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Microbiologia applicata e biotecnologia (2018) 102: 4675 - 4686

https://doi.org/10.1007/s00253-018-9032-3

MINI-REVISIONE

Caglio a base di cardo per la produzione di formaggio

Carla Malaquias Almeida 1 & Isaura Simões 1,2,3

Ricevuto: 25 febbraio 2018 / Revisionato: 16 aprile 2018 / Accettato: 16 aprile 2018 / Pubblicato online: 26 aprile 2018
# Springer-Verlag GmbH Germania, parte di Springer Nature 2018

Astratto
L'uso di estratti acquosi grezzi di Cynara cardunculus fiori come coagulanti nella produzione di formaggi ovini e caprini di alta qualità - come nel caso di diverse
varietà di formaggio portoghesi e spagnole con status di denominazione di origine protetta - è stato mantenuto sin dai tempi antichi. Gli attributi reologici unici e le
proprietà sensoriali caratteristiche di questi formaggi hanno sempre suggerito che questo coagulante vegetale (e, quindi, le sue proteasi coagulanti isolate) potesse
essere utilizzato come caglio alternativo nell'industria lattiero-casearia, particolarmente adatto per la produzione di ovini e caprini formaggi. Tuttavia, la mancanza
di standardizzazione di C. cardunculus Gli estratti di fiori grezzi, la cui qualità e performance dipendono da numerosi fattori, ha sempre ostacolato l'applicazione di
questo caglio vegetale nelle scale di produzione industriale. Per superare questi limiti e mirare a sviluppare soluzioni più efficaci con un potenziale di scalabilità
della produzione e dell'applicazione commerciale, negli ultimi anni sono state intraprese diverse strategie per stabilire nuovi caglio a base di cardo. Questa
recensione fornisce una panoramica su questi sviluppi e sulle soluzioni attualmente disponibili, che vanno dalla produzione di formulazioni standardizzate di enzimi
cardo nativi, all'ottimizzazione della produzione eterologa di cardosine e ciprosine per generare versioni sintetiche di questi enzimi di coagulazione del latte.
Vengono anche discusse le sfide e le opportunità emergenti.

Parole chiave Cynara cardunculus L.. Proteasi aspartica. Formaggio di pecora e capra. Caglio di origine vegetale. Cardosina sintetica B. Ciprosina ricombinante.
Coagulante vegetale in polvere

introduzione Circa il 75% di questa produzione e la maggior parte delle varietà di formaggio
sono prodotte per coagulazione enzimatica (caglio) (Fox et al. 2017b ).
Il formaggio è probabilmente il gruppo di prodotti lattiero-caseari più vario e Sorprendentemente, i riferimenti all'uso di diversi tipi di caglio risalgono al
complesso, con circa 750 varietà descritte (Fox et al. periodo romano dove si ritiene che la produzione di formaggio fosse già ben
2017a ). Sebbene i primi tentativi di convertire il latte in formaggio possano essere consolidata (Fox et al.
stati un modo per facilitare il trasporto, migliorare la stabilità e, eventualmente, 2017a ). Infatti, il soldato romano Lucius Junius Moderatus Columella nel
diversificare la dieta umana con un prodotto ad alto valore nutritivo, nel tempo il suo trattato di agricoltura, De Re Rustica (c
formaggio si è trasformato in un prodotto di primaria importanza economica (Fox et 50) - considerata una delle descrizioni antiche più dettagliate della produzione
al. 2017a ). L'attuale produzione mondiale di formaggio è di circa 19 × 10 6 t all'anno, casearia - descrive l'utilizzo di caglio di agnello o capretto e precisa che i formaggi
che rappresenta circa il 35% del latte totale prodotto. possono essere prodotti anche con caglio di derivazione vegetale. Columella
menziona l'uso di fiori di cardi selvatici (probabilmente Cynara cardunculus), semi di
Carthamus tinctorius ( un altro fiore simile a un cardo), o la linfa degli alberi di fico
per coagulare il latte dei piccoli ruminanti (Fox e McSweeney

* Isaura Simões
2004 ). Sorprendentemente, in Portogallo e in alcune regioni della Spagna,
isimoes@biocant.pt
l'uso di estratti di fiori secchi di C. cardunculus L. si è mantenuta con
1 successo fin dall'antichità per la produzione di molte varietà tradizionali di
Biocant, Biotechnology Innovation Center, Parque Tecnológico de Cantanhede,
Núcleo 4, Lote 8, 3060-197 Cantanhede, Portogallo formaggi ovini e caprini, rafforzando ulteriormente l'idoneità di questo caglio
2 per la produzione di formaggi di alta qualità (Reis e Malcata 2011 ; Roseiro et
Isaura Simões, Edifício UC-Biotech, Biocant-Parque Tecnológico de Cantanhede,
Núcleo 04, Lote 8, 3060-197 Cantanhede, Portogallo al. 2003a , b ; Sousa e Malcata 2002 ). Pertanto, negli ultimi decenni, sono stati
3 compiuti molti sforzi per comprendere le proprietà di questo coagulante
CNC - Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra,
3004-517 Coimbra, Portogallo vegetale unico. Parecchi

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Gli autori hanno dedicato i loro sforzi di ricerca per caratterizzare gli enzimi parte del fiore utilizzato, il suo stadio di maturità, il tempo di essiccazione o il
coagulanti del latte presenti nei fiori di cardo, il loro ruolo nell'idrolisi delle caseine contenuto di umidità finale (Correia et al. 2016 ; Fernandez Salguero et al. 2002 ;
in vitro e il loro effetto nel processo di proteolisi durante la maturazione (Agboola Guine et al. 2016 ; Macedo et al. 1993 ). Ciò si traduce in preparazioni di estratto di
et al. 2004 ; Brodelius et al. 1995 ; Esteves et al. 2001 ; Esteves et al. 2003b ; Faro et cardo non standardizzate che possono variare in termini di attività di coagulazione
al. e proteolitica e possono in ultima analisi influenzare la resa di produzione e le
1992 ; RamalhoSantos et al. 1996 ; Roseiro et al. 2003a , 2003b ; Silva et al. 2003
proprietà finali del formaggio (Sousa e Malcata 2002 ). Tuttavia, l'impatto di queste
; Silva e Malcata 1998 ; Silva e Malcata variazioni sull'attività di coagulazione è per lo più gestibile per i formaggi DOP di
1999 , 2000 , 2005 ; Sousa andMalcata 1997 , 1998b , 2002 ). A causa del produzione tradizionale, ancora prodotti in piccole scale di produzione. Ciò ha
potenziale di questi enzimi cardo di servire come caglio alternativo in processi sicuramente permesso di continuare a utilizzare questo caglio unico fin
di produzione su larga scala, negli anni più recenti sono state intraprese dall'antichità per la produzione di queste specialità di formaggi di latte ovino e
diverse strategie per sviluppare formulazioni più standardizzate degli enzimi caprino la cui produzione è ora rigorosamente regolamentata con lo status di DOP /
nativi o per esplorare la loro produzione in sistemi eterologhi per generare IGP.
versioni sintetiche di queste proteasi. Questa revisione mira a fornire una
panoramica delle attuali conoscenze sui caglio a base di cardo, concentrandosi
in particolare su questi progressi più recenti per produrre forme più efficaci di
questo coagulante vegetale per grandi scale di produzione industriale.
Verranno presentate le soluzioni e le sfide attuali e le prospettive generali in Cardosine: diversità e proprietà nel contesto
merito della produzione casearia

