involucra una fase inicial donde la pared
celular se sintetiza de forma no polar u homogénea en la superficie de la espora seguida
de una síntesis polar en el ápice de tubo germinativo.
113
Después de fluctuaciones que se presentan al comienzo del crecimiento, el valor
de “G” se mantiene constante conforme la colonia se desarrolla, siendo dicho valor
característico para cada hongo, por ejemplo, para Geotrichum es de 160 m y para
Neurospora es de 120 m. Al mismo tiempo, se puede calcular la velocidad específica de
crecimiento “ ” se relaciona con la velocidad de crecimiento radial y el diámetro de la
colonia “W”, como sigue:
Velocidad de crecimiento radial = W
El crecimiento de los hongos filamentos se puede poner de manifiesto por
varios métodos, como son la determinación del crecimiento radial, del crecimiento
longitudinal, del peso seco y del peso húmedo.
METODOLOGÍA.
I.- Cuenta de bacterias por el método nefelométrico.
1.- Inocular un matraz nefelométrico que contenga 25 ml de un cultivo de 12 horas
de E. Coli.
2.- Homogeneizar el inóculo en el medio y medir la turbidez del cultivo en
fotocolorímetro Klett-Summerson (tiempo cero). Incubar el matraz en un baño de 37°C. El
cero del fotocolorímetro se ajusta con medio E sin inocular.
3.- Realizar lecturas como en el punto 2 cada 0.5 horas durante 7 horas,
manteniendo el cultivo a 37°C.
II.- Cuenta viable del inóculo bacteriano original.
1.- Marcar del 1 al 10 dos series de 10 tubos que contienen 4.5 ml de agua
destilada estéril.
2.- Agregar al primer tubo 0.5 ml del cultivo joven (12h) de E. Coli.
3.- Efectuar diluciones decimales hasta 10-10.
4.- Colocar o.1 ml de las diluciones 10-6 a 10.10 en la superficie de 5 placas
de gelosa nutritiva marcadas previamente con la dilución correspondiente
(hacer lo anterior por duplicado).
5.- Extender con la varilla de vidrio previamente esterilizada.
6.- Incubar a 37°C durante 24-48 horas.
114
2.- Realizar el siguiente esquema de diluciones al cultivo anterior, utilizando
medio E como diluyente. Determinar la turbidez en el fotocolorímetro a cada
una de las diluciones.
115
IV.- Crecimiento longitudinal de hongos.
1.- Sembrar en un extremo del tubo de Ryan con gelosa Sabouraud una
porción del crecimiento de la cepa del hongo proporcionada. Incubar a
28°C.
2.- Medir la longitud del crecimiento en mm a las 24, 48, 72 y 96 horas de
incubación.
V. Crecimiento radial de hongos.
1.- Sembrar por punto el centro de una caja de Petri con gelosa Sabouraud con
una porción del crecimiento de la cepa del hongo proporcionada. Incubar a
28°C.
2.- Medir el diámetro en mm de la colonia a las 24, 48, 72 y 96 horas de
incubación.
PRECAUCION:
Mover lo menos posible los tubos de Ryan y las cajas de Petri una vez inoculadas
para evitar la dispersión de las esporas.
INFORME.
3.- Con base en los datos de la tabla anterior, ¿cuál es el número de bacterias
116
/ml del cultivo original de E. Coli.
4.- De acuerdo con el punto III de la sección de Métodos, tabule las unidades
Klett que corresponden a cada una de las diluciones efectuadas y calcule la
Concentración de bacterias en cada dilución de la muestra original de
E. Coli.
Dilución Unidades Klett Bacterias/ml
a) 1:1.22
b)
c)
d)
e)
f)
g)
h)
i)
j)
k)
5.- Hacer una gráfica con los resultados de la tabla anterior. Interpolar en la
gráfica anterior cada uno de los valores de U.K. obtenidos en el punto 1
de esta sección y tabularlos de la siguiente forma:
117
generación.
10.- Tabular los resultados del crecimiento lineal y radial de los hongos, como
se indica en la siguiente tabla.
Tiempo
(días) Radial Lineal
0
1
2
3
4
Cepa
11.- Hacer una gráfica con los resultados de la tabla anterior, colocando el
tiempo de incubación en el eje de las abscisas y el crecimiento en centí-
metros en el de las ordenadas.
