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INTRODUZIONE

La Bluetongue, BT (“Lingua blu”), conosciuta anche come


febbre catarrale degli ovini, è una malattia infettiva non
contagiosa dei ruminanti, causata da un virus (Blue Tongue Virus
– BTV) appartenente al genere Orbivirus, famiglia Reoviridae e si
trasmette agli ospiti vertebrati prevalentemente attraverso la
puntura di artropodi ematofagi. Alcune specie di ditteri
appartenenti al genere Culicoides, famiglia Ceratopogonidae,
rappresentano i vettori biologici p.d. in quanto competenti per la
replicazione virale.

La malattia, sebbene non sempre le infezioni da BTV esitino


in forme cliniche, è caratterizzata da infiammazione catarrale a
carico degli apparati digerente e respiratorio, edema della testa,
necrosi della muscolatura scheletrica, laminite, aborto e
malformazioni fetali. Questi, infatti, sono spesso indeboliti in
maniera letale causando gravi perdite dal punto di vista
economico. Per questo motivo la Blue Tongue è stata inserita
nella lista A dell’Office International des Epizooties (O.I.E.) che
comprende patologie animali che ”che possiedono il potenziale
per una diffusione molto rapida e di rilevante entità …..e che
assumono la maggiore importanza nel commercio internazionale
degli animali e delle produzioni animali.”.

Gli orbivirus, a causa dell’organizzazione del loro genoma,


risultano essere tra i virus maggiormente soggetti a mutazioni e
ricombinazioni. Al momento sono segnalati 24 sierotipi diversi del
virus della Blue Tongue, la cui distribuzione geografica non è
uniforme. La presenza del virus è segnalata in tutti i continenti,
mentre la malattia appare diffusa in determinate aree ed a
determinate latitudini, essendo la sua presenza considerata
generalmente ristretta alle aree geografiche comprese tra il 35°
parallelo S e il 40° parallelo N. Il continente in cui è segnalato il
maggior numero di sierotipi (21 per l’esattezza) è quello africano,
1
ma alcuni sierotipi si riscontrano esclusivamente in altri
continenti, soprattutto Asia e Oceania.

EZIOLOGIA

L’agente causale della malattia è rappresentato da un


orbivirus, genere del quale il BTV rappresenta il prototipo. Il
genoma è costituito da 10 segmenti di RNA a doppio filamento
(DsRNA) che codificano 11 proteine. E’ considerato tra i virus a
maggiore frequenza di mutazione e ricombinazione genetica.

Il virione è di forma pressoché sferica di 65-80 nm ed è


sprovvisto di envelope. Ha simmetria icosaedrica con un doppio
capside costituito da 32 capsomeri e la cui porzione interna
costituisce il core. Al microscopio elettronico i capsomeri
appaiono foggiati in forma di anelli esamerici e pentamerici che
hanno dato origine al nome del genere (in latino orbis = anello).

Il virus si dimostra stabile a pH 8-9 ma la sua infettività


diminuisce allorquando i valori di pH fuoriescono dal range di 6,5-
10,2 fatto correlabile alla perdita dello strato capsidico esterno
soprattutto in ambiente acido. In presenza di proteine il virus è
molto stabile e nel siero delle pecore infette mantenuto per 25
anni a temperatura ambiente, conserva inalterato il proprio
potere infettante, inoltre viene riscontrato per un lungo periodo
nelle carcasse di animali infetti anche in avanzato stato di
decomposizione. Alla temperatura di 60°C il virus è inattivato in
15 minuti. Il congelamento diminuisce l’infettività del BTV, ma a
temperature di –70°C esso rimane stabile a lungo. Il virus è
resistente all’etere, al sodio desossicolato e al cloroformio ma
sensibile alla tripsina, anche a bassa concentrazione, all’alcool a
70°, alla formalina al 3% ed a composti iodofori e fenolici.

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Le proteine del virus vengono suddivise in strutturali (VP1-
VP7) e non strutturali (NS1-NS3 e NS3A).

Il virione é formato da un core a simmetria icosaedrica


costituito da due proteine maggiori: la VP3 che costituisce la
parete interna e la VP7 all’esterno. All’interno del core tre
proteine, VP1, VP4 e VP6, insieme ai 10 segmenti di RNA. Questo
core è circondato da un capside esterno costituito da altre due
proteine, la VP2 e la VP5, rispettivamente disposte sulle pareti
esterna ed interna. Altre tre proteine non strutturali sono
sintetizzate dalle cellule infette, ma non entrano a far parte della
costituzione del virione.

La ricostruzione tridimensionale del virus e la


crioelettronmicroscopia hanno mostrato che lo strato esterno del
capside è costituito da 180 copie di VP2 e 360 copie di VP5
organizzate in trimeri; le prime formano delle proiezioni che
sporgono per 4 nm sulla superficie.

Lo strato capsidico interno è invece formato da una rete


complessa di 260 trimeri di VP7 sostenuti da un’impalcatura
costituita da 120 copie di VP3 responsabile della simmetria
icosaedrica del virione. [92]

Il capside esterno poggia su quello interno in


corrispondenza di 180 trimeri di VP7 cui si legano le molecole di
VP2. Al centro di ogni anello di VP7 si adagia un trimetro di VP5.
[92]

Internamente alla VP3 sono presenti le tre proteine minori


VP1, VP4 e VP6.

La proteina VP2 è la più esterna delle proteine del virione e


per questo motivo rappresenta il maggiore antigene sierotipo
specifico, responsabile della produzione di anticorpi
neutralizzanti [84, 146] . Il gene che la codifica, L2, è quindi

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quello sottoposto alla maggiore pressione immunitaria da parte
dell’ospite, e questo spiega la sua alta variabilità che può portare
alla selezione di varianti anche con maggiore virulenza. La VP2
sembra essere la principale responsabile della penetrazione del
virus all’interno delle cellule dell’ospite vertebrato [50]. Il gene
L2 può essere utilizzato, grazie alla specificità nei confronti del
sierotipo, in prove per l’identificazione di questo basate
sull’analisi dell’acido nucleico. L’analisi della sequenza di L2 ha
dimostrato che la VP2 presenta notevoli variazioni della struttura
primaria tra i diversi sierotipi, con un numero considerevole di
regioni variabili[108]. Inoltre la VP2 ha forte affinità di legame
con una sialoglicoproteina degli eritrociti indicando una
partecipazione della VP2 durante la trasmissione del virus dai
Culicoides ai mammiferi col pasto di sangue, ed esprime attività
emagglutinante.[50]

La seconda proteina dello strato esterno del capside, VP5, è


codificata dal gene M5. Anche essa può determinare variazioni
del capside e della neutralizzazione e, nonostante non sia in
grado da sola di stimolare la produzione di anticorpi
neutralizzanti, sembra in grado di potenziare il titolo anticorpale
indotto da VP2 [84] . M5 è il gene che ha il secondo maggior
grado di variabilità nell’ambito di un sierogruppo. Una ricerca del
’91 ha però dimostrato un’elevata conservazione della sequenza
aminoacidica codificata da M5 tra il sierotipo 13, 10 e 2
statunitensi ed il sierotipo 1 australiano e sudafricano per cui si
può affermare che buona parte della VP5 si trovi all’interno della
struttura del capside e che le porzioni maggiormente variabili
siano quelle che sporgono all’esterno e che quindi gran parte se
non tutta la variabilità di questa proteina sia in realtà dovuta alla
variabilità di VP2 cui è intimamente legata; inoltre lo stesso
lavoro ha dimostrato una certa indipendenza delle variazioni
della VP5 dai fattori geografici)[108, 52].

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La VP2, ma anche VP5, sembrerebbero indispensabili per
l’interazione virus-citoscheletro che conduce poi alla liberazione
del virione dalla cellula ospite attraverso la mediazione di
NS3/NS3A [52].

VP3 è codificata da L3, mentre VP7 è codificata da S7.


Insieme, come già detto, costituiscono il core virale e sono
relativamente conservate. La VP3 è in grado di autoassemblarsi
formando 12 decameri pentagonali con un poro centrale, che
unendosi formano la base della struttura icosaedrica del subcore
virale.[92] VP7 è organizzata in 260 trimeri, ognuno di essi può
occupare una posizione differente a seconda della distanza dal
poro centrale di ogni decamero di VP3. Questo porta ad una
disposizione dei trimeri di VP7 a formare capsomeri anulari e
formazioni pentameriche attorno ad ogni poro.[92] In assenza di
VP3 la VP7 si organizza in formazioni piane esameriche.[92]
Particelle virali a cui è stato sottratto lo strato capsidico esterno,
con conseguente esposizione delle VP3 e VP7, hanno mostrato di
essere ugualmente infettanti per il vettore, mentre lo sono meno
per l’ospite vertebrato.[92] La struttura del core formata dalla
VP3 e’ in grado di autoassemblarsi anche in assenza di tutte le
altre componenti virali.[92, 125] Cellule co-infettate con
baculovirus ricombinanti contenenti L3 ed S7 , producono
particelle core simili capaci di legare sia il ds-RNA BTV-specifico
che quello non specifico, che il DNA.[107, 78,51,
92,125]Particelle chimeriche sintetizzate a partire da genoma di
BT e di EHDV hanno dimostrato che la VP3 dell’EHDV può
sostituire la VP3 della BT nella formazione di particelle core-like
funzionali, inoltre studi sul genoma codificante le due proteine
hanno dimostrato delle differenze del 20 % degli aminoacidi, la
metà dei quali mantiene pero’ le funzioni biochimiche[71, 107].
E’ stato dimostrato che l’attività RNA legante risiede nella VP3 ed
e’ inibita dalla presenza di CsCl nel medium (per cui e’ difficile
dimostrare la stessa attività in particelle purificate a partire da

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virioni completi) sono state inoltre riscontrate forti somiglianze
tra l’attività RNA-legante della VP3 e quella delle VP2 dei
rotavirus, nonostante l’assenza di omologie nella struttura
aminoacidica.[78, 92]. L’RNA legato e’ presente in prevalenza
all’esterno delle particelle core-like [78]. La VP7 e’ la più piccola
delle proteine del core ed ha alti livelli di espressione [107]. Il
frammento genomico S7 che la codifica e’ conservato tra tutti i
sierotipi di BTV [107]. E’ stato dimostrato che VP7 è responsabile
dell’attacco del virus alle cellule del Culicoides, ed ha una
notevole idrofobicità che potrebbe essere fondamentale per la
sua capacità di formare il core in unione alla VP3.[ 107] VP3 ha
mostrato diversi genotipi in diverse aree geografiche per cui è
messa in relazione con differenze nella competenza dei vettori
mentre non si è potuto dimostrare lo stesso per VP7. Questa
ultima rappresenta il maggiore antigene sierogruppo specifico, e’
altamente immunogeno per i tutti i sierotipi di BT e parzialmente
immunogeno anche per AHSV e EHDV, nonostante S7 abbia
poche affinità con i corrispettivi tratti di genoma di EHDV e
AHSV[107, 161].

Le tre particelle minori non sono in realtà proteine


strutturali vere e proprie del virione, ma si trovano all’interno del
core virale e fanno parte del corredo enzimatico essenziale per la
sua replicazione[76]. VP1 è la RNA-polimerasi virale ed è
codificata dal gene L1. Interagisce col core virale a livello delle
particelle VP3 [76]. La sequenza di questo gene è altamente
conservata e ciò dimostrerebbe che è necessario un elevato
grado di conservazione per mantenere la funzionalità della
polimerasi. Esso polimerizza ssRNA a partire dal dsRNA virale e
necessita della presenza di Mg2+. [92, 19] E’ stato dimostrato
che la VP1 non e’ sequenza specifica e quindi il riconoscimento
tra sequenze virali e non –virali e’ effettuato in base al legame
con le proteine del core.[19] VP4 è codificata da M4 ed è una
guanilil-transferasi, ma ha anche funzioni di metil-transferasi e di

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capping [120,19,94]. ]. VP6 è codificata da S9 e’ una proteina
idrofila e ricca di aminoacidi basici, adatta dunque a legare gli
acidi nucleici ed ha infatti funzione legante l’RNA mono- e
bicatenario ed attività di elicasi e di NTPasi, è una dei
componenti dei corpi inclusi cellulari tipici della BT.[122,19]. E’
moderatamente conservata nell’ambito di un sierogruppo ma
variabile tra i vari sierogruppi.[122] Ha dimostrato inoltre alto
potere immunogeno.[122] Il complesso di trascrittasi (VP1, VP4 e
VP6) sembra posizionato sulla faccia interna della VP3 in
prossimità dei pori ed ogni complesso sembra associato ad un
singolo frammento di dsRNA.[92, 78]

NS1 è la proteina più conservata nell’ambito di uno stesso


sierogruppo, ma diversa in differenti sierogruppi.Ciò permette di
utilizzare il gene che la codifica, l’M6, per procedure diagnostiche
basate sull’analisi dell’acido nucleico. La proteina è responsabile
della formazione di tubuli di significato sconosciuto nelle cellule
infette, caratteristici della replicazione degli orbivirus[45].E’
anche la proteina più sintetizzata dal BTV, possedendo circa il
50% del livello di espressione di tutte le 11 proteine, ed e’ stata
presa in considerazione come nuovo carrier vaccinale, dal
momento che può presentare sia epitomi per i linfociti T-
citotossici che T-helper che B[45].

Il gene S8 codifica per NS2, fosfoproteina correlata alla


formazione di corpi inclusi nelle cellule infette. NS2 ha attività
NTP-asica, idrolizzando ATP e GTP, e funzione legante l’RNA
monocatenario; queste caratteristiche potrebbero suggerire un
intervento nel fornire energia per il packaging dell’RNA
nell’assemblaggio dei virioni.

Infine il gene S10 possiede due open reading frames e


codifica per NS3 e NS3a. Entrambe intervengono nella
gemmazione del virione maturo sulla superficie delle cellule
infette[52].

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Il genoma è costituito da 10 segmenti di RNA bicatenario,
classificati in base al comportamento all’elettroforesi in gel di
agarosio all’1% in grandi (L1, L2, L3), medi (M4, M5, M6) e piccoli
(S7, S8, S9, S10). Ciascuno di questi segmenti codifica per una
proteina eccetto S10 che codifica per due, possedendo due ORF
(Open Reading Frame). La particolare organizzazione del genoma
virale in segmenti separati permette un’elevata frequenza di
mutazioni e ricombinazioni. Sono stati evidenziati fenomeni di
cross-reattività sia all'interno dei sierotipi sia nei confronti di altri
sierogruppi appartenenti alla famiglia reoviridae. Il polimorfismo
genetico è associato a differenze nelle proprietà antigeniche,
suscettibilità del vettore, tropismo tissutale e virulenza
evidenziati nei singoli membri di un sierogruppo o di un sierotipo
[111]. Anche virus isolati nello stesso periodo e da una stessa
regione geografica possono essere geneticamente eterogenei
così come possono esserlo virus isolati da un singolo focolaio o
addirittura da un singolo ospite[111].

In particolare le proteine del capside interno ed alcuni


enzimi associati al virione sono le più conservate nella famiglia
Reoviridae.[93]

Come tutti i virus a doppio filamento di RNA, il BTV non e’


in grado di utilizzare il proprio RNA come RNA messaggero
all’interno della cellula ospite o come modello per la trascrittasi
cellulare. Così la particella virale deve contenere al suo interno
tutti gli enzimi necessari per la sintesi delle proprie proteine e
deve portare questo corredo enzimatico all’interno della cellula
proteggendolo dai sistemi di difesa della stessa.[93] Il core del
BTV contiene infatti, oltre ai 10 segmenti di dsRNA, un sistema
enzimatico che consente la trascrizione di ogni singolo
frammento in RNA messaggero utilizzabile dalla cellula ospite,
che viene poi rilasciato nel citoplasma attraverso dei pori al
vertice della struttura icosaedrica.[92]

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L’ mRNA virale resta inoltre associato alle proteine
neoformate favorendo la sintesi di particelle virali complete e
impedendo ai sistemi anti dsRNA cellulari di riconoscerlo.

Il virus della BT ha dimostrato forti correlazioni con altri


orbivirus, in particolare con il virus della malattia epizootica
emorragica del cervo (EHDV) con il quale e’ stata anche
postulata una possibile ricombinazione in vivo in quanto
entrambi i virus possono infettare i ruminanti.[71]

La replicazione del virus studiato al microscopio elettronico


avviene nei primi 5-10 minuti dall'infezione. Durante l’ingresso
del virus nelle cellule infette le proteine esterne VP2 e VP5
vengono perse il core resiste e funge da protezione per l’rna
virale nei confronti del sistema di sorveglianza del dsRNA
cellulare durante la sintesi di RNA messaggero.[103]

CENNI STORICI

Il virus ha un comportamento simile a quello della peste


equina ed è un agente che ha fatto nei secoli un lungo viaggio
tra i continenti: i primi casi furono segnalati dalla Dutch East
India Company in Sud Africa fra il 1652 e il 1870, quando
vennero immesse in questa zona pecore Merinos ed altre razze
europee. La malattia, probabilmente già presente in precedenza
in forma lieve, e’ divenuta manifesta in seguito alla trasmissione
a queste pecore di razze più sensibili che hanno presentato i
sintomi che contraddistinguono la forma acuta.

Nel 1876 l'epidemia assunse vaste proporzioni e la Cattle


and Sheep Diseases Commission riferì di una malattia ad elevata
mortalità che venne classificata come Epizootic Catarrh. Sempre
alla fine del 1800 risale la prima descrizione scientifica della

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malattia, nella quale vennero per la prima volta descritte le
forme cliniche e formulate le prime ipotesi sulla natura non
contagiosa della malattia, la possibile presenza di una
trasmissione mediata da artropodi e i benefici effetti del ricovero
notturno degli animali e dell’uso di repellenti. Nel 1944 Du Toit,
in Sud Africa, dimostrò che il virus viene trasmesso da Culicoides
imicola.

Già dal 1924 la malattia venne segnalata a Cipro ma solo


nel 1943, contemporaneamente ad un'altra epidemia in
Palestina, venne isolato ed identificato il virus, che ha fatto la sua
ultima comparsa nell’isola nel 1979[9, 17,132].

Nel 1956-1957 si è manifestata un'epidemia in Portogallo


e Spagna, presumibilmente a seguito dell'importazione di
animali infetti o insetti vettori trasportati dal vento provenienti
dall'Africa, durante la quale solo nei primi 4 mesi le perdite di
capi ovini ammontarono a 180.000[9, 17,133]. Casi clinici sono
stati segnalati nel 1977 nella costa occidentale della Turchia e,
due anni dopo nell'isola greca di Lesbo dove si isolò il sierotipo 4.
[17,48, 131]

Verso la fine degli anni ’40 una malattia simile alla BT fu


rilevata per la prima volta negli Stati Uniti. Il virus fu isolato da
ovini, bovini e ruminanti selvatici in Texas[104], (stato
attraversato dal 30° N), e identificato per la prima volta nel 1952
in California[9].

La sindrome causata dagli stipiti statunitensi venne


chiamata “soremuzzle” (muso infiammato). Negli anni successivi
comparve anche in altri stati: Arizona, Colorado, Kansas,
Nebraska, [104],ecc. sino al Montana, stato che giunge quasi al
50° N. Più recentemente la malattia è stata segnalata anche in
Canada in una zona immediatamente a ridosso del confine con
gli Stati Uniti, la Okanagan Valley [135], ove sono segnalati
inoltre focolai di EHDV.
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La pluralità dei sierotipi della BT fu riconosciuta più tardi
con 12 sierotipi riconosciuti entro il ’60, altri 4 tra il ’60 e il ‘’70 e
gli altri 8 solo dopo gli anni ’70.