B da dove a dove verranno presi in considerazione i caglio a base di cardo. C. cardunculus L. è una varietà di cardo, che produce grandi teste e fiori viola.
L'attività di coagulazione di questa pianta è limitata al fiore, più precisamente
allo stigma e allo stile dell'infiorescenza (RamalhoSantos et al. 1997 ), e risulta
dall'espressione di diversi membri di una famiglia multi-genica di proteasi
Fiori di cardo e formaggi DOP aspartiche (Pimentel et al. 2007 ). Sono stati isolati due gruppi di proteasi
aspartiche tipiche C. cardunculus L. fiori: ciprosine (precedentemente chiamate
Sette dei 12 formaggi portoghesi di pecora o capra con lo status di cinarasi) e cardosine (Cordeiro et al. 1994 ; Heimgartner et al. 1990 ; Verissimo
Denominazione di Origine Protetta (DOP) (o in un caso, Indicazione et al. 1995 ). Le proprietà biochimiche e biologiche di queste proteasi
Geografica Protetta (IGP)) sono prodotti utilizzando solo un estratto grezzo aspartiche sono state compilate in modo esauriente da Cavalli e collaboratori
di fiori secchi di C. cardunculus (Cavalli et al. 2013 ), e l'effetto di questi coagulanti vegetali sulle proprietà
L. come coagulante. Lo stesso accade con le varietà DOP spagnole B Torta del reologiche e sensoriali del formaggio è stato recentemente rivisto (Ben Amira
Casar, ̂ B La Serena, ̂ e B Flor de Guíâ (Tabella 1 ). In tutti i casi, questo et al. 2017 ). Qui ci concentreremo brevemente sulle proprietà nel contesto
marchio di qualità attesta le eccezionali proprietà organolettiche e reologiche delle caseine isolate e della produzione di formaggio che forniscono la base
di questi formaggi e la loro autenticità in termini di origine regionale o per il loro potenziale biotecnologico per servire come caglio innovativo
produzione tradizionale (Regolamento (UE) n. 1151/2012). Una caratteristica nell'industria lattiero-casearia. Tre ciprosine sono state isolate da estratti di
comune a questi formaggi (in particolare quelli prodotti con latte di pecora) è la fiori essiccati che erano tutte glicoproteine eterodimeriche, con un peso
pasta morbida dal sapore squisito, leggermente amarognolo e talvolta molecolare stimato di circa 49 kDa (catene pesanti di circa 32 - 36 kDa e
piccante. Infatti, la valutazione sensoriale dei formaggi di pecora prodotti con catene leggere di 14 - 18 kDa) e un pH ottimale di 5,1 a 37 ° C (Heimgartner et
estratti di cardo ha rivelato proprietà aromatiche migliorate con una minore al. 1990 ). Nonostante queste somiglianze, le ciprosine mostrano diverse
percezione di amaro rispetto ai formaggi prodotti con coagulante microbico o attività proteolitiche e di coagulazione del latte. È stata segnalata un'attività
caglio di vitello (Agboola et al. 2004 ; Jacob et al. 2011 ). Queste proprietà proteolitica più elevata per la ciprosina 3 insieme a un'attività di coagulazione
sensoriali e di consistenza uniche sono principalmente attribuite a una del latte paragonabile alla chimosina nella fase iniziale dell'idrolisi (Brodelius
proteolisi più pronunciata delle caseine da parte degli enzimi di coagulazione et al. 1995 ). Tuttavia, sono state rilevate differenze nella compattezza della
del latte di cardo (rispetto al caglio animale), che combinate con le proprietà cagliata quando chimosina e ciprosina sono state analizzate in parallelo, con
fisico-chimiche uniche del latte di pecora e le caratteristiche contestuali danno una cagliata più morbida osservata con quest'ultima. Ulteriori studi con latte
luogo a prodotti ad alto valore intrinseco (Jacob et al. 2011 ). Gli estratti acquosi vaccino hanno confermato la scissione del legame Phe105Met106 di κ- caseina
di cardo sono ottenuti da fiori essiccati di C. cardunculus L. o, meno e idrolisi aggiuntiva di
frequentemente, da una miscela di fiori secchi di C. cardunculus Sbarcare C.
humilis L. (Vioque et al. 2000 ). Pertanto, l'attività dell'estratto vegetale dipende
da numerosi fattori come l'ecotipo del fiore di cardo, il

α s1-caseina, β- caseina e almeno uno dei γ- caseine da ciprosine (Cordeiro et al. 1992
). È interessante notare che questi autori

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Tabella 1 Formaggi di pecora e


capra con Protetto latte Origine Logo di qualità UE / anno ottenuto

Denominazione di Origine (DOP) o


Geografica Protetta Queijo de Azeitão Pecore Portogallo DOP / 1996

Stato di indicazione (IGP) prodotto con Queijo de Évora Pecore Portogallo DOP / 1996
estratti grezzi di fiori di
Queijo de Nisa Pecore Portogallo DOP / 1996
Cynara cardunculus L.
Queijo Serpa Pecore Portogallo DOP / 1996