CUESTIONARIO.
1.- De acuerdo con el modelo de crecimiento exponencial, resuelva el siguiente
problema: usted inoculó 106 células de E. Coli en 25 ml de medio de cultivo
adicionado de glucosa, incubó su matraz durante 4 horas. Sabiendo que el
tiempo de generación es de 20 min. Calcule el número de bacterias, toma
0.01 ml del matraz y lo inocula en medio de cultivo con manitol; incuba
durante 4 horas, obteniendo al cabo de este tiempo 2.4 X 107 bacterias/ml.
En este medio se presentó una fase lag de 20 min. Calcule usted el tiempo de
generación para este microorganismo en el medio con manitol.
2.- Si tenemos un cultivo que contiene 100 células de E. Coli, el cual presenta
un tiempo de generación de 30 min. a 35°C, dibuje la curva de crecimiento
de dicha bacteria cuando: a) las células se incuban a 35°C durante 5 horas.
b) después de 5 horas, la temperatura se cambia a 20°C durante 2 horas.
c) después de 5 horas a 35°C la temperatura se cambia a 5°C durante 2
horas, al término de las cuales se regresa a 35°C durante 5 horas más.
REFERENCIAS.
Campbell, R.C. 1974. Statistics for biologists. 2nd Ed. Cambridge University
Press, London. P 385.
Donachie, W:D: 1993. The cell cycle of Escherichia coli. Ann. Rev.
Microbiol. 47: 199-230
118
Abundance. 2nd. Ed. Harper and Row, Pub. P 678.
119
120
PRÁCTICA No. 4
OBJETIVOS.
Producir vinagre de vino por un método industrial a escala de laboratorio como es
el caso del biorreactor con células inmovilizadas del tipo Frings determinando los
parámetros de proceso: cálculo de las mezclas vinagre-hidroalcohólicas para la
alimentación del biorreactor; cálculo de oxigeno necesario para la oxidación alcohólica;
cálculo de rendimientos de alcohol-vinagre; determinación del intervalo de temperatura
óptima de producción y obtención de vinagre al 4%, de tal manera que se amplíen los
criterios de aplicación de la Ingeniería Bioquímica.
INTRODUCCIÓN.
Aunque hace miles de años que se conoce el vinagre, no se determinó la
naturaleza microbiológica de su producción hasta hace poco m s de 160 años, cuando
Kútzing dio a conocer que la conversión del etanol en ácido acético era llevada a cabo
por microorganismos vivos. Quince años antes, Peerson había designado con el nombre
de Mycoderma a la película que se forma sobre los líquidos en los cuales tiene lugar una
fermentación acética. Pasteur (1868), confirmó la opinión de Kútzing y demostró la
naturaleza fisiológica de la fermentación acética, pero Pasteur creía que esta
fermentación era ocasionada por una sola especie de bacteria, Mycoderma aceti.
En 1878, Hansen demostró que eran más de una las especies de bacterias
capaces de producir la acidez de la cerveza, es decir, la oxidación del etanol a ácido
acético. Aisló y dio nombre a Bacterium aceti, y a Bacterium pasteurianum. Más tarde
aisló Bacterium kutzingianum, mientras que Brown describía una cuarta especie. Hacia el
año 1879. Hemberg estudió el grupo, lo reclasificó y describió varias especies más. La
nomenclatura y clasificación vigente es la adoptada en el Manual de Bergey.
levaduras
C6H 12O6 + O2 CH3CH2OH + CO2
Bacterias acéticas
CH3CH2OH + O2 CH3COOH + H2o
121
Requisitos generales de la fabricación:
METODOLOGÍA.
Aunque hace miles de años que se conoce el vinagre, no se determinó la
naturaleza microbiológica de su producción hasta hace poco m s de 160 años, cuando
Kútzing dio a conocer que la conversión del etanol en ácido acético era llevada a cabo
por microorganismos vivos. Quince años antes, Peerson había designado con el nombre
de Mycoderma a la película que se forma sobre los líquidos en los cuales tiene lugar una
fermentación acética. Pasteur (1868), confirmó la opinión de Kútzing y demostró la
naturaleza fisiológica de la fermentación acética, pero Pasteur creía que esta
fermentación era ocasionada por una sola especie de bacteria, Mycoderma aceti.