Negli anni settanta-ottanta sono stati segnalati casi di


malattia in Asia e Oceania. Verso la fine degli anni ’70 cominciò
però a venire riesaminato il livello di pericolosità della malattia.
Era pur vero che il virus della BT poteva dar luogo in alcune
circostanze a drammatiche epidemie però, spesso, non solo
queste tendevano ad esaurirsi più o meno spontaneamente, ma
si verificavano casi di segnalamento della presenza del virus in
assenza della malattia conclamata. Tra i Paesi che maggiormente
avevano contribuito a diffondere l’allarme per la BT vi era
l’Australia, che con i suoi 150 milioni e oltre di ovini più di altri
temeva la comparsa della malattia, tanto da organizzare uno dei
maggiori simposi internazionali sulla BT nel 1975.
Paradossalmente nel 1977 proprio in Australia venne isolato il
virus della BT in un pool di Culicoides catturati nel 1975 presso la
città di Darwin, senza che fosse mai stata segnalata, né allora né
successivamente, la presenza della malattia. Si trattava
addirittura di un nuovo sierotipo. Indagini successive non solo
mettevano in evidenza che in Australia erano presenti ben 8
sierotipi diversi, ma esami sierologici retrospettivi indicavano
anche che i virus della BT circolavano nel Paese almeno dal
1958.

In Turchia, un focolaio comparso nel 1977 nelle regioni


occidentali, si estese nei due anni successivi alle regioni
adiacenti. Il sierotipo in causa era il 4 e fu tenuto sotto controllo
per mezzo di vaccini monovalenti attenuati[159, 17, 131].
Probabilmente questi focolai provenivano da Cipro dove lo stesso
sierotipo era stato segnalato in precedenza. [131]

Negli anni ’80 la patologia compare nell’America tropicale,


ma la mancanza di grosse perdite economiche negli anni ’80 e

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primi anni ‘90 spinge alcuni studiosi a proporre di eliminare la BT
dalla lista A dell’OIE in quanto patologia limitata solo ad alcuni
territori in cui si trovava in forma endemica[9].

Sfortunatamente pochi anni dopo la malattia fa la sua


comparsa in modo eclatante nel bacino del mediterraneo, prima
nella Grecia insulare, poi estendendosi ad almeno 10 paesi di cui
sei (Italia, Francia, Bulgaria, Macedonia, Jugoslavia, Tunisia)
precedentemente indenni e due (Grecia peninsulare e Spagna
insulare) colpiti in zone mai prima toccate dalle epidemie[9,91].

Infatti nell’Ottobre del 1998 e’ stato segnalato il sierotipo 9


in diverse isole greche e nel Giugno 1999 in Bulgaria. Nello
stesso anno il sierotipo 4 viene isolato in Turchia ed in Grecia,
dove circola anche il sierotipo 16. Nel 2000 il sierotipo 2 colpisce
Tunisia ed Algeria e si espande poi a Sardegna, Calabria, Sicilia,
Maiorca e Minorca e in Corsica. [2, 3 23]Nelle Baleari a seguito di
questi casi si e’ proceduto alla vaccinazione sistematica delle
greggi.[2, 3] Dal 2001 il virus può essere considerato diffuso a
tutto il territorio italiano in cui compare anche il sierotipo 9,
riportato anche in Bulgaria, Kosovo e Serbia[48]. L’epidemia
mediterranea pur non potendo considerarsi ancora estinta, e’ già
la più grave mai registrata.[9, 91]

§ sierotipo 4 spagna marocco

Attualmente la patologia in Europa viene segnalata, pur


non potendo a tutti gli effetti essere considerata endemica, in
diversi Paesi: Spagna, Francia (Corsica)[ 23], Grecia (isole e parte
continentale), Bulgaria. Tra i Paesi del bacino del Mediterraneo
più prossimi all’Europa ritroviamo Algeria, Tunisia, Marocco e
Turchia.

VIE DI TRASMISSIONE

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Con alcune eccezioni di scarso rilievo epidemiologico per il
mantenimento dell’infezione il virus viene trasmesso agli ospiti
vertebrati biologicamente tramite cicli alternati da vertebrato ad
invertebrato.

Il vettore naturale conosciuto del Virus della Bluetongue


(BTV) è un Dittero appartenente alla famiglia dei
Ceratopogonidae, genere Culicoides.

Dei Culicoides esistono innumerevoli specie ma non tutte


sono nella stessa misura competenti nel consentire la
replicazione virale. A seconda della specie tale competenza può
quindi variare da “nulla” a progressivamente “massima”. Data la
non omogenea distribuzione delle specie di Culicoides e date
anche le differenti predilezioni di ospite e di altre caratteristiche
biologiche, non sempre e non necessariamente le specie più
competenti risultano essere le responsabili della massima
diffusione del virus, sebbene vettori particolarmente competenti
possono infettarsi anche con titoli virali nel sangue molto bassi.

Si è visto che esistono differenze nelle varie specie ed


anche nelle varie popolazioni di Culicoides nel trasmettere
particolari sierotipi rispetto ad altri e questo spiega in parte la
presenza di determinati sierotipi in alcune aree e non in altre.

Il virus è in grado di replicare attivamente nei vettori


competenti, che assumono così il ruolo di vettore biologico, ma
non esiste trasmissione verticale del virus alle successive
generazioni di insetti, cioè non c’e’ trasmissione transovarica alle
uova della femmina infetta.

La specie maggiormente in causa nell’area mediterranea


e’ Culicoides imicola.

Culicoides imicola è un moscerino apparentato alle zanzare


e come queste punge gli animali per nutrirsi. L’adulto misura

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circa 1-3 mm e ha le ali macchiettate. Le femmine adulte sono
ematofaghe hanno una durata di vita variabile in funzione della
temperatura, infatti, in estate possono vivere una ventina di
giorni, mentre, nei periodi più freddi, possono campare anche per
qualche mese in quanto la loro attività decresce quando la
temperatura scende sotto i 10°C e diventano quiescenti. [6, 130].

E’ stato dimostrato che i Culicoides non sopravvivono ad


una temperatura di -17°C per due ore e se sottoposti a basse
temperature producono proteine da stress e proteine anti shock
termico di cui non e’ però stata dimostrata l’effettiva efficacia.
[105] Al di sopra dei 35°C gli adulti sono quiescenti[130].

Il ciclo biologico dei Culicoidi è costituito da 4 stadi larvali


ed uno pupale. Il ciclo completo da uovo a uovo ha una durata
dipendente dalla temperatura ed è più rapido a valori elevati,
potendo compiersi in 15 giorni a 25° C.

Dopo la nascita le femmine vanno alla ricerca di un


animale per nutrirsi e possono attaccare le pecore, i bovini, i
cervi, i maiali e anche le galline. Durante la loro vita possono
avere fino a una decina di pasti di sangue.

Dopo qualche giorno da ogni puntura le femmine


maturano uova che vengono deposte in gruppi di una sessantina
di elementi nel fango umido ai bordi di riserve di acqua
stagnante inquinate da escrementi di animali quali laghetti
aziendali e pozzanghere vicino agli abbeveratoi. Le larve, che
nascono dopo qualche giorno, si sviluppano immerse nell’acqua
a 1-2 centimetri di profondità ad un massimo di 10 cm dal bordo
delle pozzanghere, non hanno zampe e nuotano nutrendosi di
microrganismi che pullulano particolarmente in questi ambienti
fortemente inquinati. Le pupe sviluppano invece nel fango umido
fino ad una distanza di un paio di centimetri dalla linea d’acqua.

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Gli insetti adulti non si allontanano che di poche centinaia
di metri dal luogo dove sono nati, anche se possono essere
trasportati dal vento a più lunga distanza [135]. Essi pungono gli
animali durante la notte e il massimo di attività si riscontra
appena dopo il tramonto e poco prima dell’alba[130].
Difficilmente entrano nelle stalle chiuse e generalmente vengono
attaccati gli animali all’aperto. Il volo degli adulti è disturbato
soprattutto dal vento ma anche dalla pioggia e dalle basse
temperature [135]. Condizioni di siccità e di venti deboli
diminuiscono significativamente i tassi di sieroconversione in
mandrie sentinella [153].

Non sempre il moscerino che attacca l’animale viremico


diviene infetto; l’infezione del Culicoides avviene solo se il virus
riesce a superare le barriere difensive e giunge a replicare nelle
ghiandole salivari. [41] Studi condotti si C.varipennis hanno
dimostrato infatti che mentre l’iniezione sperimentale
intratoracica del virus nel vettore esita invariabilmente nella
disseminazione del virus e nella trasmissione di questo alla
saliva, solo in un terzo degli insetti che hanno assunto sangue
infetto il virus raggiunge le ghiandole salivari. [41] Tra i vettori
infettati oralmente, dopo 5 giorni dal pasto di sangue si
riscontrano titoli variabili tra 100.75 e 105.5 TCID50 per cui solo il
12% circa di essi risultano realmente capaci di trasmettere il
virus (cioè quelli con titoli superiori a 103.0TCID50 che consentono
una replicazione anche a livello di ghiandole salivari) [41]. Le
barriere principali alla trasmissione della BT ai Culicoides
sembrano essere una barriera mesenterale che può restringere
l’infezione alle cellule intestinali, ed una barriera di
disseminazione che previene l’infezione degli organi secondari da
parte del virus penetrato nell’emocele.[41]

Il picco di concentrazione si riscontra dopo 5-8 giorni


dall'infezione dell'insetto per mantenersi costante per circa un
mese, tempo che corrisponde generalmente alla vita media di un

15
culicoide adulto (solitamente 10-20 giorni, ma in casi eccezionali
anche 90 giorni).

Il numero di moscerini che si infetta dipende, oltre che dal


livello di viremia e dal numero di attacchi, anche dalla
competenza del vettore [90].

Oltre ai vettori noti (C. imicola), altre specie di insetti


ematofagi sono considerate vettori sospetti in quanto, pur non
essendo stata dimostrata la loro capacità di trasmissione
biologica del virus in questione, da esse è stato isolato il virus.
Inoltre le specie di Culicoides associate a ruminanti, sulle quali
non sono stati effettuati esami virologici, sono tutte considerate
vettori potenziali.

Solo poche specie di Culicoides sono in grado di


trasmettere in maniera efficiente il virus. Delle oltre 1400 specie
appartenenti al genere, quelle responsabili della trasmissione
dell’infezione naturale sono una ventina, diversamente distribuite
nel mondo.

Tra le specie sospette particolare attenzione richiedono


quelle del complesso C. obsoletus, anch'esse presenti in Italia e
appartenenti allo stesso subgenere Avaritia del complesso C.
imicola. C. variipennis ha un ruolo determinante nel Nord
America, C. insignis e C. fulvus in Australia.

In sintesi, le specie di Culicoides coinvolte nella


trasmissione del BTV sono diverse ed hanno una differente
distribuzione geografica, tra queste si riportano di seguito le più
importanti:

• C.imicola (Africa, Cipro, Spagna, Portogallo, Grecia,


Asia) [17,132,133]

• C.obsoletus (Nord America, Cipro, Grecia, Turchia)


[17]

16
• C.milnei (Africa, Asia)

• C.variipennis recentemente suddiviso nelle due


sottospecie C.v.variipennis e C.v.sonorensis (Nord America)[6,
104, 135 ]

• C.puncticollis (Cipro)[132]

• C.fulvus (Australia)

• C.actoni (Australia)

• C . insignis e C. pusillus (Centro e Sud America)

• C. bolitinos in Africa

• C. schultzei in Asia e Cipro [132]

• C:newsteadi a Cipro [132] (vettore non dimostrato)

• C. brevitarsis in Asia in Australia

• C. orientalis in Asia

• C. wadai in Australia

• C. oxystoma in Australia

• C. peregrinus in Australia

In Sardegna, prima Regione italiana nella quale è stata


segnalata la malattia, uno studio epidemiologico inerente
l'identificazione dei vettori presenti nella Regione, ha permesso
di identificare, al momento, 20 differenti specie di Culicoides,
solo di alcune delle quali attualmente è nota la potenzialità di
trasmissione del virus.

La modalità di trasmissione attraverso insetti caratterizza


la periodicità stagionale della blue tongue, che si manifesta

17
durante i mesi caldi, in annate particolarmente umide, con una
forte incidenza a metà estate e un picco di prevalenza alla fine
dell'estate. La malattia scompare con il sopraggiungere dei primi
freddi, quando la temperatura ambientale scende al di sotto dei
12°C. La conservazione del virus nei periodi interepidemici e in
assenza di vettori sembra sia da attribuire all'intervento di ospiti
serbatoio quali bovini e caprini che, meno sensibili, possono
mantenere ed albergare il virus per periodi molto lunghi.

Altre modalità di trasmissione possono essere


rappresentate da insetti ematofagi di altri generi, che fungono da
vettori meccanici, e da aghi contaminati. Altra via di trasmissione
del BTV potrebbe essere rappresentata dal pidocchio degli ovini
(Melophagus ovinus) ma non è stato chiarito se esso funga da
vettore biologico o meccanico. Una modalità di trasmissione che
preoccupa molto per le conseguenze sulla fecondazione
artificiale, e’ costituita dalla trasmissione tramite il seme di
animali infetti in fase viremica, probabilmente dovuta
all’inquinamento con cellule ematiche provenienti da lesioni
dell’apparato genitale [1] . Tramite questo mezzo possono essere
infettate le femmine riceventi sia con la monta naturale che con
la fecondazione artificiale. Anche gli embrioni prelevati da
animali infetti possono contribuire alla diffusione dell’infezione

E’ riportata anche la possibilità di infezione della pecora


tramite somministrazione protratta di mangimi contaminati.

Per quanto queste ultime modalità di trasmissione siano


possibili, la loro importanza epidemiologica e’ poco significativa
in quanto responsabili solo di singolo casi sporadici nelle aree
indenni e di importanza irrilevante nelle zone endemiche o
epidemiche.

E’ inoltre da considerare il fatto che il BTV non viene


veicolato da embrioni opportunamente lavati ne’ dal seme di
maschi portatori ma non viremici per cui le vie di trasmissione di
18
tipo venereo possono essere considerate facilmente ed
efficacemente controllabili[6]

SPETTRO D’OSPITE

La BT è una malattia sostanzialmente ristretta ai ruminanti


domestici e selvatici.

La pecora è sicuramente la specie più sensibile ma con


notevoli differenze relative alla razza (le razze europee sono le
più sensibili, quelle africane e asiatiche e le merinos appaiono più
resistenti), alla provenienza (i soggetti provenienti da zone
endemiche sono più resistenti), l’età (gli adulti sviluppano
sintomatologia più severa dei piccoli), gli stress e l’alimentazione
stati di immunosoppressione (animali immunosoppressi
sviluppano sintomatologia più grave ed hanno maggiori livelli e
durata di viremia) (25] o anche da condizioni ambientali quali per
esempio l’irraggiamento solare.

I Bovini non mostrano solitamente sintomatologia


apprezzabile in seguito all’infezione ed appaiono
costituzionalmente resistenti indipendentemente dalla zona
epidemiologica e dalla razza. Inoltre, data la particolare
predilezione dei Culicoides per tale specie, essa rappresenta in
tutto il mondo, oltre naturalmente a qualche altra specie
selvatica quale i bufali, il principale ospite del virus della BT
svolgendo perciò un ruolo importantissimo nell’epidemiologia del
virus. Il bovino agisce cioè da amplificatore virale e l'esistenza
del ciclo virale bovino - Culicoides diviene manifesto solitamente
quando le pecore entrano nel ciclo epidemico [24].

Nel bovino il genoma virale è stato identificato con la


tecnica PCR fino a 140 giorni dopo l'infezione, mentre la viremia,

19
che nella pecora dura non più di 30 giorni, può arrivare fino a
100 giorni dall'infezione. Nelle capre è stata reperita viremia in
intervalli di tempo compresi tra il 1° e il 21° giorno. Nel bovino è
stata rilevata viremia fino a 100 giorni post infectionem [Mac
Lachlan et al. 1991]. In pecore di diverse razze ed infettate con
diversi sierotipi la viremia è stata riscontrata tra il 1°-3°giorno e il
21°-31° giorno post infectionem. Nelle capre è stata reperita
viremia in intervalli di tempo compresi tra il 1° e il 21° giorno.
Tuttavia in pecore e capre dell’isola di Lesbo la viremia è stata
rilevata dal 3° fino al 54° giorno [Koumbati et al., 1999]

Anche la specie caprina e i ruminanti selvatici come


antilopi, cervi e Big Horn sono generalmente asintomatici.

Nonostante tali differenze tutte le specie di ruminanti sono


in grado di contrarre l’infezione e di consentire la replicazione del
virus e spesso più che di resistenze di specie si puo’ parlare di
resistenze genetiche dipendenti dalla zona epidemiologica. Ad
esempio in Africa, la BT è un'infezione dei ruminanti selvatici, nei
quali non si evidenzia sintomatologia clinica come nel damalisco
dalla fronte bianca (Damaliscus albifrons), l'antilope alcina
(Taurotragus oryx), il nyala (Tragelaphus engasii), il Kudu
maggiore (Tragelaphus scriptus ), il Cobo dell’elisse (Kobus
ellipsiprymnus), l’ Alcelafo di Coke (Alcelaphus buselaphus), il
Cobo (Kobus kob), il bufalo, l’ elefante e i rinoceronti.
[Lundervold]. In Nord America, al contrario, tra i selvatici, come il
cervo americano (Odocoileus virginianus) [104], il cervo comune
(Cervus elaphus), il cervo mulo (Odocoileus Hemionus) [104],
l'antilocapra (Antilocapra americana) [104], il bisonte (bison
bison) e la pecora a grandi corna (Ovis canadiensis) [104], si
evidenziano sindromi emorragiche o sintomi della blue tongue
classica. Anticorpi anti-BT sono stati rilevati nel muflone (Ovis
musimon).

20
La saiga (Saiga tatarica) che vive nelle pianure del
Kazakistan a contatto con bestiame sieropositivo, non ha
mostrato sieroconversione in vivo. [81]Come già accennato la
maggior parte di queste differenze e’ dovuta al fatto che, nei
ruminanti delle regioni ove l’attività del vettore è massima e
costante durante tutto l’anno, si sono prodotti nell’arco dei secoli
fenomeni di selezione genetica che hanno condotto da un lato a
popolazioni animali sempre più resistenti alla forma clinica della
malattia, dall’altro a popolazioni virali sempre più capaci di
trasmettersi e di dar luogo all’infezione. E’ verosimile che un
identico evento si sia verificato anche per le popolazioni dei
vettori, anzi in queste il tutto sarà avvenuto ancora più
rapidamente dato il maggior numero di generazioni rispetto ai
vertebrati. Nell’ambito dei ruminanti la pressione selettiva
genetica opera nel senso di scegliere tra tutti gli individui quelli
meno sensibili o insensibili all’azione patogena del virus (gli
animali sani e che sopravvivono sono gli unici in grado di
riprodursi). I motivi per i quali alcuni soggetti sono
costituzionalmente resistenti possono essere molteplici, per
esempio le loro cellule possono essere meno permissive per la
replicazione virale, in ogni caso tali individui esercitano anch’essi
una pressione selettiva sul virus. A questa però si affianca anche
quella del sistema immunitario. A seguito dell’infezione può
venire a crearsi, se l’infezione interessa la maggior parte degli
effettivi, una vera e propria immunità di popolazione. Il virus per
poter sopravvivere e moltiplicarsi deve pertanto riuscire a
superare questa barriera e può raggiungere questo obbiettivo
quanto più risulta efficiente nel mutare la propria costituzione
genetica e quindi antigenica. E’ questo essenzialmente il motivo
per cui il virus della Bluetongue ha dato luogo alla creazione di
tanti sierotipi (24 almeno sinora sicuramente riconosciuti)
usandola come strategia di sopravvivenza e diffusione.