Queijo Serra da Estrela Queijo Pecore Portogallo DOP / 1996

de Castelo Branco Queijo Pecore Portogallo DOP / 1996

mestiço de Tolosa Torta del Pecora / capra Portogallo IGP / 2000

Casar Pecore Spagna DOP / 2003

Queso de La Serena Queso Pecore Spagna DOP / 1996

de Flor de Guía Pecore Spagna DOP / 2010

ha anche riportato una maggiore attività di coagulazione della ciprosina 3 nel latte di e Malcata 1998b ). Un primo studio condotto da Sousa e Malcata ha rivelato che la
pecora (rispetto al latte vaccino e rispetto all'attività di coagulazione osservata della cardosina Awas è in grado di fendere gli ovini α-
chimosina in entrambi i tipi di latte) e un'idrolisi più limitata delle caseine in questo e β- caseine (sia in forme caseinate che isolate), essendo queste ultime più suscettibili
tipo di latte (Cordeiro et al. 1992 ). alla proteolisi (Silva eMalcata 1998 ). Per la cardosina B, un risultato simile è stato
osservato quando le caseine sono state preparate nella forma isolata; tuttavia, è stato
Il secondo gruppo di proteasi aspartiche isolate dai fiori di cardo è noto come osservato il contrario quando è stato testato il caseinato ovino, con α- caseine essendo
cardosine e rappresenta la maggior parte delle proteine solubili totali presenti negli più suscettibili alla proteolisi di β- caseina (Silva e Malcata 1999 ). Durante il processo
stimmi maturi (RamalhoSantos et al. 1997 ). Le più abbondanti sono la cardosina A e di stagionatura del formaggio di pecora è stato effettuato un confronto tra l'effetto di
la cardosina B sebbene, più recentemente, quattro cardosine aggiuntive siano state questo coagulante vegetale e il caglio animale. Sebbene non siano state osservate
isolate dai fiori (cardosine E, F, G eH) (Sarmento et al. 2009 ; Verissimo et al. 1995 ). differenze significative nella composizione chimica del formaggio, il coagulante
Tra tutti gli enzimi di coagulazione del latte di cardo, la cardosina A e la cardosina B vegetale ha dimostrato una minore attività proteolitica nei confronti degli ovini α-
sono i meglio caratterizzati finora. Sono anche glicoproteine eterodimeriche che
comprendono una catena pesante (31 e 34 kDa) e una leggera (rispettivamente 15
e 14 kDa). Entrambi idrolizzano preferenzialmente i legami peptidici con catene caseina e β- caseina, con il progredire della maturazione (Sousa eMalcata

laterali idrofobiche, sebbene la cardosina A abbia una specificità del substrato più 1998a ). Inoltre, estratti di C. cardunculus sono stati descritti come
stretta e una minore efficienza catalitica rispetto alla cardosina B. Da queste responsabili della proteolisi primaria piuttosto che della microflora prevalente
specificità e proprietà cinetiche, la cardosina A è stata considerata una proteasi o degli enzimi nativi (Sousa e Malcata
simile alla chimosina mentre la cardosina B assomiglia alla pepsina (Verissimo et al. 19951997 ). Un altro passaggio cruciale durante il processo di produzione del formaggio è la
). Le cardosine favoriscono la destabilizzazione delle micelle e la conseguente gelificazione del latte. Focalizzato sull'ottenimento di una caratterizzazione più dettagliata

formazione di coaguli di latte attraverso la scissione del legame Phe105-Met106 del di C. cardunculus estratti come agenti coagulanti del latte, sono stati studiati gli effetti della

bovino κ- caseina (Verissimo et al. temperatura di gelificazione sulle caratteristiche del gel di latte. Questa valutazione ha

incluso anche il confronto con la chimosina ed è stato osservato che tempi di gelificazione

più brevi per estratti vegetali mentre gel più sodi e tempi di invecchiamento lunghi sono

stati osservati per formaggi prodotti con chimosina (Esteves et al. 2003a ). Inoltre, l'attività

1995 ). Inoltre, le cardosine mostrano un comportamento simile al caglio animale coagulante di C. cardunculus estratto è stato meno influenzato dalle variazioni di

con la scissione specifica del legame riferito senza alcuna idrolisi aggiuntiva di κ- caseina
temperatura rispetto a quelli prodotti con chimosina. Questa caratteristica potrebbe

(Faro et al. 1992 ). D'altra parte, le cardosine mostrano una specificità più ampia costituire un vantaggio per la produzione di formaggi che richiedono un'ampia gamma di

rispetto alla chimosina nei confronti dei bovini α- e β- caseine idrolizzando ulteriori temperature di gelificazione (Esteves et al. 2003a ).

legami peptidici in condizioni di digestione simili (Macedo et al. 1996 ;


RamalhoSantos et al. 1996 ). Un confronto dell'attività enzimatica nei confronti dei
bovini α- e β- la caseina delle cardosine e della chimosina ha mostrato che le
cardosine hanno una maggiore attività proteolitica che porta alla formazione di
diversi peptidi (Macedo et al. 1996 ; Sousa e Malcata 2002 ). La ritenzione di questi Caglio a base di cardo
peptidi nella cagliata a causa della loro elevata idrofobicità, contribuisce
fortemente al gusto amaro. Tuttavia, un risultato leggermente diverso è stato Le nuove richieste di prodotti più sani, diversificati e di alta qualità da parte dei
ottenuto per la caseina ovina (Sousa consumatori finali hanno portato a cambiamenti significativi nel settore
lattiero-caseario che ora è più impegnato nell'innovazione di prodotto. Una delle
sfide affrontate dal formaggio

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produttori è lo sviluppo di prodotti di alta qualità con nuove caratteristiche di gusto cagliata (Albenzio e Santillo 2011 ; Balthazar et al. 2017 ; Nunez 2016 ). Pertanto, la
o consistenza per soddisfare queste nuove esigenze di mercato. Sebbene i preparazione del caglio utilizzata nella produzione di formaggio di pecora e capra ha
formaggi di latte vaccino rappresentino ancora il mercato più grande, i formaggi un impatto significativo sulle proprietà del prodotto finale (Nunez 2016 ).
prodotti da latte di pecora e capra stanno guadagnando dimensioni di mercato e Probabilmente, non a caso, le varietà tradizionali di alta qualità di formaggi di capra
assumendo una rilevanza sempre più economica in molti paesi sviluppati e di pecora sono prodotte principalmente con coagulanti non bovini, come estratti o
(Balthazar et al. 2017 ; Nunez 2016 ; Selvaggi et al. 2014 ). Ciò è attribuito all'alta paste di caglio di capretto o di agnello, nonché estratti di fiori di cardo. Su scala
qualità di questi prodotti (selezionati in molti paesi come specialità / formaggi industriale, tuttavia, il caglio naturale bovino o la chimosina bovina prodotta dalla
gourmet) e al loro valore nutritivo. Infatti, le caratteristiche fisico-chimiche e di fermentazione sono ancora i coagulanti più comunemente usati. Con la crescente
composizione del latte di pecora e di capra differiscono sostanzialmente da quelle domanda da parte dei consumatori di formaggi di capra, pecora e latte misto, la
del latte di vacca (Balthazar et al. 2017 ; Nunez 2016 ; Park et al. 2007 ). Il latte di ricerca di sostituti del caglio alternativi che possano sfruttare efficacemente queste
pecora è quello con un valore nutritivo più elevato a causa di concentrazioni più matrici del latte su scale di produzione più ampie e, quindi, contribuire
elevate di proteine, grassi, vitamine e minerali rispetto al latte di capra e di mucca all'innovazione di prodotto per quanto riguarda le proprietà organolettiche o
(Balthazar et al. 2017 ). Inoltre, i lipidi hanno generalmente caratteristiche fisiche reologiche acquista evidente rilevanza.
migliori nel latte di pecora e capra rispetto al latte di mucca. La dimensione media
dei globuli di grasso è inferiore nel latte di pecora e capra rispetto al latte di
vacca, il che si traduce in una migliore digeribilità del latte dei piccoli ruminanti Nonostante le proprietà uniche degli estratti di fiori di cardo, l'uso di questo
(Park et al. 2007 ). Inoltre, le caratteristiche delle micelle di caseina del latte di coagulante vegetale in ambienti di produzione industriale è stato ostacolato
pecora e di capra sono diverse per dimensione media, idratazione e dalla variabilità di questi estratti di piante rispetto all'attività enzimatica e alla
mineralizzazione rispetto al latte vaccino. Le caratteristiche specifiche del latte di qualità microbiologica, e dalle limitate risorse dei fiori (Fernandez-Salguero et
pecora, in particolare, lo rendono un'ottima matrice per la produzione di al. 1999 ; Gomez et al. 2001 ; Sousa e Malcata 2002 ). Questi limiti intrinseci
formaggio (Balthazar et al. 2017 ). Tutte queste specificità del latte di pecora e hanno sempre spinto alla ricerca di strategie alternative per sviluppare forme
capra per quanto riguarda la composizione e le proprietà fisico-chimiche hanno standardizzate di questo caglio di derivazione vegetale. Negli ultimi 20 anni,
un impatto sulla renettabilità di questi tipi di latte, che differisce nettamente dal sono stati intrapresi diversi approcci con questo obiettivo, con sforzi di ricerca
latte vaccino sia per le proprietà di coagulazione che per i parametri reologici di concentrati sia su nuove formulazioni di C. cardunculus estratti di fiori e sulla
produzione di forme ricombinanti di cardosine o ciprosine in diversi ospiti
eterologhi (Fig. 1 ). Le varie soluzioni sono riassunte in Tabella 2 e sarà
presentato e discusso di seguito.