En 1878, Hansen demostró que eran más de una las especies de bacterias
capaces de producir la acidez de la cerveza, es decir, la oxidación del etanol a ácido
acético. Aisló y dio nombre a Bacterium aceti, y a Bacterium pasteurianum. Más tarde
aisló Bacterium kutzingianum, mientras que Brown describía una cuarta especie. Hacia el
año 1879. Hemberg estudió el grupo, lo reclasificó y describió varias especies más. La
nomenclatura y clasificación vigente es la adoptada en el Manual de Bergey.
Actividades bioquímicas tic Acetobacter.
Las actividades bioquímicas de Acetobacter consisten principalmente en procesos
catabólicos aerobios y anaerobios y en la síntesis de polisacáridos. Desde el punto de
vista industrial las m s importantes son las desasimilaciones aerobias que comprenden el
catabolismo oxidante de azúcares y alcoholes. De ellas la mejor conocida y más antigua
es la de producción de ácido acético o vinagre.
bacterias
CH3CH20H + 02 CH3COOH + H20
acéticas
El vinagre es el condimento hecho a partir de sustancias azucaradas o feculentas
por fermentación alcohólica seguida de fermentación acética cuyo producto final no debe
contener menos de 4 g de ácido acético por cada 100ml de solución a 20 grados
centígrados.
De acuerdo con lo anterior el proceso general quedaría descrito por:
levaduras
C6H 12O6 + O2 CH3CH2OH + CO2
Bacterias acéticas
CH3CH2OH + O2 CH3COOH + H2o
122
etanol empleado y del vinagre añadido al principio para acidificarlo, la cantidad de oxígeno
suministrada, la naturaleza del medio de fermentación, la temperatura de fermentación, la
maduración y conservación, la clarificación, el embotellado y la pasteurización y
finalmente el carácter y composición de los depósitos, recipientes y materiales que se
ponen en contacto con el vinagre durante el proceso de fabricación.
RESULTADOS.
Presentar en un cuadro los cálculos para. el ajuste de la concentración de
la mezcla vino-vinagre y la aireación necesaria.
Presentar cuadro y gráfica de la velocidad media de reacción.
Si la velocidad de reacción es de primer orden, usando los valores
experimentales, determinar:
a) - la constante k de la reacción
b) - el tiempo óptimo de cosecha
REFERENCIAS.
Amerine, M.A.1974. Análisis de vinos y mostos. Ed. Acribia, Barcelona
Pirt, S.J. 1975. Principles of microbial and cell cultivation. Blackwell Scientific
Publications, London.
Antonio Madrid, V. 1991. Vinos e industria vinícola. Tecnología del vino y bebidas
derivadas. Mundi-Prensa Libros S.A.. Madrid España 1991.
Vinagre envasado para consumo público. Norma Oficial Mexicana DGN-F-122-
1968. Secretaria de Comercio y Fomento Industrial
Han, K, henry c. Lim, H.C. & Hon& J. 1992. Acetic acid formation in Escherichia
col fermentation. Biotechnology and Bioengineering. 39:663-671
123
PRÁCTICA No. 5
EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ENZIMAS DE HONGOS
OBJETIVOS.
Realizar la extracción y purificación parcial de la invertasa de levaduras.
INTRODUCCION.
Los caldos de fermentación son mezclas complejas, compuestas de células,
productos solubles extracelulares, productos intracelulares y medio de cultivo sin
convertir. Particularmente un bioproceso incluye los procesos de producción de un
metabolito específico y su posterior recuperación.
La selección del proceso de recuperación del producto se basa en los siguientes
criterios:
La localización del producto (intracelular o extracelular).
La concentración del producto en el caldo de fermentación.
Las propiedades físicas y químicas del producto (tamaño, carga,
solubilidad, etc.).
El uso tentativo de] producto.
Las impurezas del caldo de fermentación.
El precio del producto en el mercado.
Obtención del producto final. En esta última etapa se obtiene el producto con el
nivel de pureza requerido. Los procesos que se incluyen aqu¡, son un secado al vacío,
cristalización y liofilización.