21
In un solo caso è stata segnalata infezione naturale in
animali non ruminanti, precisamente roditori delle specie
Rhabdomys pumilio e Otomys muratus, mentre
sperimentalmente è stato possibile infettare topini e criceti
neonati ed anche topini adulti con virus adattato alle uova
embrionate. La malattia è stata trasmessa accidentalmente al
cane attraverso l’utilizzo di vaccini contaminati.

SPETTRO D’OSPITE IN VITRO

Il virus della Blue Tongue replica su vari substrati. Il primo


ad essere utilizzato e’ stato l’uovo embrionato di pollo di 6 giorni,
inoculato nel sacco vitellino, in vena o sulla membrana
allantoidea e incubato a 33,6 °C.

Per quanto riguarda le colture cellulari, replica bene su


rene di agnello, colture primarie di amnios umano, rene fetale
bovino, surrene e testicolo di agnello e vitello, oltre che su linee
continue quali Vero, HeLa, BHK21 e Chang liver.

MODALITA’ DI INTRODUZIONE

Nei Paesi collocati a ridosso delle zone endemiche ove non


esistono barriere naturali, per esempio mari o catene montuose,
il virus giunge principalmente attraverso le continue incursioni
del vettore infetto, sia per spostamento attivo, sia,
maggiormente, a seguito degli effetti del vento e delle correnti
ascendenti e discendenti di aria calda e fredda [135, 130]. Il
vento sarebbe anche il principale responsabile della diffusione
della malattia nelle zone indenni ove siano interposte barriere

22
naturali, in particolare l’acqua. In effetti sono stati anche
realizzati modelli epidemiologici predittivi basati su tale
presupposto. Ovviamente anche l’introduzione di animali, specie
bovini, da Paesi non indenni può risultare pericoloso. In
alternativa, sebbene ciò sembri rivestire importanza relativa, la
pratica della fecondazione artificiale e dell’embryo-transfer può
risultare anch’essa fattore di rischio poiché il virus può essere
rilevato durante il periodo di viremia, anche se raramente, nel
seme. La possibilità che il virus possa venire veicolato con
farmaci, soprattutto vaccini attenuati, è ipotesi remota ma non
del tutto escludibile. Sono comunque i fattori atmosferici quelli
sicuramente considerati principale modalità di introduzione. Ciò
trova conferma anche nell’epidemiologia della Peste equina,
anch’essa determinata da un orbivirus, che può essere
considerata la patologia degli equidi corrispondente alla BT.

Considerato quanto detto sopra riguardo alle modalita’ di


trasmissione, allo spettro d’ospite ed alle caratteristiche del virus
e del vettore, si possono valutare quali siano i fattori necessari e
quelli favorenti la comparsa ed il mantenimento della malattia in
una popolazione ovina prima indenne.

Per garantire una trasmissione del virus agli ospiti


vertebrati innanzitutto, come e’ ovvio, virus, vettore e ospite
vertebrato devono essere presenti nella stessa area almeno per
un certo periodo di tempo. Le densità di popolazione devono
inoltre essere tali da consentire una quantità di “incontri”
sufficiente a rendere efficace questo tipo di trasmissione. Le
popolazioni degli ospiti, ancorché ampie, devono essere
sufficientemente esposte a rischio, vale a dire che non devono
esistere barriere interposte tra vettore e vertebrato, per esempio
ricoveri o repellenti, oppure tra virus e vertebrato (soprattutto
fenomeni immunitari) o tra virus e vettore (per esempio una
minore competenza di quest’ultimo).

23
Una sufficiente diffusione del virus nel territorio inoltre e’
funzione della densità della popolazione ospite recettiva. Si deve
in questo caso parlare di popolazione recettiva in quanto i
soggetti con un sistema immunitario efficace contro il virus della
Blue Tongue non solo non sviluppano la malattia ma non
presentano neanche viremia venendo in questo modo totalmente
esclusi dal ciclo virus-vettore-ospite vertebrato. Il fenomeno
descritto può assumere ancora maggiore rilevanza nelle
patologie trasmesse da vettori in quanto i soggetti non recettivi
competono per il vettore per due aspetti: competono con i
soggetti recettivi intercettando l’azione di vettori infetti dando
così luogo a trasmissioni abortive e competono con i soggetti
infetti intercettando l’azione di vettori indenni che pertanto
restano tali.

Per questo motivo ampie aree popolate prevalentemente


da soggetti non recettivi potrebbero costituire una barriera,
diciamo “immunitaria”, all’ulteriore diffusione del virus.

Nel caso della BT sono interessate più specie di ruminanti,


ognuna delle quali gioca un ruolo diverso nell’ambito della
diffusione per diversi motivi.

Dal punto di vista della persistenza della viremia, per


quanto riportato in letteratura, si riscontra una maggiore durata
nel bovino. Sembra inoltre che anche sotto l’aspetto del tropismo
alimentare del vettore il bovino sia notevolmente preferito
rispetto all’ovino. Secondo quanto riportato da alcuni autori, il
vettore si alimenterebbe sulle altre specie solo in caso di una
minore disponibilità diretta od indiretta di bovini.

Per quanto riguarda gli ospiti vertebrati bisogna anche


prendere in considerazione la movimentazione diretta ed
indiretta di ospiti infetti, non solo riguardo allo spostamento
autonomo di animali domestici e selvatici infetti, solitamente su

24
brevi distanze, ma anche quello operato dall’uomo anche su
grandi distanze.

Per quanto attiene il ruolo esercitato dai vettori nella


diffusione scendono in campo altri elementi quali l’ evoluzione
stagionale delle popolazioni dei vettori, maggiormente attivi
durante i mesi caldi, o la numerosità dei vettori e soprattutto la
loro movimentazione. I vettori si sposterebbero infatti
autonomamente solo per brevi tragitti, dell’ordine di alcune
centinaia di metri. Possono però essere veicolati anche su
distanze piuttosto lunghe, anche di centinaia di chilometri, dal
vento e da correnti aeree [135]. Importanti a tale riguardo le
barriere naturali che potrebbero limitare questo fenomeno (per
esempio vegetazione, rilievi collinari o montuosi), condizioni
ambientali locali limitanti (habitat in senso lato), ed ancora quelle
che abbiamo prima definito barriera “immunitaria”. Non si può
escludere il trasporto da parte di veicoli (automezzi, aerei, navi,
treni, ecc,) ma probabilmente ha importanza più limitata.

I fattori che possono influire sull’evoluzione temporale della


BT in una popolazione indenne come quella sarda durante la
prima fase sono stati innanzitutto legati alle condizioni climatiche
(soprattutto temperatura, umidità, piovosità) che sono fattori
determinanti nel regolare la dinamica delle popolazioni dei
vettori.

Per quanto riguarda i fattori che favoriscono il permanere


del virus all’interno di una popolazione, ricordiamo a tale
proposito che in letteratura l’infezione sia nelle specie ospite che
in quelle dei vettori sono considerate a “termine” intendendo che
nei soggetti delle specie vertebrato l’infezione tende a
scomparire o in seguito alla morte dell’animale o alla guarigione,
cui consegue immunità e che nei vettori l’infezione, limitata
all’adulto, scompare con la morte di quest’ultimo.

25
Qualora si verificasse una assenza o una drastica riduzione
della popolazione adulta dei vettori per un lasso di tempo
sufficientemente ampio (dai 60 ai 90 gg.), periodo di durata
medio di viremia “efficiente per la trasmissione” nel bovino, sia
per fenomeni naturali che a seguito di metodi di profilassi diretta,
si potrebbe essere sicuri che sia eliminata la presenza del virus.
Diciamo potrebbe perché meritano sicuramente un
approfondimento maggiore altri possibili meccanismi di
persistenza del virus che potrebbero essere stati sottovalutati. Si
tenga conto che la BT è stata studiata prevalentemente in Paesi
ove erano sufficienti i normali cicli ospite/vettore a garantire la
persistenza del virus (il così detto overwintering). [140]

Infatti il BTV può sopravvivere fino a 9-12 mesi in assenza


di vettori adulti, situazione che si verifica tipicamente durante
l’inverno, da cui il nome inglese del fenomeno “overwintering”,
senza episodi rilevabili di malattie, sieroconversione o viremia
nell’ospite vertebrato. Il meccanismo in causa non e’ ancora del
tutto conosciuto. [140] Una possibile spiegazione potrebbe
essere la sopravvivenza del vettore adulto infetto. Come gia’
detto la vita media di un culicoide adulto e’ intorno ai 10 giorni e
in alcune circostanze puo’ arrivare a piu’ di un mese, ma non
esiste nessuna prova che suggerisca una possibile sopravvivenza
di questi insetti fino a 9-12 mesi. [140] Allo stesso modo
benche’ sia dimostrata la sopravvivenza delle larve all’inverno,
non c’e’ nessuna evidenza di trasmissione transovarica del BTV.
[140] Anche la reintroduzione di ospiti vertebrati o invertebrati
infetti da vicine zone endemiche puo’ simulare un processo di
overwintwering, benche’ sia spesso difficile escludere una simile
eventualita’ almeno in alcuni casi questa si e’ dimostrata
inconciliabile con i dati epidemiologici, come ad esempio nella
recente epidemia mediterranea. [140] Un’altra possibilita’ e’ un
ospite vertebrato o un vettore sconosciuti possano fungere da
reservoir del virus durante la stagione fredda, ma anche questa

26
possibilita’ e’ remota visto che le temperature fredde avrebbero
uguali effetti negativi anche in altri tipi di vettori invertebrati,
mentre ripetute prove di infezione sperimentale in animali diversi
dai ruminanti hanno dimostrato una scarsa recettivita’ di questi
all’infezione. [140] E’ stato dimostrato in vitro che BTV puo’
infettare in maniera persistente linfociti T ovini silenti, se questo
fenomeno fosse dimostrato anche in vivo potrebbe essere una
spiegazione alla persistenza del virus all’interno dell’organismo
ospite in assenza di evidenza clinica e sierologica, e della
ricomparsa della malattia con l’inizio della stagione riproduttiva
dei vettori. [140]

Analogo risultato si potrebbe ottenere se venissero limitate


le possibilità di incontro tra ospite e vettore (per esempio con
l’utilizzo di ricoveri o repellenti) o eliminare i Culicoides adulti
esposti alla possibilità di infettarsi (attraverso l’uso di farmaci
antiparassitari). Dal punto di vista strettamente tattico, qualora si
abbia come obiettivo unicamente la minore espressione clinica
negli ovini, non è necessario eradicare il virus basterebbe
teoricamente limitare le popolazioni dei vettori restringendo
l’infezione soprattutto al comparto bovino. Dal punto di vista
strategico l’eradicazione del virus ripristinerebbe le condizioni
pre-infezione anche dal punto di vista delle restrizioni normative.

Diversi sono anche i fattori che permettono la comparsa o


meno di manifestazioni cliniche nella popolazione in esame e la
loro gravita’.

Oltre ai fattori gia’ accennati riguardo alla diversa


suscettibilita’ dell’ospite in base all’eta’, alla razza ed alla specie
bisogna considerare le differenze dovute allo stato immunitario
dei soggetti. L’immunità naturale è di solida durata e i soggetti
immuni possono essere considerati tali sicuramente per oltre un
anno. L’immunità è considerata, pur con qualche variabilità,
sierotipospecifica. L’introduzione, o la co-presenza, di altri

27
sierotipi renderebbe di fatto i soggetti immuni, recettivi a questi
altri. L’immunità passiva di origine materna è protettiva nel
primo periodo di vita. Possiamo considerare in circa un mese
post infezione lo stabilirsi di un buon livello di difesa immunitaria.
Questa non appare però sufficiente a garantire la riduzione del
periodo di viremia per cui individui immuni possono trasmettere
il virus per il periodo soprariportato (60-90 gg.).

La sintomatologia varia anche a seconda dello stipite virale


in causa e soprattutto dell’ adattamento genetico di uno stipite
virale per la popolazione ospite e viceversa della resistenza
dell’ospite allo stipite virale in causa.

Da cio’ si deduce anche che generalmente si riscontrano


casi clinici piu’ gravi in zone precedentemente non toccate dal
sierotipo virale in questione, rispetto alle zone in cui esso e’
endemico.

Bisogna inoltre ricordare che un ruolo importante nella


sintomatologia della BT e’ giocato dalla fotosensibilizzazione per
cui anche il tipo di ricovero adottato nell’allevamento riveste una
certa importanza nel determinism di sintomi piu’ o meno gravi.

DISTRIBUZIONE

Riguardo la diffusione del virus nel pianeta occorre


distinguere diverse aree:

• Endemica, che geograficamente corrisponde alle regioni


tropicali e sub-tropicali (da 0° a 23° di latitudine Nord e Sud),
dove l’infezione è presente tutto l’anno seppure con variazioni di
intensità;

28
• Epidemica, in cui l’infezione si presenta quasi tutti gli anni
in relazione ai venti e vi e’ una continua circolazione di sierotipi
differenti (fino a 40° Nord e 35° Sud). In questi casi la malattia
alterna frequentemente fasi di evoluzione di tipo enzootico ad
altre di tipo epizootico;

• Incursiva, in cui l’infezione compare sporadicamente in


seguito all’azione dei venti, ma si esaurisce con la stagione
fredda (intorno al 40° parallelo Nord). In questi casi solitamente
l’esordio della malattia è di tipo epizootico con un successivo
periodo di progressiva riduzione dei focolai che precede, di
norma, la scomparsa della malattia. Questo è particolarmente
vero per esempio per i Paesi europei che si affacciano sul
Mediterraneo, ove esiste una barriera naturale costituita dal
mare, lo è meno per gli Stati Uniti ove la continuità territoriale
con le zone tropicali (Miami è collocata poco a Nord del Tropico
del Cancro) rende la malattia enzootica e frequente anche a
latitudini elevate;

• Indenne, corrisponde alle latitudini estreme (Canada,


Russia, Europa settentrionale), dove le condizioni climatiche non
consentono l'attività degli artropodi vettori.

La distribuzione del virus e’ stata modificata dal proliferare


degli allevamenti e dal commercio di animali selvatici, e
dall’aumento dei ruminanti allevati in condizioni artificialmente
riprodotte anche in zone aride o semiaride[130]. Stante la
notevole dipendenza di questa malattia da fattori meteorologici il
quadro finora descritto, se correlato ad eventi climatici inusuali,
potrebbe essere suscettibile di modificazioni non tutte
prevedibili. Basti pensare a quanto fenomeni come “El Niño”,
“l’effetto serra” o il c.d. “buco nell’ozono” possono condizionare il
clima di tutto il pianeta.

29
Tradizionalmente la diffusione della malattia nel mondo
viene considerata compresa in un'area geografica delimitata
approssimativamente tra il 35° parallelo sud e il 40° parallelo
nord. In realtà non esiste una linea netta di demarcazione, infatti,
mentre nelle Regioni occidentali del Nord America la sua
diffusione rispetta il limite citato, in quelle orientali raggiunge il
48° parallelo.

Focolai di BT si sono verificati recentemente in Turchia,


Cipro, Israele, Arabia Saudita e India. Per quanto riguarda il
Mediterraneo, l'infezione si è presentata recentemente in
Bulgaria, sierotipo 9, Grecia, sierotipi 4, 9, 16, Tunisia e Algeria,
sierotipo 2, Francia (Corsica) [2], sierotipo 2, Spagna (Baleari)
sierotipo 2[2, 3], Jugoslavia, Albania, Bosnia herzegovina,
Macedonia, Croazia, Kosovo, Turchia, sierotipo 9 e inoltre in Sud
America (Argentina e Brasile), America centrale[6],Carabi,[6]
Malesia[6], Indonesia[6],Pakistan[5] nel Nord e Nord-Est
dell'Australia e ancora in Cina[6] e Giappone, vale a dire in quelle
zone al limite delle aree in cui il virus è endemico. In Italia la
malattia e’ per ora limitata all’Italia centro-meridionale
(Sardegna sierotipo 2 e attualmente 4 e Italia meridionale
sierotipo 2, 4, 9, 16) [2, 36].

Per la maggior parte del XX secolo C.imicola aveva una


bassa presenza nella zona del bacino del Mediterraneo e
nonostante fosse comparsa diverse volte in forma epidemica,
non si era mai stabilita in alcun territorio europeo una situazione
di endemia. A partire dal ’98 la presenza del vettore e’ stata
segnalata zone in cui prima d’ora non era mai comparsa (Francia
e Italia) ed in zone in cui era comparsa finora solo in forma
sporadica (Spagna, Grecia e Turchia). In sovrapposizione con
questo ampliamento dell’areale del vettore, si e’ avuto
l’espandersi della BT.[9]

30
Le recenti epidemie di BT in Europa si sono sviluppate a
partire dal 1999 da due focolai differenti: uno nell’Europa sud-
occidentale riguardante il sierotipo 2 e proveniente da Tunisia e
Algeria (Corsica, Baleari, Italia) ed uno nell’Europa orientale
riguardante i sierotipi 4,9 e 16 (Bulgaria, Grecia, Jugoslavia,
Albania, Bosnia herzegovina, Macedonia, Croazia, Kosovo,
Turchia) probabilmente partita da un focolaio greco[91].

Nell’Ottobre del ’98 BTV viene confermato in quattro isole


greche adiacenti alle coste dell’Anatolia. Per la prima volta in
Europa viene isolato da questi focolai il sierotipo 9. I focolai di
malattia furono attivi fino a Dicembre dopo cui i fenomeni di
sieroconversione si arrestarono fino al Giugno successivo quando
lo stesso sierotipo venne identificato in Bulgaria. Da qui il virus
inizio’ a viaggiare in direzione Ovest, benche’ durante questo
periodo non furono segnalati casi nei territori che separano i
focolai greci da quelli bulgari. L’epidemia bulgara fu attiva fino al
tardo Ottobre del ’99. Nel Luglio dello stesso anno le autorita’
turche segnalarono dei casi in regioni confinanti con la Bulgaria e
la Grecia continentale. Come misura profilattica fu adottata la
vaccinazione con vaccino vivo attenuato contro il sierotipo 4.
Solo più tardi il virus di campo fu identificato come appartenente
al sierotipo 9. In seguito la malattia si espanse anche alle
province Anatoliche della Turchia. Fonti non ufficiali dalla Turchia
suggerirono una possibile presenza del sierotipo 9 gia’ nel corso
del ’98. Nell’Agosto del 2000 fu segnalato un nuovo focolaio
ascrivibile al sierotipo 16. Nell’Agosto del ’99 il sierotipo 9 fu
segnalato nella Grecia continentale, inizialmente solo nelle zone
confinanti con Bulgaria e Turchia, espandendosi nei mesi
seguenti ad un terzo della penisola greca. Questi focolai
restarono attivi sino al Dicembre inoltrato e casi sporadici furono
segnalati nel Settembre successivo. Nell’autunno del ’99 un
focolaio separato fu identificato a Lesbo e in altre isole del
Dodecanneso. Come detto oltre al sierotipo 9 altri due ceppi virali

31
furono identificati nel corso di questa epidemia: il sierotipo 4
partito dai confini turchi ed il 16 inizialmente evidenziato dalle
stesse isole colpite in principio dal sierotipo 9. Da principio si
avanzo’ l’ipotesi che i focolai ascrivibili al sierotipo 4 fossero
dipendenti dalla frettolosa e poco accurata campagna di
vaccinazione praticata in Turchia ma questa teoria non può a
tutt’oggi essere dimostrata. Nel settembre del 2001 le autorita’
greche confermarono la presenza del virus per il quarto anno
consecutivo nel loro territorio, questa volta ai confini con
l’Albania. In seguito a segnalazioni in Serbia, Montenegro,
Kosovo, Macedonia, Bulgaria e Croazia, la preoccupazione crebbe
per il potenziale interessamento di tutta l’Europa sud-orientale in
un epidemia di grandi dimensioni.