Fig. 1 Vantaggi, limiti e opportunità


dell'utilizzo di coagulanti a base di
cardo nella produzione di formaggi
ovini e caprini

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Tavolo 2 Soluzioni disponibili su caglio a base di cardo Caglio a base di

cardo Proprietà Riferimenti

Formulazioni di estratto di cardo

Coagulante vegetale in polvere Estratto acquoso di fiori ottenuto da cardo essiccato Fernandez-Salguero et al., 2002 ; Tejada e
(PVC) fiorisce per congelamento / essiccazione senza bisogno di conservanti; Privo di Fernandez-Salguero, 2003 ; Prados et al.,
microrganismi vitali; 2007 ; Pino et al. 2009a
Utilizzato con successo nella produzione di pecore e capre
formaggi con risultati simili agli estratti di fiori grezzi (formaggi di
consistenza morbida e cremosa con caratteristiche di sapore e aroma
migliori rispetto a quelli prodotti con caglio animale);

Cynzime ™ Concentrato enzimatico ottenuto da fiori di cardo essiccati, Notifica GRAS # 551
per estrazione a bassa temperatura ea pH 7,4; Enzima formulato
con cloruro di sodio come stabilizzante
e benzoato di sodio come conservante;
Disponibile nelle versioni polvere e liquida sotto
marchio Cynzime ™;
Ciprosine ricombinanti

Cyprosin B Ciprosina B ricombinante prodotta in S. cerevisiae e Fernandez-Salguero et al., 2003 ;


purificato mediante un processo di purificazione in due fasi o una singola fase di Sampaio et al., 2008 , 2014a
cromatografia di interazione idrofobica; Resa di recupero di ~ 20% e purificazione
piega complessiva di 12,5; Attività ottimale a pH 4,5 e e 42 ° C (verso caseina FITC);
Testato nella produzione di formaggio di latte di pecora, risultante

nei prodotti con livelli più elevati di idrolisi della caseina rispetto a quelli
osservati con la chimosina;

Cyprozime ™ Descritto come un ricombinante vegetale derivato dalla ciprosina Fytozimus Biotech Inc.
enzima nel portafoglio prodotti di Fytozimus Bioteh Inc .; Non vengono (Edmonton, Canada)
fornite ulteriori informazioni sulla relazione tra questo prodotto e la
ciprosina B ricombinante;
Cardosine ricombinanti

Cardosina sintetica B Cardosina B ricombinante purificata (ottimizzata mediante delezione di Almeida et al. 2017
il PSI e l'ottimizzazione del codone) prodotto in K. lactis ( GRAS); Profili di pH,
temperatura e inibizione simili a quelli
osservato per cardosina B nativa (verso (MCA)
KKPAGFFALK (DNP));
Struttura cristallina disponibile (file PDB 5NFG), conferma
la piega canonica delle proteasi aspartiche e due strutture glicaniche legate al
tipo N ad alto contenuto di mannosio; La cardosina sintetica B mostra una minore
efficienza catalitica

e specificità del substrato più rigorosa rispetto alla cardosina B nativa;

VRen (caglio vegetale) Prodotto estratto sintetico arricchito di cardosina B di coltura grezza Almeida et al. 2015
nel K. lactis, non richiedendo fasi di purificazione delle proteine a valle;
Preparato di caglio attivo e stabile in forma liquida e liofilizzata;

PH, temperatura e profili di digestione della caseina ottimali


di VRen simile alla cardosina B nativa;
Utilizzato con successo nella produzione di pecore, capre e mucche
formaggi, con conseguenti rese di formaggio più elevate rispetto alla chimosina
sintetica MaxiRen® per tutti i tipi di latte testati;

Coagulante vegetale in polvere Con l'obiettivo di aggirare queste limitazioni, è stata sviluppata e brevettata una
forma in polvere di questo coagulante vegetale (brevetto spagnolo 200.001.593,
Oltre alla ben nota variabilità degli estratti acquosi di fiori di cardo rispetto 2000). Questa nuova formulazione è stata denominata coagulante vegetale in
all'attività di coagulazione del latte, studi sulla qualità microbiologica di polvere (PVC) ed è ottenuta per liofilizzazione di estratti acquosi grezzi di fiori
questi estratti hanno anche suggerito che possono produrre un'ulteriore secchi di C. cardunculus L. (i fiori vengono fatti macerare in acqua per 24 - 36 h, a
contaminazione del latte, e quindi dei formaggi, da microrganismi temperatura ambiente; w / v rapporto di 1 - 2/10) (Fernandez-Salguero et al. 2002 ).
indesiderati ( Fernandez-Salguero et al. 1999 ; Gomez et al. 2001 ). Con Questa formulazione è stata

