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NadR E. coli: Introduzione.

La cellula funziona attraverso una miriade di vie metaboliche (processi

degradativi, trasferimento di energia, sintesi di macromolecole) ciascun

passaggio delle quali è catalizzato da uno o più enzimi. Le reazioni che

comportano il trasferimento di atomi di idrogeno, si realizzano con

l’intervento di specifiche proteine enzimatiche e di un limitato numero di

composti accettori, denominati coenzimi.

Uno di questi è il NAD+: nicotinammide adenin dinucleotide (fig. 1).

Figura 1. Forma ossidata del nicotinammide adenin dinucleotide (NAD+).


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Nell’ossidazione dei substrati, il NAD+ è il principale accettore di elettroni

per la formazione di adenosina trifosfato (ATP). Il residuo coinvolto è l’anello

piridinico (fig. 2): durante l’ossidazione del substrato, uno ione idruro (un

nucleo di idrogeno con due elettroni) viene trasferito sul C4 dell’anello

piridinico del NAD+, che quindi si riduce a NADH; durante la riduzione del

substrato, uno ione idruro viene trasferito dal C4 dell’anello piridinico del

NADH, che si riossida a NAD+.

Figura 2. L’anello di nicotinammide è la parte reattiva del NAD+ nelle reazioni di


ossido-riduzione.

In aggiunta, il NAD+ è substrato di reazioni che sfruttano l’energia

liberata dalla rottura dei legami altamente energetici presenti nella molecola.

Negli eubatteri, la scissione del legame pirofosforico, con liberazione di

nicotinammide mononucleotide (NMN) e adenosina monofosfato (AMP), è


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utilizzata per l’attivazione della DNA ligasi, uno degli enzimi della

replicazione del DNA.

Sempre negli eubatteri, con la rottura del legame N-glicosidico, viene

liberato un residuo di ADP-riboso che, a livello della membrana plasmatica

e/o del citoplasma, legato covalentemente a una proteina accettrice, ne

modula l’attività. La reazione è catalizzata dalle mono ADP-ribosiltrasferasi

(1). Negli eucarioti, invece, la reazione è una poli ADP-ribosilazione e

l’enzima è una poli ADP-riboso polimerasi, capace di legare covalentemente

polimeri di ADP-riboso a proteine accettrici coinvolte in importanti eventi

nucleari quali la riparazione del DNA, l’espressione genica ed il

differenziamento cellulare (2, 3).

Infine, un gruppo di enzimi denominati NAD+ glicoidrolasi catalizza

l’idrolisi del NAD+ a nicotinammide e ADP-riboso noché la conversione di

quest’ultimo ad ADP-riboso ciclico, un potente fattore che modula il rilascio

del calcio intracellulare (4, 5).

Il NAD+ è quindi un composto indispensabile per la cellula (durante la

crescita esponenziale di Escherichia coli la concentrazione del nucleotide

piridinico è 1,3 mM): pertanto i livelli intracellulari debbono essere

accuratamente mantenuti costanti, attraverso una fine regolazione delle sue

vie di sintesi e di degradazione.


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Attualmente l’unico regolatore conosciuto della biosintesi del NAD+ è la

proteina NadR, presente solo negli eubatteri. In Escherichia coli e Salmonella

typhimurium, NadR, indicato da alcuni come NadI (8, 9, 19, 20), agisce come

repressore della trascrizione di nadA e nadB, due geni della sintesi de novo, e

di pncB, un gene di una delle vie di recupero (6, 7, 8).

Biosintesi del NAD+ negli eubatteri.

Sintesi de novo.

Esistono due principali vie biosintetiche del NAD+: la prima, presente

negli eucarioti, inizia dalla degradazione aerobica del triptofano, l’altra è

tipica degli eubatteri ed avviene in anaerobiosi. Entrambe le vie portano alla

formazione dell’acido chinolinico (QA) e quella che converte questo a NAD+

è comune a tutti gli organismi (10, 11).