In Anatolia è stata ripetutamente segnalata la presenza di


C. imicola, ma prima del ’99 esso era sconosciuto in grecia
eccezion fatta per le isole di Chios, Rodi e Lesbo. Inoltre una serie
di catture effettuate negli anni ’80 non ne rilevarono mai la
presenza nella Grecia continentale, neanche nelle zone in seguito
colpite dall’epidemia di BT. Nuove ricerce condotte durante
l’epidemia, ne segnalarono invece la presenza anche in altre
isole e in varie localita’ della penisola. Nonostante ciò, anche
questi nuovi studi non ne rilevarono la presenza nella Grecia
settentrionale colpita dall’epidemia né in Bulgaria. In queste
regioni durante l’epidemia i cricoidi maggiormente presenti
furono c. obsoletus e c. pulicaris. Studi condotti sul gruppo c.
obsoletus hanno evidenziato bassi livelli di competenza (2% di
vettori infetti contro il 19% di c. sonorensis) ma l’alta fertilita’ e
la grande capacita’ di sopravvivenza dimostrate durante
l’epidemia bulgara, potrebbero essere sufficienti a compensare
una bassa competenza per BTV, è inoltre dimostrato che la
competenza e’ un fattore genetico legato più alla popolazione
che alla specie, per cui è possibile che la popolazione interessata

32
nell’epidemia greco-bulgara fosse piu’ competente delle
popolazioni prese in esame durante gli studi di laboratorio.

Il secondo focolaio fu per la prima volta segnalato nel


Gennaio 2000 nel nord della Tunisia e fu identificato come
responsabile in sierotipo 2. Non si segnalarono nuovi casi fino al
periodo Giugno-Ottobre 2000. A Luglio-Agosto 2000 nuovi casi
comparvero lungo i confini tra Tunisia e Algeria. Da Settembre in
poi nuove sieroconversioni furono segnalate prima nell’Algeria
occidentale, poi in Marocco. A partire da Agosto la BT fece la sua
comparsa per la prima volta in Italia; prima in Sardegna, poi in
Sicilia e Italia Meridionale. In Sardegna l’epidemia fu
particolarmente feroce con più di 4000 focolai e 90000 capi morti
o abbattuti. I focolai italiani ebbero un arresto dell’espansione
durante l’inverno 2000-2001 a causa delle basse temperature.
Nell’Ottobre del 2000 l’epidemia si espanse anche alla Corsica e
a Minorca e Maiorca anch’esse mai toccate prima dal virus.
Purtroppo a Settembre dell’anno successivo alcuni focolai
comparvero nuovamente in Corsica, Sardegna, Calabria e nella
penisola italiana fino al Lazio e alla Toscana. Tutti questi focolai
sono da ascrivere al sierotipo 2 benche’ ci sia il sospetto di un
incursione del sierotipo 9 in Toscana dalla Grecia o dalla penisola
Balcanica. Tutti questi focolai si trovano nettamente a nord
rispetto agli areali soliti per BTV e le dinamiche epidemiologiche
indicherebbero chiaramente la presenza di fenomeni di
overwintering di c. imicola che se dimostrati allargherebbero
notevolmente il numero delle aree a rischio di epidemie.

Il vettore in causa nell’ epidemia meridionale pare essere


unicamente c. imicola che pur non essendo mai stato segnalato
in precedenza in alcune delle aree colpite, ha fatto la sua
comparsa in tali zone in concomitanza con il manifestarsi della
malattia. Alcune delle zone segnalate durante questa epidemia
come zone di riproduzione di c. imicola sono le piu’ settentrionali
mai segnalate.

33
La direzione dell’espansione (principalmente est-ovest) e la
rapidita’ con cui e’ avvenuta, fanno pensare che la causa
primitiva sia non tanto il surriscaldamento globale del pianeta,
ma una concomitanza di eventi meteorologici e di alte
temperature che ha consentito al vettore di raggiungere aree che
prima gli erano precluse.[9]

Inoltre c’e’ l’evidenza dell’ emergenza di un nuovo vettore


la cui identita’ e’ tuttora sconosciuta, sicuramente responsabile
della trasmissione della BT in alcune zone dei Balcani, ma che
potrebbe rapprsentare un fattore di ulteriore espansione del virus
specialmente se risultasse rappresentato da C obsoletus, un
culicoide diffuso anche nell’Europa settentrionale.[9, 91]

Tra l’altro c.obsoletus era stato chiamato in causa anche


durante l’epidemia nell’isola di Lesbo nel ’78.[17]

In Sud Africa la malattia e’ presente almeno sin dal 1700 ed


e’ malattia endemica degli animali domestici e selvatici. I
sierotipi presenti sono 21 e sono considerati sierotipi esotici solo
il 17, il 20 ed il 21. Negli studi piu’ recenti i sierotipi prevalenti
nella regione risultano essere l’1, il 2, il 3 e il 4 [24]. Qui’ fu
impiegato il primo vaccino (un monovalente sierotipo 4
attenuato) per una profilassi su ampia scala. Attualmente tutta la
popolazione ovi-caprina africana puo’ considerarsi sieropositiva e
resistente alle manifestazioni cliniche della BT eccezion fatta per
alcune greggi di altura, non tanto per le vaccinazioni regolari,
quanto per l’ampia diffusione del virus nel territorio e quindi la
continua esposizione del bestiame agli antigeni virali.

In Sud Africa, nel periodo invernale, il virus persiste nei


portatori, con il sopraggiungere della stagione estiva la
popolazione di insetti vettori si moltiplica e si ha
un'amplificazione virale prima nei ruminanti selvatici e in seguito
nei bovini. Alla fine dell'estate australe, nei mesi di febbraio-
marzo, quando sia i vettori sia il virus sono ai loro massimi livelli
34
di concentrazione, la malattia esplode improvvisamente nelle
pecore che fungono da animali sentinella. Questo è stato
comprovato da un piano di sorveglianza istituito sulle popolazioni
sia di Culicoides spp. sia di vertebrati recettivi. Si è evidenziato
che C. imicola preferisce nutrirsi sui ruminanti selvatici e sui
bovini piuttosto che sulle pecore. In una stagione, si possono
isolare da questi vettori anche 15 diversi sierotipi del virus.
Alcuni di essi possono essere predominanti per una, due o più
stagioni e costituire il 60-65% del totale degli isolamenti
effettuati. Negli anni successivi la loro predominanza può ridursi
al punto tale che dimostrarne la presenza diventa difficile con i
metodi di campionamento utilizzabili sul campo. Sulla base di
queste osservazioni, i sierotipi sono stati così distinti: quelli
aventi un alto potenziale endemico, come ad esempio i sierotipi
2, 4, 5 e 6, quelli con potenziale intermedio, sierotipo 12, e quelli
a basso potenziale: sierotipi 7, 15, 18 e 22. Si tiene conto di
queste osservazioni per decidere quali sierotipi vadano inclusi nel
vaccino polivalente da utilizzare per la immunizzazione degli
ovini nei Paesi dove la malattia è endemica, e dove circolano più
sierotipi virali.

In Giappone e’ dal secolo scorso conosciuta una patologia


denominata “Ibaraki virus” la cui sintomatologia e’
sovrapponibile a quella della BT, ma che si presenta solitamente
in forma lieve e guaribile in 3-4 giorni negli ovini, dimostrando, al
contrario della BT una maggiore patogenicita’ per i bovini
[160].Alcuni casi di BT sono stati segnalati nella regione di Kanto.
Le prime segnalazioni riguardano episodi di sintomatologia
manifesta sia negli ovini che nei bovini. In seguito i programmi di
monitoraggio hanno rilevato crescenti livelli di sieroconversione
nei bovini ma nessun sintomo di malattia se non un focolaio
isolato. Anche nelle isole di Kyushu e Okinawa sono stati rilevsti
csi di sieroconversione ed il virus e’ stato isolato da esemplari di
C. brevitarsis. Ulteriori studi genetici hanno dimostrato la scarsa

35
omogeneicita’ con i ceppi australiani e una differenziabilita’ dei
campioni giapponesi in due ceppi, segno probabilmente di
mutazioni in corso all’interno del sierotipo in azione nella
regione.

In Australia la prima conferma della presenza di BTV fu nel


’77. Durante i seguanti 15 anni furono isolati nel sub-continente
8 sierotipi diversi, in assenza di manifestazioni cliniche della
malattia. Questo ha portato le autorita’ a concentrare le ricerche
nel campo della possibile trasmissione del virus attraverso il
seme e gli embrioni per ridurre l’impatto economico sulle
esportazioni, ed a istituire un piano di sorveglianza strettissima
per quanto riguarda la distribuzione di virus e vettori. Questo
piano consiste principalmente nella disposizione di animali
sentinella in punti chiave del territorio e di trappole per la cattura
dei vettori nelle stesse aree. L’Australia d’altra parte presenta
delle caratteristiche uniche nel suo genere. Innanzitutto e’
climaticamente divisa in due regioni: una regione nord orientale
con alta temperatura ed umidita’ ed una meridionale
semidesertica. L’ allevamento bovino e’ concentrato nella prima
regione ed e’ un tipo di allevamento allo stato semibrado, mentre
nella zona arida si concentra tutta la popolazione ovina
australiana. Non sono mai stati attuati piani di vaccinazione, ma
si e’ provveduto, tramite il monitoraggio costante ed interventi
mirati a limitare la diffusione del virus alla zona settentrionale,
quindi alla popolazione bovina che essendo resistente non
sviluppa la malattia.

Tutti i paesi del Sud America hanno almeno una porzione


del loro territorio all’interno della fascia tra il 40° parallelo N ed il
35° S. La prima segnalazione del virus nella regione fu fatta nel
’79 in Brasile. Gli ospiti suscettibili sono risultati, oltre agli ovi-
caprini, ai bovini ed ai bufali, anche l’alpaca, mentre il lama, il
guanaco, la vigogna ed il cervo della pampa non hanno mostrato
sieroconversione. I sierotipi finora isolati sono il 4, 6, 12, 14, 17,

36
19 ed il vettore responsabile sembra essere C.insignis e
probabilmente anche C. pusillus.

In Cina la BT fa la sua comparsa nel ’79 ed i sierotipi in


causa sembrano essere l’1,2,3,4,12,15,16.

In India la BT e’ endemica e anticorpi anti-BTV sono


riscontrati regolarmente in bovini, caprini e bufali, in assenza di
malattia conclamata. L’incidenza della patologia e’ ciclica, con la
maggior parte dei casi segnalati durante la stagione dei monsoni
sud-occidentali, da giugno a settembre. Sono stati isolati 21 dei
24 sierotipi ma non sono mai stati fatti studi sui vettori
responsabili della trasmissione. Sieroconversione e’ stata rilevata
anche nel vicino Pakistan per i sierotipi 3,9,15,16 e 18.
Sieroconversione e’ stata segnalata anche negli animali dello Sri
Lanka e del Bangladesh in assenza di sintomatologia clinica.

Uno studio condotto nella Provincia Nord orientale del


Pakistan ha rilevato una prevalenza di quasi il 50% dei capi e
quasi del 90 % delle greggi ovine esaminate, con una leggera
influenza sui casi di aborto nella stagione precedente a quella in
cui furono condotti gli esami, mentre la pratica della
transumanza ha dimostrato di avere una forte influenza negativa
sulle percentuali di sieroconversione[5].

Negli Stati Uniti, sono stati identificati sino ad ora 4


sierotipi di virus: 10, 11, 13 e 17 piu’ rarei episodi riferibili al
sierotipo 2[104, 111]. Il tipo 10 fu il primo a essere isolato negli
anni' 50 in California; il tipo 1l, isolato in Texas, è quello
predominante; il tipo 17 sembra presente solo negli USA. Dai dati
di un'indagine sierologica, condotta in un periodo di circa tre
anni, la positività tra gli animali controllati risultava così
distribuita: bovini 30%, ovini 36%, caprini 21 %, antilopi 50%,
altri selvatici 28%. La maggior parte dei casi di BT si verifica negli
stati del Sud e dell'Ovest, mentre il Nord-Est del Paese
sembrerebbe indenne. È da ricordare inoltre, che negli Stati Uniti
37
è diffusa su tutto il territorio la "Epizootic haemorrhagic disease"
del cervo, malattia sostenuta da un virus appartenente allo
stesso genere e strettamente correlato a quello della BT.

La regionalizzazione della BT negli Stati Uniti è


probabilmente dovuta al fatto che C. variipennis varietà
sonorenzis, vettore della BT negli Stati del Sud-Est e dell'Ovest,
non è presente negli Stati del Nord-Est. In questi ultimi, le varietà
di C. variipennis presenti non sono efficienti trasmettitori
dell'infezione.

In Canada la presenza del BTV sembra limitata ad alcune


incursioni sporadiche nella valle dell’Okanogan, ai confini con gli
USA [135].

In Israele la BT appare regolarmente a partire dal ’76.

MALATTIA NELL’OVINO

SINTOMATOLOGIA

Nella pecora, morbilità, mortalità e letalità variano


enormemente in funzione di diversi fattori sia ospite che virus
dipendenti. In particolare la presenza della malattia in una
Regione indenne e di sierotipi particolarmente patogeni possono
determinare tassi di morbilità fino al 30% e di mortalità fino al
10%.

La fase di incubazione varia da 4 a 16 giorni, la media è di


circa una settimana[29]. Nell’inoculazione sperimentale di
materiale infetto nella pecora tale periodo è di 4-6 giorni con

38
estremi da 2 fino a 15 giorni in caso di virus adattato
all’embrione di pollo[29].

L’intensità della sintomatologia nell’ovino, come sopra


riportato, è estremamente variabile e può dar luogo a forme
acute, subacute o di scarsa o nulla entità a seconda del sierotipo
virale in causa e dalla razza [29]. In alcune razze africane
autoctone, l'infezione può essere inapparente mentre in quelle
importate, in particolare la merinos, la sintomatologia è
grave[29]. È da tenere presente che la fotosensibilizzazione
gioca un ruolo importante nel determinare la gravità dei sintomi,
infatti, se le pecore sono tenute al riparo dalle radiazioni solari, le
alterazioni congestizie sono meno evidenti[29]. La letalità nelle
normali condizioni di campo varia tra l'1 e il 30%[29].

La forma acuta inizia con febbre (40-41°C) remittente che


dura per una settimana circa e la cui intensità non è correlata
con la gravità della forma morbosa[29]. Nonostante la febbre sia
presente nella maggioranza dei casi, si sono avuti anche casi di
animali sicuramente infetti che non hanno manifestato questo
sintomo, mentre spesso e’ l’unico sintomo durante gli aborti da
BTV [29]. Il rialzo termico dura solitamente 6-7 giorni, e puo’
essere accompagnato, nei casi piu’ acuti da tachipnea[29].
Questa fase e’ seguita, dopo 24-36 ore dal primo rialzo febbrile,
da iperemia delle mucose nasale e orale, intensa salivazione
accompagnata da abbondante secrezione nasale, e lambimento
continuo della regione che esitano in formazione di croste sul
labbro superiore ben visibili anche a distanza per il loro colore
bruno[29]. Lo scolo nasale, inizialmente sieromucoso, diventa
mucopurulento; intorno alle narici si formano croste che, se
rimosse, evidenziano una superficie erosa[29]. Lacrimazione e
iperemia congiuntivale e palpebrale sono spesso osservate[29].
Altro segno solitamente presente e ben visibile è l’edema
soprattutto diffuso alle labbra, lingua e spazio intermandibolare,
che a volte scende fino ad interessare testa, collo e ingresso del

39
torace[29]. In alcuni casi di interessamento delle orecchie
nell’edema della testa, queste assumono un portamento
pendulo[29]. Le mucose orali e nasali possono presentare
emorragie petecchiali in particolare a livello della giunzione
muco-cutanea[29]. Il segno che da il nome alla malattia, lingua
blu, è dovuto alla cianosi per l’aggravamento delle lesioni del
circolo sanguigno ed è piuttosto incostante[29]. In alcuni casi, la
lingua edematosa e cianotica protrude dalla bocca in altri
l'edema linguale non è molto pronunciato ma può essere messo
in evidenza osservando la punta che appare arrotondata[29].
Possono anche essere rinvenute escoriazioni delle gengive, del
palato duro, della faccia interna di labbra e guance e sul
cuscinetto dentale [29]. Le porzioni esposte sono dolenti ed
emorragiche[29]. Come conseguenza di cio’ la saliva puo’ essere
striata di sangue e fetida a causa della presenza di materiale
necrotico[29]. Anoressia e depressione accompagnano
solitamente questo quadro[29]. Emorragie papillari possono
essere visibili su tutta la superficie linguale ma in particolare su
quella ventrale. Occasionalmente, l'edema e le emorragie sono
profonde, evidenziabili solo con il taglio dell'organo. L'edema e le
incrostazioni a livello delle narici possono essere causa di
difficoltà respiratoria [29, 19]. Può esserci anche paresi
dell’esofago che puo’ portare a vomito e polmonite ab ingestis a
causa della disfagia[29]. Occasionalmente puo’ sovrapporsi una
diarrea emorragica che rappresenta sempre uno sfavorevole
segno prognostico[29]. L'iperemia e l'edema delle palpebre le
emorragie a livello del musello) e la cianosi della mucosa orale
sono caratteristiche delle infezioni con ceppi virali ad alta
virulenza.

Sul margine linguale e sulla mucosa gengivale in


corrispondenza degli incisivi e dei molari sono visibili erosioni con
accumulo di materiale necrotico; la saliva è schiumosa. Queste

40
lesioni tendono a guarire rapidamente, in circa 5 giorni dalla
remissione della sintomatologia [19].

Abbastanza frequente è la localizzazione al piede dove a


livello del cercine coronario si nota una linea iperemica ed
emorragia petecchiale che può estendersi in profondità nel
tessuto corneo[29]. La coronite e la laminite si esprimono con
fenomeni iperemici, calore della parte e viva dolorabilità che
provoca zoppia o, nel caso siano colpiti tutti gli arti, difficoltà di
stazione o inarcamento della schiena come atteggiamento
antalgico[29]. Tali fenomeni sono spesso rilevabili anche a
seguito di miosite che provocano rigidità, debolezza e talvolta
torcicollo, che possono esitare in emaciazione rapida e morte
dell’animale perche’ si uniscono agli altri sintomi nell’impedire un
adeguata alimentazione dell’animale[29].

Le lesioni podali solitamente si sviluppano dopo la


scomparsa della sintomatologia febbrile e sono più frequenti agli
arti posteriori che a quelli anteriori; per il dolore l'animale ha
difficoltà nella deambulazione e cerca di camminare sulle
ginocchia[29]. La coronite, se grave, esita nella rottura dello
zoccolo. Non sembra esserci diretta correlazione tra la gravita’
delle lesioni buccali e di quelle podali[29].

Spesso si rileva iperemia delle zone di cute glabra, o anche


dell’intero corpo[29]. L'iperemia cutanea è maggiormente
evidenziabile negli animali che vivono all'aperto; se la regione
inguinale viene anche leggermente strofinata si possono
determinare emorragie; se l'animale "siede" sul posteriore, come
può avvenire durante l'esame degli arti anteriori, si può verificare
emorragia sulla punta della coda. Le alterazioni cutanee sono
molto importanti per le razze ovine produttrici di lana; infatti la
fibra che si sviluppa nel periodo in cui l'animale è malato è più
sottile, tende a rompersi e non può essere utilizzata nell'industria
laniera. A 3-4 settimane dalla defervescenza può osservarsi

41
distacco della lana[29]. In certi casi l'animale può perdere l'intero
vello [19, 29]. In caso di superamento della malattia può esservi
una considerevole fragilità della lana.

