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L'ACIDO CITRICO E IL SUO RUOLO NELLA

BIOLOGIA E NELLA BIOTECNOLOGIA


Elaborato per l'Esame di Stato 2019/2020
di Joel Niciak
Il ciclo di Krebs viene anche detto ciclo dell’acido citrico, proprio perché quest'ultimo è l’intermedio di
reazione più biologicamente rilevante che troviamo sulla strada di questo processo metabolico.

Nel corso delle righe che seguono andremo ad analizzare proprio il processo biologico nel quale questo
composto viene prodotto, per poi analizzare la sua importanza come regolatore allosterico della glicolisi
(allargando poi il concetto ai generali fattori di regolazione
dell’attività enzimatica) e successivamente finire con considerazioni
sul processo industriale biotecnologico che interessa la produzione
dell’acido citrico e i suoi possibili utilizzi, specialmente nel settore
alimentare.

IL CICLO DI KREBS
Questo processo ha il compito di produrre energia attraverso l’ossidazione di Acetil-CoA (ovvero una
molecola ottenuta tramite il catabolismo di carboidrati, lipidi e proteine). Si ottiene questa energia
fosforilando molecole di GDP e producendo NADH + H + e FADH2 (che serviranno poi nella catena di
trasporto degli elettroni o catena respiratoria).

Le reazioni che lo compongono sono 8 e vengono ripetute ciclicamente:

1) Formazione del citrato: questa reazione viene catalizzata dall’enzima citrato sintasi. Consiste
nella reazione tra una molecola di Acetil-CoA ed una di ossalacetato a formare una molecola di
Acetil-CoA-Ossalacetato (intermedio di reazione) che poi rilascia il Coenzima A grazie all’ingresso
nella reazione di una molecola d’acqua, formando così il citrato (che altro non è in realtà che la
forma ionizzata dell'acido citrico, quella che generalmente va a formare i sali di questo acido).

2) Formazione dell’isocitrato: catalizzata dall’enzima aconitasi, questa reazione prevede


l’isomerizzazione del citrato a isocitrato attraverso la perdita e la successiva riacquisizione di una
molecola d’acqua (essenzialmente si tratta dello spostamento di un gruppo ossidrile dal carbonio 3
al carbonio 4)

3) Formazione dell’α-chetoglutarato: in questo passaggio accadono due cose:


a) Viene ridotta una molecola di NAD+ in seguito all’ossidazione del gruppo -OH del carbonio 4
grazie alla catalisi data dall’isocitrato deidrogenasi ( formando NADH + H+ che verrà
successivamente utilizzato per la catena respiratoria)

b) La molecola rimanente, ovvero l’intermedio di reazione (ossalsuccinato), viene decarbossilata


(ovvero privata del gruppo COO- che viene rilasciato sotto forma di CO2).

Ciò che ne risulta è l’α-chetoglutarato.

4) Formazione del succinil-CoA: a questo punto l’α-chetoglutarato perde un ulteriore molecola di CO 2


per legare invece nuovamente il Coenzima A che era stato eliminato durante la prima reazione. A
catalizzare la decarbossilazione è l’enzima α-chetoglutarato deidrogenasi, che agisce grazie anche
all’aiuto del NAD che viene ridotto a NADH + H +. Il prodotto finale di questa reazione è il succinil-
CoA.

5) Formazione del succinato: questo passaggio segna l’inizio della seconda fase del ciclo di Krebs. Qui
un fosfato inorganico si lega al posto del Coenzima A per poi essere ceduto ad una molecola di GDP,
formando una molecola di GTP (equivalente dell’ATP) e una di succinato. Il tutto viene reso
possibile dall’enzima succinil-CoA sintetasi.
6) Formazione del fumarato: qui il succinato perde due atomi di idrogeno (grazie all’enzima succinato
deidrogenasi), che vanno a ridurre una molecola di FAD (generando FADH 2). Ne risulta una
molecola di fumarato.

7) Formazione del malato: una molecola d’acqua entra nella reazione aggiungendo un gruppo
ossidrile (-OH) al carbonio in posizione 2 e un atomo di idrogeno al carbonio in posizione 3
formando così il malato (la catalisi è ad opera dell’enzima fumarasi).

8) Formazione dell’ossalacetato: questa è la reazione finale di tutto il processo. La molecola di malato


viene ridotta dall’enzima malato deidrogenasi mentre una molecola di NAD+ viene ridotta.
Otteniamo quindi l’ossalacetato, che verrà riutilizzato nella prima reazione.