124
21,fructofuranosos. Se obtiene comercialmente a partir de la levadura de Saccharomyces
cerevisiae que es un subproducto de la industria cervecero. Sin embargo después de un
estudio cinético realizado, se encontró que en la levadura Candida utilis Y-900 bajo ciertas
condiciones se presenta una mayor actividad específica (U/g de células). Actualmente en
México no se produce invertasa y la que se utiliza en la industria es importada de Europa
y los Estados Unidos.
A pesar de que es una enzima extracelular, la mayor parte de ella está retenida en
la pared celular, por lo que es necesario la desorganización de esta estructura para su
liberación.
Se ha informado que compuestos con grupos sulfhidrilos son capaces de inducir la
liberación de enzimas que se encuentran de alguna forma unidas a la pared celular de
levaduras. La adición de cisteína a altas densidades celulares de la levadura reduce el
tiempo de liberación de la enzima.
Una vez que se tiene el extracto enzimático, se seleccionan las técnicas para la
purificación de la invertasa. En este caso el mejor m‚todo fue la precipitación con etanol,
estableciendo las condiciones para precipitar selectivamente a la invertasa, dejando en
solución al resto.
El etanol ha sido empleado por varias décadas como un agente precipitante de
proteínas. La obtención de proteínas puras de una mezcla compleja se facilita por la
influencia de factores como el pH, la fuerza iónica, la temperatura y la concentración de
proteína sobre la acción precipitante del etanol.
Además de interaccionar con otras variables, el etanol por s¡ mismo causa
precipitación de proteínas ya que disminuye significativamente la constante dieléctrica de
las soluciones acuosas.
Finalmente se utiliza la centrifugación para recuperar el precipitado.
METODOLOGÍA.
Se utilizará la biomasa generada en la práctica de Producción de proteínas
unicelular mediante la técnica de cultivo extendido como materia prima para la obtención
de la invertasa, o bien, se emplear S. cerevisiae de origen comercial.
125
Purificación parcial de la enzima. Al sobrenadante obtenido se le adicionan 4°C
volúmenes de etanol muy lentamente y con agitación en un baño de hielo. Se deja
reposar por una hora a 40C para permitir la precipitación de la enzima. Después de este
tiempo se recuperar el precipitado por centrifugación a 3500 rpm por 10 minutos. El
precipitado se resuspende en un volumen exacto de regulador de TRIS-HCI 50 mM y pH
de 7.2. A este precipitado se le determinará la actividad de invertasa empleando el
método de glucosa-oxidasa-peroxidasa y la concentración de proteína por el método de
Lowry.
METÓDOS ANALÍTICOS.
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE INVERTASA POR EL MÉTODO DE LA
GLUCOSA-OXIDASA-PEROXIDASA.
Reactivos:
A. Solución enzimática: a un litro de regulador de fosfatos 0.1 M pH 7.0 se le
adicionan 5 mg de peroxidasa (SIGMA) y 1 ml de la enzima glucosa oxidasa (SIGMA).
B. Solución de o-dianisidina: 300 mg de o-dianisidina en 50 mi de agua destilada.
C. Mezcla enzimática: 20 mi de reactivo A m s 1 mi de reactivo B (preparada al
momento de usarse).
D. Solución de sacarosa 0.5 M.
E. Solución de HCI 6 N.
F. Regulador de acetatos 0.1 M PH 4.5.
Procedimiento:
En un tubo de ensayo se colocan 100 microlitros del reactivo F y 50 microlitros del
reactivo D. La mezcla se incuba 10 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente se
adicionan 2 mi del reactivo C y se deja a temperatura ambiente durante 8 minutos.
Transcurrido este tiempo se detiene la reacción adicionando 2 mi del reactivo E. El color
desarrollado se mide a 540 nm en un espectrofotómetro.
Una unidad de invertasa (U) se define como un micromol de glucosa liberada por
un minuto en las condiciones de ensayo.