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descritto come un prodotto privo di microrganismi vitali, solubile in acqua o È stata osservata una maggiore proteolisi della caseina anche nei formaggi di
latte, stabile a scaffale in un contenitore ermetico senza bisogno di latte di capra prodotti con PVC rispetto a quelli prodotti con chimosina (quando il
conservanti e facile da caratterizzare in termini di attività coagulante e da PVC è stato usato come coagulante sono stati riportati livelli più elevati di
manipolare come coagulante vegetale (Fernandez-Salguero et al. 2002 ). frazione di azoto solubile e contenuti più elevati di peptidi idrofobici) (Pino et al. 2009a
Inoltre, il PVC è caratterizzato dalle seguenti proprietà di composizione: ,
umidità 20 - 60 g kg - 1, proteina 150 - 180 g kg - 1, pH 4,8 - 5.2, attività dell'acqua b ; Tejada et al. 2008 ). Pertanto, è stato anche suggerito che l'uso del PVC
0.2 - 0,34 e attività di coagulazione 0,031 - 0,042 RU (Fernandez-Salguero et potrebbe anche accelerare la maturazione di questo tipo di formaggi e,
al. 2002 ). Dal suo sviluppo, sono stati pubblicati diversi rapporti che quindi, contribuire a prodotti finali con migliori caratteristiche sensoriali (ad
affrontano l'effetto dell'uso del PVC (rispetto all'uso dell'estratto grezzo o esempio, maggiore cremosità e morbidezza) causate dall'aumentata attività
della chimosina) sulle proprietà fisico-chimiche, biochimiche, proteolitica delle cardosine ( Pino et al. 2009a , b ; Tejada et al. 2008 ). È stata
microbiologiche e sensoriali di diversi formaggi (Galan et al. 2012 , 2008 ; valutata la stabilità del PVC in termini di attività di coagulazione del latte e
Pino et al. 2009a , b ; Prados et al. 2007 ; Teiada et al. 2008 ; Tejada e qualità microbiologica ed è stato dimostrato che questa formulazione può
Fernandez-Salguero 2003 ; Tejada et al. 2007 , essere mantenuta liofilizzata per almeno 1 anno senza alcuna riduzione
dell'attività di coagulazione del latte (Tejada et al. 2008 ). Sebbene il PVC si
sia dimostrato un adeguato sostituto degli estratti grezzi di cardo, può ancora
2008 ). Questa formulazione è stata utilizzata con successo nella presentare limitazioni per applicazioni su larga scala poiché dipende ancora
produzione dei formaggi Los Pedroches e Manchego (due formaggi dalla disponibilità dei fiori e dalla loro intrinseca variabilità nell'attività
tradizionali spagnoli a base di pecora ' s latte) e nella produzione di diversi proteolitica. Infatti, come recentemente dimostrato da Correia e coautori,
tipi di formaggi di capra. In questi studi le proprietà reologiche e l'uso di diversi ecotipi di C. cardunculus gli estratti di fiori per produrre il
organolettiche dei formaggi prodotti con il PVC erano molto simili a quelle formaggio Serra da Estrela (formaggio portoghese di pecora DOP) hanno
prodotte con gli estratti grezzi di fiori di cardo. Inoltre, l'analisi di diversi avuto un impatto significativo sulle proprietà sensoriali del prodotto finale,
gruppi microbici nella cagliata e nei formaggi ha rivelato una conta evidenziando ancora una volta i limiti nella standardizzazione della
microbica inferiore quando è stato utilizzato il PVC, che era previsto produzione di questi estratti vegetali (Correia et al. 2016 ). Più recentemente,
dall'uso di un coagulante privo di microrganismi vitali (superando l'impatto un concentrato di enzima ciprosina ottenuto dalla macerazione di fiori
negativo della scarsa qualità microbiologica riportata per il grezzo estratti di essiccati di C. cardunculus e l'estrazione a bassa temperatura con fosfato di
cardo). Rispetto ai formaggi prodotti con caglio animale, l'uso del PVC sodio a pH 7,4 è stata sviluppata (notifica GRAS # 551, http://www.accessdata.fda.gov/scripts
(come l'estratto vegetale grezzo) determina livelli più elevati di idrolisi della fdcc /? set = GRASNotices & id = 551 ). Questo preparato enzimatico è
caseina che si riflettono in un contenuto di azoto solubile (SN) più elevato formulato con cloruro di sodio come stabilizzante e benzoato di sodio come
osservato all'inizio della maturazione (indice di maturazione più alto). 2007 ; conservante, e commercializzato sia in polvere che in versione liquida con il
Tejada e Fernandez-Salguero 2003 ; Tejada et al. marchio registrato Cynzime ™, dalle società Fytozimus Biotech Inc.
(Edmonton, Canada) e Enzyme Development Corporation (New York, USA).
Una miscela di Cynzime ™ e altro caglio commerciale disponibile è anche
disponibile nel portafoglio di prodotti Fytozimus Biotech Inc. con il marchio
Cynmix ™. Essendo prodotto anche da estratti vegetali, Cynzime ™ presenta
le stesse limitazioni del PVC per quanto riguarda le loro potenziali
applicazioni nei processi di produzione su larga scala.

2007 ). Questi livelli più elevati di proteolisi della caseina promossi dal coagulante
vegetale portano a consistenze di formaggio più cremose e morbide, con migliori
caratteristiche gustative, generalmente con maggiore amarezza e con un aroma
leggermente piccante, proprietà molto apprezzate dai consumatori. Sulla base di
queste proprietà, diversi autori hanno anche valutato il potenziale utilizzo del PVC
per accelerare la maturazione delle pecore ' s formaggio di latte (Galan et al. 2008 , 2012
; Prados et al. 2007 ). È stato infatti dimostrato che i formaggi di latte di pecora
prodotti con PVC o una miscela di PVC e caglio animale hanno mostrato una
riduzione del tempo di maturazione rispetto a quelli prodotti con caglio animale, pur Ciprosina ricombinante B
conservando tutte le proprietà sensoriali e di consistenza caratteristiche di questi
formaggi. Ciò è indicato come un vantaggio per i produttori di formaggio che Un'alternativa all'uso di estratti grezzi e PVC è l'uso di forme ricombinanti
possono ridurre i costi associati al processo di stagionatura del formaggio degli enzimi di coagulazione del latte presenti nei fiori di cardo. Cyprosin B
utilizzando PVC o miscele di PVC e caglio animale (Galan et al. 2008 , 2012 ; Prados (precedentemente noto come cinarasi
et al. 2007 ). 3) è una delle proteasi aspartiche la cui produzione è stata esplorata in
diversi sistemi eterologhi negli ultimi 19 anni (Sampaio et al. 2008 , 2010b ;
White et al. 1999 ).