Negli eubatteri, dunque, la sintesi de novo procede anaerobicamente

attraverso una prima reazione di condensazione tra L-aspartato e

diidrossiacetonefosfato (DHAP), catalizzata dal sistema della chinolinato

sintetasi, un complesso di due enzimi. Il gene nadB codifica per il primo

enzima del complesso: l’L-aspartato ossidasi, che converte l’L-aspartato in

immino aspartato; il gene nadA codifica per il secondo enzima del sistema: la

chinolinato sintetasi che catalizza la condensazione dell’immino aspartato con

il DHAP, per dare QA (10, 11). Un unico enzima, la chinolinato


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fosforibosiltrasferasi (QPRTasi), interviene nel passaggio da QA a desamido

NMN (NaMN); la nicotinammide mononucleotide adeniltrasferasi (NMN-

AT), utilizzando ATP, adenila NaMN a desamido NAD+ (NaAD+). Infine

l’enzima NAD+ sintetasi catalizza la reazione di amidazione del NaAD+, con

produzione di NAD+ (10, 11) (fig. 3).

nad B nad A nad C nad D nad E


COOH COOH COOH COOH COOH CONH2

1 2 3 4 5
H2N COOH +
HN COOH N COOH N + +
N Ad N Ad

Asp IA PO4 QA R P R P P R R P P

NaMN NaAD NAD


O

OH

DHAP

Figura 3. Sintesi de novo del NAD+ negli eubatteri. Enzimi: (1) L-aspartato ossidasi;
(2) chinolinato sintetasi; (3) chinolinato fosforibosiltrasferasi; (4) nicotinammide
mononucleotide adeniltrasferasi; (5) NAD+ sintetasi. (Asp: aspartato; IA:
imminoaspartato; QA: chinolinato; DHAP: diidrossiacetonefosfato).

Vie di recupero.

Una volta sintetizzato, il NAD+ è utilizzato per molteplici scopi e

sottoposto a un continuo turnover: esistono più vie di recupero dei prodotti di


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degradazione del dinucleotide, complessivamente note come Ciclo dei

Nucleotidi Piridinici, PNC (10, 11).

In Escherichia coli e Salmonella typhimurium sono conosciute due vie di

recupero operanti a livello della membrana cellulare (10) (fig. 4 e 5).

La principale via di recupero è schematizzata in fig. 4 e comprende 1a)

l’idrolisi del legame pirofosforico del NAD+ con formazione di NMN e AMP;

2a) la deamidazione dell’NMN a NaMN; 3a) la formazione di NaAD+ a

partire da NaMN e ATP e 4a) infine la conversione di NaAD+ a NAD+.

Questo ciclo è noto come PNC IV (10).

La seconda via, indicata come PNC VI (10) e illustrata in figura 5,

procede con 1b) la rottura del legame pirofosforico del NAD+ e liberazione di

AMP e NMN; 2b) l’idrolisi del legame glicosidico dell’NMN con formazione

di nicotinammide (Nm); 3b) la deamidazione della nicotinammide a

nicotinato (NA); 4b) la conversione di NA a NaMN catalizzata dalla

nicotinato fosforibosiltrasferasi (NaPRTasi), codificato dal gene pncB. In

Escherichia coli, l’enzima è sotto il controllo repressivo del nicotinato (11) e

attraverso tale repressione, la cellula modula i livelli intracellulari di NAD+

(10). Infine le ultime due reazioni del ciclo sono la 3a) e la 4a), descritte per il

ciclo PNC IV.


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nad D nad E
COOH CONH2

4 5
+
N + + Ad
N Ad N
R P R R P P R
P P R
NaMN NaAD NAD

11 6 lig

CONH2

N
+ NMN

R P

membrana plasmatica membrana plasmatica

NMN

10 pnu E

NAD

Figura 4. PNC IV. Enzimi: (4) nicotinammide mononucleotide adeniltrasferasi; (5)


NAD+ sintetasi; (6) DNA ligasi; (11) NMN deamidasi; (10) NAD+ pirofosfatasi.
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nad D nad E
COOH COOH COOH

+ 4 + 5 +
N N Ad N Ad
R P R P P R R P P R
NaMN NaAD NAD

9 pnc B

6 lig
COOH

N NA

8 pnc A

CONH2 CONH2
7

+
NMN
N N
Nm R P

membrana plasmatica membrana plasmatica

NMN

10
pnu E

NAD

Figura 5. PNC VI. Enzimi: (4) nicotinammide mononucleotide adeniltrasferasi; (5)


NAD+ sintetasi; (6) DNA ligasi; (7) NMN glicoidrolasi; (8) nicotinammide deamidasi;
(9) nicotinato fosforibosiltrasferasi; (10) NAD+ pirofosfatasi. (Nm: nicotinammide; NA:
acido nicotinico.)
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Regolazione della via biosintetica del NAD+: il fattore di trascrizione

NadR.