Reactivos:
A. Solución de tartrato de sodio y potasio al 1% en sulfato cúprico al 0.5%.
B. Solución de carbonato de sodio al 2% en hidróxido de sodio 0.1 N.
C. Se mezclan 50 mi de B con 1 mi de A (preparado al momento de usarse)
D. Reactivo Folin-Ciocalteu diluido 1:2 con agua destilada.
Procedimiento:
En un tubo de ensayo se adicionan 500 microlitros de muestra diluida y 5 ml del
reactivo C, se dejan incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente, pasado este
tiempo se agregan 0.5 ni] del reactivo D, la mezcla se agita y se esperan 30 minutos para
que se lleve a cabo la reacción, transcurrido este tiempo, el color desarrollado se mide en
un espectrofotómetro a 500 nm. De la misma manera se prepara un blanco de reactivos,
126
sustituyendo la muestra por agua destilada, y un control utilizando una solución de
albúmina de bovino de 0.5 mg/ml tratado en forma similar.
RESULTADOS.
1. Elaborar un cuadro comparativo de la actividad enzimática en el
sobrenadante y el paquete celular antes y después de la extracción.
2. Determinar el % de liberación de la enzima durante la extracción.
3. Determinar la eficiencia de recuperación de la enzima durante la
purificación.
4. Determinar el grado de purificación relativo de la invertasa.
5. Discusión y conclusiones.
REFERENCIAS.
Ahuatzi C. D. Extracción y purificación de la invertasa de Cándida utilis Y-900.
Tesis Escuela Nacional de Ciencias Biológicas. IPN. México.
127
PRÁCTICA No. 6
FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA
OBJETIVOS.
Esta práctica tiene como objetivo que el participante conozca la importancia
económica y social que tiene la producción de alcohol, permitiendo la integración de
conocimientos de microbiología industrial, ingeniería bioquímica, operaciones unitarias,
as¡ como diversos métodos analíticos, para su elaboración a escala de laboratorio,
partiendo desde el acondicionamiento de la materia prima hasta la recuperación de]
producto, basados en una investigación previa de los métodos actuales de producción de
alcohol a nivel industrial.
INTRODUCCIÓN.
Una de las fermentaciones industriales de mayor importancia económica y, quizás,
la más antigua producida por el hombre, es la fermentación alcohólica, que es la base
para la producción del aguardiente, por destilación de un mosto fermentado.
El mosto fermentado se obtiene a partir de la acción de un microorganismo
usualmente una levadura, sobre una solución azucarada.
La fuente más común para la producción de alcohol, es la caña de azúcar,
utilizando principalmente en la industria las melazas. Otras son los frutos, los granos,
tubérculos, y agaves. El uso de una u otra dependerá del producto que se desea y de un
estudio económico.
A continuación se presenta una tabla que relaciona el tipo de bebida alcohólica
según la materia prima que se utilice.
I.Frutas
Uvas.
a) Vinos generosos. Licores (bebidas naturales
b) coñac. con ingredientes y
c) Brandy. endulzadas).
Manzana. a)Sidra.
Durazno, zarzamora, b)Licores
Naranja, etc.
II. Caña de azúcar
Piloncillo.
a) Aguardiente. Licores
b) Ron. Vodka, Ginebra.
c) Alcohol
Melazas.. a) Aguardiente. Licores
b) Ron. Vodka Ginebra
c)Alcohol Alcohol industrial
III. Granos
Maíz glucosa a) Whisky. Vodka.
b) Alcohol Ginebra.
128
Cebada, maltosa, a) Cerveza.
Y glucosa. b) Whisky.
Arroz. a) Sake.
b) Whisky
IV.Tubérculos
Remolacha. a) Aguardiente.
b) alcohol.
V.Agaves
Agave atrovirens. a) Pulque.
Agave azul. a) Tequila
Agave esperrima Jacobi a) Mezcal
Agave. a) sotol
.
REACTIVOS, MATERIALES Y EQUIPO.
1. Materias primas: Fuente de carbono (de acuerdo a la disponibilidad en el
laboratorio, melazas, piloncillo, ó almidón y malta), sulfato de amonio dibásico, fosfato de
amonio, sulfato de magnesio, ácido sulfúrico 1:1, levadura de panificación seca o fresca,
y agua.
2. Mosto: Preparar el mosto a partir de melazas, o piloncillo, continuar en el
inciso 3. Si la materia prima es almidón y malta, continuar en el punto 7.
3. Determinar el contenido de azúcares reductores y los grados Brix a las
melazas (piloncillo).