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La ciprosina B ricombinante è stata espressa per la prima volta in Pichia B è stato ulteriormente aumentato e un sostanziale miglioramento nelle prestazioni

pastoris ( White et al. 1999 ), con questo lavoro che ha contribuito a importanti della composizione del terreno di coltura selezionato [30 g / L di glucosio, 15 g / LYE,

approfondimenti sulla lavorazione e maturazione della proteasi, nonché 27 g / L di bactopeptone, mantenendo costante la concentrazione dell'induttore (20 g /

sull'impatto dei 104 aminoacidi dell'inserto specifico della pianta (PSI) sul L di galattosio)] è stato osservato durante la fermentazione in un bioreattore (Sampaio

ripiegamento delle proteine. White e collaboratori hanno dimostrato che la et al.

forma matura di ciprosina B accumulata nel terreno di coltura consisteva nella 2010a ). Questo processo di ottimizzazione ha portato a un incremento del 139%
catena pesante associata alla catena leggera attraverso un legame disolfuro. nella produzione di ciprosina B ricombinante rispetto alle condizioni di
Ciò risulta dall'escissione incompleta del dominio PSI durante l'elaborazione fermentazione iniziale o alla coltura nel ceppo W303-1A (Sampaio et al. 2008 , 2010a
della proteasi in Pichia ( completamente asportato in ciprosina nativa isolata dai ). In uno studio successivo, metodi statistici multivariati sono stati applicati ai dati
fiori di cardo), evidenziando possibili differenze nel processo di maturazione tra sperimentali per selezionare le condizioni di espressione più adeguate quando si
le cellule vegetali e questo ospite eterologo (White et al. 1999 ). Le proprietà considerano più variabili. Una produzione ottimale di ciprosina B è stata ottenuta
catalitiche della ciprosina B ricombinante erano leggermente diverse da quelle utilizzando il ceppo S. cerevisiae BJ1991 trasformato con il vettore episomale,
dell'enzima nativo (maggiore efficienza catalitica dell'enzima nativo, nelle inoculato in mezzo YNB ed espresso in terreno contenente glucosio e galattosio
condizioni descritte), cosa attribuita alla rimozione incompleta del PSI nella (Sampaio et al. 2011 ). Successivamente è stato dimostrato che queste condizioni
forma ricombinante. È interessante notare che, quando è stato espresso un aumentano la densità cellulare e la produzione di ciprosina B ricombinante
costrutto troncato privo dell'intero dominio PSI, la proteina ricombinante si è quando si utilizza una strategia fed-batch rispetto alla coltivazione in batch
accumulata in una forma non trattata e inattiva, suggerendo un ruolo per PSI (Sampaio et al. 2014a ). In questo lavoro, Sampaio e collaboratori hanno anche
nel ripiegamento della ciprosina B (White et al. 1999 ). Dopo questa implementato un approccio di purificazione utilizzando una singola fase di
pubblicazione, sono stati compiuti numerosi sforzi per l'ottimizzazione di un cromatografia di interazione idrofobica, ottenendo ciprosina B ricombinante con
sistema di espressione per la produzione di ciprosina B ricombinante per una resa del 16,4% e una purificazione di piega complessiva di 12,5 (Sampaio et
applicazioni nella produzione di formaggio (Brevetto internazionale WO00 / al. 2014a ). Questi risultati erano simili a quelli inizialmente ottenuti da Sampaio e
75283, PCT / PT00 / 00007) (Sampaio et al. 2008 ). Il sistema meglio collaboratori (Sampaio et al. 2008 ), utilizzando due fasi consecutive della
caratterizzato è Saccharomyces cerevisiae, dove l'ottimizzazione della cromatografia a scambio ionico. Più recentemente, sono stati pubblicati diversi
produzione di ciprosina B è stata favorita da diverse strategie, come testare lavori sull'implementazione di strumenti di monitoraggio in tempo reale
diversi plasmidi e ceppi, ottimizzare la composizione dei terreni di coltura e (principalmente basati su tecniche di spettroscopia infrarossa) per ottimizzare e
testare diverse strategie di crescita (Sampaio et al. 2008 , 2010a , 2011 , controllare i processi di coltivazione e produzione di ciprosina B ricombinante in S.
cerevisiae ( Sampaio et al.

2014a ). Gli studi iniziali sono stati effettuati utilizzando S. cerevisiae 2014b , 2017 ; Sampaio e Calado 2017 ). Sebbene siano stati compiuti sforzi
ceppo W303-1A e un plasmide centromero che ospita la sequenza codificante significativi per ottimizzare la produzione di ciprosina B in questo sistema di
della ciprosina B. In queste condizioni, è stato dimostrato che l'espressione lievito, le rese di recupero riportate e la relativa purificazione della proteasi
della ciprosina B ricombinante dipende direttamente dalla concentrazione di sono ancora basse alla fine del processo di purificazione (Sampaio et al. 2008
galattosio usato come induttore e che la proteasi è secreta e si accumula nei , 2014a ), quale potrebbe essere una potenziale limitazione per
terreni di coltura sia nella catena matura / attiva (due catene) e nella forma l'implementazione di questo processo per la produzione su larga scala di
precursore / inattivo. È stato implementato un processo di purificazione in due ciprosina B. È stata anche riportata una sovraespressione di questo enzima
fasi (due metodi di cromatografia a scambio anionico), con un grado di coagulante del C. cardunculus
purificazione di 12,5 volte e una resa di recupero del 25,6% della proteasi
ricombinante. L'attività di coagulazione del latte è stata confermata e l'attività L., con resa in qualche modo simile (33%) e grado di purificazione (8,3 volte) alla
proteolitica (verso la caseina FITC) è stata ottimale a pH4,5 ea 42 ° C e inibita fine del processo di purificazione (Sampaio et al.
dalla pepstatina A (Sampaio et al. 2008 ). Poiché l'associazione delle catene 2010b ).
pesanti e leggere della ciprosina B ricombinante attraverso il legame disolfuro L'uso della ciprosina B ricombinante nella produzione di formaggio è stato
non è stata valutata in questo lavoro, non è possibile inferire se il meccanismo segnalato da Fernandéz-Salguero e collaboratori (Fernandez-Salguero et al. 2003
di elaborazione in S. cerevisiae è simile a quello precedentemente osservato in Pichia). I formaggi di latte di pecora prodotti in parallelo con ciprosina ricombinante o
( White et al. 1999 ). Utilizzando una diversa combinazione di ceppo / plasmide caglio animale sono stati confrontati in termini di caratteristiche
(BJ1991 / plasmide episomico) e attraverso l'ottimizzazione della composizione fisico-chimiche, biochimiche e microbiologiche su 4 mesi di maturazione.
del terreno di coltura utilizzando modelli matematici, la produzione di ciprosina Livelli più elevati di proteolisi sono stati osservati nei formaggi prodotti con
ricombinante ciprosina ricombinante, che si sono riflessi in un contenuto di azoto solubile
significativamente più alto nonché in un indice leggermente più alto di
profondità di maturazione (