L’Acetil-CoA utilizzato dal ciclo di


Krebs viene ottenuto in diversi modi,
come ad esempio alcuni processi di
deamminazione e/o
transamminazione di amminoacidi o
ancora dal metabolismo degli acidi
grassi, ma il principale è la
decarbossilazione ossidativa del
piruvato, prodotto finale della
glicolisi. Il piruvato, quando presente
in quantità abbondante, passa
facilmente nel mitocondrio dove,
tramite la decarbossilazione
ossidativa, appunto, viene
trasformato in Acetil-CoA ed entra
nel ciclo di Krebs.

Il ciclo di Krebs ha attività anfibolica, ovvero è un processo che presenta sia una componente catabolica
(quella che abbiamo appena analizzato) che una componente anabolica. Molti degli intermedi che abbiamo
citato, infatti, sono precursori di molecole più complesse o hanno determinate funzioni biologiche
all’interno della cellula.

Di questi composti andremo ad analizzare il citrato e la sua funzione di regolatore allosterico nella glicolisi.

FATTORI DI REGOLAZIONE DELL’ATTIVITA’ ENZIMATICA

Sono meccanismi che agiscono sugli “enzimi regolatori”, ovvero enzimi particolari che catalizzano alcuni
passaggi delle principali vie metaboliche. Questi “checkpoint” servono per poter ottimizzare l’utilizzo delle
risorse energetiche sulla base della necessità della cellula, ovvero a fermare i processi metabolici nel
momento in cui si rendono non più necessari e a farli riprendere nel caso contrario. Un primo livello di
regolazione è rappresentato dalla variazione dei parametri ambientali (gli enzimi sono suscettibili a
cambiamenti di pH, temperatura, ecc.), ma ne esistono di altri tipi:
1) Enzimi allosterici:

questo meccanismo si basa su altre molecole dette modulatori, ovvero composti che legandosi ad
un sito specifico dell’enzima detto sito
allosterico inducono una variazione
conformazionale (ovvero una modificazione
della struttura terziaria della catena peptidica
che costituisce l’enzima) che rende il sito attivo
più (modulatori positivi) o meno (modulatori
negativi) affine al legame con il substrato. I
prodotti e/o i reagenti possono talvolta
fungere essi stessi da modulatori.

2) Modificazione covalente:
a sua volta si suddivide in:

a) Reversibile: che consiste nell’aggiunta di un


piccolo gruppo chimico (fosfato, acetile, metile,
ecc.) all’enzima, il che modifica l’attività di
quest’ultimo (sempre tramite un cambio di
struttura(?))

b) Irreversibile: ovvero la rimozione di un ridotto


quantitativo di amminoacidi dalla catena
polipeptidica per idrolisi di specifici legami Uno schema rappresentativo della
peptidici. Ne risulta una diversa conformazione e modificazione covalente reversibile di
proprietà differenti. un enzima

3) Isoenzimi:
questi enzimi sono tutti diversi tra di loro (anche si assomigliano) ma catalizzano la stessa reazione.
Differiscono gli uni dagli altri per le proprietà cinetiche, per la distribuzione nell’organismo e per la
struttura quaternaria (ergo, ognuno ha una diversa affinità con il substrato, più ne ha e più la
reazione catalizzata viene favorita, il contrario succede quando l’affinità è minore). Spesso questi
enzimi sono risultato dello splicing alternativo effettuato durante la maturazione dell’mRNA.

L’attività di controllo enzimatico esercitata dal citrato rientra nella prima classe di cui abbiamo parlato.
Questo composto, infatti, funge da modulatore allosterico per l’enzima fosfofruttochinasi (che catalizza la
terza reazione della glicolisi). Il citrato ha funzione di modulazione negativa, ovvero la sua presenza blocca
la glicolisi a livello della terza reazione (segue quindi la necessità metabolica della cellula: la presenza di
citrato in una data concentrazione rende non più necessario lo svolgersi della glicolisi e quindi la sintesi di
piruvato).
PRODUZIONE INDUSTRIALE DI ACIDO CITRICO