4. Con el resultado anterior, y utilizando el diagrama de Pearson, estimar la
cantidad de melazas que se requieren para 15 litros de mosto con una
concentración de 18 % de azúcares reductores.
5. Enriquecer el mosto con:
NH4)2SO4 0.300 g/l.
NH4)2HP04 0.240 g/l.
MgSO4 0.024 g/l.
6. Ajustar el pH entre 4.0 y 4.5 con ácido sulfúrico diluido 1:1
7. Almidón, en este caso se requiere como paso preliminar la transformación
del almidón en azúcares fermentables por la levadura, este proceso se realiza utilizando
enzimas procedentes de otras fuentes, que hidrolizan al almidón en maltosa y glucosa. El
grano de trigo se somete a una molienda regular, para aumentar el rea de contacto del
almidón con las enzimas, pesar y colocar la molienda en un recipiente y agregar dos
veces su peso de agua, y calentar para gelatinizar el almidón. La temperatura de
gelatinización varía con el tipo de almidón y tamaño de los granos, por ejemplo el almidón
de trigo gelatiniza a temperatura de 60 a 85°C, el de papa entre 55 y 60°C y el almidón de
arroz entre 80 y 85°C. el tiempo de gelatinización es de 15 a 20 minutos. Ya gelatinizado,
se ajusta la temperatura a 70°C y se le adiciona de un 20 a 30% de malta referido al peso
de la molienda del grano de almidón, se mantiene a 70'C para que las enzimas que se
encuentran en la malta actúen hidrolizando el almidón, el tiempo de hidrolizado se
determina con una prueba sencilla de tinción de almidón con una solución de yodo al 1%,
129
cuando la prueba es negativa, habrá terminado el proceso de gelatinización (el yodo ya
no da color, ya que los almidones han sido hidrolizados).
8. Se procede como en los puntos 3, 4. y 6, y luego pasar al inciso 9
9. Fermentación: Para iniciar la fermentación primero se tiene que inocular
adicionando 2 g de levadura fresca de panificación por litro de mosto, o 1 g de levadura
de panificación seca por litro de mosto. Se recomienda activar la levadura 30 min. antes
en 1.5 litros del mismo mosto con burbujeo de aire estéril. Una vez realizado esto, se tapa
el recipiente en que ha de efectuarse la fermentación, del cual se tomar n muestras cada
6 horas para el control del proceso, iniciando con una muestra al tiempo cero.
Grado alcohólico real: En un matraz balón de 500 ml, colocar 100 ml de muestra
(15 o 20°C), mas 60 ml de agua destilada. Destilar lentamente recibiendo el destilado en
un matraz volumétrico de 100 m], éste se sumerge en un recipiente con hielo. Recoger el
destilado hasta 2 ml antes del aforo, completar con agua destilada, homogeneizar y medir
el grado alcohólico con un densímetro Ga -Lussac, y la temperatura (corregir por
temperatura y referir la lectura Gay-Lussac a 15 °C)
METODOLOGÍA.
La práctica se efectuará en cuatro sesiones, de acuerdo a. la programación que le
ser entregada por el coordinador del laboratorio, más tiempo extraclase.
En la primera sesión los participantes del equipo, presentarán en una sesión de
Seminario los siguientes puntos que habrá investigado con anticipación a la fecha de la
práctica programada.
Ruta metabólica a través de la cual se verifica la fermentación alcohólica y
organismos que la llevan a cabo.
130
Antecedentes históricos sobre la producción de alcohol en el país.
Importancia económica e impacto social.
Uso del alcohol
Fuentes de carbono susceptibles de ser usados como materia prima en la
producción de alcohol y su acondicionamiento.
Producción industrial de alcohol por vía fermentativa, a) materias primas, b)
condiciones del proceso, c) cinética de la fermentación d) productos y subproductos,e)
recuperación del producto.
RESULTADOS.
El informe de la práctica incluir los siguientes puntos:
Presentación e introducción.
Cinética de producción de etanol, consumo del sustrato y crecimiento
microbiano.
Comparar los rendimientos, teórico y experimental de producción de etanol.
Calcular el rendimiento de la primera destilación.
Discusión y conclusiones.
Bibliografía.
REFERENCIAS.