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frazione di azoto (NPN) a fine maturazione) rispetto a quelle osservate nei sono previsti costi di produzione. La cardosina A e la cardosina B sono state
formaggi prodotti con caglio animale (Fernandez-Salguero et al. 2003 ). Come espresse anche nei sistemi vegetali, ma in questi casi principalmente per
accennato in precedenza, questa aumentata proteolisi della caseina è stata comprendere il traffico di proteine e la localizzazione cellulare (da Costa et al. 2010 ;
ampiamente documentata quando estratti di fiori grezzi o PVC sono usati da Costa et al. 2011 ; Duarte et al.
come coagulanti, suggerendo che l'uso della sola ciprosina B ricombinante 2008 ). È interessante notare che questi studi hanno dimostrato che il traffico
potrebbe ottenere modelli di idrolisi simili. A nostra conoscenza, non sono intracellulare di cardosina B può variare con il tipo di cellula (essendo secreto o
stati riportati ulteriori studi sull'uso della ciprosina B ricombinante nella vacuolare a seconda dei tessuti) mentre la cardosina A mostra sempre una
produzione di formaggio dopo il 2003 (Fernandez-Salguero et al. 2003 ). La localizzazione vacuolare, suggerendo chiaramente differenze nella natura / forza
società Fytozimus Biotech Inc. ha nel suo portafoglio il prodotto Cyprozime ™ dei determinanti di ordinamento vacuolare tra cardosine . Inoltre, la maturazione
della cardosina B si è dimostrata più rapida di quella della cardosina

che è descritto come un ricombinante a base vegetale per l'uso nella produzione su A, che si verifica probabilmente durante il traffico di proteine (da Costa et al.

larga scala. 2010 ; da Costa et al. 2011 ).


Sono stati recentemente pubblicati ulteriori studi dedicati allo sviluppo di una
nuova forma ricombinante di cardosina B per applicazioni nella produzione
Cardosine ricombinanti industriale di formaggi ovini e caprini (Almeida et al. 2015 ). In questo caso, il
sistema di espressione eterologo selezionato era Kluyveromyces lactis grazie al
La cardosina A e la cardosina B rappresentano la maggior parte delle proteine suo status GRAS, alla facilità di manipolazione e alle buone prestazioni
solubili nei fiori di cardo maturo, con la cardosina A che rappresenta la nell'espressione della chimosina bovina sintetica la cui produzione / uso è
principale proteasi aspartica espressa nei pistilli. Sebbene da questi tessuti approvato dalla FDA (commercializzato con il marchio MaxiRen® da DSM,
siano state isolate anche altre proteasi aspartiche (Pimentel et al. 2007 ; Heerlen, Paesi Bassi). Gli autori hanno implementato una strategia graduale per
Sarmento et al. 2009 ), la cardosina A e la cardosina B sono considerati i ottimizzare l'accumulo di cardosina B nel terreno di coltura. Ciò consisteva nello
principali enzimi coagulanti del latte a causa della loro abbondanza nei fiori screening della composizione dei terreni di coltura, seguito da un approccio di
maturi. Come descritto in precedenza, questi enzimi sono stati ampiamente ingegneria proteica e da una fase di ottimizzazione del codone (Almeida et al. 2015
studiati nel corso degli anni e sono considerati proteasi aspartiche tipiche delle ). La secrezione di cardosina B è stata sostanzialmente migliorata con questa
piante modello (Castanheira et al. 2005 ). Date le loro proprietà, la cardosina A e ottimizzazione in più fasi, portando allo sviluppo di una preparazione di caglio
la cardosina B sono sempre emerse come promettenti candidati per lo sviluppo designata come VRen (da
di un caglio di derivazione vegetale sintetica. Pertanto, la loro espressione in
diversi sistemi eterologhi è stata esplorata da più di 15 anni (Almeida et al. 2015 ;
Almeida et al. 2017 ; Castanheira et al. 2005 ). Cardosin Awas espresso con V egetable Ren netto). VRen consiste nell'estratto arricchito con cardosina B
successo in E. coli, di coltura grezza, che non richiede passaggi di purificazione proteica a
valle. Questa preparazione di caglio si è dimostrata attiva e stabile (sia in
forma liquida che liofilizzata), mostrando pH e temperatura ottimali, nonché
con questo lavoro fornendo importanti intuizioni sui meccanismi di profili di digestione della caseina simili a quelli della cardosina nativa B.
elaborazione / attivazione dimostrando che la forma zimogena di cardosina A VRen è stato utilizzato con successo nella produzione di formaggio e ha
subisce l'elaborazione sequenziale autocatalitica. È interessante notare che portato a resa del formaggio per i tre tipi di latte testati (latte di pecora,
gli autori dimostrano che, in presenza del dominio PSI, la maturazione della capra e mucca), rispetto alla chimosina bovina sintetica MaxiRen®. Le
procardosina A ricombinante avviene attraverso la scissione sequenziale del differenze di resa in massa sono state del 3,1% per i formaggi di capra
dominio prosegmento seguita dall'escissione incompleta del dominio PSI (latte crudo), del 7,3% per i formaggi di pecora di latte pastorizzato e del
(Castanheira et al. 2005 ). Come osservato per la ciprosina B espressa in Pichia 6,0% per quelli prodotti da latte crudo di pecora e del 4% per i formaggi
( White et al. 1999 ), la cardosina A ricombinante matura mantiene le catene vaccini (latte pastorizzato).
pesanti e leggere associate attraverso un legame disolfuro. Tuttavia,
contrariamente a quanto descritto per la ciprosina B, è stato possibile produrre
una forma troncata di cardosina A senza il dominio PSI in E. coli, con proprietà
catalitiche e preferenze di specificità molto simili a quelle dell'enzima nativo.
Poiché questo metodo di produzione era basato sul ripiegamento da corpi di
inclusione - 2015 ). Più recentemente, è stata pubblicata una caratterizzazione dettagliata di questo

caglio sintetico derivato dalla cardosina B (Almeida et al.