Più raramente può esserci influenza sul feto e sulla


fertilità. L’infezione durante il periodo di gravidanza comporta
effetti sul prodotto del concepimento variabili a seconda dello
stadio di gestazione. L’infezione dal 30° al 60° giorno provoca
malformazioni scheletriche agli arti (accorciamento, deformità,
mancanza dei segmenti distali), del rachide (scoliosi, deviazione
della testa), della mandibola (prognatismo). Tra il 60° e il 90°
giorno si ha aborto o lesioni neurologiche come ipoplasia o
degenerazione della sostanza grigia, idrocefalo interno,
retinopatie. Le lesioni neurologiche sono assenti in caso di
infezione prima dei 30 e dopo i 90 giorni di gestazione. La morte
può avvenire in percentuale molto variabile, solitamente 0-20 %,
ma può giungere sino al 40-50 e, seppure raramente, 70 % dei
casi.

Le forme subacute combinano i sintomi anzidetti ma li


esprimono ad un livello più modesto,di solito estrinsecandosi in
emaciazione, debolezza, torcicollo e un lunghissimo periodo di
convalescenza. Le forme lievi mostrano unicamente una lieve
ipertermia

La prognosi dei casi lievi puo’ essere favorevole, con


recupero rapido e con solo un leggero scadimento delle
condizioni fisiche[29]. Nei casi gravi la prognosi deve essere
sempre riservata fino a completa remissione dei sintomi in
quanto sono frequenti improvvise recrudescenze in fase di
guarigione[29]. I tempi di recupero sono largamente influenzati
dalla gravita’ delle lesioni buccali e podali che prostrano
l’animale rallentandone la ripresa. Il tasso di mortalita’ e’ molto
vario e dipende da numerosi fattori, primi fra tutti il ceppo virale
e l’esposizione al sole[29]. Sempre a causa dell’influenza della

42
fotosensibilizzazione, la sintomatologia appare piu’ grave negli
animali tosati di recente[29]. Ci sono segnalazioni di aumento
della sucscettibilita’ al virus in ovini precedentemente esposti al
BTV in dosi inferiori alla dose minima infettante[29]. La morte
solitamente sopravviene tra l’1 e gli 8 giorni post infezione e la
causa piu’ comune sembra essere la polmonite ab ingestis[29].

Studi ematologici e di diagnosi di laboratorio riferiscono un


aumento della glicemia, dell’azoto non proteico e dell’azoto
ureico ed in casi gravi una diminuzione dell’emoglobina e dei
leucociti[29]. Un aumento di Ig circolanti si rileva entro i primi 8
giorni post infezione[29]. La magior parte delle pecore mostra
anche segni di anemia emolitica. I livelli sierici di GPT, GOT,
lattico-deidrogenasi e aldolasi sono ugualmente aumentati[29].
Alcuni casi mortali hanno mostrato un incremento della creatina
fosfochinasi dopo il picco febbrile[29]. Probabilmente questi
ultimi dati sono da ascrivere allo sviluppo di una miopatia
scheletrica[29].

LESIONI ANATOMO-PATOLOGICHE

Il quadro classico della malattia si riferisce alla fase acuta


febbrile o post-febbrile, bisogna infatti ricordare che le lesioni
sono correlate ai sintomi clinici ed alla fase della malattia in cui
e’ sopraggiunta la morte[29]. Animali venuti a morte in uno
stadio avanzato della patologia presenteranno un quadro
necroscopico oscurato dall’insorgere di complicazioni
secondarie[29].

A carico dell’apparato digerente si rilevano iperemia,


edema, cianosi, emorragie ed ulcere della mucosa orale[29].
Escoriazioni sono presenti in tutto il cavo orale esono coperte da
tessuto necrotico[29]. Lesioni di tipo difteroide e necrotico sono
da imputarsi a batteri di irruzione secondaria. La mucosa di tutto

43
il tratto digerente può presentare fenomeni infiammatori
iperemico-emorragici[29]. L’apparato respiratorio è sede di
flogosi catarrale della mucosa nasale, per cui le cavita’ nasali
sono spesso occupate da materiale grigio-marrone formato da
cellule epiteliali, muco e polvere[29]. Il setto nasale e’ congesto
ed il musello presenta escoriazioni[29]. Edema della laringe e
della trachea sono frequenti mentre a livello polmonare si
rilevano edema interstiziale e alveolare, emorragie subpleuriche,
versamento pleurico[29]. L'edema descritto nella regione orale e
mandibolare si può estendere sino allo sterno. I polmoni sono
congesti, negli alveoli e nell'intero albero bronchiale è presente
liquido schiumoso[29].

Nelle forme a decorso più lento sui lobi polmonari si


osservano petecchie emorragiche.

Sono presenti idrotorace, idropericardio ed emorragie


subepicardiche e subendocardiche[29].

Le emorragie alla base dell'arteria polmonare sono, da


alcuni ricercatori, considerate patognomoniche: sono lesioni
sottoendoteliali e possono essere meglio evidenziate se l'arteria
è osservata in controluce, sono visibili in almeno i1 95% dei casi
di BT. I linfonodi possono essere ingrossati e presentare edema
perilinfonodale[29].

Emorragie possono essere messe in evidenza a carico di


milza e linfonodi[29]. A livello cutaneo si possono notare aree
fortemente iperemiche laddove la cute è glabra e quindi esposta
all’azione diretta dei raggi solari[29]. L’apparato locomotore è
interessato nella componente muscolare che puo’ presentarsi
atrofica[29]. I muscoli del collo, dorso e quarto posteriore
possono presentare emorragie, accumulo di liquido gelatinoso di
colore giallastro, depigmentazione, trombosi e necrosi cui
consegue calcificazione[29]. L'effetto di queste lesioni diventa
clinicamente visibile 2 o 3 settimane dopo la fase acuta, quando
44
l'animale manifesta cachessia, torcicollo e difficoltà
deambulatorie, alterazioni osservabili anche un anno dopo
l'infezione.

Per quanto riguarda la cavità addominale, sono


evidenziabili emorragie sulla mucosa dell'omaso, all'apice delle
papille del rumine e ovunque vi sia attività muscolare[29]. Sulla
mucosa dell'omaso c'è una netta demarcazione fra le aree
interessate e quelle normali, ed un anello iperemico circonda
solitamente il piloro; ciò è probabilmente dovuto ad un
coinvolgimento selettivo del sistema circolatorio come avviene
nella peste equina[29]. L'intestino solitamente non presenta
alterazioni, in alcuni casi si possono evidenziare fenomeni
congestizi[29]. La cistifellea spesso presenta petecchie
emorragiche evidenti[29].

Dal punto di vista istologico le lesioni endoteliali sono


rappresentate da degenerazione, palloniforme, inclusioni
citoplasmatiche, picnosi, carioressi[29]. La necrosi dell’epitelio è
accompagnata da infiltrazione leucocitaria. A livello di tessuto
podofilloso si nota stasi ematica, essudazione e infiltrazione di
eritrociti e granulociti. Nel tessuto muscolare striato si osservano
lesioni progressivamente rappresentate da rigonfiamento delle
fibre muscolari, deformazione, lisi, riassorbimento e
rigenerazione; la sostituzione del tessuto muscolare con tessuto
fibroso è alla base del torcicollo rilevabile in alcuni soggetti. Nei
feti ovini possono essere evidenziati edema, iperemia, emorragie
a livello epatico, cardiaco e della ghiandola surrenale; può
esserci meningite non suppurativa e miocardite necrotica.

Nella pecora le lesioni congenite differiscono secondo il


periodo di gestazione in cui l'infezione ha avuto luogo. Negli stadi
iniziali si ha idrocefalo, negli stadi intermedi formazione di cisti
cerebrali, mentre nell'ultimo periodo, si osserva encefalite a
focolai.

45
PATOGENESI

Il virus, dopo essere penetrato, a seguito della puntura di


un insetto vettore, si localizza e replica nei siti primari di
replicazione rappresentati dai linfonodi regionali, raggiunge
quindi i siti di replicazione secondari rappresentati dai tessuti
linfatici (milza e linfonodi) e polmoni [29, 30] Segue una viremia
cellulo-mediata in cui il virus è presente nei monociti, nei linfociti,
nelle piastrine e nei globuli rossi[29]. In questi ultimi, che nelle
fasi più avanzate rappresentano la sede esclusiva di
mantenimento del virus nel sangue, i virioni sono localizzati in
invaginazioni della membrana plasmatica [29, 25 [Brewer e
MacLachlan,1992]. Protetto così dall’azione degli anticorpi
neutralizzanti il virus può permanere nel sangue finchè non
avviene la naturale distruzione dell’eritrocita infetto. [29, 25] La
diversa durata della vita delle emazie nelle varie specie
renderebbe conto della diversa durata della viremia[1]. [25]
L'associazione del virus agli elementi mononucleati è importante
nella disseminazione del virus nei vari tessuti, mentre la sua
presenza negli eritrociti riveste un ruolo primario nella
trasmissione dell'infezione agli artropodi vettori. [25]

La replicazione del virus nelle cellule endoteliali e


periendoteliali e nei periciti dei capillari, delle arteriole e delle
venule di particolari distretti sono la causa dei sintomi clinici e
delle lesioni tipiche della Blue Tongue[29]. L'immunoistochimica
e la microscopia elettronica hanno evidenziato fenomeni
degenerativi e necrotici nelle cellule endoteliali di differenti
tessuti, in particolare fenomeni di degenerazione vacuolare,
ipertrofia, picnosi e carioressi delle cellule[29]. Alla necrosi
seguono processi rigenerativi che comportano ipertrofia e
iperplasia delle pareti vasali e occlusione del lume che porta a
46
stasi ematica, essudazione, ipossia dei tessuti colpiti[29].
E’accertata una sorta di selezione di alcuni endoteli nel processo
patologico in funzione sia di differenti funzioni delle cellule
endoteliali sia in relazione di uno specifico tropismo di alcuni
stipiti virali. Sono inoltre presenti anormalità nei processi di
coagulazione attraverso una forma di coagulopatia intravascolare
disseminata che si esprime attraverso diatesi emorragiche che
caratterizzano la forma clinica fulminante. L'azione combinata di
processi degenerativi e rigenerativi determina iperplasia ed
ipertrofia degli endoteli con conseguente occlusione vasale, stasi
ematica ed essudazione associate ad ipossia. Un quadro di
panleucopenia precede la fase viremica, probabilmente correlato
a replicazione virale in alcuni precursori dell’apparato
emopoietico E stato osservato come spesso le lesioni piu’ gravi i
rinvengano in aree che presentano una temperatura
inferiore,probabilmente da correlare all’effetto aggiunitvo della
vasocostrizione periferica alla stasi ematica[29].

LA MALATTIA NEL BOVINO

SINTOMATOLOGIA

Nelle zone endemiche, la BT raramente si manifesta nei


bovini in forma clinica, nei capi in cui la sintomatologia è
presente essa può essere molto simile a quanto si osserva nelle
pecore. Nelle aree endemiche degli USA l'infezione colpisce sino
al 90% della popolazione, tuttavia solo un animale su 1000
manifesta sintomi clinici. Questi ultimi possono presentarsi sotto
forma di dermatite crostosa dell'area toracica e cervicale,
iperestesia generalizzata e zoppia conseguente alla coronite. Le

47
lesioni a carico della bocca, se presenti, consistono inizialmente
in piccole formazioni vescicolari che evolvono in erosioni
localizzate, di preferenza, sul palato duro, lieve scialorrea, edema
e disepitelizzazione delle labbra e del musello, erosioni della
mucosa orale. Si può inoltre osservare scolo nasale
sieroemorragico o mucopurulento, alito fetido, iperpnea e tosse,
moderata laminite, spesso a tutti e quattro gli arti, con
conseguente andatura rigida, lesioni negli unghielli ed ulcerazioni
nei capezzoli delle vacche in lattazione. Può essere talora rilevato
un incremento della temperatura rettale sino a 41° C e
leucopenia, respirazione frequente e superficiale. Viene anche
segnalato ispessimento, fessurazione o desquamazione della
cute e caduta parziale o totale del pelo.

L'animale è anoressico e la morte molto rara. Le infezioni


congenite sono responsabili di aborti e malformazioni fetali,
analoghe a quelle evidenziate nella specie ovina, e si sono
riscontrate in caso di infezione tra il 70° e il 150° giorno di
gravidanza.

Le forme gravi, rarissime, sono caratterizzate da un


eczema cutaneo con desquamazione e screpolature della cute.

LESIONI ANATOMO PATOLOGICHE

Simili a quelle riscontrate nell'ovino. Nel bovino non sono


presenti alterazioni necrotiche a carico dei muscoli. Nel bovino, in
caso di infezione precoce si può avere riassorbimento embrionale
e aborto, mentre negli ultimi tre mesi di gestazione, solitamente,
non si osservano alterazioni di rilievo [19]. In Turchia e’ stato
segnalato un caso di artrogrifosi e idranencefalia in un vitello

48
risultato positivo al sierotipo 4, anche se è probabile si trattasse
di una confezione col virus di Akabane.[159, 131]

PATOGENESI

Nel bovino sembra che la malattia sia da attribuire ad una


azione di ipersensibilità ritardata mediata da IgE. I sintomi sono
preceduti da un rapido incremento delle IgE con conseguente
liberazione di ammine vasoattive cui segue comparsa di edemi e
infiltrazione da parte di eosinofili. L'infezione è prevalentemente
subclinica e, quando presenti, i sintomi sarebbero da riferire a
reinfezione. L'infezione determina una viremia prolungata cui è
associata l'importanza che riveste questa specie
nell'epidemiologia della malattia. La patogenesi è simile a quanto
osservato nella specie ovina. L'immunoistochimica ha però
evidenziato un numero ridotto di cellule endoteliali interessate da
fenomeni degenerativi e necrotici dei tessuti isolati da animali
infetti.

In questa specie sembra che la malattia sia da attribuire ad


una azione di ipersensibilità ritardata mediata da IgE. I sintomi
sono preceduti da un rapido incremento delle IgE con
conseguente liberazione di ammine vasoattive cui segue
comparsa di edemi e infiltrazione da parte di eosinofili.
L'infezione è prevalentemente subclinica e, quando presenti, i
sintomi sarebbero da riferire a reinfezione. L'infezione determina
una viremia prolungata cui è associata l'importanza che riveste
questa specie nell'epidemiologia della malattia. Di considerevole
significato è anche la preferenza degli insetti nel cibarsi in questa
specie rispetto ad altri ruminanti. Solo quando la popolazione dei
vettori aumenta considerevolmente ed in presenza di un numero

49
limitato di bovini, essi si nutrirebbero anche da altri ruminanti
quali gli ovini.

La patogenesi è simile a quanto osservato nella specie


ovina. L'immunoistochimica ha però evidenziato un numero
ridotto di cellule endoteliali interessate da fenomeni degenerativi
e necrotici dei tessuti isolati da animali infetti [30].

ALTRE SPECIE

Nei caprini la malattia risulta di solito asintomatica o


limitata ad un lieve rialzo termico, se presente rimarca quanto
avviene nell’ovino[29]. I ruminanti selvatici, con l’esclusione del
cervo a coda bianca (Odocoileus virginianus) nei quali e’
endemico il complesso BT-EHD[38] e il cervo mulo (Odocoileus
Hemionus)[4], sono di norma alquanto resistenti come il
wapiti(Cervus elaphus canadensis)[4], sebbene in alcuni casi i
cervidi possano presentare una sintomatologia simile a quella
ovina oppure simile a quella causata dalla malattia emorragica
del cervo[38, 104].Queste differenze comunque sembrano in
parte legate agli habitat diversi delle varie specie, soprattutto in
relazione all’altitudine ed alla vicinanza degli allevamenti[4].
Malattia causata da BTV e’ stata documentata anche nell’
antilocapra americana e nella pecora delle Montagne Rocciose
(Ovis canadensis) [104]. In una pecora dalle grandi corna del
deserto infettatasi in Arizona, la sintomatologia fu caratterizzata
da edemi della testa e letargia[104]. All’esame necroscopico
l’animale presentava un esteso edema sottocutaneo che
interessava tutta la porzione ventrale del corpo, idrotorace e
idropericardio, emorragie epicardiche e miocardiche, placche
grigiastre diffuse sulla mucosa della cistifellea, il lume uterino
occupato da materiale ceroso[104]. Microscopicamente,

50
emorragie perivascolari erano presenti in varie porzioni del
sistema nervoso centrale e segni di encefalite, perivasculite era
presente anche nel tessuto cardiaco che presentava inoltre aree
di necrosi diffusa [104]. Il virus ha in tutte le specie ridotta
influenza sulla fertilità o sullo sviluppo di malformazioni fetali.
Nella cagna, a seguito di infezione iatrogena, si può avere aborto
o natimortalità e spesso la stessa può venire a morte. Le cagne
gravide sono inoltre gli unici soggetti che esprimono
clinicamente la malattia, negli altri si osserva unicamente
sieroconversione.

5. IMMUNITA'

La risposta immunitaria in ruminanti infettati dal BTV si


esplica attraverso la produzione di interferone, la stimolazione
dell'immunità umorale e cellulo-mediata. L'immunità può essere
naturalmente acquisita dalla prole durante la gestazione o a
seguito di infezione, nei soggetti infettati dall'insetto vettore. La
risposta antivirale degli animali infettati previene una successiva
infezione con il sierotipo omologo. In seguito all’esposizione al
virus si ha una risposta immunitaria sia umorale che cellulo-
mediata. Linfocitosi si osserva dal 14° giorno post infectionem.
Gli anticorpi neutralizzanti, diretti contro VP2, sono rilevabili a
partire da 1-4 settimane dopo l’esposizione al virus e
conferiscono protezione omologa anche se in alcuni casi si può
avere protezione crociata nei riguardi di altri sierotipi. Inoltre
anticorpi contro orbivirus correlati, come il virus della malattia
emorragica del cervo (EHDV), possono cross reagire con il BTV
creando problemi nella diagnostica sierologica. Anche anticorpi
diretti verso altri antigeni ,come VP7 o NS1, possono essere usati
a scopo diagnostico.

51
5.2 IMMUNITA' UMORALE

BTV è un forte induttore di produzione di interferone in


vitro.

L'interferone è stato inoltre riscontrato nel siero di bovini


ed ovini subito dopo l'infezione. Mentre l'interferone
probabilmente limita la diffusione del virus nell'organismo, è
improbabile che influenzi l'eliminazione del virus poiché la
viremia persiste a lungo dopo che l'interferone non è più
rilevabile nel siero. [28].

A seguito dell'infezione virale si sviluppa, sia nell'ovino che


nel bovino, una risposta immunitaria umorale verso differenti
proteine virali [20, 46]. Gli anticorpi neutralizzanti presenti nel
siero prevengono la reinfezione con un sierotipo omologo e la
neutralizzazione del virus è in funzione della presenza di
immunoglobuline verso la proteina del capside esterno VP2[27].
E' stato inoltre dimostrato che la reazione nei confronti dello
stesso determinante antigenico del virus può variare
considerevolmente tra differenti ceppi dello stesso sierotipo, per
cui, in alcuni ceppi, lo stesso determinante può assumere un
ruolo primario o secondario nella risposta di neutralizzazione. La
spiegazione di questo comportamento risiede nella
conformazione e associazione di diversi epitopi tra loro. Ne
deriva che gli stessi epitopi possono essere o meno siero
neutralizzanti in funzione del ceppo cui appartengono.

