LA REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)

La PCR , Polymerase Chain Reaction o comunemente Reazione a Catena della Polimerasi , è una
tecnica di Biologia Molecolare che consente di amplificare esponenzialmente ed in modo selettivo un
determinato segmento di DNA , definito DNA bersaglio / DNA target a partire o da un singolo filamento di
DNA stampo / DNA Template o da una miscela complessa di DNA stampo/Template avente un basso
livello di purificazione.
La PCR è perciò un metodo dalle vaste potenzialità, per amplificare grandi quantità della porzione
desiderata di una molecola di DNA in tempi molto più brevi di quelli necessari per il clonaggio e, difatti pur
non prevedendo l'impiego di cellule viventi , la PCR riproduce similmente in vitro (in provetta) il
meccanismo di replicazione del DNA , utilizzato da milioni di anni dalle cellule dei viventi.
La tecnica PCR è stata ideata da Kary B. Mullis nel 1983, il quale ottenne, per questo, il Premio Nobel per la
chimica nel 1993.
Un prerequisito indispensabile per eseguire un corretto esperimento di PCR , è la conoscenza delle
sequenze nucleotidiche che delimitano le estremità della regione bersaglio o target .
E' necessario conoscere le sequenze fiancheggianti perché la PCR richiede che due corti oligonucleotidi
(complementari ai tratti 3' del DNA bersaglio / DNA target) a singolo filamento , si ibridino alla molecola
di DNA stampo / DNA Template , in particolare alle due estremità 3' della regione bersaglio /target.
Questi oligonucleotidi , definiti primer , fungono da innesco per la reazione di sintesi del DNA ,
delimitando la sequenza bersaglio/ target che verrà amplificata.

La tecnica di PCR consente di riprodurre centinaia di milione di copie di DNA tutte identiche tra loro e alla
sequenza bersaglio / target.

I Componenti della PCR

La PCR è una tecnica capace di riprodurre in vitro (provetta) il meccanismo di replicazione del DNA ,
miscelando in soluzione :
- DNA stampo o DNA Template
Il DNA stampo è una molecola di DNA a doppia elica, la quale , contiene necessariamente la sequenza
bersaglio o target da amplificare.
E' possibile verificare la presenza della sequenza bersaglio nel DNA stampo mediante opportuni controlli :
un controllo positivo indicherà la presenza della sequenza bersaglio, diversamente , un controllo negativo
indicherà l'assenza della sequenza bersaglio , dovuto ad eventuali contaminazioni .
La PCR è una tecnica estremamente sensibile e può essere realizzata a partire da una singola molecola di
DNA bersaglio o a partire quantitativamente da 105-106 molecole di DNA bersaglio .
La natura del DNA stampo o DNA Template è relativamente :
-Omogenea, ( esempio : DNA plasmidico purificato ) si intende un insieme di molecole di DNA stampo
identiche tra loro. In tal caso sono sufficienti pochi picogrammi (pg) di DNA stampo per consentire la
reazione di amplificazione.
-Eterogenea, (esempio : DNA genomico o materiale biologico) si intende un insieme di molecole DNA
stampo diverse tra loro. In tal caso è necessario almeno 1 microgrammo ( g) di molecole di DNA stampo
per consentire la reazione di amplificazione.
La lunghezza del DNA stampo o DNA Template deve essere compresa tra 1.5 - 2 Kb per garantire un'ottima
efficienza della tecnica PCR.