2017 ). In questo lavoro, l'impatto del dominio PSI sui livelli di secrezione di
richiedendo quindi l'implementazione di processi di purificazione a valle per cardosina B in K. lactis è stato valutato con diversi costrutti troncati. La
applicazioni alimentari - e le rese di produzione erano generalmente basse, questo presenza di piccole parti del PSI ha ridotto drasticamente la secrezione in
approccio è stato considerato meno attraente per le applicazioni scale-up, come questo sistema, mentre la sostituzione dell'intero dominio PSI con un linker
un impatto negativo in diverso

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Appl Microbiol Biotechnol (2018) 102: 4675 - 4686 4683

le sequenze non hanno avuto alcun impatto negativo sulla secrezione di cardosina B. bilancia. Inoltre, la continua espansione della nicchia di mercato dei vegetariani
Inoltre, sono state riportate anche differenze nell'elaborazione della proteasi a seconda e la crescita del mercato degli alimenti Kosher e Halal spingono anche alla
della presenza o dell'assenza di parti rimanenti del PSI (Almeida et al. 2017 ). Questi risultati ricerca di sostituti del caglio da fonti vegetali, per generare prodotti adatti a
forniscono ulteriori informazioni su come i determinanti di selezione delle proteine possono questi specifici segmenti di mercato. Come evidenziato in questa recensione,
influenzare in modo differenziato la maturazione delle proteine ei livelli di secrezione e, nel corso degli anni sono stati affrontati diversi approcci per sviluppare nuovi
quindi, influire negativamente e sostanzialmente sui rendimenti di produzione di cardosine caglio a base di cardo, sebbene con vari gradi di successo. Le soluzioni a base
(o ciprosine) in sistemi eterologhi. di formulazioni in polvere o liquide di estratti di fiori di cardo sono indicate come
più maneggevoli, più prontamente standardizzate, igieniche e, quindi, che
Un'analisi approfondita dei requisiti di specificità della cardosina sintetica offrono migliori garanzie di salute rispetto agli estratti grezzi, senza
isolata B, nonché delle sue proprietà biochimiche e strutturali, è stata riportata compromettere le caratteristiche sensoriali distintive caratteristiche di questi
anche da Almeida e collaboratori (Almeida et al. 2017 ). La delucidazione della formaggi (Tejada et al . 2008 ). Tuttavia, la dipendenza dalla disponibilità di fiori e
struttura della cardosina B (file PDB 5NFG) ha confermato la piega canonica di la variabilità intrinseca nell'attività di coagulazione del latte tra C. cardunculus ecotipi
una proteasi aspartica e la presenza di due strutture glicaniche legate all'N (tipo (Correia et al. 2016 ; Guine et al. 2016 ) impongono limitazioni nell'applicazione di
alto mannosio). È interessante notare che sono state riportate anche alcune queste formulazioni su scala industriale. Pertanto, cardosine o ciprosine
differenze nella conformazione della regione del lembo (rispetto alla cardosina A). prodotte in modo ricombinante rappresenterebbero una soluzione a questi
Inoltre, è stato dimostrato che la cardosina B sintetica mostra una minore problemi, essendo probabilmente l'opzione migliore per l'implementazione nei
efficienza catalitica e che è più selettiva in sequenza rispetto alla cardosina B processi di produzione su larga scala. Finora, i migliori risultati sono stati
nativa. Queste due caratteristiche particolari - rendendo questo caglio sintetico descritti per la ciprosina B e la cardosina B, con diversi livelli di dettaglio e
leggermente più spinto e meno proteoliticamente attivo - sono indicati come ulteriori sviluppo. Sebbene, a nostra conoscenza, la ciprosina B sia l'unica forma
vantaggi che possono influenzare positivamente le prestazioni di questa ricombinante presente nel portafoglio di un'azienda, il grado di purificazione e il
preparazione di caglio nella produzione di formaggio (Almeida et al. 2017 ). recupero riportati si ottengono in S. cerevisiae potrebbe ancora avere un impatto
negativo sui costi di produzione delle proteine. A nostro avviso, il principale
ostacolo al successo dello sviluppo di un caglio sintetico a base di cardosina /
ciprosina risiede nell'ottimizzazione dei livelli di elaborazione e secrezione di
queste proteasi nel sistema eterologo selezionato. I livelli di secrezione più
elevati di cardosina B ottenuti nel K. lactis dopo la rimozione del dominio PSI
Sfide e prospettive future (Almeida et al. 2015 ) è un chiaro esempio di come la manipolazione della
selezione / lavorazione delle cardosine possa essere fondamentale per
Lo sviluppo di consistenza, aroma e sapore della maggior parte dei promuovere l'accumulo di proteasi nel mezzo di coltura. Per la cardosina B
formaggi stagionati è direttamente influenzato dalla proteolisi della caseina, sintetica, questo passaggio è stato determinante per lo sviluppo della
che è uno dei principali cambiamenti biochimici che si verificano durante la preparazione del caglio VRen che non richiede passaggi di purificazione a valle.
maturazione del formaggio (Fox e McSweeney 1996 ). I livelli più elevati di Tuttavia, e dai nostri tentativi di produrre cardosina A in
idrolisi della caseina osservati nei formaggi di pecora e capra prodotti con
estratti di cardo rompono la rete della caseina, dando luogo a formaggi con
maggiore cremosità, consistenze più morbide, caratteristiche gustative
migliori e leggermente piccanti (Tejada et al. 2007 ). Il lavoro che noi e altri
abbiamo sviluppato negli anni rafforza le proprietà uniche delle proteasi
coagulanti del latte di cardo e rafforza il loro potenziale come alternative
efficaci per l'esigente aumento della qualità e diversificazione dei prodotti K. lactis ( risultati non pubblicati), è chiaro che sono ancora necessari ulteriori studi
da parte dei consumatori, in particolare per i mercati dei formaggi ovini e per comprendere appieno la natura / forza dei determinanti di ordinamento nelle
caprini. È interessante notare che nel 2012 il nostro gruppo ha condotto proteasi simili alla cardosina (o ciprosine), poiché questi enzimi sembrano dipendere
un'indagine su 20 produttori di formaggio in Portogallo (che includevano da più segnali di smistamento per definire la loro localizzazione intracellulare. I
produttori di formaggi non DOP e DOP) (risultati non pubblicati), ei risultati risultati ottenuti in K. lactis suggerire che questo lievito potrebbe essere esplorato in
hanno confermato che la maggior parte dei produttori seleziona il caglio in futuro come un organismo modello (più semplificato) per comprendere le dinamiche
base al suo impatto sulla qualità / innovazione del il prodotto finale. Più delle cardosine ' smistamento e, quindi, aiutare a superare questo importante collo di
sorprendente, la maggioranza ha risposto che prenderebbe in bottiglia (Almeida et al. 2017 ). Nel frattempo, la produzione di successo e le
considerazione l'uso di un sostituto degli estratti di fiori di cardo se adattato conoscenze disponibili sull'organizzazione strutturale e le preferenze di specificità
per la produzione su scala industriale (non DOP). della cardosina sintetica B (Almeida et al. 2017 ) apre interessanti possibilità per il
futuro sviluppo di soluzioni su misura per i produttori di formaggio attraverso
l'ingegnerizzazione di varianti sintetiche di cardosina B con attività, selettività o
stabilità della proteasi varia

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