In Escherichia coli e Salmonella typhimurium la trascrizione dei primi due

geni della sintesi de novo del NAD+, nadA e nadB (6, 7, 8) e la trascrizione di

pncB (21, 22), che partecipa alle vie di recupero del dinucleotide piridinico,

sono sotto il controllo negativo di una proteina codificata da un gene

regolatore denominato nadR (6, 7), da alcuni indicato come nadI (8, 9, 19,

20).

In entrambi gli organismi il locus nadR mappa vicino il gene pnuA, che

codifica per un enzima coinvolto nel trasporto della nicotinammide (16), e il

gene serB, che codifica per un enzima della sintesi della serina (15).

Escherichia coli e Salmonella typhimurium sono in grado di trasportare

dall’ambiente esterno, attraverso la membrana citoplasmatica, la molecola

intatta dell’NMN, che viene poi utilizzata per la sintesi del NAD+. Coinvolta

nel trasporto del mononucleotide è la proteina di membrana PnuC, codificata

dal gene pnuC, che forma un operone con nadA (17, 18).

Mutazioni nadR possono originare fenotipi difettosi nella regolazione

della trascrizione, fenotipi carenti nel trasporto dell’NMN e fenotipi mancanti

di entrambe le funzioni (18, 19, 21). Il gene nadR da Salmonella typhimurium

è stato clonato e sequenziato (18): plasmidi ricombinanti per il nadR,


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introdotti in ospiti con fenotipi difettosi nella regolazione genica e nel

trasporto dell’NMN, complementano tali funzioni (18). Mutazioni che

spengono la regolazione genica, senza influenzare il trasporto, sono

localizzate verso l’estremità ammino terminale della proteina (21); mutazioni

nella regione carbossilica, invece, annullano la funzione di trasporto, senza

alterare la capacità di legare il DNA (21).

Il NadR è quindi una proteina bifunzionale che agisce da repressore per

regolare la biosintesi del NAD+ e partecipa al trasporto dell’NMN. È stato

ipotizzato che il NadR sia una proteina allosterica: l’una o l’altra funzione si

realizzerebbe in risposta ai livelli intracellulari del dinucleotide piridinico. In

presenza di alti livelli di NAD+, NadR assumerebbe una conformazione adatta

alla funzione di repressore e interagirebbe con nadA, nadB, pncB,

bloccandone la trascrizione; in carenza di NAD+, NadR assumerebbe una

conformazione adatta alla funzione di trasporto, per favorire l’ingresso

dell’NMN esterno, lasciando contemporaneamente libera la trascrizione di

nadA, nadB, pncB. Sarebbe proprio l’interazione diretta tra NAD+ e NadR a

far assumere a quest’ultima una delle due conformazioni funzionali (fig. 6, 7).
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NMN
 
PnuC
membrana plasmatica membrana plasmatica membrana

NadR

DNA nadA // nadB // pncB

Figura 6. Modello proposto per la natura bifunzionale del NadR: a basse


concentrazioni intracellulari di NAD+, il NadR permette la trascrizione di nadA, nadB,
pncB e interagisce con la proteina di membrana PnuC, per favorire il trasporto di NMN
all’interno della cellula.

NMN

PnuC
membrana plasmatica membrana plasmatica membrana

NAD+

NadR
DNA nadA // nadB // pncB

Figura 7. Modello proposto per la natura bifunzionale del NadR: ad alte concentrazioni
intracellulari di NAD+, il NadR, interagendo con il dinucleotide, cambia conformazione,
si stacca dalla NMN permeasi (PnuC) e reprime la trascrizione dei geni nadA, nadB e
pncB.
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È stato importante l’isolamento di un mutante, nadRS (21), denominato

super repressore, che non era più sottoposto ad alcun tipo di regolazione, nel

senso che il NadR inibiva costantemente la trascrizione dei geni nadA e nadB.