Gli anticorpi neutralizzanti non eliminano subito il virus


dalla circolazione [29, 46].

I ruminanti producono anticorpi nei confronti di molte altre


proteine virali [29, 46]. La risposta , valutata sui risultati di test

52
diagnostici, evidenzia come alcune appartenenti al core come la
VP7 ed altre non strutturali come la NS1 non mostrino variazioni
tra i differenti ceppi e sierotipi.

IMMUNITA' CELLULO MEDIATA

La risposta immunitaria cellulo mediata probabilmente


limita la diffusione del virus nelle fasi iniziali dell'infezione,
sebbene non determini una rapida eliminazione del virus della BT
nei ruminanti. Nel bovino si è osservato un incremento dei
linfociti T CD8+ nella linfa drenata dai linfonodi tributari della
regione corrispondente al sito di inoculazione 6-8 giorni dopo
l'infezione, mentre il picco ematico è stato raggiunto dopo 14
giorni [31].

PROFILASSI

Come detto la BT e’ una patologia non contagiosa che può


essere trasmessa solo con la puntura di insetti ematofagi o, più
raramente, tramite il trasferimento diretto di sangue o seme da
un animale infetto ad uno suscettibile. I metodi di lotta verso la
BT devono prendere in considerazione quindi:

• la peculiarità di trasmissione della patologia


attraverso insetti vettori che condiziona la presenza di forme
epidemiologiche differenti in relazione alle condizioni climatiche del
Paese in cui è presente la malattia;

• la situazione zootecnica ed ecologica del territorio;

• la durata del periodo di infettività del virus negli


animali recettivi;

53
• gli obiettivi che si vogliono raggiungere con la stessa
profilassi

Nonostante la maggior parte delle aree colpite da Bue


Tongue non siano riuscite ad eliminarla dal proprio territorio, e’
importante ricordare che c’e’ stato almeno un caso di successo
nell’eradicazione della malattia da un territorio fortemente
colpito. E’ questo il caso dell’epidemia che nel ’56 colpi’ la
penisola iberica. Nonostante la gravita’ delle perdite economiche,
sia la Spagna che il Portogallo attuarono immediatamente delle
misure per rallentare la diffusione del virus, e non appena fu
pronto un vaccino valido diedero il via ad una campagna di
vaccinazione protrattasi per tre anni, al termine dei quali tutta la
penisola iberica torno’ ad essere indenne e resto’ tale fino al
2000 in cui la malattia fece la sua comparsa nelle Baleari ma fu
ugualmente tenuta sotto controllo.[44, 91]

Il controllo della patologia può quindi essere effettuato


tramite [91]:

• Restrizioni al movimento degli animali per impedire


che animali infetti possano dare inizio a nuovi focolai in zone non
colpite. [91]

• Restrizioni all’utilizzo di seme per la fecondazione


artificiale per prevenire la diffusione tramite questa via. [91]

• Macellazione degli animali in fase viremica per


impedire che essi fungano serbatoio di virus per gli insetti
vettori. [91]

• Modifiche ai sistemi di allevamento. [91]

• Controllo dei vettori. [91]

• Vaccinazione. [91]

54
MODIFCHE DEL MANAGEMENT AZIENDALE

Per quanto riguarda le modifiche al sistema di allevamento,


esse devono mirare ad una riduzione delle occasioni di contatto
tra ospite vertebrato e vettore. La maggior parte dei vettori
conosciuti ad esempio, sono fortemente enofili, quindi la
stabulazione degli animali durante le ore di massima attività del
vettore può portare una significativa riduzione delle punture e
quindi della trasmissione. [91]In aggiunta a questo se si
utilizzano nelle vie d’accesso delle stalle accorgimenti quali l’uso
di zanzariere a maglie sottili impregnate di repellenti, si può
ridurre ulteriormente la possibilità di trasmissione della BT.
[91]Dal momento poi che i culicoides hanno dimostrato una certa
predilezione per l’alimentazione sul bovino, da molte parti è stata
suggerita la creazione di mandrie miste o comunque
l’inserimento di bovini nelle aree di pascolo degli ovini per
deviare in qualche modo l’attenzione del vettore su un ospite più
resistente alla malattia. [91] In ogni caso quest’ultimo
suggerimento non impedisce ne’ rallenta la diffusione del virus
nell’area di interesse e quindi non e’ raccomandabile qualora
l’obiettivo finale fosse l’eradicazione. [91]

CONTROLLO DEI VETTORI

Raramente si rivela possibile una totale eliminazione del


vettore dalle zone colpite, per cui nella maggior parte dei casi ci
si deve accontentare di ridurne la popolazione in modo che i
contatti tra vettore e virus divengano quanto più possibile rari, e
si giunga all’estinzione del focolaio per rallentamento della
trasmissione. [91]Esistono molti metodi per ottenere un controllo

55
dei vettori ma i piani più efficaci sono quelli che uniscono più di
un metodo. [91]

La possibilità di alterare l’habitat dei vettori e’ direttamente


dipendente dalla capacità di riconoscere e distruggere le aree di
riproduzione dei culicoidi. [91]Come detto c. imicola predilige
raccolte d’acqua stagnante inquinate da sostanze organiche. Le
raccolte d’acqua devono persistere per almeno 7-10 giorni per
consentire il completamento del ciclo riproduttivo per cui sono
più adatte le zone con terreno argilloso che quelle con terreno
sabbioso. [91] Le dimensioni di tali areali possono variare da
pozzanghere di pochi metri di diametro a intere zone paludose.
[91] Casualmente l’habitat ideale per i culicoides si trova di
frequente all’interno degli allevamenti, dove possono godere
della presenza di zone di abbeverata per gli animali quasi
costantemente inquinate dalle feci di questi e con delle fonti di
alimentazione immediatamente disponibili. [91]Queste zone di
riproduzione dei culicoidi sono facilmente risanabili quando sono
di piccole dimensioni e facilmente riconoscibili, ma diventano un
problema quando sono molto estese o quando sono inevitabili
senza una spesa superiore ai vantaggi che puo’ offrire. [91]

L’utilizzo di insetticidi ad ampio spettro e su larga scala


rappresenta un problema di tipo ambientale, ma alcune sostanze
come i piretroidi sintetici possono essere usati in maniera mirata
sia sulle strutture di ricovero che sugli animali stessi senza
eccessivi rischi per la salute degli animali e dei consumatori
grazie alla oro bassa tossicità per i mammiferi[91]. Inoculazioni di
ivermectina sottocute o endovena possono essere utili per
l’uccisione degli insetti pungitori. [91] Un ulteriore vantaggio di
queste sostanze come dell’additivo alimentare come il
tetrachlorvinphos è che vengono eliminati con le feci e possono
avere quindi un ulteriore effetto larvicida a livello dei siti di
riproduzione. [91]

56
L’applicazione di sostanze larvicide nei siti di riproduzione
ha un effetto lento ma duraturo e si dimostra un metodo efficace
anche in presenza di forti contaminazioni fecali. [91]I sistemi di
controllo biologico con agenti quali Bacillus thuringensis, si è
dimostrato per ora inefficace. [91]

Numerosi repellenti sono stati testati contro i culicoidi, ma


anche i migliori fra questi non hanno dimostrato di avere un
efficacia sufficientemente duratura da rappresentare un efficace
metodo di controllo. [91] Solo il Di- ethil- toluamide sembra
possedere una efficacia significativa di durata superiore alle 4
ore. [91]

VACCINI

I vaccini per le malatie virali sono spesso costituiti da virus


vivi attenuati o inattivati. La possibilita’ con questi vaccini di una
incompleta inattivazione del virus o di una rivirulentazione di un
ceppo attenuato costituisce un problema concreto. Queste
considerazioni sono particolarmente vere per virus come la BT,
ad alta capacita’ ricombinante e a genoma segmentato. In
queste circostanze un animale vaccinato puo’ essere infettato da
un altro sierotipo virale e questo potrebbe condurre alla
comparsa di una nuova variante virale [111]. In aggiunta a cio’
alcuni vaccini vivi possono conservare alcune delle loro capacita’
patogene, ad esempio possono avere proprieta’ teratogene o
aborigene. Vaccini costituiti da subunita’ proteiche virali hanno
dimostrato di possedere attivita’ antigenica ma solo a dosi molto
superiori rispetto ai vaccini vivi. La necessita’ quindi di produrre
quantita’ molto elevate di queste proteine porta in generale ad
un maggior costo di questi vaccini che nel caso della prevenzione
in campo veterinario si scontra con il necessario rapporto costo
della prevenzione- valore dell’animale.

57
Un tipo particolarmente efficace di particella virale
utilizzata per la produzione di vaccini spenti sono le particelle
simil virali, che riproducono la struttura dell’intero virione senza
la presenza di genoma virale infettante.[125, 123] La sintesi di
queste particelle nasce dall’osservazione che le proteine virali
una volta sintetizzate tendono ad aggregarsi spontaneamente
nella struttura tipica del capside virale. [125, 123] Generalmente
le particelle simil-virali stimolano sia la risposta anticorpale che
quella cellulo-mediata, in particolare i CD4 e i linfociti T
citotossici. [125, 123] Per la sintesi di particelle simil-BTV viene
comunemente utilizzato un sistema a baculovirus che consente
alti livelli di produzione con pochi rischi di tipo sanitario [146,
127, 125, 123]. Per la BT e’ stato elaborato un sistema che
consente la sintesi contemporanea di VP2, VP3, VP5 e VP7 dallo
stesso genoma di baculovirus nella stessa cellula[146,127, 125,
123]. Gli studi effettuati su vaccini prodotti utilizzando questa
tecnica hanno dimostrato la loro piena efficacia anche a basse
dosi (10 µg), ed inoltre hanno dimostrato efficacia non solo
contro il sierotipo vaccinale ma anche parziale protezione nei
confronti di sierotipi correlati[146,127, 125, 123]. Sembra inoltre
che forniscano una protezione di lunga durata (14 mesi)
[146,127, 125, 123]. Confrontando l’efficacia di varie tipologie
vaccinali si e’ visto che mentre la vaccinazione con 100 µg di VP2
forniva una protezione solo parziale, vaccinazioni con VP2 e VP5
combinate fornivano protezione completa con rispettivamente 50
e 25 µg, mentre vaccinazioni con particelle simil virali davano lo
stesso tipo di protezione con soli 10 µg.[146, 103, 125,123] La
sicurezza del vaccino è dovuta sia all’assenza di acido nucleico
all’interno delle VLP sia al fatto che il baculovirus non replica su
cellule di mammifero[146, 125, 123]. L’efficacia è correlata alla
presentazione degli stessi epitopi presenti nel virus originale
[146, 40, 125, 123].

58
Sfruttando il fatto che tra i differenti sierotipi esistono in
alcuni casi strette correlazioni, la procedura sopracitata potrebbe
permettere di riunire particelle virali con un più ampio spettro
antigenico, in maniera tale da ridurre il numero dei sierotipi virali
da incorporare nel vaccino[146, 125, 123].

In aggiunta a cio’ la capacita’ delle proteine simil-virali di


stimolare la risposta cellulo mediata, ha suggerito il loro impiego
come molecole carrier per epitopi di altri virus.[103, 125]

Vari tipi di vaccini sono stati sperimentati per il controllo


della Blue Tongue soprattutto nelle aree endemiche, prima
vaccini atteuati o inattivati, poi vaccini a DNA ricombinante. Allo
stato attuale esistono in commercio due soli tipi di prodotti
immunizzanti nei confronti del BTV: vaccini attenuati e inattivati
o spenti. E’ disponibile anche un vaccino monovalente
sull’efficacia del quale pero’ ci sono ancora pochi dati
sperimentali disponibili. La poca letteratura a riguardo riporta
buoni livelli immunitari se il vaccino viene conservato ad
adeguate temperature, in particolare risulta perdere gran parte
della sua efficacia se mantenuto a 35°C per alcune ore. Per lo
stesso vaccino, studi di campo effettuati in italia durante le
campagne di prevenzione, hanno segnalato viremia post-
vaccinale a basso titolo.[48]

Per quanto riguarda i vaccini polivalenti, quelli cioe’che


possono dare una copertura per piu’ di un sierotipo, sono stati
sperimentati con successo, specialmente quelli formati da VP2 di
un numero limitato di sierotipi; i quali dimostrano una certa
cross-reattivita’[146].

Il primo vaccino prodotto con tre sierotipi, attenuati con


passaggi seriali su uova embrionate, fu utilizzato in Sud Africa
nel 1947.

59
L'attuale individuazione di 24 sierotipi crea difficoltà per
I'immunizzazione degli animali. Il vaccino attualmente utilizzato
nell'Africa australe contiene 15 sierotipi, raggruppati a seconda
della loro patogenicità residua per la pecora e somministrati in
tre dosi pentavalenti a tre settimane di intervallo l'una dall'altra. I
tipi virali maggiormente attenuati sono somministrati con la
prima dose, mentre quelli meno attenuati con la terza. I sierotipi
sono anche selezionati e incorporati nel vaccino sulla base della
loro predominanza nel vettore.

I vaccini vivi attenuati (ALV) hanno un’ottima efficacia nel


controllare la sintomatologia clinica. E' necessaria un'unica dose
affinché la stimolazione antigenica sia capace, attraverso la
replicazione del virus negli animali vaccinati a conferire una
protezione completa nei confronti di BTV del medesimo sierotipo.
Per ottenere questi risultati è necessario un bilanciamento tra
l'attenuazione della virulenza e la capacità di replicazione negli
animali. I costi di produzione sono contenuti e, attualmente, sono
i prodotti immunizzanti maggiormente impiegati nella profilassi
verso BTV.

I problemi maggiori riscontrati a seguito dell'utilizzazione


degli ALV possono essere ricondotti a:

1. Possibilità di attività teratogenica e aborto [38];

2. Presenza del virus attenuato nel seme e nel sangue,


in fase viremica, di bovine vaccinate [38];

3. La possibilità di trasmissione di ceppi attenuati


attraverso insetti vettori, benche’ gli studi a proposito siano
contrastanti[3, 36], cui consegue:

3.1. la possibilità di trasmettere in presenza di ceppi


teratogeni il virus da animali vaccinati ad animali non vaccinati

60
3.2. la liberazione di virus vivi nell'ambiente con
possibilità di reversione della virulenza

4. Sierotipo vaccinale e selvaggio di BTV, se presenti


contemporaneamente, possono facilmente, in conseguenza delle
caratteristiche del genoma virale, dare luogo ad una
ricombinazione genetica da cui derivano virus con caratteristiche
genetiche e di conseguenza biologiche, nuove, frutto della
combinazione casuale tra i virus parentali. [38, 111]; la virulenza
e la trasmissibilità di questi ultimi virus è assolutamente
imprevedibile.

Bisogna pero’ ricordare che in zone indenni, l’introduzione


di ceppi antigenici estranei potrebbe essere nociva per una
buona riuscita dei piani di controllo.[44]

Molto discussa e’ la possibilita’ che i vaccini attenuati


possano provocare aborti e malformazioni fetali in pecore
gravide.

Per questi motivi e’ essenziale disporre dei piani di


monitoraggio capaci di discernere gli animali che presentano
anticorpi vaccinali da quelli che sono venuti in contatto col ceppo
di campo[2, 3].

Sembra che un unico passaggio in coltura cellulare possa


causare delle mutazioni del virus selvaggio tali da diminuirne
sensibilmente la virulenza. Dall’altro lato sembra che lo stesso
passaggio in coltura possa favorre la comparsa di mutanti capaci
di attraversare la barriera placentare[6]

Una ricerca effettuata inoculando pecore gravide a


differenti stadi di gestazione con un vaccio attenuato del
sierotipo 23 ha dato i seguenti risultati:

• A 35-43 giorni il 56% delle gravidanze ha avuto esito


negativo

61
• A 57-64 giorni il 30 % delle gravidanze ha avuto esito
negativo

• A 81-88 giorni il 30 % delle gravidanze ha avuto esito


negativo

• da 109 giorni in poi tutte le gravidanze sono state


portate a termine senza danno per il feto.

Un gruppo di controllo vaccinato con surnatante di coltura


cellulare non infetta ha avuto il 6.7% di gravidanze fallite.[37]

Sono stati provati vaccini inattivati (IV), ma finora i risultati


ottenuti sono stati insoddisfacenti. I maggiori problemi del
fallimento del loro sviluppo risiede:

1. nella possibilità di una incompleta inattivazione del


virus da utilizzare nel vaccino

2. nel costo elevato in raffronto agli ALV a causa del


numero di virus da utilizzare per ogni singola dose (fino a 100
volte maggiore)

3. alla necessità di ripetere il trattamento


immunizzante per 2 volte

Negli ultimi anni sono state sviluppate biotecnologie


concernenti l’uso di baculovirus per la produzione di vaccini privi
di metriele genetico. Queseti vaccini consistono in proteine virali
assemblate in particelle virioniche prive di acidi nucleici[6]

Differenti studi e sperimentazioni hanno fornito risultati


estremamente incoraggianti sull'efficacia di vaccini ottenuti
attraverso tecniche di ingegneria genetica.

DIAGNOSI

62
Per la coltivazione del virus possono essere utilizzate le
uova embrionate di pollo, nelle quali l'inoculazione deve essere
eseguita preferibilmente nel sacco vitellino, anche se
attualmente è preferibile l'utilizzazione delle colture cellulari
attraverso l'impiego di numerosi substrati: cellule VERO, cellule
amniotiche umane, rene fetale di bovino, surrene e testicolo di
vitello nelle quali il virus determina, quale effetto citopatico più
evidente, la formazione di placche.