Amerine, M.A. 1974. Análisis de vinos y mostos. Ed. Acribia Barcelona
Palacios L. H. 1956. Fabricación del alcohol. Salvat editores, S.A.
Prescott, S.C. & Dunn C.G. 1962. Microbiología Industrial, 3a. edición Aguilar,
Madrid
131
PRÁCTICA No. 7
PRODUCCIÓN DE PROTEÍNA UNICELULAR MEDIANTE LA TÉCNICA DEL
CULTIVO EXTENDIDO
OBJETIVOS.
Realizar un proceso fermentativo de producción de proteína unicelular
programando la alimentación de sustrato a partir de la simulación del proceso basada en
los modelos, las constantes cinéticas y estequiométricas que rigen el crecimiento del
microorganismo.
INTRODUCCIÓN.
Los cultivos por lote co - suministro de sustrato han recibido a lo largo de su
historia diversas denominaciones; proceso "Zulauf - término introducido por investigadores
daneses y alemanes a principios de este siglo -, proceso "batch fed", "Semibatch" y "fed-
batch" en los países de habla inglesa. Este último término es actualmente el de uso más
generalizado y fue introducido por Yoshida en 1973.
Existen otras denominaciones para casos particulares como son los de: "cultivo
extendido" y el de "fed-batch exponencial" que se aplican para describir un cultivo
alimentado en donde la concentración de sustrato limitante del crecimiento es mantenida
constante por manipulación de la velocidad de suministro de nutrientes. Ocasionalmente,
estos cultivos son referidos como “fermentaciones de volumen variable”..
La técnica del cultivo extendido (CE) se ha venido utilizando desde hace por lo
menos medio siglo. Su uso fue completamente empírico hasta bien entrada la década de
los setenta en que coinciden; el desarrollo de modelos matemáticos para este tipo de
cultivos con el auge de la aplicación de los microprocesadores en la tecnología de
fermentaciones, coincidiendo además con el desarrollo de nuevos sensores y
servomecanismos para el seguimiento y control de procesos.
Para que un cultivo alimentado sea realmente productivo y en ‚l se obtengan
valores elevados de conversión de nutrientes a productos, se requiere de una exacta
predicción de los eventos que ocurrir n en el cultivo, tales como variación en los
indicadores cuantitativos de: crecimiento, producción de metabolitos y consumo de
nutrientes y de oxígeno, del microorganismo; así como de un estricto control de las
variables ambientales que afectan al proceso fermentativo. Una inadecuada predicción
de eventos puede resultar en alteraciones ambientales que modifiquen de forma
imprevista la fisiología del microorganismo, provocando una desviación en la fermentación
hacia la producción de metabolitos indeseables, abatiéndose la productividad, el
rendimiento o ambos.
Dependiendo del objetivo de una fermentación, la estrategia de alimentación de
nutrientes a un cultivo puede ser de dos tipos: velocidad de suministro constante o
variable. En este último caso, la velocidad de suministro se incremento paulatinamente
con el fin de sostener un nivel constante del sustrato limitante en el cultivo. La variación
en este suministro puede programarse previamente para satisfacer la demanda creciente
del cultivo por nutrientes o bien, puede introducirse un sistema de control capaz de
estimar y satisfacer dicha demanda. Tal sistema tendría una serie de sensores que
suministrarían información a una unidad de procesamiento de datos, la cual enviaría a
servomecanismos periféricos específicos (válvulas, bombas, motovariadores, etc.) para
modificar velocidades de suministro de nutrientes o de oxígeno, cuando esto fuera
necesario.
132
BASES TEÓRICAS DEL CULTIVO EXTENDIDO.
a) Ecuaciones de balaiwe.
Consideremos un reactor con un volumen inicial [Vo] de medio de cultivo con una
concentración de sustrato limitante [s] y una densidad de población celular [x] que se
incremento con una velocidad específica de crecimiento [ ]. A un tiempo dado se
comienza a suministrar al cultivo un flujo [F] de medio fresco que contiene al sustrato
limitante del crecimiento a una concentración [Sr]. No habiendo salida del mosto del
reactor durante el proceso, el volumen de medio en el fermentador variará continuamente,
a menos que la alimentación se haga con sustrato puro (sólido o líquido), en cuyo caso el
volumen se mantendrá constante.