In questo mutante, la proteina NadR era probabilmente bloccata nella

conformazione che permette la regolazione genica. Quattro mutazioni nadRS

su cinque mappavano nella zona centrale del gene, suggerendo che la

sequenza amminoacidica, da questa codificata, fosse responsabile del

passaggio da una conformazione all’altra, a seguito della probabile

interazione con il NAD+ (21). Tuttavia, non sono state trovate nel NadR

sequenze consensus tipiche di proteine che legano dinucleotidi, anche se sono

presenti due sequenze consensus per il legame di mononucleotidi: Gly-X-X-

X-Gly-Lys, nella regione ammino terminale, Gly-X-X-X-X-Gly-Lys-Ser,

nella regione centrale (18). L’ipotesi che sia proprio il NAD+, interagendo o

meno con la zona centrale del NadR, a spingere la proteina verso una delle

due conformazioni possibili e quindi a determinare una delle funzioni a queste

collegate, non è stata fino ad ora dimostrata. È interessante sottolineare che la

sequenza consensus presente nella regione centrale del NadR e tipica di

proteine che legano l’ATP, è anche presente nel sito di legame per il NAD+ di

una famiglia di aldeidi deidrogenasi NAD+ dipendenti (23, 24).


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Recentemente sono state approfondite le conoscenze sull’interazione

DNA-NadR (22). La proteina da Salmonella typhimurium, iperespressa in

Escherichia coli e purificata, è stata sottoposta a studi di interazione con il

DNA e nei geni nadA, nadB e pncB sono state evidenziate tipiche regioni

consensus, chiamate NAD+box, nelle quali si è dimostrato avere luogo il

legame di NadR. I geni nadA e nadB presentano due NAD+box, che si

sovrappongono a un potenziale sito di legame per l’RNA polimerasi (box 1) e

a un potenziale sito di legame per il ribosoma (box 2), favorendo forse la

formazione di un’ansa nel DNA. Il gene pncB ha un solo NAD+box completo,

che si sovrappone a un potenziale sito di legame per il ribosoma; così pncB è

regolato meno strettamente rispetto a nadA e nadB (22).

L’interesse per il NadR del laboratorio in cui ho svolto il lavoro oggetto

della presente tesi è scaturito dai risultati di una ricerca in banca dati con il

programma BLAST (25), che hanno evidenziato una significativa omologia di

sequenza tra il NadR da Escherichia coli e Salmonella typhimurium con

l’enzima NMN adeniltrasferasi da Methanococcus jannaschii (13). L’NMN

adeniltrasferasi, codificato dal gene nadD, nella via biosintetica del NAD+

catalizza il trasferimento del gruppo adenilico dell’ATP all’ NMN o desamido

NMN con formazione di NAD+ o desamido NAD+, e liberazione di

pirofosfato (fig. 3, 4, 5).


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Una regione di 29 amminoacidi, presente nella parte ammino terminale

dell’NMN adeniltrasferasi da Methanococcus jannaschii è significativamente

omologa a una regione centrale del NadR da Escherichia coli e Salmonella

typhimurium (fig. 8).

NMN AT da Metahanococcus jannaschii:


1 -----------LRGFIIGRFQPFHKGHLEVIKKIAEEVDEIIIGIGSAQKS-------HT 42
NadR da Escherichia coli:
61 FLGLEFPRQKKTIGVVFGKFYPLHTGHIYLIQRACSQVDELHIIMGFDDTRDRALFEDSA 120
NadR da Salmonella typhimurium:
53 FLGLEFPRRQKNIGVVFGKFYPLHTGHIYLIQRACSQVDELHIIMGYDDTRDRGLFEDSA 112

Figura 8. Omologia di sequenza tra NMN adeniltrasferasi da Methanococcus


jannaschii, NadR da Escherichia coli e NadR da Salmonella typhimurium. In rosso sono
riportati i residui amminoacidici identici e simili.

La presenza nel NadR di tale sequenza, conservata in tutte le NMN

adeniltrasferasi da archaea (12, 13), da eubatteri (44) e da eucaria (45, 46) ha

indotto ad ipotizzare un’attività NMN adeniltrasferasica associata al NadR

che, a partire da NMN e ATP, sarebbe così capace di sintetizzare NAD+. A

tale proposito è importante sottolineare che fino ad oggi, in letteratura, sono

riportati solo pochissimi esempi di fattori trascrizionali dotati di attività

enzimatica (26, 27).


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Scopo della presente tesi è il clonaggio e l’espressione del nadR da

Escherichia coli, al fine di verificare e studiare l’attività NMN

adeniltrasferasica della proteina ricombinante.