Per poter sperare di contenere un focolaio di BT ed


impedirne la distribuzione ad ampi territori, e’ necessario
innanzitutto porre l’attenzione su una diagnosi precoce.[44]

Per fare cio’ bisogna prima di tutto disporre di servizi


veterinari ben inseriti nel territorio, con un numero adeguato di
personale preparato a riconoscere la patologia dai suoi primi
segni. E’ necessario inoltre attuare dei piani di sensibilizzazione
degli allevatori che li spingano a rivolgersi alle autorita’ sanitarie
ai primi segni di malattia. Infine e’ indispensabile disporre di una
rete di informazione il piu’ rapida possibile in modo che subito
dopo la segnalazione di u focolaio sia possibile far partire i piani
di emergenza sanitaria e di profilassi. In particolare questi
accorgimenti risulteranno quanto piu’ utili tanto piu’ il focolaio
sara’ a lenta diffusione e a bassa virulenza, o nel caso i sintomi
clinici siano segnalati negli allevamenti bovini.[44]

In seguito al segnalamento devono essere effettuati tutti gli


esami di laboratorio atti a confermare la presenza di BTV e alla
tipizzazione sierologia.[44]

In zone ad alta presenza di allevamenti esclusivamente


bovini puo’ rendersi utile introdurre delle greggi ovine sentinella
per poter monitorare la situazione epidemiologica, ricordando
pero’ sempre che i culicoides prediligono alimentarsi sui bovini

63
che sugli ovini. Meglio sarebbe, per questo motivo, stabilire dei
piani di sorveglianza sierologia sulle mandrie bovine, anche se
questo tipo di test riesce ad identificare i positivi slo 3-6
settimane post infezione, il che potrebbe rappresentare un
periodo di tempo tropp lungo per un intervento rapido.[44]

CONTROLLO

Nonostante i piani di controllo non possano che basarsi su


cio’ della patogenesi ed epidemiologia che gia’ e’ conosciuto, non
bisogna dimenticare che un virus ad alta potenzialita’
ricombinante e trasmesso da artropodi, puo’ trovare in zone
precedentemente indenni, nuove forme di propagazione e nuovi
pattern epidemiologici.[44]

Innanzitutto essendo un virus trasmissibile esclusivamente


attraverso la puntura di insetti vettori, si puo’ prescindere da
tutte quelle forme di profilassi che prevedano la disinfezione di
locali e mezzi, l’abbattimento in loco dei soggetti infetti e
recettivi, il seppellimento delle carcasse. Nel caso quindi si
decidesse un abbattimento di tutti i capi all’interno del focolaio, i
danni economici sarebbero comunque minori rispetto ad altre
patologie, ed in alcuni casi anche rispetto al mantenimento in
vita dei capi che, nel caso contraessero la malattia, vedrebbero
deprezzata la qualita’ delle carcasse.[44]

E’ importante anche attuare un serio piano di lotta al


vettore tramite l’impiego di insetticidi e la bonifica delle zone di
riproduzione.[44]

E’ inoltre auspicabile, ove possibile, ridurre le occasioni di


incontro tra il vettore e l’ospite, ad esempio spostando le greggi
in altura nel periodo di massima attivita’ del vettore [5,44] e/o

64
tenere gli animali al chiuso dal tramonto all’alba.[44]Inoltre e’
possibile proteggere i ruminanti tramite l’impiego di repellenti.
Tra questi risultano particolarmente efficaci i piretroidi di sintesi (
permetrina, deltametrina, flumetrina, ciflutrina,ecc.)in quanto
possiedono oltre a potere repellente, anche potere abbattente,
agiscono sia per contatto che per ingestione, hanno brevi o nulli
tempi di sospensione e persistono a lungo a livello cutaneo. Sono
inoltre utilizzabili le Avermectine che pur non avendo effetto
repellente, hanno effetto insetticida dopo ingestione, sebbene le
dosi raccomandate siano solitamente molto inferiori a quelle
efficaci[44, 54, 55, 42]. Le Avemectine potrebbero essere
utilizzate su bovini introdotti allo scopo nelle zone di pascolo per
diminuire la popolazione di vettori della zona[55]. Targhette
auricolari impregnate di fenvaleriato garantiscono una alta
protezione per tempi superiori al mese, e sono efficaci nel
proteggere anche i capi non direttamente trattati grazie alle
interazioni tra gli animali che permettono di diffondere il principio
attivo a tutto il gregge[53]

Puo’ essere utile, inoltre, limitare il movimento dei


ruminanti recettivi in un area di quarantena attorno al focolaio.
[44]

Un alto importante fattore da tenere in considerazione


quando si progetta un piano di controllo per la Ble Tongue e’ la
presenza di ruminanti selvatici potenzialmente recettivi nell’area
di interesse.[44]

Allo scopo di prevenire l’introduzione del virus in Australia il


governo di questo paese ha imposto delle severe restrizioni
sull’importazione di ruminanti vivi, di seme e ovuli dagli altri
paesi, ma ovviamente provvedimenti di questo tipo portano
benefici solo in nazioni nelle quali, per ragioni geografiche, e’
impossibile che il virus possa penetrare per altre vie.[43]

65
ANIMALI SENTINELLA

L'utilizzazione del bovino per la rilevazione del virus,


attraverso indagini indirette, deriva dalla preferenza dei
culicoides a nutrirsi su questa specie rispetto ad altri ruminanti
domestici. Gli animali devono essere collocati nelle aree a rischio
secondo modalità che prendano in considerazione le peculiarità
dei singoli territori, in modo tale da incrementare il più possibile
la probabilità di questi soggetti ad essere infettati per primi nel
caso di presenza di vettori contaminati. Il controllo sierologico
dovrà essere eseguito frequentemente soprattutto nei periodi più
critici, vale a dire quando la popolazione dei culicoides è attiva.
E' evidente che nella scelta degli animali dovranno essere
eseguite preliminarmente prove sierologiche atte ad escludere
una sieropositività nei confronti di BTV. Ciò assume notevole
importanza laddove l'utilizzazione dei bovini sentinella segua un
trattamento immunizzante eseguito in territori confinanti o nello
stesso territorio in cui sono presenti. L'impiego di questi animali
oltre che prevenire la diffusione di nuove infezioni in territori
indenni, consente di monitorare la dinamica che la patologia
assume nei Paesi dove l'infezione è presente e di definire, in
questo modo, una mappatura del territorio in funzione delle
mutevoli situazioni che si possono verificare.

LOTTA AL VETTORE

La lotta contro le larve va effettuata nei focolai dove è


presente l'infezione e possibilmente nel punto esatto dove vivono
le larve e cioè nell’acqua ai bordi delle pozzanghere o laghetti
inquinati da escrementi di animali (Figura 5). Possono essere

66
impiegati insetticidi poco tossici per gli animali come alcuni
piretroidi di sintesi. I trattamenti non sono totalmente efficaci e
vanno ripetuti periodicamente. E’ evidente che la strategia
migliore sarebbe quella di risanare i focolai larvali, prosciugando
quelli più densamente popolati dall’insetto oppure impedendo
l’accesso diretto agli animali nelle riserve d’acqua mediante
l’utilizzazione di abbeveratoi. Infatti, condizione essenziale per lo
sviluppo dell’insetto è la presenza ai bordi del laghetto di
escrementi che arricchiscono di sostanza organica le riserve
d’acqua.

La lotta degli adulti non deve essere condotta in maniera


generalizzata, perché i trattamenti su tutta la superficie
aziendale potrebbero determinare gravi problemi di
inquinamento ambientale e di residui pesticidi nella carne e nel
latte. Inoltre, come già detto, gli adulti si trovano in generale
vicino agli animali, pertanto devono essere trattati, con piretroidi
di sintesi registrati, esclusivamente i ricoveri degli animali e in
particolare le pareti interne ed esterne degli ovili. Questo
trattamento può esercitare un’azione adulticida attraverso il
contratto degli adulti sulle superfici trattate. Gli animali possono
essere protetti con il ricovero notturno in ambienti isolati con
zanzariere (meglio se trattate con insetticida) oppure mediante
trattamenti direttamente sul corpo, con prodotti registrati allo
scopo, a base di piretroidi in soluzione oleosa. L’intervento va
effettuato sul dorso di pecore e vacche, zona di elezione per
l’attacco del Culicoides e va ripetuto periodicamente. La lotta al
Culicoides è molto difficile e nessuna delle tecniche proposte è
sufficiente da sola a controllare il vettore. Pertanto, il controllo
dell’insetto deve essere condotto secondo i principi della lotta
integrata, non facendo affidamento su un’unica tecnica ma
impiegando tutte quelle disponibili in maniera coordinata. E’
evidente che ciò si potrà raggiungere con il coinvolgimento
diretto degli allevatori che meglio di tutti conoscono la realtà

67
aziendale e che possono fare molto per migliorare le condizioni
igieniche degli animali che sono sicuramente il fattore principale
delle abbondanti popolazioni di Culicoides riscontrati dappertutto
[6].

IMMUNIZZAZIONE

L'Office International des Epizooties (OIE) ha classificato


questa malattia nel gruppo A che comprende tutte le patologie
più importanti in quanto malattie trasmissibili, di particolare
gravità ed altamente diffusibili tanto da estendersi oltre i confini
nazionali, con gravi conseguenze socioeconomiche e sanitarie e
di notevole rilievo per i riflessi negativi che comportano nel
commercio degli animali e dei prodotti da essi derivati.

L'OIE riporta le norme zoosanitarie internazionali in un


codice sanitario che dedica alle differenti patologie indicate nelle
liste A e B degli appositi capitoli che indicano le norme verso le
quali tutti i Paesi membri devono attenersi. In particolare il
capitolo 2.1.9 è dedicato alla Blue Tongue. Verranno di seguito
sinteticamente riportate le misure di profilassi indicate nei
differenti articoli del capitolo inerente la BT:

Articolo 2.1.9.1

Il periodo di infettività del virus della BT è di 100 giorni.

68
L'area di distribuzione geografica è compresa
approssimativamente tra le latitudini 40°N e 35°S.

In caso di assenza di segni clinici in Paesi o zone del mondo


comprese entro le latitudini sopra indicate, lo stato del Paese o
della zona, rispetto alla BT, dovrà essere determinato per mezzo
di un programma di vigilanza e monitoraggio continuo che
prenda in considerazione i seguenti punti:

• Visita clinica precoce dei capi sospetti di infezione

• Isolamento dell'agente patogeno e prevalenza


dell'infezione

Il programma di vigilanza dovrà inoltre comprendere:

• Inchieste a carattere scientifico

• Campionamenti e test di animali negli allevamenti, nei


mercati e nei macelli

• L'inserimento, nel territorio, di animali sentinella

• La ricerca del virus nei vettori

• L'archiviazione dei risultati per una analisi


epidemiologica retrospettiva

Ed inoltre la descrizione delle caratteristiche della


popolazione recettiva presente nel territorio e la valutazione dei
fattori ambientali

In sintesi, il programma di vigilanza deve prendere in


considerazione le caratteristiche epidemiologiche della malattia,
focalizzando l'attenzione verso i fattori climatici e geografici, la
caratteristiche biologiche dei culicoides e/o prove sierologiche da
eseguire negli animali sensibili.

69
Il programma può essere indirizzato a regioni o zone del
Paese esposte ad un maggior rischio in funzione di fattori storici,
geografici, climatici, informazioni relative alla popolazione dei
ruminanti o dei culicoides, o la prossimità di alcune regioni a
zone enzootiche o a rischio di incursione di vettori.

Quanto indicato deve essere applicato anche in quei Paesi


o zone confinanti con Paesi non indenni dalla BT. In quest'ultimo
caso il programma di sorveglianza dovrà comprendere una
distanza di almeno 100 Km. dalla frontiera.

Articolo 2.1.9.2 (Paesi o zone indenni)

Possono essere considerati indenni I Paesi o le zone nelle


quali la denuncia di malattia è resa obbligatoria ed inoltre:

1. Se l'intero Paese o la zona sono collocati al Nord del


40° grado di latitudine N. ed al sud del 35° di latitudine S. e non
sono confinanti con Paesi o zone non indenni.

2. Se il programma di vigilanza descritto nel


precedente articolo ha dimostrato assenza di infezione da BTV
degli ultimi due anni e nessun ruminante è stato vaccinato verso
il virus di questa malattia negli ultimi dodici mesi.

3. Se il programma di vigilanza ha dimostrato l'assenza


di culicoides nel Paese o nella zona.

Un Paese o zona indenne non potrà più essere considerato


tale se si importano animali sieropositivi o infetti , sperma ovuli
od embrioni da Paesi o zone infette.

Un Paese o zona indenne adiacente ad uno dove è


presente la patologia deve essere sottoposto ad un controllo di

70
vigilanza permanente. Tale zona deve essere ben definita in
funzione di fattori geografici e epidemiologici correlati con il BTV.

Articolo 2.1.9.3 (Zone stagionalmente liberi da BTV)

Una zona stagionalmente libera dal BTV è una parte di un


Paese o di una zona in cui è presente l'infezione nella quale la
vigilanza e la sorveglianza continua dimostrano l'assenza,
durante un periodo dell'anno, di trasmissione del BTV o di
culicoides adulti.

La zona è ritenuta libera dal BTV a partire dal giorno


seguente l'ultima segnalazione di trasmissione del BTV (indicato
dal programma di vigilanza permanente) o dalla cessazione
dell'attività dei culicoides adulti.

Il periodo durante il quale la zona è libera dal BTV termina


quando:

1. Almeno 28 giorni prima che il BTV faccia la sua


prima apparizione secondo i dati storici o, in alternativa,

2. Immediatamente se le condizioni climatiche o i dati


che derivano dal programma di sorveglianza permanente
indicano una ripresa precoce dell'attività dei culicoides.

Una zona stagionalmente libera da BTV, nella quale la


vigilanza permanente ha dimostrato la assenza di vettori del
virus, non potrà essere considerata tale se importa animali
sieropositivi o infetti, sperma o ovuli/embrioni da Paesi o zone
infette.

71
Articolo 2.1.9.4 (Paesi o zone infettate da BTV)

Vengono definiti Paesi o zone infette da BTV territori


chiaramente definiti nei quali è stata segnalata la presenza del
virus durante gli ultimi 2 anni.

Articolo 2.1.9.5

Le Autorità veterinarie nazionali dovranno valutare se il


Paese è a rischio di infezione da BTV accettando o meno
l'importazione o il transito da altri Paesi nel territorio nazionale
delle seguenti merci:

 Ruminanti ed altri erbivori sensibili al BTV

 Seme di queste specie

 Embrioni o ovuli di queste specie

 Materiale patologico e prodotti biologici provenienti


da queste specie

Sarà inoltre valutata la assenza di rischio di diffusione del


BTV attraverso tutte le altre merci oggetto di commercio
internazionale.

Dalle norme zoosanitarie internazionali dell’Office


International des Epizooties (OIE) deriva una differente modalità
nell'esecuzione della profilassi in funzione del territorio nel quale
la patologia è o può essere presente.

Nei Paesi indenni la profilassi è solo igienico - sanitaria e si


basa sui seguenti punti:

72
 divieto di importazione di animali di specie recettive
e loro prodotti da Paesi in cui è presente la malattia

 disinfezione e disinfestazione dei mezzi di trasporto


proveniente dagli stessi Paesi

 quarantena degli animali esotici recettivi destinati


agli zoo.

La quarantena nel Paese esportatore e di destinazione


deve aver luogo in locali a prova di insetto. Quando un Paese pur
indenne è ad alto rischio di introduzione della patologia devono
in aggiunta ai precedenti punti essere prese in considerazione
ulteriori misure di prevenzione quali:

 Un piano di sorveglianza sierologica a sua volta


basato:

 sull’utilizzo di una rete di bovini sentinella da


sottoporre a regolari controlli sierologici;

 sul monitoraggio dei vettori e della loro diffusione.

Gli animali sentinella devono essere controllati


periodicamente e frequentemente al fine di verificare
sieropositività negli stessi prima che la patologia possa
diffondere nel territorio.

Il monitoraggio dei vettori e la diffusione degli stessi si


effettua attraverso un piano di sorveglianza entomologica per
determinare la distribuzione geografica dei culicoides al fine di
definire delle mappe di rischio che, sulla base di modelli di
simulazione, siano in grado di rappresentare l'effetto delle
condizioni ambientali e delle loro interazioni sulla densità e sulla
dinamica delle popolazioni di vettori.

73
In caso di focolaio in un Paese precedentemente indenne si
deve procedere all'abbattimento degli animali nel focolaio, al
blocco della movimentazione animale e stabilire una zona di
protezione con un raggio di almeno 100 km, tenendo conto delle
barriere naturali. Vanno quindi espletate tutte le azioni di lotta
attraverso l'applicazione di differenti strategie che variano in
funzione di numerosi fattori (popolazione di animali recettivi,
distribuzione degli stessi nel territorio, specie presenti nel
territorio e loro diffusione, popolazione dei culicoides, presenza di
uno o più sierotipi ecc.)

In linea generale possono essere adottate le seguenti


misure:

 Lotta al vettore (attraverso l'utilizzazione di


insetticidi da utilizzare sugli animali o in aree dove vivono gli
insetti, repellenti per gli insetti da utilizzare sugli animali)

 Divieto di movimentazione animale dalle aree


infette al fine di evitare la diffusione della malattia in zone nelle
quali i vettori non sono infettati

 Utilizzazione di vaccini che possono ridurre la


sintomatologia negli animali infettati e le perdite economiche
correlate alla malattia

Nei paesi dove la BT è endemica, la lotta al vettore trova


applicazione limitata ed indirizzata esclusivamente ad aree
ristrette. La malattia è difficile da controllare, sia perché
l'infezione può avere un decorso inapparente in molte specie
animali, sia perché la stabulazione non è di pratica applicazione
con la specie ovina. L'unica reale alternativa a disposizione degli
allevatori è la vaccinazione.

74
Diagnosi

Diagnosi clinica

La diagnosi clinica si basa sull’osservazione della comparsa


dei sintomi di malattia nella stagione favorevole all’attività dei
vettori. La presenza di manifestazioni cliniche caratteristiche,
come febbre elevata, scialorrea, edema, cercinite, rinite,
infiammazione della mucosa orale, e delle lesioni anatomo-
patologiche della malattia, la diagnosi non è difficile. Nel caso di
animali che presentino forme sub-cliniche o negli animali in fase
di guarigione la diagnosi può essere più difficoltosa. E’ inoltre
opportuno effettuare una diagnosi differenziale con altre malattie
come, nel caso degli ovini:

• vaiolo ovino

• fotosensibilizzazione

• infestazione da Oestrus ovis

• avvelenamenti da piante

• eczemi facciali

• afta epizootica

• Stomatite micotica

• infezione da EHDV

75
• peste dei piccoli ruminanti

• polmoniti

• cenurosi

• malattia di Akabane (in caso di aborti e deformazioni


fetali)

• salmonellosi

• ectima contagioso

• emoncosi acuta (con depressione ed edema


sottomandibolare)

• poliartriti

• laminiti dovute a pedaina

• ascessi e altre affezioni del piede

Nel bovino, nei rari casi di manifestazione clinica della


malattia, occorrerà differenziarla da peste bovina,

• peste bovina

• afta epizootica

• BVD/MD

• febbre catarrale maligna

• IBR

• Fotosensibilizzazione

• Avvelenamenti da piante

76
DIAGNOSI DI LABORATORIO

TECNICHE DI CAMPIONAMENTO

Per la diagnosi definitiva di infezione da BTV, soprattutto


nelle forme subcliniche, si ricorre spesso a tecniche di laboratorio
volte all’isolamento del virus e alla dimostrazione della presenza
di antigeni virali e acidi nucleici o di anticorpi specifici[1]. A tale
scopo possono essere effettuati dei prelievi ematici, con
particolare interesse per la frazione eritrocitaria, dagli animali in
periodo febbrile, oppure di campioni di seme di animali durante il
picco della viremia o ancora per biopsia di vari tessuti da animali
infetti o feti abortiti [1].

Per quanto riguarda i campioni ematici bisogna sempre


tenere in considerazione che il virus si trova sempre
strettamente associato ai globuli rossi, sequestrato al loro interno
o associato alle invaginazioni di membrana, protetto dagli
anticorpi e da altri meccanismi immunitari finche’ non avviene la
naturale degradazione dell’eritrocita[1].La fase viremica, che
generalmente coincide con il periodo febbrile e precede la
sieroconversione e la comparsa di anticorpi neutralizzanti, e’ un
fenomeno transitorio a meno che l’animale non venga esposto ad
un nuovo siertipo virale[1].

I campioni ematici ottenuti dovrebbero essere sottoposti a


lavaggio per centrifugazione, per evitare che eventuali anticorpi
neutralizzanti presenti nel siero possano rendere vana la
procedura, e infine lisati mediante sonificazione o aggiunta di
acqua distillata in modo tale da liberare la gran quota di virioni
che si lega alle invaginazioni della membrana protoplasmatica
delle emazie[1].

Sangue intero eparinizzato, sottoposto a lavaggio e


risospeso in PBS e’ il campione preferibile per l’isolamento del
BTV[1]. Anche il sodio citrato e’ un buon anticoagulante per

77
questo scopo[1]. Se non si può effettuare un congelamento dei
campioni è consigliabile la conservazione dei campioni in OPG
(ossalato-fenolo-glicerina) tra i 4 e i 10 °C,mentre se è possibile
effettuare il congelamento è opportuno conservarli a
temperature inferiori a -70 dopo averlo stoccato in un buffer di
peptone e lattosio o in DMSO[1].