133
[d(Vs)/dt]ac = F(Sr) - 0 - qs(Vx) = F(Sr) - ( /Yxs)(Vx) (5)
Siendo (qs = /Yxs), donde [qs] es la velocidad específica de consumo de sustrato.
s(dV/dt) + V(ds/dt) = F(Sr) - ( /Yxs)(Vx)
Por lo tanto la velocidad volumétrica de acumulación de sustrato estar dada por:
(ds/dt)ac = D(Sr - s) - x/Yxs (6)
Cuando interesa describir la acumulación de algún producto en el reactor, se
hace a partir de la ecuación de balance para producto.
Las ecuaciones de balance anteriores pueden considerarse como las
fundamentales para el cultivo alimentado.
b) Comportamiento de un cultivo extendido.
Partiendo de la base de que el suministro de nutrientes se mantendrá igual a la
demanda del cultivo; se tendrá un valor constante de la concentración de sustrato
limitante [s], y por lo tanto una velocidad específica de crecimiento [m] constante. En
estas condiciones tendremos que en la ecuación de balance (6), el valor de la
acumulación volumétrica de sustrato ser cero.
Por tanto:
(F/V)(Sr - s) = ( x/Yxs)
De donde:
F = [( xV)/Y(Sr - S)] (7)
Sustituyendo el valor (xV = X) en la ecuación de balance (3) e integrando entre los
límites (to = 0 -> t):
X = Xo e( t) = xV (8)
Sustituyendo esta expresión en la ecuación (7), tendremos:
F = [ Xo/Yxs(Sr - s)] e( t) (9)
Con base en las consideraciones iniciales planteadas (s= cte, = cte.) tendremos
que de acuerdo a la ecuación (2); el valor d‚ [Y] ser también constante. Por lo tanto
tendremos que el flujo variar exponencialmente de acuerdo a la ecuación:
F = a e( t) (10)
Donde:
a = [ .Xo/Yxs(Sr - S)] = Constante.
La variación en volumen se obtiene sustituyendo el valor de [F] en la
diferencial:
dV/dt = F = a e( t)
Integrando entre los límites (to = 0 -> t), obtendremos:
V=Vo + [Xo/ Yxs(Sr - s)] [e( t) – 1] (11)
Por sustitución de las ecuaciones (2) y (11) en la ecuación (8), obtendremos la
trayectoria de la concentración celular en un cultivo alimentado exponencialmente:
x = [(XoVo) e( t)]/(Vo +[xoVo ( + mYg)/( Yg)(Sr - s)][e( t) – 1]} (1,2)
Para poder alimentar exponencialmente a un cultivo, manteniendo un nivel
constante del sustrato limitante, se requiere de un control muy preciso de la velocidad de
operación de Ia bomba de suministro de nutrientes.
134
METODOLOGÍA.
1. Se realizará un cultivo por lote en donde se estimarán los siguientes valores:
[ máx] y [Yxsl. Estos, junto con otros valores obtenidos anteriormente (m, Yg y Ks), para
Candida utilis Y-900 en cultivo continuo a 35'C, ser n utilizados para establecer el
programa de alimentación del cultivo.
2. El suministro de medio fresco ser exponencial y se iniciará cuando la
concentración de sustrato llegue a un valor mínimo preestablecido. La alimentación
programada a partir de la simulación del comportamiento del cultivo, se hará por medio
de una bomba peristáltica de velocidad variable para mantener un valor de [s] constante.
3. Durante el cultivo por lote y el cultivo extendido se tomar n muestras, a las que
se les determinará inmediatamente la concentración celular y la concentración de
glucosa. La concentración celular se estimar por turbiedad y por peso seco, y la glucosa
por ensayo enzimático con glucosa oxidasa.
RESULTADOS.
Calcular [ máx], y los valores de rendimiento y productividad celular media
de Candida utilis Y-900 en el cultivo por lote.
REFERENCIAS.
Araujo, M. D. 1980. Producción de proteína unicelular a partir de desechos de
plátano mediante un proceso fermentativo de volumen variable con alimentación
programada. Tesis profesional. ENCB.
135
Reed, G., y H. J. Peppler. 1973. Yeast Technology. AVI Publishing, Co., New York.
136