PREMESSA
La produzione di questo composto organico venne
effettuata per la prima volta dal chimico americano James
Currie sfruttando il microorganismo Aspergillus niger che
risultò avere un’efficienza elevata. Tuttora vengono
utilizzati ceppi di questa muffa. In passato si utilizzava, per
la produzione di acido citrico, un sistema di estrazione
dagli agrumi che però aveva una resa davvero minima,
inferiore al 9%. Il processo biotecnologico che viene
utilizzato oggigiorno (figlio di quello ideato da Currie)
invece permette di avere rese di gran lunga superiori (fino
anche al 98%). Inoltre con le moderne tecniche di
Immagine al microscopio ottico di Aspergillus
manipolazione genetica (DNA ricombinante) è possibile niger
sfruttare ceppi modificati che riescono a processare anche
la cellulosa come substrato da cui ottenere successivamente l’acido citrico. Ad ogni modo, i substrati
utilizzati sono carboidrati (provenienti da melasse di barbabietola o di canna, sostanze amidacee, la polpa
di alcuni vegetali e/o gli scarti dell’industria del cotone o della birra).

PROCESSO (upstream)
Quando questi carboidrati vengono processati dal m.o. utilizzato per la produzione otteniamo Acetil-CoA
(che come detto precedentemente può essere in realtà ottenuto anche da altri tipi di molecole
metabolizzate dalla cellula) quest’ultimo entra nel ciclo di Krebs e reagendo con l’ossalacetato va a formare
il citrato. Per far sì che il processo non continui con la prossima reazione in modo da accumulare citrato
dobbiamo bloccare l’azione dell’aconitasi (enzima che catalizza la suddetta reazione). Bisogna altresì
evitare che l’accumulo di citrato non sia responsabile del blocco dell’enzima fosfofruttochinasi (vedere
sopra), fondamentale perché la glicolisi proceda. Per fare questo si mantiene una bassa concentrazione di
ioni manganese e una più alta concentrazione di ioni ammonio. A livello industriale si possono usare dei
biofermentatori ad agitazione meccanica (quindi con delle lamine metalliche o pale che girando
omogenizzano il substrato con la biomassa microbica in modo da massimizzare la resa) o air-lift (ovvero con
un effetto simile a quello dell’agitazione meccanica ma ottenuto con l’immissione di aria ad una pressione
adeguata, col valore aggiunto di ottenere un secondo effetto, quello di fornire l’ossigeno necessario perché
A. nigers metabolizzi il substrato, che altrimenti andrebbe aggiunto separatamente, denotando un notevole
risparmio energetico).

ESTRAZIONE (downstream)
I m.o., alla fine del processo produttivo vengono eliminati per filtrazione. L’acido ossalico (che viene
prodotto insieme al citrato durante la fermentazione ma che non ci serve ed è quindi un prodotto di scarto)
viene fatto precipitare con idrossido di calcio (Ca(OH) 2, mentre il citrato di calcio che si forma viene fatto
precipitare con l’acido solforico (H2SO4). Otteniamo così acido citrico in soluzione e precipitato di CaSO 4).
L’acido citrico viene quindi separato per centrifugazione, poi la soluzione viene purificata su filtri a carbone
attivo e resine a scambio ionico. Il filtrato viene successivamente concentrato per evaporazione sottovuoto
e poi nuovamente purificato per cristallizzazione o essiccamento.

Di seguito uno schema dell'intera linea produttiva:

UTILIZZI E PROPRIETA’
L’acido citrico viene usato prevalentemente nell’industria alimentare (75%) per le sue proprietà di acido (è
un acidificante, viene aggiunto lungo le linee produttive per mantenere nel range corretto il pH del
prodotto), di conservante (proprietà antiossidante) e di riduttore del grado di dolcezza. Viene poi utilizzato
anche nell’industria chimica (15%) per la produzione di detersivi (sostituto dei fosfati), di calcestruzzo
(ritardante dell’indurimento) e di vernici. Ultimo ma non meno importante viene usato nell’industria
farmaceutica (10%) come stabilizzante di agenti farmaceutici (evita l’ossidazione delle vitamine), come
regolatore di pH e come conservante per il plasma sanguigno (anticoagulante).

GRAZIE PER L’ATTENZIONE


BIBLIOGRAFIA e SITOGRAFIA
www.chimica-online.it
www.andytonini.com
Biochimica e Biologia Molecolare – Bruno Tinti – Piccin Nuova Libraria – Padova
Biologia, microbiologia e biotecnologie – Fabio Tinti – Zanichelli – Milano
Immagini: www.google.it/imghp?hl=it