Sono riportate solo leggere variazioni nel quantitativo di


BTV isolabile da sangue bovino infetto conservato come sangue
intero con EDTA o come componenti cellulari lavati conservati a
4°C o con aggiunta di 10%DMSO e congelate a -70°C[1].

Per isolare il virus da campioni di seme, si può procedere al


prelievo da animali in picco viremico con le comuni procedure
utilizzate per l’inseminazione artificiale[1]. E’ importante notare
che una volta preparato il campione di seme per l’inseminazione
artificiale, il virus si trova nelle condizioni ideali per diffondersi
anche a grande distanza[1]. I campioni di seme possono essere
utilizzati allo stato fresco oppure previo congelamento [1].
Tuttavia per evitare gli effetti citotossici si preferisce diluire il
seme in PBS prima dell’inoculo in uova embrionate o colture
cellulari[1].

Per dimostrare la presenza del virus si possono fare dei


prelievi di vari tessuti tra i quali è preferibile usare campioni
provenienti da milza, fegato, linfonodi, midollo osseo, cervello e
polmoni qualora il prelievo provenga da animali morti o feti
abortiti; dalle lesioni sulla mucosa dell’ apparato digerente e
respiratorio, dall’apparato vascolare, reticolo endoteliale e
scheletrico di animali infetti, e infine prelievi bioptici di mucosa
orale o pelle[1]. I piu’ adatti in senso assoluto sembrano essere il
midollo osseo femorale di animali infetti, il cervello fetale, e milza
e fegato di agnello[1]. Questi campioni vanno conservati
asetticamente a 4°C e trasportati a temperature di refrigerazione
e preparati in una sospensione al 10% di PBS in soluzione a ph

78
7,2. [1]. Il surnatante di una sospensione del 10% di tessuto
triturato in PBS e’ ugualmente un campione valido per
l’isolamento[1].

TECNICHE DI ISOLAMENTO

Per l’isolamento del virus possono essere usate uova


embrionale di pollo, colture cellulari oppure puo’ essere inoculato
il virus su ovini recettivi[1,47].

Le prime tecniche di isolamento su uova embrionale di


pollo prevedevano l’inoculazione nel sacco vitellino o nello spazio
corio-allantoideo[1,47].

Attualmente la procedura di routine per l’isolamento di


ceppi di campo del BTV prevede l’utilizzo di uova embrionale,
appartenenti a ceppi Spf (specific pathogen free), al decimo-
undicesimo giorno di incubazione inoculate per via intravenosa
con 0,1 ml di campione in soluzione e quindi incubate a
33,5°C[1,47]. L'embrione, che muore dopo 24 ore per azione del
virus, assume una colorazione rosso ciliegia in seguito alla
comparsa di petecchie diffuse[1]. Gli embrioni si possono usare
per l’evidenziazione diretta o per la semina di colture cellulari[1].
Questa tecnica consente una sensibilita’ ed un adattamento
molto migliori rispetto alle tecniche precedenti.[1,47]

L’inoculazione routinaria di sospensioni di organo dagli


embrioni infetti a colture cellulari esita solitamente
nell’adattamento in vitro del BTV[1,47].

Il primo tipo di coltura cellulare utilizzata per l’isolamento


di BTV fu il rene d’agnello[1]. Successivamente furono
sperimentate numerosi substrati differenti ed i piu’ adatti sono

79
risultati: BHK21 e VERO tra le colture provenienti da cellule di
mammiferi e C6-36 per quelle di insetti[1]. Generalmente non e’
raccomandato l’utilizzo di colture cellulari per l’isolamento diretto
di ceppi di campo, di solito si procede con l’inoculazione di
sospensione di organi dell’embrione infetto in coltura cellulare
adatta per consentire l’adattamento del BTV in vitro[1].

Piu’ recentemente alcuni studi hanno segnalato un’alta


sensibilita’ della line cellulare CPAE (calf pulmonary artery
endothelial) da endotelio di arteria polmonare di vitello che,
sempre secondo questi studi, sembrerebbe suscettibile sia ai
ceppi di campo che a quelli adattati in laboratorio, pero’ risultava
meno sensibile dell’uovo embrionato a basse dosi virali e
riconosceva la viremia per un periodo di tempo minore[1].

Altri studi riportano la possibilita’ di isolare ceppi vaccinali


direttamente da campioni ematici e tessuti di agnelli e feti ovini
infettati sperimentalmente, utilizzando l’FB4BM da cellule di
midollo osseo fetale bovino[1]. Questa possibilita’ e’ legata
anche al ricorso ad una soluzione tampone ipotonica per la lisi
degli eritrociti che ha minori effetti lesivi sulle particelle virali[1].

Possono essere usate anche cellule amniotiche umane,


rene fetale di bovino, surrene e testicolo di vitello nelle quali il
virus determina, quale effetto citopatico più evidente, la
formazione di placche.

Tali piastre di coltura vengono poste in incubazione a 37°C


con un atmosfera al 5% di CO2. L’evidenza della replicazione
virale esita in fenomeni citopatici e citolitici, che si estendono
rapidamente a tutte le cellule della coltura.

La prima evidenza della replicazione virale e’ la comparsa


nel monostrato cellulare di cellule rigonfie che presto si
distaccano dal monostrato per galleggiare nel medium di
coltura[1]. Entro uno-due giorni il processo citotossico si estende

80
a tutte le cellule[1]. Microscopicamente le colture infette rivelano
cellule con citoplasma granulare, nucleo picnotico,
frammentazione ed infine distruzione completa della struttura
cellulare[1]. Con la microscopia elettronica si possono
evidenziare corpi inclusi virali gia’ 4 ore post infezione, con
caratteristiche sia granulari che fibrillari, soprattutto in vicinanza
del nucleo[1]. Le uniche strutture BTV-specifiche trovate nelle
cellule infette sono strutture tubulari di 68 nm di diametro e
formate principalmente da NS1[1]. Per l’isolamento diretto da
ceppi di campo sembra che i qualche risultato si ottenga con
colture cellulari in monostrato coltivate in contenitori voluminosi
che permettano l’inoculazione di grossi quantitativi di materiale
patologico[1].

L’inoculazione in ovini recettivi rimane il piu’ sensibile ed


affidabile metodo di isolamento del BTV da ceppi di campo[1,47].
Gli ovini tollerano bene l’iniezione intravenosa di un grosso
volume (200-300 ml) di inoculum comprendente pool ematici
lisati, sospensioni di tessuti e omogeneizzati di insetti[1,47]. Le
pecore cosi’ infettate possono sviluppare sintomatologia clinica o
produrre anticorpi rilevabili con metodologie sierogruppo e
sierotipo specifiche[1,47]. Non c’e’ correlazione tra la quantita’ di
virus inoculata e la gravita’ dei sintomi clinici, ma sembra esserci
una correlazione negativa tra il quantitativo di inoculum ed il
tempo di persistenza della viremia[1 ,47]. Il vrus diviene
rintracciabile nel siero ovino al piu’ presto un giorno dopo
l’inoculazione, al piu’ tardi un mese dopo[47]. Le pecore vengono
infettate, per via endovenosa con 1 ml di una delle sospensioni
predisposte, sebbene siano in grado di tollerare l’inoculazione di
quantità molto maggiori[,47]. Tra il 4 ° e il 7° giorno
dall'inoculazione si ha la reazione febbrile; la comparsa e
l'intensità degli altri sintomi sono in relazione all'esposizione
degli animali ai raggi solari.

81
Oggi comunque questa tecnica e’ stata quasi del tutto
abbandonata a seguito dei successi nella metodica su uova
embrionale, che consente di ottenere, con l’inoculazione
intravenosa, titoli virali comparabili a quelli ottenibili con
l’inoculazione in ovini recettivi[1,47].

In alcuni casi sono stati utilizzati anche topini neonati di 2-3


giorni nei quali il BTV inoculato per via intracerebrale causa
letargia, atassia, prostrazione, coma e morte entro 2-5 giorni
post inoculazione[1].

TECNICHE DI IDENTIFICAZIONE

Dopo la fase di replicazione nei vari substrati è necessario


ricorrere a tecniche biochimiche per evidenziare la presenza del
virus.

Nonostante l’immunofluorescenza, la fissazione del


complemento e la sieroneutralizzazione restino, nella pratica, le
tecniche piu’ usate per la tipizzazione degli stipiti isolati, molti
studi hanno dimostrato come tecniche immuniistochimiche,
immunoenzimatiche e immunoelettromicroscopiche utilizzando
anticorpi monoclinali, risultano ugualmente rapide, sensibili e
specifiche[1]. Inoltre il miglioramento delle conoscenze sulla
struttura molecolare del virione, ha aperto la strada
all’ibridazione ed alla PCR[1].

Ricordiamo l’immunofluorescenza, ossia il legame dei


virioni del tessuto in esame con anticorpi anti –BTV specifici
legati a loro volta ad IgG anti anticorpo coniugate con delle
particelle fluorescenti, con questa tecnica non si riescono a
distinguere i vari sierotipi, viene percio’ per lo piu’ utilizzata per
la distinzione del BTV dal virus della malattia emorragica del
cervo, anche se iniziano ad essere prodotti alcuni anticorpi
monoclinali sierotipo specifici [1].

82
Un'altra metodica usata e’ la fissazione del complemento
che viene usata per la conferma dell’identificazione e per
individuare gli aumenti del titolo anticorpale dopo le infezioni
sperimentali[1]. Puo’ essere anche effettuato su tessuti e fluidi di
uova embrionate utilizzando siero iperimmune di animali da
laboratorio[1]. E’ stato anche dimostrato che il fluido di colture
cellulari infette puo’ essere usato come substrato per la
fissazione del complemento[1]. Questa metodica non e’ utile per
la distinzione di sierotipi diversi, ed anche come identificazione di
sierogruppi non e’ molto utilizzata, anche a causa delle difficolta’
di procedura e della necessita’ di utilizzare siero iperimmune[1].

Altri metodi efficaci sono le tecniche immunoenzimatiche,


in particolare l’ELISA[1].

Tra i metodi in nostro possesso per il riconoscimento di


anticorpi sierogruppo specifici, l’immunodiffusione in gel di agar,
e l’ELISA competitiva sono i piu’ utilizzati[1].

• l' ELISA indiretta. A partire dall’anni 80 si è cercato di


standardizzare le prove Elisa per la ricerca degli anticorpi anti-
BTV. I primi test si basavano su una metodica indiretta che,
sebbene dotata di una buona sensibilità, si scontrava con la
difficoltà di ottenere una buona specificità a causa della difficoltà
di purificare la produzione di anticorpi.

• l'ELISA competitiva. Questa prova sfrutta la capacità


degli anticorpi specifici anti-BTV di legarsi con gli antigeni
virali[1]. Si procede nel modo seguente, preso il siero da
esaminare si aggiungono antigeni virali noti ed in seguito un
siero specifico antimonoclonale cui è legato un substrato
cromogeno. In presenza di anticorpi nel siero da testare questi si
legheranno agli antigeni occupando i siti di legame. Dunque
l’assenza di reazione cromatica indica un siero positivo, invece la
risposta cromatica indica la disponibilità di siti di legame e
dunque l’assenza di anticorpi nel siero. Oltre all’elevata
83
affidabilità del test è importante sottolineare la disponibilità di kit
adatti ad evidenziare anticorpi di tutti i 24 sierotipi virali
conosciuti, inoltre la meccanica del test esclude la possibilità di
reazione crociata con virus antigenicamente correlati[1]. La
lettura dei risultati della prova con lo spettrofotometro esclude,
infine, errori d’interpretazione soggettivi. L'ELISA competitiva è
stata adottata dall'OIE come procedura di analisi ufficiale per
BTV.

In una fase ulteriore si procederà alla tipizzazione del


ceppo virale isolato.I tempi di analisi variano dalle 4 ore con
l'ELISA competitiva, ai 5 - 15 giorni per l'isolamento del virus in
colture cellulari con conferma mediante immunofluorescenza;
10-14 giorni se si utilizzano uova embrionate e 2- 3 settimane se
viene effettuata l'infezione sperimentale in pecore.

• Agid. L’immunodiffusione in gel di Agar è stata per


lungo tempo la prova di routine per l’identificazione degli
anticorpi della BTV per la facilita’ e rapidita’ di esecuzione[1] . Si
basa sulla migrazione in piastra di agarosio, nella quale vengono
scavati sei pozzetti, degli anticorpi presenti nel siero confrontati
con la migrazione degli anticorpi di un siero di controllo.
L’interpretazione si basa sulla posizione e nettezza della linea di
precipitazione. La prova è limitata nella sua praticità dalla
difficoltà ad ottenere degli anticorpi monoclonali purificati e dalle
difficoltà interpretative che causano specificita’ e sensibilita’ non
ottimali[1]. E’ stato inoltre dimostrato che sieri contenenti
anticorpi relativi ad altri orbivirus (EHDV) possano reagire dando
luogo ad interpretazioni falsamente positive[1]. E’ stata
soppiantata dall’ELISA per la sua maggiore praticità e specificità.

Le prove sierotipo specifiche sono: la sieroneutralizzazione


e 1' inibizione dell'emoagglutinazione. La prima si effettua su
piastra microtiter a 96 pozzetti, in cui il siero specifico si mette in
incubazione con colture cellulari. Tale test tuttavia si scontra

84
contro una serie di problemi di affidabilità e standardizzazione
che ne rendono l’utilizzo valido solo per monitoraggi
epidemiologici.[1] La seconda, descritta nel 1980, non è mai
entrata nell'uso corrente, poiché richiede per ciascun sierotipo un
antigene altamente purificato, che così preparato non risulta
stabile.

Tecniche di identificazione di antigeni ed acidi nucleici.

Benche’ i test sierologici siano generalmente affidabili e di


semplice esecuzione, spesso non sono in grado di riconoscere le
infezioni recenti, oppure di discernere tra animali ammalati e
animali guariti o vaccinati[11].

Tra le varie tecniche di immunoistochimica


l’immunoperossidasi consente di individuare la presenza di
antigeni virali in cellule fissate e tessuti animali. Inizialmente la
tecnica fu messa a punto per individuare gli antigeni virali negli
embrioni di pollo fissati, in seguito venne messa a punto una
metodica più avanzata, la perossidasi anti perossidasi.Questa
tecnica utilizza siero ovino anti-BTV come prima fonte di anticorpi
e si e’ dimostrato affidabile e specifico. Un'altra tecnica e’ quella
del complesso avidina-biotina che utilizza invece antisiero
cunicolo, che consente tra le altre cose di individuare con buoni
risultati gli antigeni in cervello di agnello autolisato. Nessuna di
queste metodologie da risultati paragonabili all’isolamento in
embrione di pollo.

Per ovviare a questo problema, nei laboratori specializzati è


possibile isolare il virus con la tecnica della PCR (reazione a
catena della polimerasi), che nello specifico dovendo replicare da
un Rna prevede una fase di retrotrascrizione ed in seguito la vera

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e propria replicazione dell’acido nucleico[2, 3, 7]. Sono state
anche sviluppate metodiche che con l’utilizzo di una trascrittasi
inversa permettono di effettuare una retro-PCR in un solo
passaggio[2, 3].Questa metodica consente, oltre alla possibilità
di identificare il virus a partire da varie tipologie di campioni,
anche una buona capacità di tipizzazione e la distinzione tra i
ceppi di campo e quelli vaccinali tramite l’analisi dei siti di
clivaggio, ed inoltre accorcia i tempi necessari per la diagnosi ad
appena 24 ore. [2, 3, 7, 11]. Con questa metodica il virus
vaccinale e’ individuabile nel sangue da 7 a 30 giorni post
inoculazione, quello di campo dai 3 giorni in poi [3].La PCR in
tutte le sue possibili varianti, e’ un test diagnostico di alta
sensibilità e specificità, in particolare se si aggiungono dei
controlli interni che permettano di individuare false negatività
dovute ad errori di campionamento[11].

Fattori climatici associati alla prevalenza della BT

Le fasce climatiche solamente associate con la presenza di


BT includono la zona equatoriale ( clima caldo umido per tutto
l’anno), la zona tropicale (clima caldo tutto l’anno con stagioni
secche e stagioni umide), zone aride (clima caldo e secco), zone
semiaride (clima caldo con precipitazioni scarse), zone
subtropicali secche (estate calda e secca, inverno fresco), zone
subtropicali umide (estati calde e umide, inverni freschi), zone
continentali umide (estati calde e inverni freddi) [130]. E’ stata
documentata piu’ volte l’associazione tra la temperatura e
l’abbondanza e distribuzione delle specie di Culicoides a livello
mondiale, ciò significa che e’ evidente una correlazione, seppure
indiretta, tra questo parametro climatologico e la prevalenza
della BT nelle varie aree. [151]. Generalmente i Culicoides non
sono considerati attivi ed in grado di riprodursi a temperature
inferiori ai 13°C o superiori ai 35°C. [151, 130]. La temperatura
massima esplica il suo effetto sulle popolazioni di vettori tramite
un aumento della mortalità. [151]. A temperature ancora

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superiori ci si aspetta un aumento proporzionale dei tassi di
mortalità. [151]. Un altro fattore importante e’ l’umidità e la
quantità e distribuzione delle precipitazioni nelle aree in esame,
anche se e’ bene ricordare che l’umidità necessaria per la
moltiplicazione dei culicoides può provenire da fonti diverse dalle
precipitazioni (canali di irrigazione, corsi d’acqua, pozzi).
[151,130].Comunque nelle zone in cui le precipitazioni si sono
dimostrate un fattore significativo sull’incidenza della BT, i valori
minimi annuali richiesti variavano tra i 750 e i 1000mm. [151].
Un altro importante fattore e’ rappresentato dalla velocità e
direzione del vento, in particolare per quanto riguarda la
distribuzione dell’infezione ad aree indenni o incursive. [130,
151, 131] A velocita’ eoliche più alte della normale velocità di
spostamento del vettore e’ infatti possibile un volo passivo lungo
le correnti d’aria per tratti lunghi fino a 700km. [130,131] Per
garantire la sopravvivenza del vettore, il volo deve avvenire
entro correnti d’aria di temperatura compresa tra i 13 e i 35 °C,
condizioni che si possono ritrovare fino ad un altitudine di 1,5
km. [130] La velocità di questi venti può variare tra i 10 e i 40
km/h ed in alcune tempeste tropicali ache superiori. [130] In
alcuni casi i movimenti dei culicoides sono stati messi in
relazione con i movimenti della zona di convergenza
intertropicale, tempeste tropicali, venti caldi da zone subtropicali
a zone più alte, ed altre correnti d’aria di temperatura
adatta[151, 130]. L’inizio del volo puòavvenire per movimento
degli insetti o per correnti calde ascensionali, cosi’ come
l’atterraggio può essere dovuto ad una discesa attiva dei
culicoides come ad un improvviso calo del vento o un ostacolo
alla corrente. [130]

DISTRIBUZIONE DEI SIEROTIPI

BTV1 Sud Africa (’58) India(’99), Egitto [132]

BTV2 Sud Africa (’58 e ’99), Cina (’96)

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BTV3 Cipro (’44) e Sud Africa (’99)

BTV4 Sud Africa (1900 e’99), Turchia (’77)[131], Cipro (’67)


[132], Israele [132] Egitto [132]

BTV8 Sud Africa (’37 e ’99)

BTV10 Israele [132] Egitto [132]

BTV11 Sud Africa (’44 e ’99), USA

BTV12 Cina (’96), Israele [132] Egitto [132]

BTV13 USA

BTV15 Cina (’96)

BTV16 Cina (’96) Israele [132] Egitto [132]

BTV17 USA

BTV18 India (’99)

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